專利名稱：：乳腺癌的生物標(biāo)志的制作方法乳腺癌的生物標(biāo)志相關(guān)申請案本申請案主張2005年5月26日申請的美國暫時申請案60/685,459的優(yōu)先權(quán)，該案全部內(nèi)容特別并入本案參考。
技術(shù)領(lǐng)域：
：一般而言，本發(fā)明關(guān)于臨床診斷法。
背景技術(shù)：
：乳腺癌為在女性中最常被診斷出來的癌癥。在其仍可切除且有治愈機(jī)會下，癥狀前篩選以偵測早期乳腺癌可大大地降低乳腺癌相關(guān)的死亡率。不幸的是，只有63%的乳腺癌(1992-1999，美國)在診斷時被發(fā)現(xiàn)(Je腿l，A.ds丄(2004)CACancerJ.Clin.54:8-29)。即使以乳房X光攝影通常會錯過或是沒看到小病變，特別是在年輕女性及胸部組織密集的女性中(Antman，K.andShea，S.(1999)JAMA281:1470-1472)。有潛力辨識這些對造影技術(shù)而言為不可見的小病變的分子標(biāo)志將提供在瘤腫(neoplasm)侵襲組織之前真正治療它的機(jī)乳腺癌為高度異質(zhì)。已經(jīng)研究、用于乳腺癌早期偵測的大部分以分子為主的方法針對特定因子例如致癌基因、腫瘤抑制基因、生長因子、腫瘤抗原或其他基因產(chǎn)物。固有的問題為這些因子沒有一個能夠單獨(dú)算是大多數(shù)的乳腺癌且有些對癌癥或?qū)π夭拷M織不具特異性，因此，這些方法的敏感度及特異性都低。目前，沒有任一個分子生物標(biāo)志被推薦用于乳腺癌早期偵測(Smith,R.A.e"丄(2004)CACancerJ.Clin.54:41-52)。人類乳腺由源自乳頭且通過周圍基質(zhì)往胸壁的叉狀分枝的分離乳管泡(ductal-alveolar)系統(tǒng)組成。大部分的乳腺癌(70-80%)被認(rèn)為是從內(nèi)襯于這些結(jié)構(gòu)的末端乳管的上皮細(xì)胞形成。乳房上皮脫落細(xì)胞成為更新的組織且在乳管的腔室分泌液體。這些液體通過位于乳頭的6至9個分離洞口而離開每個乳房，且其可使用兩種非侵入性步驟的任何一種收集乳頭吸引術(shù)(nippleaspiration)及乳管灌洗法(ductallavage)。在乳頭吸引術(shù)中，簡單的手提式吸杯放置于乳頭上且用于自乳頭開口快速獲得濃縮的液滴。這些液滴經(jīng)毛細(xì)管收集。此技術(shù)可成功用在大部分的女性(Sartorius，0.W.e"丄(1977)J.Natl.CancerInst.59:1073-1080)且產(chǎn)量典型為數(shù)微升至100微升(Klein,P.s丄(2001)BreastJ.7:378—387;Hsiung，R.a丄(2002)CancerJ.8:303-310)。由于乳頭吸引的液體(NAF)只來自乳頭的緊接的鄰近區(qū)域且產(chǎn)量不可預(yù)測時，于是設(shè)計出乳管灌洗法系統(tǒng)。此方法涉及乳頭抽吸以局部化NAF的生產(chǎn)腺體。之后使用微導(dǎo)管插管NAF的生產(chǎn)腺體且以生理食鹽水灌洗。因其沖洗乳管全長，乳管灌洗液體(DLF)可提供較佳的細(xì)胞及腫瘤釋放出的蛋白質(zhì)的來源。與血清相比，乳房液體可能提供較佳的乳腺癌生物標(biāo)志來源，因其呈現(xiàn)的蛋白質(zhì)是特異性地來自乳房組織。因此，以可識別大部分乳腺癌病例的多樣蛋白質(zhì)組篩選一大群患者的乳房液體是有利的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是基于，至少部分基于乳頭吸引液體(NAF)及乳管灌洗液體(DLF)中乳腺癌生物標(biāo)志的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明提供一種鑒定受試者乳腺癌狀況的方法，包括(a)測量來自受試者的生物樣本的至少一種生物標(biāo)志，其中，至少一種生物標(biāo)志選自由表1生物標(biāo)志所組成的群組；及(b)關(guān)聯(lián)測量與乳腺癌狀況。在一種具體實施例中，至少一種生物標(biāo)志是通過在SELDI探針吸附表面捕捉生物標(biāo)志且以激光解析電離質(zhì)譜質(zhì)譜測定法(laserdesorption-ionizationmassspectrometry)偵領(lǐng)lj被捕捉的生物標(biāo)志而測量。在另一種具體實施例中，至少一種生物標(biāo)志以免疫檢定法(immunoassay)測量。在一種具體實施例中，該吸附劑為IMAC-Cu2+吸附劑。在另一種具體實施例中，該吸附劑為生物特異性吸附劑(例如，生物特異性吸附劑包括抗防御素-l(defensin-l)、a_防御素-2、a-防御素-3a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1或a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2的抗體)。在一種具體實施例中，該關(guān)聯(lián)是由軟件分類演算法而實現(xiàn)。在另一種具體實施例中，乳腺癌狀況選自乳腺癌及非乳腺癌。在另一種具體實施例中，乳腺癌狀況選自第I期或第II期原發(fā)性原位乳腺癌及非乳腺癌。在另一種具體實施例中，若該測量關(guān)聯(lián)于該乳腺癌，該方法進(jìn)一步包括投予受試者至少一種治療，該治療選自下列群組手術(shù)、放射治療及化學(xué)療法。在一種具體實施例中，至少一種生物標(biāo)志為a-防御素(例如，a-防御素為a-防御素-l、a-防御素-2或a-防御素-3)。在另一種具體實施例中，該生物標(biāo)志為a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段(例如a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1或a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2)。在一種具體實施例中，測量至少兩種生物標(biāo)志。在另一種具體實施例中，測量至少三種生物標(biāo)志。在另一種具體實施例中，該方法進(jìn)一步包括測量至少一種能夠區(qū)別乳腺癌及非癌癥的生物標(biāo)志，且其中，該生物標(biāo)志不是a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、ci-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1或a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種決定乳腺癌進(jìn)程的方法，包括(a)第一次測量來自受試者的生物樣本的至少一種選自下列群組的生物標(biāo)志a-防御素-l、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2;(b)第二次測量來自該受試者的生物樣本的該至少一種生物標(biāo)志；及比較第一次測量及第二次測量；其中，該比較測量決定乳腺癌的進(jìn)程。在另一種具體實施例中，該方法進(jìn)一步包括(d)在處理受試者后測量至少一種生物標(biāo)志，及關(guān)聯(lián)該測量與疾病進(jìn)展。在另一種具體實施例中，該方法包括測量來自受試者的樣本的至少一種選自下列群組的生物標(biāo)志a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及ci-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種包括純化的生物標(biāo)志的組合物，其中，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種包括生物特異性捕捉劑的組合物，該捕捉劑特異地結(jié)合選自于下列群組的生物標(biāo)志a-防御素-l、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種組合物，其包括與生物標(biāo)志結(jié)合的生物特異性捕捉劑，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF_4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括(a)包括至少一種捕捉劑附著于其上的固相載體，其中，該捕捉劑與至少一種生物標(biāo)志結(jié)合，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-l、a-防御素-2及a-防御素-3;以及(b)使用該固相載體偵測該至少一種生物標(biāo)志的說明書。在一種具體實施例中，包括捕捉劑的固相載體為SELDI探針。在一種具體實施例中，該捕捉劑為頂AC-Cu2+吸附劑。在另一種具體實施例中，該試劑盒進(jìn)一歩包括(c)含有至少一種生物標(biāo)志的容器，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、a—防御素-2、a—防御素一3、BF_4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。在另一種具體實施例中，該試劑盒進(jìn)一步包括(c)一種lKd阻斷透析劑。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包括(a)包括至少一種捕捉劑附著于其上的固相載體，其中，該捕捉劑與至少一種生物標(biāo)志結(jié)合，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、d-防御素-2、ci-防御素-3、BF-4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段l及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2;以及(b)含有至少一種該生物標(biāo)志的容器。在一種具體實施例中，包括捕捉劑的固相載體為SELDI探針。在一種具體實施例中，該捕捉劑為1區(qū)^012+吸附劑。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種軟件產(chǎn)品，其包括(a)存取樣本的數(shù)據(jù)的程式，該數(shù)據(jù)包括至少一種生物標(biāo)志的測量，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、a-防御素-2、a—防御素-3、BF-4、a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2;以及(b)執(zhí)行分類演算法的程式，其分類該樣本的乳腺癌狀況作為該測量的函數(shù)。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種包括以質(zhì)譜測定法或免疫檢定法偵測至少一種生物標(biāo)志的方法，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-l、a-防御素-2、a-防御素-3、BF_4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及ofa-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種包括將關(guān)于乳腺癌狀況的診斷結(jié)果傳達(dá)至受試者的方法，該乳腺癌狀況是由來自受試者的樣本的至少一種生物標(biāo)志的相關(guān)性所決定，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-l、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。在一種具體實施例中，該診斷結(jié)果經(jīng)由電腦產(chǎn)生的媒介物傳達(dá)至受試者。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種辨識與生物標(biāo)志相互作用的化合物的方法，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-l、ci-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2，其中，該方法包括(a)將生物標(biāo)志與測試化合物接觸；以及(b)決定該測試化合物是否與生物標(biāo)志相互作用。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種調(diào)節(jié)細(xì)胞中生物標(biāo)志濃度的方法，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、a—防御素一2、a-防御素-3、BF-4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段l及a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2，其中，該方法包括將該細(xì)胞與化合物接觸，其中，該化合物調(diào)節(jié)該生物標(biāo)志的表達(dá)或翻譯后處理。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種治療受試者癥狀的方法(例如乳腺癌)，其中，該方法包括投予治療有效量的化合物至受試者，其中，該化合物調(diào)節(jié)生物標(biāo)志的表達(dá)或翻譯后處理，該生物標(biāo)志是選自于下列組成的群組a-防御素-1、a—防御素-2、a—防御素-3、BF-4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。圖示簡單說明圖1描述取自5位原發(fā)侵襲性癌癥患者(C6、CIl、C14、C16及C26)以及取自五位正?？刂平M(N4、N15、N32、N33及N36)的乳頭吸引液體的蛋白質(zhì)圖譜(profile)的假擬膠圖。使用lug(微克)的總蛋白質(zhì)于IMAC-Cu芯片陣列(chiparray)上獲得質(zhì)譜。來自不同受試者的NAF的一般蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜各異，而相同檢體三重復(fù)分析所得質(zhì)譜則具有高度再現(xiàn)性。圖2描述生物標(biāo)志的訓(xùn)練與測試。訓(xùn)練樣本NAF(A組與B組，代表兩個經(jīng)非監(jiān)督式聚類分析(unsupervisedclusteranalysis)所辨i只的亞群)。測試樣本收集組合(pooled)的DLF(C組)。所選出的生物標(biāo)志以箭頭指示。BF1至3顯示為三個高峰聚類(M/Z3375，3447及3490)且在C6及C14升高而被選做A組最有效的辨識者。BF4(M/Z)4079在C11及C16升高，而BF5(M/Z4680)在C26升高；這兩個標(biāo)志都可區(qū)別B組癌癥對非癌癥檢體。在測試數(shù)據(jù)中證實癌癥中BF1至3及BF5升高。圖3證明使用抗HNP1至3的單株抗體，BF1至3的抗體捕捉。該抗體的胺基連接至AminoLirik珠子且與兩個具有高BF1至3高峰(NAF-C6與NAF-C14)的NAF檢體培養(yǎng)。所顯示為原始NAF-C6(A)與C14(C)的質(zhì)譜；以及由兩個相同檢體捕捉到的蛋白質(zhì)質(zhì)譜(分別為B與D)。圖4描述以ELISA對HNP1至3定量分析。以SELDI分析的BF1至3高峰振幅(頂部)關(guān)聯(lián)于經(jīng)ELISA測量的麗P1至3高濃度(底部)。圖5描述從13位乳腺癌高危險群的女性中得到的42個DLF樣本中的HNP1至3濃度(以ELISA測量)(A);以及在每個樣本中相對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度(B)。在患者11中觀察到HNP1至3持續(xù)升高(在兩個時間點中，該位女性的6個樣本中的5個樣本)且HNP在樣本中的低度表達(dá)不是因為缺乏蛋白質(zhì)。圖6描述在亞群A中顯示出差異表達(dá)的BCl至3的數(shù)據(jù)；以及在亞群B中顯示出差異表達(dá)的BC4與5。BC1至3之后經(jīng)辨識為人類中性粒細(xì)胞多肽1至3(HNP1至3)。根據(jù)質(zhì)譜中的相似度劃分成組A與B;經(jīng)非監(jiān)督式聚類分析辨識。所有NAF檢體來自M.D.AndersonCancerCenter。HNP1至3與BC5的升高也同樣在來自約翰霍普金斯大學(xué)的一對組合DLF檢體中觀察到。圖7證實在4位有侵襲性癌癥的受試者(4/25)、1位有DCIS的受試者(1/3)與1位有ADH的受試者(1/3)的癌癥/患病乳房中觀察到BC5的上升表達(dá)(箭頭)。沒有一個對側(cè)控制組(contra-lateralcontrol)的乳房顯示其BC5為陽性，包括所有控制組受試者的乳房(數(shù)據(jù)未顯示)。使用來自DCIS及ADH受試者的數(shù)據(jù)顯示質(zhì)譜再現(xiàn)性。作為比對，來自先前數(shù)據(jù)的C26質(zhì)譜亦包含于其中。圖8描述以EL工SA測量的HNP1至3濃度(毫微克/微克(ng/ug))。A:5個癌癥受試者(c)的癌癥乳房及5個健康控制組的乳房(n)的NAF樣本從M.D.AndersonCancerCenter獲得。在5個癌癥病例中的2個觀察到上升的HNP1至3，為濃度70-80ng/ug;B:先前數(shù)據(jù)，來自西北大學(xué)的DLF。為乳腺癌高危險群(5年蓋爾危險率(Gailrisk)〉1.6或先前有小葉癌病史)的女性每6至12個月進(jìn)行雙側(cè)乳管灌洗法。在受試者11觀察到HNP1至3持續(xù)上升；C:NAF.1:侵襲性受試者控制組乳房；2:侵襲性受試者癌癥乳房；3:DCIS控制組乳房；4:DCIS癌癥乳房;5:ADH控制組乳房;6:ADH患病乳房;7:低危險群控制組受試者(無第1級相關(guān)家族史及具有小于2次的先前切片檢查)；8:高危險群控制組受試者(第1級相關(guān)家族史或有大于或是等于2次先前切片檢查)。D:目前數(shù)據(jù)，DLF在西北大學(xué)收集。從58個高危險群受試者(5年蓋爾危險率〉1.6或先前有小葉癌病史)的149個雙側(cè)乳管灌洗法取得的檢體測量HNP1至3的基準(zhǔn)線表達(dá)。圖9A至9B描述BF-5經(jīng)胰蛋白酶分解后的質(zhì)譜。A:BF-5經(jīng)胰蛋白酶分解后的質(zhì)譜。B:A經(jīng)胰蛋白酶分解后的1842高峰的質(zhì)量片段的Mascot標(biāo)記。圖10A至10B描述BF-5的質(zhì)譜。A:BF-5的質(zhì)譜。B:BF-5至2發(fā)明詳細(xì)說明1.引言生物標(biāo)志為有機(jī)的生物分子，比較其在一種表現(xiàn)型狀況的受試者樣本中(例如，帶有疾病)與在另一種表現(xiàn)型狀況的受試者樣本中(例如，不帶疾病)為有差異性地呈現(xiàn)。若計算在不同群組中的生物標(biāo)志平均值或中{直表達(dá)程度于統(tǒng)計學(xué)上為顯著時，則生物標(biāo)志在不同的表達(dá)型狀況視為有差異性地呈現(xiàn)。于其它測試中，常見用于計算統(tǒng)計學(xué)上顯著的檢定其中包括T檢定(t-test)、ANOVA、Kruskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney及比值比(oddsratio)。單獨(dú)或組合的生物標(biāo)志提供測量受試者屬于一種或另一種表現(xiàn)型狀況的相關(guān)危險率。因此，生物標(biāo)志為用于疾病(診斷法)、藥物治療有效性(治療診斷科技(theranostics))及藥物毒性的有用標(biāo)志。2.乳腺癌的生物標(biāo)志2.1.生物標(biāo)志本發(fā)明提供以多勝肽為主的生物標(biāo)志，其在患有乳腺癌的受試者中有差異性地呈現(xiàn)，特別是在乳腺癌患者與正常人(非乳腺癌)比較下。生物標(biāo)志由質(zhì)譜測定法測定的質(zhì)荷比、飛行時間式(time-of-flight)質(zhì)譜測定法中的光譜高峰形式及其對吸附劑表面的結(jié)合特性而辨別。這些特征提供測定特定偵測的生物分子是否為本發(fā)明的生物標(biāo)志的方法。在區(qū)別生物分子的方法中，這些特征呈現(xiàn)出生物分子固有的特征且但并非作為分辨該生物分子的限制。在一態(tài)樣中，本發(fā)明提供呈單離型態(tài)的生物標(biāo)志。生物標(biāo)志使用來自CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont,CA)("Ciphergen")的蛋白質(zhì)芯片陣列以SELDI技術(shù)發(fā)現(xiàn)。樣本從被診斷患有乳腺癌的受試者(切片檢査法證實為第I期或第II期單側(cè)原發(fā)侵襲性乳腺癌)及被診斷為正常的受試者中經(jīng)乳頭吸引術(shù)或乳管灌洗法收集。施用樣本至SELDI生物芯片，且樣本中多勝肽光譜經(jīng)CiphergenPBSII質(zhì)譜儀的飛行時間式質(zhì)譜測定法產(chǎn)生。使用蛋白質(zhì)芯片軟件3.0(Ciphergen)收集與評估原始光譜。手動選擇信號/雜訊>5的合格質(zhì)量高峰(目測檢查)，且標(biāo)準(zhǔn)化高峰強(qiáng)度為所選擇質(zhì)量區(qū)域(在這個例子中，其介于3kDa及135kDa)的總離子流。將二重復(fù)分析中所得的該高峰強(qiáng)度平均，之后轉(zhuǎn)換成對數(shù)用于結(jié)果分析。此方法將于實施例有更詳細(xì)的描述。因而發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志如表l所列。該「蛋白質(zhì)芯片分析」一欄指的是發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志的層析流份(chromatographicfraction)、生物標(biāo)志所結(jié)合的生物芯片種類及洗滌條件如各例所示。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>本發(fā)明的生物標(biāo)志以經(jīng)質(zhì)譜測定法測定的質(zhì)荷比為特征。每個生物標(biāo)志的質(zhì)荷比提供于表l中「M」之后。因此，例如，M3447具有測量出的質(zhì)荷比為3447。質(zhì)荷比由CiphergenBiosystems,Inc.PBS-II蛋白質(zhì)芯片讀數(shù)器質(zhì)譜儀產(chǎn)生的質(zhì)譜測定。此儀器具有質(zhì)量準(zhǔn)確率約+/-0.15%。此外，此儀器具有質(zhì)量分辨率(massresolution)約400至1000m/dm，其中，m為質(zhì)量而dm為在O.5峰高時的質(zhì)譜寬度。使用BiomarkerWizardu"車欠件(CiphergenBiosystems,Inc.)測定生物標(biāo)志的質(zhì)荷比。BiomarkerWizard通過聚類由PBSII所測定的所有分析光譜的相同高峰的質(zhì)荷比、取聚類中最高與最低質(zhì)荷比且再除以2而指派出生物標(biāo)志的質(zhì)荷比。因此，所提供的質(zhì)量反映出這些說明。本發(fā)明的生物標(biāo)志進(jìn)一步由飛行時間式質(zhì)譜測定法的光譜高峰的形式辨別。質(zhì)譜顯示的高峰所代表的生物標(biāo)志如圖3所示。假擬膠圖顯示的條紋所代表的生物標(biāo)志如圖1與2所示。本發(fā)明生物標(biāo)志進(jìn)一步以其于層析表面的結(jié)合性質(zhì)為特征。生物標(biāo)志在以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后與金屬親和性捕捉芯片陣列(例如Ciphergen皿C-Cu芯片)結(jié)合。本發(fā)明生物標(biāo)志的某些身份BF-1、BF-2、BF-3、BF-5-1及BF-5-2已決定并顯示于表1。做出該決定的方法于實施例中描述。對于身份己經(jīng)決定的生物標(biāo)志，其是否存在可由
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中已知的其他方法測定。特別是，BF-1、2及3經(jīng)辨識分別為人類中性粒細(xì)胞多肽2、l及3(HNP-2、l及3)，亦已知分別為a-防御素-2、1及3。HNP-1、2及3已知其特征為勝肽抗生素，其主要由人類嗜中性白血球制造，即使某些腫瘤亦可能產(chǎn)生具有相同能力的a-防御素。近期研究已辨識出HNP-1、2及3不同的作用活性，包括在腎細(xì)胞癌的腫瘤細(xì)胞增生(Miiller，CA.ds丄(2002)Am.J.Pathol.160:1311—1324)。HNP-1、2及3亦已知分別為a-防御素-1、2及3(見美國專利申請公開案US2004/0091498,此案并入本文參考)。人類a_防御素-1的胺基酸序列為ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(如SEQIDN0:1所示)。人類a_防御素-2的胺基酸序列為CYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(如SEQIDNO:2所示)。人類a_防御素_3的胺基酸序列DCYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC(如SEQIDN0:3所示)。同樣，BF-5-1已經(jīng)辨識為a-l-抗胰蛋白酶抑制物(AAT)的C端片段。BF-5-1的胺基酸序列為LEAIPMSIPPEVKFNKPFWLMIDQNTKSPLFMGK麗PTQK(如SEQIDNO:4所示)。BF-5-2已經(jīng)辨識為a-l-抗胰蛋白酶抑制物(AAT)的C端片段。BF-5-2的胺基酸序列為EAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIDQNTKSPLFMGK麗PTQK(如SEQIDNO:5所示)。因此，所例示的生物標(biāo)志在本發(fā)明的方法中有用的為a-防御素。a-防御素為一個蛋白質(zhì)家族，包括約94個胺基酸殘基。特別是，a-防御素3為94個胺基酸蛋白質(zhì)，其為GenBankAccessionNo.NP—005208的基因的表達(dá)產(chǎn)物。SEQIDN0:3為a-防御素3的C端片段。a-防御素1為94個胺基酸蛋白質(zhì)，其為GenBankAccessionNo.:NP一004075的基因的表達(dá)產(chǎn)物。a-防御素由AbCam(CatalogNumberab12757)(Cambridge,MA)的抗體辨識。特定的a-防御素生物標(biāo)志如表1所示為SEQIDNOs:1至3。進(jìn)一步，在本發(fā)明方法中有用的生物標(biāo)志為a-l-抗胰蛋白酶抑制物(AAT)的C端片段。a-l-抗胰蛋白酶抑制物為含有約418個胺基酸殘基的蛋白質(zhì)且為GenBankAccessionNo.:K01396的基因的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明所例示的標(biāo)志包括抗胰蛋白酶抑制物的C端片段，例如長度為大約30、35、40、45或50個胺基酸殘基的片段。a-1-抗胰蛋白酶抑制物由AbCam(CatalogNumberab9399)(Cambridge,MA)的抗體辨識。如表1所示特定的a-l-抗胰蛋白酶抑制物生物標(biāo)志為SEQIDNOs:4及5。因為本發(fā)明的生物標(biāo)志以質(zhì)荷比、結(jié)合特性及光譜形式為特征，其可由質(zhì)譜測定法偵測而不需要知道其特定身份。然而，如需要，身份未經(jīng)測定的生物標(biāo)志可由，例如測定多勝肽的胺基酸序列辨識。例如，生物標(biāo)志可由一些酵素如，胰蛋白酶或V8蛋白酶做勝肽比對，及分解片段的分子量可用來搜尋序列資料庫中所符合的以各種酵素產(chǎn)生的分解片段的分子量?；蛘撸鞍踪|(zhì)生物標(biāo)志可使用串聯(lián)式(tandem)MS技術(shù)定序。在此方法中，蛋白質(zhì)以例如凝膠電泳單離。切下含有生物標(biāo)志的條紋且蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶分解。以第一個質(zhì)譜儀分離個別蛋白質(zhì)片段。該片段之后經(jīng)碰撞誘發(fā)冷卻，其使勝肽成片段且產(chǎn)生多勝肽階梯。多勝肽階梯之后以串聯(lián)式MS的第二個質(zhì)譜儀分析。多勝肽階梯部分質(zhì)量的不同而辨識序列中的胺基酸。整個蛋白質(zhì)可以這個方法定序，或序列片段可經(jīng)資料庫探勘找到身份候選者。偵測生物標(biāo)志的較佳生物來源為乳頭吸引液體(NAF)或乳管灌洗液體(DLF)。然而，在其他具體實施例中，生物標(biāo)志可在血液、血清、血漿或尿液中偵測到。本發(fā)明的生物標(biāo)志為生物分子。因此，本發(fā)明提供呈單離形態(tài)的生物分子。該生物標(biāo)志可從生物液體如NAF或DLF中單離。其可以任何
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中已知的方法根據(jù)其質(zhì)量及結(jié)合特征而單離。例如，如此處所述，含生物分子的樣本經(jīng)層析分離，以及用例如，丙烯醯胺凝膠電泳進(jìn)一步分離。依對生物標(biāo)志身份的知識亦可使用免疫親和性層析法單離。3.生物標(biāo)志及蛋白質(zhì)的不同型態(tài)蛋白質(zhì)常以多種不同型態(tài)存在于樣本中。這些型態(tài)可因翻譯前修飾及翻譯后修飾其中之一或兩者而導(dǎo)致。翻譯前修飾型態(tài)包括等位基因變異(allelicvariant)、剪接變異(splicevariant)及RNA編輯型態(tài)(RNAeditingform)。翻譯后修飾型態(tài)包括因蛋白質(zhì)裂解(proteolyticcleavage)(例如，信號序列(signalsequence)的裂角軍或母蛋白質(zhì)的片段)、糖基化、磷酸化、脂化、氧化、甲基化、半胱胺酸化(cysteinylation)、磺酸化及乙醯化所導(dǎo)致的型態(tài)。當(dāng)在樣本中偵測或測量到蛋白質(zhì)時，區(qū)別蛋白質(zhì)不同型態(tài)的能力端靠差異的性質(zhì)及用來偵測或測量的方法。例如，使用單株抗體的免疫檢定法將偵測到含有該表位的蛋白質(zhì)的所有型態(tài)且將無法區(qū)別它們。然而，使用2種抗體針對蛋白質(zhì)上不同表位的夾心免疫檢定法將偵測到含有2種表位的蛋白質(zhì)的所有型態(tài)而不會偵測到只含有1種表位的蛋白質(zhì)型態(tài)。在診斷分析中，當(dāng)使用特殊方法偵測到的型態(tài)不論其為任何特定型態(tài)，其同樣為良好的生物標(biāo)志，則不能區(qū)別蛋白質(zhì)不同型態(tài)便只有很小的影響。然而，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的特定型態(tài)(或特定型態(tài)的子群)與使用特定方法一起偵測到的不同型態(tài)群相比為較佳的生物標(biāo)志，則分析的能力可能受到考驗。在此情況下，使用可以區(qū)別蛋白質(zhì)型態(tài)與專一地偵測及測量所需蛋白質(zhì)型態(tài)的分析方法較有用。區(qū)別分析物不同的型態(tài)或?qū)Ｒ坏貍蓽y分析物的特定型態(tài)則稱為「解析」分析物。質(zhì)譜測定法為解析蛋白質(zhì)的不同型態(tài)特別有用的方法學(xué)，因為不同型態(tài)典型具有可由質(zhì)譜測定法解析的不同質(zhì)量。因此，若對于某一疾病，蛋白質(zhì)的某一種型態(tài)與生物標(biāo)志的另一種型態(tài)相比為較好的生物標(biāo)志，在傳統(tǒng)的免疫檢定法無法區(qū)別型態(tài)且不能特異地檢測有用的生物標(biāo)志時，質(zhì)譜測定法可能能夠特異地偵測及測量有用的型態(tài)。一種有用方法為將質(zhì)譜測定法與免疫檢定法結(jié)合。首先，使用一種生物特異性捕捉劑(例如，抗體、適體(aptamer)或辨識生物標(biāo)志及生物標(biāo)志其他型態(tài)的親和體(Affibody))用來捕捉有興趣的生物標(biāo)志。較佳為，將生物特異性捕捉劑結(jié)合至固相如珠子、孔盤、膜或陣列。在洗去未結(jié)合材料后，以質(zhì)譜測定法偵測及/或測量被捕捉的分析物。(此方法亦將導(dǎo)致捕捉與蛋白質(zhì)結(jié)合的蛋白質(zhì)互動物(interactor)或被抗體所辨識的蛋白質(zhì)相互作用物且其本身可能為生物標(biāo)志)質(zhì)譜測定法的各種形式均有用于偵測蛋白質(zhì)型態(tài)，包括激光解析方法如傳統(tǒng)MALDI或SELD工及電噴射電離法。因此，當(dāng)此處提及偵測特定蛋白質(zhì)或測量特定蛋白質(zhì)的量，意指解析或不解析蛋白質(zhì)的各種型態(tài)而偵測及測量蛋白質(zhì)。例如，「測量a-防御素」的步驟包括以不區(qū)分樣本中蛋白質(zhì)各種型態(tài)的方法(例如，某些免疫檢定法不區(qū)分a-防御素-1、a-防御素-2及ci-防御素-3)及以從其他型態(tài)中區(qū)分某些型態(tài)或測量蛋白質(zhì)特定型態(tài)(例如，任何及/或全部的a-防御素-1、a-防御素-2及a-防御素-3，單獨(dú)或組合)的方法測量a-防御素。反之，當(dāng)需要測量蛋白質(zhì)特定型態(tài)時，具體指明該特定型態(tài)。例如，「測量a-防御素-l」意指從其他a-防御素的型態(tài)例如，a-防御素-2及a-防御素-3，區(qū)別測量出a-防御素-1。同樣，提及「測量a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段」包括測量抗胰蛋白酶抑制物C端片段的任一及/或所有型態(tài)例如，在受試者測試樣本中，個別的a-1-抗胰蛋白酶抑制物C端片段l及/或a-1-抗胰蛋白酶抑制物C端片段2或其組合。4.偵測乳腺癌的生物標(biāo)志本發(fā)明的生物標(biāo)志可由任何適合的方法偵測。為這目的可使用的偵測范例包括光學(xué)方法、電化學(xué)方法(電位測定法及電流滴定法(amperometry)技術(shù))、原子力顯微鏡及射頻(radiofrequency)方法例如多極性共振光譜學(xué)(multipolarresonancespectroscopy)。除了顯微鏡學(xué)外，共焦及非共焦光學(xué)方法的例子為螢光、冷光、化學(xué)冷光、吸收率、反射率、透光率及雙折射或折射率(例如表面等離子共振、橢偏儀、共振鏡法、光柵耦合器波導(dǎo)法或干涉術(shù))的偵測。在一種具體實施例中，樣本由生物芯片的方法分析。生物芯片一般包括固相基材并具有捕捉劑(亦稱為吸附劑或親和劑)附著的平坦表面。通常，生物芯片的表面包括多個可編址的位置，每個都有捕捉劑妙入亡口口o蛋白質(zhì)生物芯片為適用于捕捉多勝肽的生物芯片。許多蛋白質(zhì)生物芯片在本
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中提及。此類生物芯片包括例如，由CiphergenBiosystems，Inc.(Fremont,CA)、PackardBioscienceCompany(MeridenCT)、Zyomyx(Hayward，CA)、Phylos(Lexington,MA)及Biacore(Uppsala，Sweden)所制造的蛋白質(zhì)生物芯片。此類蛋白質(zhì)生物芯片的例子如下列專利或公開的專利申請案所述U.S.專利號6,225,047;PCT國際公開號WO99/51773;U.S.專利號6,329,209;PCT國際公開號WO00/56934及U.S.專利號5，242，828。4.1.質(zhì)譜測定法的偵測在一較佳的具體實施例中，本發(fā)明的生物標(biāo)志由質(zhì)譜測定法偵測，其為一種運(yùn)用質(zhì)譜儀偵測氣相離子的方法。質(zhì)譜儀的例子為飛行時間式、磁扇形場式、四極濾質(zhì)器、離子阱、離子回旋共振、靜電扇形場式分析器及上述的混合。在進(jìn)一步較佳方法中，質(zhì)譜儀為激光解析/電離質(zhì)譜儀。在激光解析/電離質(zhì)譜測定法中，分析物置于質(zhì)譜測定法探針表面，適于接合質(zhì)譜儀探針介面的設(shè)備將分析物置于電離能量下使得電離且導(dǎo)入質(zhì)譜儀中。激光解析質(zhì)譜儀運(yùn)用激光能量，典型來自紫外光激光，亦有紅外線激光，從表面將分析物釋出以揮發(fā)及電離分析物，并使質(zhì)譜儀離子光學(xué)與分析物接觸。通過LDI做蛋白質(zhì)分析可采用MALDI或SELDI的形式。4.1.1.SELDI于本發(fā)明使用的較佳質(zhì)譜測定技術(shù)為「表面增強(qiáng)激光解析及電離」或"SELDI"例如，在Hutchens及Yip的U.S.專利號5，719，060及6，225，047中所述者。其提及解析/電離氣相離子光譜測定法(例如質(zhì)譜測定法)，其中分析物經(jīng)捕捉在SELDI質(zhì)譜測定法探針表面(此處為一種或多種生物標(biāo)志)。SELDI亦被稱做「親和性捕捉質(zhì)譜測定法」或「表面增強(qiáng)親和性捕捉」("SEAC")。此型涉及探針的使用，其在探針表面的物質(zhì)透過物質(zhì)與分析物之間非共價親和性互動(吸附)而捕捉分析物。此物質(zhì)廣泛稱做「吸附劑」、「捕捉劑」、「親和劑」或「結(jié)合部分」。此類探針可稱做「親和性捕捉探針」且具有「吸附表面」。此捕捉劑可為任何能夠結(jié)合分析物的物質(zhì)。通過物理吸附或化學(xué)吸附，捕捉劑附著至探針表面。在某些具體實施例中，探針具有已經(jīng)附著于表面的捕捉劑。在其他具體實施例中，探針經(jīng)前活化且包括能夠結(jié)合捕捉劑的反應(yīng)部分例如，透過反應(yīng)形成共價鍵或配位共價鍵。環(huán)氧化物及醯基-咪唑為共價結(jié)合如，抗體或細(xì)胞受體的多勝肽捕捉劑的有用反應(yīng)部分。氨基三乙酸(nitrilotriaceticacid)及亞氨基二乙酸為有用反應(yīng)部分，作為與金屬離子結(jié)合的螯合劑，與含組胺酸的勝肽非共價相互作用。吸附劑通常分類為層析吸附劑及生物特異性吸附劑。「層析吸附劑」指典型用于層析術(shù)的吸附物質(zhì)。層析吸附劑包括例如離子交換物質(zhì)、金屬螯合物(例如氨基三乙酸或亞氨基二乙酸)、固定化金屬螯化物、疏水性相互作用吸附劑、親水性相互作用吸附劑、染劑、簡單生物分子(例如核苷酸、胺基酸、簡單糖類及脂肪酸)及混合型吸附劑(例如疏水吸引/靜電排斥吸附劑)?！干锾禺愋晕絼怪负猩锓肿拥奈絼?，該生物分子例如核酸分子(例如適體)、多勝肽、多醣類、脂質(zhì)、類固醇或這些物質(zhì)的共軛物(例如醣蛋白、脂蛋白、醣脂、核酸(例如DNA-蛋白質(zhì)共軛物)。在某些例子，生物特異性吸附劑可為大分子結(jié)構(gòu)如多蛋白復(fù)合體、生物膜或病毒。生物特異性吸附劑的例子為抗體、受體蛋白質(zhì)及核酸。生物特異性吸附劑典型比層析吸附劑對標(biāo)的分析物具有較高的特異性。再者，用于SELDI的吸附劑的例子可見于U.S.專利號6,225,047?！干镞x擇性吸附劑」指與分析物結(jié)合親和性為至少l(TM的吸附劑。由CiphergenBiosystems，Inc.所制造的蛋白質(zhì)生物芯片包含在可編址位置附著層析吸附劑或生物特異性吸附劑的表面。Ciphergen蛋白質(zhì)芯片(ProteinChipr陣列包括NP20(親水性)；H4及H50(疏水性)；SAX-2、Q-10以及(離子交換);WCX-2及CM-10(陽離子交換)；頂AC-3、頂AC-30及頂AO50(金屬螯化物)；以及PS-IO、PS-20(帶有醯基-咪唑、環(huán)氧化物的反應(yīng)表面)及PG-20(經(jīng)由醯基-咪唑耦合的蛋白質(zhì)G)。疏水性蛋白質(zhì)芯片陣列具有異丙基或壬基苯氧基-聚(乙二醇)甲基丙烯酸的官能性。陰離子交換蛋白質(zhì)芯片陣列具有季銨的官能性。陽離子交換蛋白質(zhì)芯片陣列具有羧酸鹽的官能性。固定化金屬螯化物蛋白質(zhì)芯片陣列具有氨基三乙酸的官能性aMAC3及頂AC30)或0-甲基丙烯醯基-N，N-雙-羧基甲基酪胺酸的官能性(BIAC50)，其通過螯合吸附過渡金屬離子如銅、鎳、鋅及鎵。預(yù)先活化蛋白質(zhì)芯片陣列具有醯基-咪唑或環(huán)氧化物的官能基，其可與蛋白質(zhì)上的基團(tuán)反應(yīng)作共價鍵此類生物芯片進(jìn)一步于美國專利號6，579，719(HutchensandYip，"RetentateChromatography"，J匿17,2003);美國專禾!j號6，897，072(Richs義"ProbesforaGasPhaseIonSpectrometer"May24，2005);美國專利號6，555，813(Beecher"s義"SampleHolderwithHydrophobicCoatingforGasPhaseMassSpectrometer",April29，2003);美國專利公開號U.S.2003-0032043Al(PohlandPapa叫"LatexBasedAdsorbentChip"，July16,2002);以及PCT國際公開號WO03/040700(Ums7，"HydrophobicSurfaceChip"，May15，2003);美國專利公開號US2003-0218130Al(Boschettids厶"BiochipsWithSurfacesCoatedWithPolysaccharide-BasedHydrogels"，April14，2003)及美國專利公開號U.S.2005-059086Al(Huange力s丄，"PhotocrosslinkedHydrogelBlendSurfaceCoatings"，March17，2005)中描述。一般而言，帶有吸附劑表面的探針與樣本接觸的時間足以使樣本里可能表達(dá)的生物標(biāo)志與吸附劑結(jié)合。經(jīng)過培養(yǎng)時期后，洗滌基材以移除未結(jié)合的物質(zhì)。可使用任何適合的洗滌溶液；較佳為使用水性溶液。分子維持結(jié)合的程度可通過調(diào)整洗滌的嚴(yán)格度(stringency)操作。洗滌液的洗提特征根據(jù)例如pH、離子強(qiáng)度、疏水性、混亂趨性(chaotr叩ism)程度，清潔強(qiáng)度及溫度。除非探針具有SEAC及SEND兩種特征(如此處所述)，之后將能量吸收分子施加至帶有結(jié)合生物標(biāo)志的基材。在另一方法中，探針可由結(jié)合于固相的免疫吸附劑捕捉生物標(biāo)志，該吸附劑具有與生物標(biāo)志結(jié)合的抗體。洗滌吸附劑以移除未結(jié)合物質(zhì)后，該生物標(biāo)志自固相洗提而出且施用于與生物標(biāo)志結(jié)合的SELDI芯片而經(jīng)偵測并以SELDI分析。在氣相離子光譜儀如飛行時間式質(zhì)譜儀中偵測與基材結(jié)合的生物標(biāo)志。以離子化源如激光離生物標(biāo)志，以離子光學(xué)裝置收集所產(chǎn)生的離子，之后質(zhì)量分析儀分散且分析通過的離子。之后偵測器將所偵測到的離子資訊轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。生物標(biāo)志的偵測典型涉及信號強(qiáng)度的偵測。因此，可測定生物標(biāo)志的量及質(zhì)量。4.1.2.SEND激光解析質(zhì)譜測定法的另一種方法叫做表面增強(qiáng)凈解析("SEND")。SEND涉及使用含有與探針表面("SEND探針")化學(xué)性結(jié)合的能量吸收分子的探針。術(shù)語「能量吸收分子」(EAM)表示能夠吸收來自激光解析/電離源的能量的分子，且之后用于解析及電離與之接觸的分析物分子。EAM種類包括用于MALDI的分子，通常指為「基質(zhì)」且以肉桂酸衍生物、芥子酸(SPA)、氰基-羥基-肉桂酸(CHCA)及二羥苯甲酸、阿魏酸及羥基苯乙酮衍生物為例子。在某些具體實施例中，能量吸收分子并入線性或交聯(lián)聚合物例如聚甲基丙烯酸酯。例如，組合物可為a-氰基-4-甲基丙烯醯基氧基肉桂酸與丙烯酸酯的共聚合物。在另一種具體實施例中，組合物為a-氰基-4-甲基丙烯醯基氧基肉桂酸、丙烯酸酯與3-(三-乙氧基)硅烷基丙基甲基丙烯酸酯的共聚合物。在另一種具體實施例中，組合物為a-氰基-4-甲基丙烯醯基氧基肉桂酸與十八烷基甲基丙烯酸酯("C18SEND")的共聚合物。SEND進(jìn)一步于美國專利號6，124,137及PCT國際公開號WO03/64594(Kitagawa，"MonomersAndPolymersHavingEnergyAbsorbingMoietiesOfUseInDesorption/IonizationOfAnalytes，，，August7，2003)中描述。SEAC/SEND為一種激光解析質(zhì)譜測定法，其中捕捉劑及能量吸收分子兩者均附著于樣本呈現(xiàn)表面。SEAC/SEND探針因而通過親和性捕捉及電離/解析而捕捉分析物且不需施用于外部基質(zhì)。CI8SEND生物芯片為一種SEAC/SEND，包括C18部分，其作用為捕捉劑，以及CHCA部分，其作用為能量吸收部分。4,1.3.SEPAR另一種LDI叫做表面增強(qiáng)光不穩(wěn)定附著及釋放("SEPAR")。SEPAR涉及使用具有附著于該表面的部分的探針與分析物共價鍵結(jié)，之后在曝光后例如激光，通過打斷于該部分內(nèi)的光不穩(wěn)定鍵而釋出分析物(見美國專利號5，719，060)。依據(jù)本發(fā)明，SEPAR及其他型態(tài)的SELDI適于偵測生物標(biāo)志或生物標(biāo)志量變曲線。4.1.4.亂DIMALDI為傳統(tǒng)用于分析如，蛋白質(zhì)及核酸的生物分子的激光解析/電離法。在MALDI方法中，樣本與基質(zhì)混合且直接沉淀在MALDI芯片。然而，生物樣本如，血清或尿液的復(fù)雜性使得此方法若無前分級樣本則較為不理想。因此，在某些具體實施例中，較佳先以生物特異性物質(zhì)(例如抗體)或耦合于固相載體如，樹脂(例如，在離心管柱中)的層析物質(zhì)捕捉生物標(biāo)志。與本發(fā)明的生物標(biāo)志結(jié)合的特定親和性物質(zhì)如上所述。于親和性物質(zhì)上純化后，洗提出生物標(biāo)志，之后以MALDI偵測。4.1.5.質(zhì)譜測定法中其他型態(tài)的電離在另一方法中，以LC-MS或LC-LC-MS偵測生物標(biāo)志。此涉及經(jīng)一次或二次通過液相層析術(shù)解析樣本中的蛋白質(zhì)，接著以質(zhì)譜測定法分析，典型為電噴射離子化。4.1.6.數(shù)據(jù)分析以飛行時間式質(zhì)譜測定法做分析物分析產(chǎn)生飛行時間式光譜。飛行時間式光譜最后分析典型不代表信號來自對樣本電離能量的單一脈沖，而是來自一些脈沖的信號總和。此減少雜訊且增加動態(tài)范圍(dynamicrange)。此飛行時間式數(shù)據(jù)之后經(jīng)數(shù)據(jù)處理。在Ciphergen's蛋白質(zhì)芯片⑧軟件中，數(shù)據(jù)處理典型包括TOF至M/Z轉(zhuǎn)換以產(chǎn)生質(zhì)譜、基準(zhǔn)線扣除以消除儀器抵銷(offset)以及高頻率雜訊過濾以減少高頻率雜訊。'通過生物標(biāo)志解析及偵測產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可使用可編程數(shù)字電腦分析。電腦程式分析數(shù)據(jù)而指出所偵測到的生物標(biāo)志的量，以及視需要指出對每個所偵測的生物標(biāo)志的信號強(qiáng)度及測定的分子質(zhì)量。數(shù)據(jù)分析可包括測定生物標(biāo)志信號強(qiáng)度及移除脫離預(yù)定統(tǒng)計分布區(qū)域的數(shù)據(jù)等步驟。例如，可通過計算與一些范圍相關(guān)的每個高峰高度來標(biāo)準(zhǔn)化所觀察的高峰。電腦可將所得數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式顯示?？娠@示標(biāo)準(zhǔn)光譜，但在一有用的形式中，光譜圖只保留高峰高度及質(zhì)量資訊產(chǎn)生較清楚的影像且使得帶有幾乎相同分子量的生物標(biāo)志更易察見。在另一有用的形式中，比較二個或更多個光譜，光譜合宜地強(qiáng)調(diào)出獨(dú)特的生物標(biāo)志以及在樣本間經(jīng)上調(diào)控(up-regulate)或下調(diào)控(down-regulate)的生物標(biāo)志。使用這些形式中任一種，可立即測定特定的生物標(biāo)志是否存在樣本中。分析通常涉及光譜中辨識高峰，其代表來自分析物的信號。高峰的選擇可憑目力完成，但軟件亦可得，如Ciphergen'sProteinChip軟件試劑盒中一部份，其可自動偵測高峰。一般來說，此軟件的作用為通過辨識具有信號對雜訊比例超過所選擇之門檻的信號，以及在高峰信號的質(zhì)心標(biāo)記高峰質(zhì)量。在一個有用的運(yùn)用中，比較許多光譜以辨識在一些所選擇比例之質(zhì)譜中出現(xiàn)的相同高峰。一種此類軟件聚類在所界定的質(zhì)量范圍內(nèi)，出現(xiàn)在各種光譜的所有高峰，以及指派質(zhì)量(M/Z)給接近質(zhì)量(M/Z)聚類中點的所有高峰。用于分析數(shù)據(jù)的軟件可包括一種程式，其將演算法運(yùn)用至信號分析以測定是否該信號代表與本發(fā)明生物標(biāo)志相符的信號高峰。軟件亦可提供關(guān)于所觀察之生物標(biāo)志高峰的數(shù)據(jù)至分類樹或ANN分析以測定生物標(biāo)志高峰或生物標(biāo)志高峰組合使否存在，顯示在檢驗下特定臨床參數(shù)的狀況。數(shù)據(jù)分析對各種直接或間接得自樣本質(zhì)譜分析的參數(shù)可能為「關(guān)鍵的」。這些參數(shù)包括，但不限于一個或多個高峰的存在或缺少、高峰的形狀或高峰群組、一個或多個高峰的高度、一個或多個高峰高度的對數(shù)值及其他高峰高度數(shù)據(jù)的計算操作。4.1.7.SELDI偵測乳腺癌生物標(biāo)志的一般程序偵測本發(fā)明的生物標(biāo)志的較佳程序如下?？芍苯邮┘訙y試的生物樣本，例如NAF于生物芯片而不需任何額外的操作。在冷凍干燥及透析移除多余鹽分后，可直接施用樣本例如，DLF于生物芯片。亦可分餾樣本例如，尺寸大小排除層析術(shù)、陰離子或陽離子交換層析術(shù)或其他分級方法。測試樣本之后與含有IMAC吸附劑的親和性捕捉探針(較佳為頂AC30-Cu蛋白質(zhì)芯片陣列(CiphergenBiosystems，Inc.))接觸，如表1所示。使用洗掉未結(jié)合分子又可以保留生物標(biāo)志的緩沖液洗滌探針。對每個生物標(biāo)志都適合的洗滌溶液為表l所示的緩沖液。以激光解析/電離質(zhì)譜測定法偵測生物標(biāo)志?；蛘撸艨傻帽孀R生物標(biāo)志的抗體例如，與a-防御素-l至3相關(guān)，可將抗體附著于探針表面如預(yù)先活化的PS10或PS20蛋白質(zhì)芯片陣列(CiphergenBiosystems，Inc.)。這些抗體可捕捉樣本中的生物標(biāo)志至探針表面。之后，可使用例如，激光解析/電離質(zhì)譜測定法偵測生物標(biāo)志。4.2.免疫檢定法偵測在另一種具體實施例中，可以免疫檢定法測量本發(fā)明之生物標(biāo)志。免疫檢定法需要生物特異性捕捉劑如，抗體以捕捉生物標(biāo)志?？贵w可由
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中已知的方法制造例如，以生物標(biāo)志使動物免疫?？赏ㄟ^生物標(biāo)志結(jié)合特征自樣本中單離生物標(biāo)志?；蛘撸粢阎鄤匐纳飿?biāo)志的胺基酸序列，可以
技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的方法合成多勝肽并用于產(chǎn)生抗體。本發(fā)明考量傳統(tǒng)免疫檢定法包括例如，夾心免疫檢定法包含ELISA或螢光免疫檢定法，以及其他酵素免疫檢定法。在SELDI免疫檢定法中，用于生物標(biāo)志的生物特異性捕捉劑附著于MS探針表面，例如，預(yù)先活化蛋白質(zhì)芯片陣列。之后透過此試劑在生物芯片上特異地捕捉生物標(biāo)志，以及以質(zhì)譜測定法偵測所捕捉的生物標(biāo)志。5.測定受試者乳腺癌狀況5.1.單一標(biāo)志本發(fā)明的生物標(biāo)志可用于診斷測試以評估受試者的乳腺癌狀況例如，診斷乳腺癌。術(shù)語「乳腺癌狀況」包括任何疾病可區(qū)別的表達(dá)形式，包括非疾病。例如，疾病狀況包括，但未限于疾病的存在或不存在(例如乳腺癌與非乳腺癌)、發(fā)展成疾病的風(fēng)險、疾病階段、疾病'進(jìn)程(例如，隨著時間疾病的發(fā)展或疾病緩解)及對疾病治療的有效程度或反應(yīng)?；跔顩r，可指示進(jìn)一步的步驟包括額外的診斷測試或治療步驟或療法。診斷測試正確預(yù)測狀況的能力通常為分析敏感性、分析特異性或在接受者作業(yè)特征("ROC")曲線下的面積。敏感性為試驗預(yù)測為陽性時真陽性的比例，而特異性為試驗預(yù)測為陰性時真陰性的比例。ROC曲線提供試驗敏感性為卜特異性的函數(shù)。在ROC面積下區(qū)域越大，試驗的預(yù)測值越有力。其他有用測量試驗效用為陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值。陽性預(yù)測值為當(dāng)試驗為陽性時，實際為陽性的比例。陰性預(yù)測值為當(dāng)試驗為陰性時，實際為陰性的比例。本發(fā)明的生物標(biāo)志在不同的乳腺癌狀況顯示統(tǒng)計學(xué)上的差異為至少p《0.05、pp《10一3、p《10—4或p《10—5。單獨(dú)或組合使用這些生物標(biāo)志的診斷測試顯示至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%及約100%的敏感性及特異性。表1所列的每個生物標(biāo)志在乳腺癌中有差異性地呈現(xiàn)，因而每個個別有助測定乳腺癌狀況。該方法涉及，首先，使用此處所述的方法例如以SELDI生物芯片捕捉，接著以質(zhì)譜測定法偵測測量受試者樣本中所選擇的生物標(biāo)志；其次，測量與區(qū)別陽性乳腺癌狀況與陰性乳腺癌狀況的診斷量或分界(cut-off)相比。診斷量代表高于或低于經(jīng)分類為患有特定乳腺癌狀況受試者的生物標(biāo)志測量值。例如，若在乳腺癌期間生物標(biāo)志與正常人相比為上調(diào)控，之后高于診斷分界的測量值提供乳腺癌的診斷結(jié)果?；蛘?，若在乳腺癌期間生物標(biāo)志為下調(diào)控，之后低于診斷分界的測量值提供乳腺癌的診斷結(jié)果。一般了解在
技術(shù)領(lǐng)域：
中，依據(jù)診斷者的喜好調(diào)整用于分析特定的診斷分界可提高診斷陣列的敏感性或特異性。特定診斷分界的測定通過，例如此處所做，測量來自患有不同乳腺癌狀況受試者，其統(tǒng)計學(xué)上顯著樣本量中的生物標(biāo)志量，以及繪出符合診斷者所需要程度之特異性與敏感性的分界。5.2.標(biāo)志組合當(dāng)個別的生物標(biāo)志均為有用的診斷生物標(biāo)志，已發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志組合比單一的生物標(biāo)志對特定的狀況可提供更好的預(yù)測值。特別是，樣本中多數(shù)個生物標(biāo)志偵測可提高測試的敏感性及/或特異性。至少兩種生物標(biāo)志的組合有時稱為「生物標(biāo)志圖譜」或「生物標(biāo)志指紋」。在某些情況下(例如，使用生物特異性試劑如，抗體偵測生物標(biāo)志時)，偵測a-防御素-1、2或3作為單一生物標(biāo)志，在此稱為「a-防御素」。在其他情況下，偵測a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段l及a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2作為單一生物標(biāo)志，在此稱為「ci-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段」。從10個NAF檢體獲得的高峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)(見下列實施例)作為選擇候選生物標(biāo)志的訓(xùn)練數(shù)據(jù)。由于所得質(zhì)譜個別可行性(憑目力檢查)，先實行非監(jiān)督式聚類分析(MATLAB)。觀察兩個聚類，一個由檢體C6、C14、N32、N33及N36所組成(群組A)。另一個由檢體Cll、C16、C26、N4及N15所組成(群組B)。接著在每個亞群使用ProPeak(3ZInformatics,Charleston,SC)實行監(jiān)督式聚類分析且選擇可有效地分別癌癥及非癌癥數(shù)據(jù)的生物標(biāo)志。ProPeak執(zhí)行統(tǒng)一最大分離性分析(UMSA)演算法之線性版，其為最先被報告用于微陣列數(shù)據(jù)分析16。ProPeak在SELDI蛋白質(zhì)陣列數(shù)據(jù)分析的運(yùn)用先前已有詳細(xì)描述7。簡言之，分析每個檢體且當(dāng)作一獨(dú)立點投射于三維組成空間，其中每個點的位置使用高峰密度數(shù)據(jù)以線性回歸來源復(fù)合指數(shù)測定。各個高峰的排列代表其對癌癥及非癌癥檢體最大分類的貢獻(xiàn)。在此例中，用目力檢查具有高區(qū)別力的高峰且選擇5個在癌癥中升高的高峰(在群組A中3個高峰，在群組B中2個高峰)做進(jìn)一歩評估。來自患有單側(cè)原位乳管癌患者的癌癥及非癌化乳房的一對組合DLF樣本測試潛在的生物標(biāo)志(在JohnsHopkinsHospital收集)。分別組合來自9個癌化乳房的ll個DLF樣本、7個非癌化乳房的13個DLF之等量蛋白質(zhì)以代表癌癥及非癌癥乳管。使用如分析NAF所述相同芯片程序在一獨(dú)立實驗中產(chǎn)生蛋白質(zhì)圖譜(profile)。5.3.乳腺癌狀況測定乳腺癌狀況典型涉及根據(jù)診斷測試結(jié)果將受試者分類為二種或更多種群組(狀況)中的一種。此處所述之診斷測試可用于在一些不同狀態(tài)的分類。5.3.1.疾病存在在一種具體實施例中，本發(fā)明提供測定受試者中乳腺癌存在與否的方法(狀況乳腺癌與非乳腺癌)。通過測量相關(guān)生物標(biāo)志決定乳腺癌存在與否，之后提交至分類演算法或與特定風(fēng)險程度相關(guān)的生物標(biāo)志參考量及/或模式比較。5.3.2.測定發(fā)展成疾病的風(fēng)險在一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種測定受試者中發(fā)展成疾病的風(fēng)險的方法。生物標(biāo)志量或模式為各種風(fēng)險狀態(tài)的特征例如高、中或低。由測量相關(guān)生物標(biāo)志決定發(fā)展成疾病的風(fēng)險，之后提交至分類演算法或與特定風(fēng)險程度相關(guān)的生物標(biāo)志參考量及/或模式比較。5.3.3.測定疾病階段在一種具體實施例中，本發(fā)明提供測定受試者中疾病階段的方法。疾病的每個階段具有特有量的生物標(biāo)志或一組生物標(biāo)志(一種模式)的相關(guān)量。測量相關(guān)生物標(biāo)志以決定疾病階段，之后提交至分類演算法或與特定階段相關(guān)的生物標(biāo)志參考量及/或模式比較。5.3.4.測定疾病演進(jìn)(發(fā)展/緩解)在一種具體實施例中，本發(fā)明提供測定受試者中疾病演進(jìn)的方法。疾病演進(jìn)意指隨著時間疾病狀況的變化，包括疾病進(jìn)程(更糟)及疾病緩解(改善)。生物標(biāo)志的量或相關(guān)量(例如模式)隨著時間變化。因此，這些標(biāo)志的趨勢隨著時間朝患病或不患病增加或減少顯示出疾病的演進(jìn)。因此，此方法涉及在至少兩個不同的時間點例如，第一次及第二次測量受試者中一種或多種生物標(biāo)志，以及若有任何量的變化比較之。根據(jù)這些比較決定疾病演進(jìn)。5.4.報告狀況本發(fā)明的附加具體實施例是關(guān)于將分析結(jié)果或診斷或兩者傳達(dá)給技術(shù)員、治療者或患者例例如，在某些具體實施例中，將使用電腦傳達(dá)分析結(jié)果或診斷或兩者給有興趣的一方例如治療者及其患者。在一些具體實施例中，實施分析或分析試驗結(jié)果的國家或管轄范圍不同于傳達(dá)結(jié)果或診斷的國家或管轄范圍。在一本發(fā)明較佳的具體實施例中，在獲得診斷結(jié)果后，盡快傳達(dá)測試受試者中關(guān)于任何此處所述的生物標(biāo)志存在與否的診斷結(jié)果給受試者。診斷結(jié)果可通過處理受試者的治療者傳達(dá)給受試者。或者，可通過電子郵件傳送診斷結(jié)果給測試受試者或以電話傳達(dá)給受試者?？墒褂秒娔X藉電子郵件或電話傳達(dá)診斷結(jié)果。在某些具體實施例中，使用電腦硬體及軟件組合可產(chǎn)生含有診斷測試結(jié)果的訊息且自動傳送給受試者，其對電信領(lǐng)域中熟諳技術(shù)人士而言為常見的。保健導(dǎo)向傳達(dá)系統(tǒng)的例子述于U.S.專利號6，283，761中；然而，本發(fā)明并不限于使用此特定傳達(dá)系統(tǒng)的方法。在本發(fā)明方法的某些具體實施例中，在不同的(例如國外)管轄范圍可實行全部或部分方法步驟，包括樣本的分析、疾病的診斷及分析結(jié)果或診斷的傳達(dá)。5.5.受試者處理在診斷乳腺癌狀況方法的某些具體實施例中，該方法進(jìn)一步包括根據(jù)狀況處理受試者治療。此類處理包括在測定乳腺癌狀況之后，治療者或臨床醫(yī)生采取的行動。例如，若治療者做出乳腺癌的診斷結(jié)果，之后可能接著某些處理療法，例如，處方或手術(shù)的實行、化學(xué)療法及/或放射治療。或者，對非乳腺癌的診斷結(jié)果或是非乳腺癌接著可能有進(jìn)一步的測試以測定患者可能遭受的特定疾病。同樣，若診斷測試對乳腺癌狀況為非決定性結(jié)果，可能需要進(jìn)一步的測試。本發(fā)明的附加具體實施例是關(guān)于將分析結(jié)果或診斷或兩者傳達(dá)給技術(shù)員、治療者或患者例例如，在某些具體實施例中，將使用電腦傳達(dá)分析結(jié)果或診斷或兩者給有興趣的一方例如治療者及其患者。在一些具體實施例中，實施分析或分析試驗結(jié)果的國家或管轄范圍不同于傳達(dá)結(jié)果或診斷的國家或管轄范圍。在一本發(fā)明較佳的具體實施例中，在獲得診斷結(jié)果后，盡快傳達(dá)測試受試者中關(guān)于任何表I所述生物標(biāo)志存在與否的診斷結(jié)果給受試者。診斷結(jié)果可通過受試者的處理治療者傳達(dá)給受試者?；蛘?，可通過電子郵件傳送診斷結(jié)果給測試受試者或以電話傳達(dá)給受試者?？墒褂秒娔X藉電子郵件或電話傳達(dá)診斷結(jié)果。在某些具體實施例中，使用電腦硬體及軟件組合可產(chǎn)生含有診斷測試結(jié)果的訊息且自動傳送給受試者，其對電信領(lǐng)域中熟諳技術(shù)人士而言為常見的。保健導(dǎo)向傳達(dá)系統(tǒng)的例子述于U.S.專利號6，283，761中；然而，本發(fā)明并不限于使用此特定傳達(dá)系統(tǒng)的方法。在本發(fā)明方法的某些具體實施例中，在不同的(例如國外)管轄范圍可實行全部或部分方法步驟，包括樣本的分析、疾病的診斷及分析結(jié)果或診斷的傳達(dá)。6.用于診斷乳腺癌狀況的分類演算法的產(chǎn)生在一些具體實施例中，使用樣本如「已知樣本」產(chǎn)生的光譜(例如質(zhì)譜或飛行時間式光譜)數(shù)據(jù)之后可用于「訓(xùn)練」分類模型?！敢阎獦颖尽篂橐严缺环诸愡^的樣本。來自光譜且用于形成分類模型的數(shù)據(jù)可指為「訓(xùn)練數(shù)據(jù)組」。一旦經(jīng)訓(xùn)練，分類模型可辨識使用未知樣本產(chǎn)生的光譜數(shù)據(jù)模式。分類模型之后可用于分類未知樣本。其有用于例如，預(yù)測特定生物樣本是否與某些生物情況有關(guān)(例如患病與不患病)。用于形成分類模型的訓(xùn)練數(shù)據(jù)組可包括原始數(shù)據(jù)或前處理數(shù)據(jù)。在一些具體實施例中，原始數(shù)據(jù)可直接從飛行時間式光譜或質(zhì)譜獲得，之后如上述可視需要經(jīng)「前處理」。使用任何適合的統(tǒng)計分類(或「學(xué)習(xí)」)方法形成分類模型，其意于根據(jù)數(shù)據(jù)中呈現(xiàn)的客觀參數(shù)分離數(shù)據(jù)成類。分類方法可為監(jiān)督式或非監(jiān)督式。監(jiān)督式及非監(jiān)督式分類過程的例子于Jain，"StatisticalPatternRecognition:AReview"，Z5Efi17ys/ssc亡70T751oz尸3tfe7y7爿zajy5^'sa/7t/i/ac力i/7e7/7Z"eJJige;7ce，Vol.22，No.1，January2000所述，其教示并入本文參考。在監(jiān)督式分類，呈現(xiàn)含有己知類別例子的訓(xùn)練數(shù)據(jù)至學(xué)習(xí)機(jī)構(gòu)，該學(xué)習(xí)機(jī)構(gòu)學(xué)習(xí)定義每個已知類別的一個或多個關(guān)系組。之后可能施用新數(shù)據(jù)于學(xué)習(xí)機(jī)構(gòu)，使用習(xí)得的關(guān)系分類新數(shù)據(jù)。監(jiān)督式分類處理的例子包括線性回歸處理(例如多元線性回歸(MLR)、偏最小二乘回歸(PLS)及主成分回歸(PCR))、二元決策樹(例如遞歸分區(qū)處理如CART-分類及回歸樹)、類神經(jīng)網(wǎng)路(artificialneuralnetwork)如倒傳遞網(wǎng)路(backpropagationnetwork)、鑒另U分析(discriminantanalysis)(例如貝氏分類器(Bayesianclassifier)或費(fèi)雪(Fischer)分析)、邏輯分類器及支援向量分類器(supportvectorclassifier)(支援向量機(jī))。較佳的監(jiān)督式分類方法為遞歸分區(qū)處理。遞歸分區(qū)處理使用遞歸分區(qū)樹分類未知樣本的光譜。關(guān)于遞歸分區(qū)處理的進(jìn)一步細(xì)節(jié)于U.S.專利申請?zhí)?0020138208Al，Paulses義"Methodforanalyzingmassspectra"提供。在其他具體實施例中，創(chuàng)造出的分類模型可使用非監(jiān)督式學(xué)習(xí)方法形成。非監(jiān)督式分類意為根據(jù)訓(xùn)練數(shù)據(jù)組中的相似性學(xué)習(xí)分類，而不預(yù)先分類訓(xùn)練數(shù)據(jù)組的光譜。非監(jiān)督式學(xué)習(xí)方法包括聚類分析。聚類分析意為劃分?jǐn)?shù)據(jù)為「聚類」或群組，該「聚類」或群組理想地具有彼此非常相似的組員且與其他聚類的組員相比非常不相似。之后使用一些距離公制測量相似性，該距離公制測量數(shù)據(jù)項目間的距離及聚類彼此較相近的數(shù)據(jù)項目。聚類技術(shù)包括MacQueen'sK平均值演算法及Kohonen's自組織映射(Self-OrganizingMap)演算法。宣稱用于分類生物資訊的學(xué)習(xí)演算法描述于例如，PCT國際公開號WO01/31580(Barnhill"s丄，"Methodsanddevicesforidentifyingpatternsinbiologicalsystemsandmethodsofusethereof")、美國專利申請?zhí)?0020193950A1(Gavin"s丄，"Methodoranalyzingmassspectra")、美國專利申請?zhí)?0030004402Al(Hitt<2丄，"Processfordiscriminatingbetweenbiologicalstatesbasedonhiddenpatternsfrombiologicaldata")及美國專利申請?zhí)?0030055615Al(ZhangandZhang,"Systemsandmethodsforprocessingbiologicalexpressiondata，，)?？稍谌魏芜m合的數(shù)字電腦形成及使用分類模型。適合數(shù)位電腦包括微電腦、微型電腦或大型電腦使用任何標(biāo)準(zhǔn)或特殊的操作系統(tǒng)如Unix、Windows或Linux為基礎(chǔ)的操作系統(tǒng)。所使用的數(shù)位電腦可實際上與用于創(chuàng)造有興趣的光譜之質(zhì)譜儀分開或可與質(zhì)譜儀結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明具體實施例的訓(xùn)練數(shù)據(jù)組及分類模型可經(jīng)由數(shù)位電腦所執(zhí)行或使用的電腦程式而體現(xiàn)。電腦程式可儲存在任何適合的電腦可讀式媒體包括光碟、磁碟、光學(xué)棒、磁棒、光學(xué)磁帶、磁帶等，且可以任何適合的電腦程式語言包括C、C++、visualbasic等寫成。上述之學(xué)習(xí)演算法有用于發(fā)展已發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志分類演算法或發(fā)現(xiàn)乳腺癌的新生物標(biāo)志。接著，通過提供使用單獨(dú)或組合的生物標(biāo)志的診斷值(例如分界點)使分類演算法形成診斷測試的基礎(chǔ)。7.物之組成在另一態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種根據(jù)本發(fā)明生物標(biāo)志物的組成。在一種具體實施例中，本發(fā)明提供純化型態(tài)的本發(fā)明的生物標(biāo)志。純化的生物標(biāo)志具有抗原作用以誘發(fā)抗體。純化的生物標(biāo)志亦具有在分析程序中當(dāng)作標(biāo)準(zhǔn)品的作用。如本文所用，「純化的生物標(biāo)志」為已從其他蛋白質(zhì)及勝肽、及/或發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志的生物樣本中之其他物質(zhì)所單離出來的生物標(biāo)志?？墒褂萌魏?br>技術(shù)領(lǐng)域：
中已知的方法純化生物標(biāo)志包括，但不限于機(jī)械分離(例如離心)、硫酸銨沉淀、透析(包括尺寸大小排除透析)、尺寸大小排除層析術(shù)、親和性層析術(shù)、陰離子交換層析術(shù)、陽離子交換層析術(shù)及金屬螯合層析術(shù)?？梢匀魏芜m合的方式例如，在層析管柱中或在生物芯片上實行此類方法。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種生物特異性捕捉劑特異地與本發(fā)明生物標(biāo)志結(jié)合，視需要為純化型態(tài)。較佳者，生物特異性捕捉劑為抗體。在一種具體實施例，生物特異性捕捉劑為與a-防御素-1、2及3結(jié)合的抗體。這些抗體能夠特異地與3個a-防御素中的任何一個結(jié)合，但不能區(qū)別它們。在另一個具體實施例中，生物特異性捕捉劑為可以區(qū)別三個a-防御素的抗體。此抗體很可能與生物標(biāo)志的N端結(jié)合，N端的胺基酸序列不同。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供一種生物特異性捕捉劑特異地與a-l-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1或a-l-抗胰蛋白酶抑制物C端片段2結(jié)合。此抗體能夠?qū)Ｒ坏嘏c兩個a-1-抗胰蛋白酶抑制物中任一個結(jié)合，但不能夠區(qū)別它們。在另一種具體實施例中，生物特異性捕捉劑為能夠區(qū)別兩個a-1-抗胰蛋白酶抑制物的抗體。此抗體很可能與生物標(biāo)志的N端結(jié)合，N端的胺基酸序列不同。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供介于本發(fā)明生物標(biāo)志與生物特異性捕捉劑之間的復(fù)合物，該復(fù)合物特異地與生物標(biāo)志結(jié)合。在其他具體實施例中，生物特異性捕捉劑與固相結(jié)合。例如，本發(fā)明考量含有衍出生物特異性捕捉劑的珠子或芯片的裝置與本發(fā)明之生物標(biāo)志結(jié)合，同樣，含有本發(fā)明之生物標(biāo)志的裝置與生物特異性捕捉劑結(jié)合。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供含有附著吸附劑例如層析吸附劑的固態(tài)基材的裝置，該吸附劑進(jìn)一步與本發(fā)明生物標(biāo)志結(jié)合。8.偵測乳腺癌生物標(biāo)志的試劑盒在另一態(tài)樣中，本發(fā)明提供一種診斷乳腺癌狀況的試劑盒，根據(jù)本發(fā)明使用試劑盒偵測生物標(biāo)志。在一種具體實施例中，試劑盒包括固相載體如芯片、微量滴定盤或珠子或具有捕捉劑附著于其上的樹脂，其中，該捕捉劑與本發(fā)明生物標(biāo)志結(jié)合。因此，例如，本發(fā)明試劑盒可包括用于SELDI的質(zhì)譜測定探針如ProteinChip"陣列。生物特異性捕捉劑的例子中，試劑盒可包括有反應(yīng)表面的固相載體及含有生物特異性捕捉劑的容器。試劑盒亦可包括洗滌溶液或制造洗漆溶液的說明書，其中，捕捉劑與洗滌溶液的組合允許將固相載體上所捕捉的生物標(biāo)志用于之后得偵測，通過例如質(zhì)譜測定法偵測。試劑盒可包括一種以上的吸附劑，每個呈現(xiàn)在不同的固相載體上。在一進(jìn)一步的具體實施例中，此試劑盒可包括以標(biāo)簽或分開的插頁之型態(tài)說明適合的操作參數(shù)的說明書。例如，說明書可通知消費(fèi)者關(guān)于如何收集樣本、如何洗滌探針或所偵測的特定生物標(biāo)志。在另一種具體實施例中，試劑盒可包括一個或多個含有生物標(biāo)志樣本的容器，作為校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)物。9.測定醫(yī)藥的治療功效在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供測定醫(yī)藥治療功效的方法。這些方法有用于執(zhí)行藥物臨床試驗上及監(jiān)控患者對藥物的發(fā)展。治療或臨床試驗包括在特定療程投予藥物。該療程可包括單一藥物劑量或隨著時間多種藥物劑量。醫(yī)生或臨床研究員隨著投予的演進(jìn)監(jiān)控在患者或受試者的藥物效果。若藥物對癥狀有醫(yī)藥影響，本發(fā)明的生物標(biāo)志量或相關(guān)量(例如模式或量變曲線)往非疾病量變曲線改變。例如，生物標(biāo)志a-防御素-l至3隨著疾病而升高。因而，在治療演進(jìn)期間，可追蹤受試者內(nèi)此類生物標(biāo)志量的演進(jìn)。因此，此方法涉及測量接受藥物治療的受試者中一種或多種生物標(biāo)志并將生物標(biāo)志量與受試者的疾病狀況相關(guān)聯(lián)。此方法的一個具體實施例涉及在藥物治療演進(jìn)中至少兩個不同時間點例如第一次與第二次測定生物標(biāo)志濃度，若有改變，則比較生物標(biāo)志量的變化。例如?？稍谒幬锿队枨昂蠡蛩幬锿队杵陂g兩個不同時間點測量生物標(biāo)志。根據(jù)這些比較決定治療的效果。若治療有效，生物標(biāo)志將趨于正常，而若治療無效，則生物標(biāo)志將趨向疾病征兆。根據(jù)這些比較決定治療的效果。若治療有效，生物標(biāo)志將趨于正常，而若治療無效，則生物標(biāo)志將趨向疾病征兆。10.乳腺癌生物標(biāo)志使用于篩選分析及治療乳腺癌的方法本發(fā)明之方法亦具有其他應(yīng)用。例如，可使用生物標(biāo)志篩選活體外或活體內(nèi)調(diào)節(jié)生物標(biāo)志表達(dá)的化合物，其中該化合物在治療或預(yù)防患者乳腺癌可能有用。在另一實施例中，可使用生物標(biāo)志監(jiān)控對乳腺癌治療的反應(yīng)。在再另一實施例中，可使用生物標(biāo)志于遺傳研究中以測定受試者是否有發(fā)展乳腺癌的風(fēng)險。因此，例如，本發(fā)明的試劑盒可包括含有金屬親和性捕捉作用(如蛋白質(zhì)生物芯片(例如CiphergenIMAC蛋白質(zhì)芯片陣列，亦即ProteniChip陣列))或生物特異親和性捕捉作用(如，含有對cx-防御素-1至3或a-1-抗胰蛋白酶抑制物C端片段的抗體之蛋白質(zhì)生物芯片)的固相基材及用于洗滌基材的PBS緩沖液，以及提供在芯片上測量本發(fā)明的生物標(biāo)志的程序以及使用這些測量診斷乳腺癌的說明書。一開始可通過辨識與表1所列的一種或多種生物標(biāo)志相互作用的化合物來篩選適于治療測試的化合物。經(jīng)由實施例，篩選可能包括重組表達(dá)表1所列的生物標(biāo)志、純化生物標(biāo)志及固定生物標(biāo)志在基材上。之后典型為在水性環(huán)境中測試化合物與基材接觸且測量測試化合物與生物標(biāo)志之間的互動，例如通過將測量洗提率作為鹽濃度的函數(shù)。某些蛋白質(zhì)可辨識及分裂表l中之一種或多種生物標(biāo)志，在這樣的情況下，可通過在標(biāo)準(zhǔn)分析例如，蛋白質(zhì)凝膠電泳中監(jiān)測一種或多種生物標(biāo)志的分解來偵測蛋白質(zhì)。在一相關(guān)的具體實施例中，可測量測試化合物抑制表1中一種或多種生物標(biāo)志活性的能力。
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟諳技藝人士將了解依照生物標(biāo)志的作用與特性，用來測量特定生物標(biāo)志活性的技術(shù)各異。例如，可分析生物標(biāo)志的酵素活性，前提為可獲得適當(dāng)?shù)幕囊约盎臐舛然蚍磻?yīng)產(chǎn)物的出現(xiàn)容易測量。潛在治療測試化合物抑制或增強(qiáng)所給生物標(biāo)志活性的能力可經(jīng)由測量測試化合物存在或不存在時的催化率測定。亦可測量測試化合物干擾表1生物標(biāo)志其中之一的非酵素性(例如結(jié)構(gòu))作用或活性。例如，可經(jīng)由光譜學(xué)監(jiān)測測試化合物存在或不存在時含有表l生物標(biāo)志其中之一的多重蛋白復(fù)合體自我組裝?；蛘?，若生物標(biāo)志為轉(zhuǎn)錄非酵素性增強(qiáng)子，通過測量測試化合物存在或不存在時，活體內(nèi)或活體外生物標(biāo)志依賴轉(zhuǎn)錄的程度可辨識干擾生物標(biāo)志提高轉(zhuǎn)錄能力的測試化合物?？赏队枘軌蛘{(diào)節(jié)表1中任一生物標(biāo)志活性的測試化合物至受苦于乳腺癌或其他癌癥的患者或有發(fā)展成乳腺癌或其他癌癥風(fēng)險的患者。例如，若特定生物標(biāo)志活體內(nèi)的活性為避免乳腺癌蛋白質(zhì)的累積，則投予增加特定生物標(biāo)志活性的測試化合物可降低患者患上乳腺癌的風(fēng)險。反之，若增強(qiáng)的生物標(biāo)志活性是乳腺癌起始的原因(至少為部分原因)，投予降低特定生物標(biāo)志活性的測試化合物可降低患者患上乳腺癌的風(fēng)險。在一附加的態(tài)樣中，本發(fā)明提供辨識有用于治療疾病例如，乳腺癌之化合物的方法，其中該疾病與a-防御素-l至3及/或C1-1-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2的修飾后型態(tài)增加的濃度有關(guān)。例如，在一種具體實施例中，可篩選細(xì)胞萃取物或表達(dá)基因庫(expressionlibrary)尋找催化裂解全長a-防御素-l至3或a-l-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2以分別形成截斷的a-防御素-l至3或a-1-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2的化合物。在一此類篩選分析的具體實施例中，通過將螢光團(tuán)附著至a-防御素-l至3或a-l-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2，可偵測a-防御素-1至3或a-1-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2的裂解，當(dāng)a-防御素-l至3或a-l-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2未被裂解時，螢光團(tuán)維持不發(fā)光，而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被裂解，則螢光團(tuán)發(fā)出螢光?；蛘?，使得胺基酸x與y之間的醯胺鍵不可裂解之修飾后全長a-防御素-l至3或a-l-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2的變體可被用來選擇性地結(jié)合或「捕捉」活體內(nèi)該位置裂解全長a-防御素-1至3或a-l-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2的細(xì)胞蛋白酶。篩選及辨識蛋白酶及其目標(biāo)的方法于科學(xué)文獻(xiàn)中有詳細(xì)記載，例如，在Lopez-Ottineta丄(NatureReviews:3:509-519(2002))中。在另一種具體實施例中，本發(fā)明提供治療或降低疾病例例如，乳腺癌發(fā)展或可能性的方法，該疾病與截斷的a-防御素-l至3及/或a-l-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2的增加濃度有關(guān)。例如，在已辨識出一種或多種蛋白質(zhì)裂解全長a-防御素-l至3或d-l-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2后，可篩選組合化學(xué)庫尋找抑制已辨識蛋白質(zhì)裂解活性的化合物。篩選此類化合物化學(xué)庫的方法在
技術(shù)領(lǐng)域：
中為已知。見例如L叩ez-0tinda丄(2002)。或者，可根據(jù)a—防御素-1至3及a-l-抗胰蛋白酶抑制物C端片段1及/或2的結(jié)構(gòu)聰明地設(shè)計出抑制化合物。在臨床階段，篩選測試化合物包括在受試者暴露于測試化合物前后，從測試受試者中獲得樣本?？蓽y量及分析樣本中表l所列的一種或多種生物標(biāo)志的濃度以測定在暴露于測試化合物之后，生物標(biāo)志濃度是否變化?？扇绫疚乃鲇觅|(zhì)譜測定法分析樣本，或者，可以任何
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中熟諳技藝人士已知適當(dāng)?shù)姆椒ǚ治鰳颖尽＠?，可直接以西方墨點法(Westernblot)使用特異結(jié)合至生物標(biāo)志的放射線標(biāo)記抗體或螢光標(biāo)記抗體測量表1所列之一種或多種生物標(biāo)志濃度?；蛘撸蓽y量編碼一種或多種生物標(biāo)志的威NA濃度的變化，并將變化與投予至受試者的所給測試化合物并置使顯出相互關(guān)系。在一進(jìn)一步的具體實施例中，可使用活體外方法及材料測量一種或多種生物標(biāo)志表達(dá)程度的變化。例如，可將表達(dá)或能夠表達(dá)表l之一種或多種生物標(biāo)志的人類組織培養(yǎng)細(xì)胞與測試化合物接觸。將例行檢査已經(jīng)測試化合物治療的受試者中任何可能因為治療導(dǎo)致的生理影響。特別是，將評估測試化合物降低受試者患病可能性的能力?；蛘撸敉队铚y試化合物至先前已經(jīng)診斷為乳腺癌的受試者，將篩選測試化合物減緩或停止疾病發(fā)展的能力。11.實施例11.1.實施例1.發(fā)現(xiàn)乳腺癌生物標(biāo)志一般了解本文所述實施例及具體實施例僅用于說明目的，且對
技術(shù)領(lǐng)域：
中熟諳技藝人士來說，按照該些實施例的各種修飾或變化也視為已由本案所建議并包括在本發(fā)明的精神與范圍及附加的權(quán)利要求范疇中。為了所有的目的，本文所引用的所有出版物、專利及專利申請案并入本文參考。11.2.實施例2.材料級方法s11.2.1.多中心(multi-center)研究設(shè)計為最小化各機(jī)構(gòu)在患者選擇及液體收集程序上潛在的偏差，以及為了最大化本發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用性，我們從3個機(jī)構(gòu)UniversityofTexasM.D.AndersonCancerCenter;JohnsHopkinsHospital中的SidneyKi醒elComprehensiveCancerCenter;以及DepartmentofSurgery.FeinbergSchoolofMedicine,NorthwesternUniversity征募乳吸引術(shù)及乳管灌洗兩種液體樣本。在每個地點的樣本收集經(jīng)各自的InstitutionalReviewBoardeach認(rèn)可，及目前的蛋白質(zhì)體研究經(jīng)JohnsHopkinsUniversity的InstitutionalReviewBoard認(rèn)可。11.2.2.患者一乳頭吸引液體(NAF)從UniversityofTexasM.D.AndersonCancerCenter獲得NAF樣本。適于雙側(cè)乳頭吸引術(shù)的患者為經(jīng)切片檢查法證實為第I期或第II期單側(cè)原發(fā)侵襲性乳腺癌者。若患者先前已經(jīng)歷過乳暈下手術(shù)可能中斷末端乳管系統(tǒng)，這樣的患者被排除。若受試者為年過40歲且經(jīng)身體檢查和乳房造影正常發(fā)現(xiàn)證實無乳房疾病或癌癥的跡象同樣適合參與。此次研究中獲得10個液體樣本，5個來自乳腺癌患者的癌化乳房，而其他5個來自健康捐贈者的乳房。11.2.3.收集程序一乳頭吸引液體(NAF)以乳頭吸引術(shù)使用類似于動力式擠乳幫浦的手提式吸杯收集乳管液體，該動力式擠乳幫浦用于從泌乳女性擠壓出乳汁。此設(shè)備由塑膠杯連接到聚合物管子部分而組成。管子附著至標(biāo)準(zhǔn)注射器用以創(chuàng)造緩和的真空。此設(shè)備原先是在Sartoriuse"丄(Sartorius，0.W.e力s丄(1977)J.Natl.CancerInst.59:1073-1080)使用及敘述，且從ProductHealth,Inc.(MenloPark,CA)購買，以用于收集NAF。在吸弓1之前，以少量的0mnipr印膠(D.0.Weaver及Co.，Aurora,C0)清潔乳頭以移除角質(zhì)拴塞，之后以酒精棉清潔。取少量的乳液置于乳房上且從胸腔壁往乳頭溫和按摩乳房1分鐘。將吸杯置于乳頭且拉開注射器活塞到5至10mL的程度直到看見乳管液體。收集液滴到10PL刻度微量吸移管(DrummondScientificCo.，Broomall，PA)。從兩個乳房獲得樣本，且為每位患者及每個乳房紀(jì)錄NAF的出現(xiàn)及所得收集過后立刻將NAF樣本潤洗到含有500u1無菌磷酸鹽緩沖食鹽水的離心管，該無菌磷酸鹽緩沖食鹽水補(bǔ)充有蛋白酶抑制物AEBSF(4-[2-胺基乙基]-苯磺醯基氟化物HCl;0.2mM)、亮肽素(leup印tin)(50g/mL)、牛蛋白(aprotinin)(2g/mL)及二硫蘇糖醇(DTT，0.5mM)。之后以1500RPM離心樣本10分鐘以移除不溶物質(zhì)且以50ul分裝收集上清液。11.2.4.患者一乳管灌洗液體(DLF)兩個機(jī)構(gòu)貢獻(xiàn)DLF樣本給本研究。在約翰霍普金斯醫(yī)院的SPORE捐贈臨床試驗中，切片檢査法證實第I或II期單側(cè)原發(fā)性乳腺癌的女性在手術(shù)前適合乳房液體收集。分別從患者的患癌乳房及對側(cè)「正?！谷榉恐惺占?至3個乳管的DLF。研究當(dāng)時，獲得42個檢體，25個來自9個患癌癥的乳房，17個來自7個對側(cè)乳房，且這些檢體來自共14名患者。在西北醫(yī)院的分開試驗中，招募因5年蓋爾危險率預(yù)估量大于1.6%、1個一等親或2個二等親患有乳腺癌或有LCIS病史的危險性增加女性做黛莫芬(tamoxifen)治療。這些女性在進(jìn)入時經(jīng)歷DL，決定是否服用黛莫芬預(yù)防乳腺癌，且之后經(jīng)重復(fù)的DL6至12個月。此次試驗從選擇不服用黛莫芬的13個高危險群女性獲得42個DLF檢體。11.2.5.收集程序一乳管灌洗液體(DLF)先實行乳頭吸引術(shù)以辨識出生產(chǎn)液體乳管(FYD)。若可見乳頭液體，以單管腔微導(dǎo)管插管FYD且以生理食鹽水灌洗。插管之前，可以乳暈周邊滲透約5mL1%木卡因(lidocaine)補(bǔ)充麻醉，通常乳管樹的麻醉為一旦將導(dǎo)管的尖端插入乳管口，經(jīng)乳頭腺管括約肌徐徐滴入2至3mL的1%木卡因。在慢慢灌輸大約2mL的食鹽水后，實行間歇乳房按摩且重復(fù)此過程四至五次，以致于總灌輸量為約10至20mL。在8x8的格子記錄生產(chǎn)液體及經(jīng)乳管插管位置，且在插入伯羅倫(prolene)縫線后照相以協(xié)助日后在西北試驗中再插管。收集過后立刻將樣本以1500RPM離心10分鐘以移除不溶物質(zhì)，且收集上清液作為接下來蛋白質(zhì)體分析。11.2.6.蛋白質(zhì)體分析的樣本準(zhǔn)備收集過后將所有樣本儲存在-80。C且將冷凍分裝，然后于干冰上運(yùn)送約翰霍普金斯。所收到的NAF檢體不需要進(jìn)一步的處理，反之，先將DLF冷凍干燥，之后使用帶有1kDa分子量阻斷的Tube-O-Dialyzer(Upstate,NY)以磷酸鹽緩沖食鹽水透析DLF—整夜以移除過多鹽分。使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒(Pierce,Rockford，IL)測量每個液體中的蛋白質(zhì)濃度。11.2.7.SELDI分析一開始評估各種蛋白質(zhì)體芯片的在蛋白質(zhì)的數(shù)目及解析度方面的化學(xué)性質(zhì)(疏水性、陰離子、陽離子及金屬親和性)以測定哪一個親和化學(xué)性質(zhì)提供最佳的圖譜。選擇固定化金屬親和性捕捉芯片陣列(IMAC30)。IMAC30上的活性位置含有氨基三乙酸基團(tuán)螯合金屬離子。蛋白質(zhì)透過組胺酸、色胺酸、半胱胺酸或磷酸化胺基酸結(jié)合至IMAC30陣列上的螯化金屬。為提供最佳的蛋白質(zhì)表達(dá)，亦測試每次分析所需的最低液體蛋白質(zhì)，及結(jié)合與洗滌條件。簡言之，根據(jù)制造說明書(CiphergenBiosystems，CA)，將皿C30芯片陣列使用96孔式的生物處理器(維持12x8點芯片)以CuS04前處理。在Cu2+并到芯片表面后，拆開生物處理器蛋白質(zhì)乳房液體樣本至經(jīng)前處理的點且使其在室溫下風(fēng)干。隨機(jī)分配檢體至蛋白質(zhì)芯片陣列，包括相同樣本的三重復(fù)。施加樣本后，將生物處理器再組合且以100ml的PBS洗滌5分鐘2次，接著以100ml的dH20快速潤洗兩次以移除結(jié)合不緊密的物質(zhì)。風(fēng)干之后，制備0.5ml的飽和芥子酸(SPA)于50%乙腈，施加0.5%三氟乙酸二次至各點作為能量吸收分子。使用PBS-II蛋白質(zhì)芯片讀數(shù)器(PrtoteinChipReader)(CiphergenBiosystems，CA)偵測結(jié)合至芯片表面的蛋白質(zhì)。使用自動分析程序控制數(shù)據(jù)取得過程。每個光譜為80次激光射擊平均值，且以已知的勝肽或蛋白質(zhì)混合物做外部校準(zhǔn)。分子量測定誤差為0.05%。11.2.8.數(shù)據(jù)分析用于此次研究的數(shù)據(jù)分析過程涉及下列歩驟(a)高峰偵測。使用蛋白質(zhì)芯片軟件3.0(CiphergenBiosystems,CA)收集及評估原始光譜。收集所有質(zhì)譜且減去基準(zhǔn)線。手動選擇帶有信號/雜訊>5的合格質(zhì)量高峰(目測檢驗)且將高峰強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化為所選擇質(zhì)量區(qū)域的總離子流。在此案，其介于3kDa及135kDa。將在三重復(fù)分析中所辨識的每個M/Z之高峰強(qiáng)度的平均，之后轉(zhuǎn)換成對數(shù)用于接下來的分'析。(b)使用訓(xùn)練數(shù)據(jù)選擇生物標(biāo)志。我們己使用來自IO個NAF檢體所獲得之高峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)作為選擇候選生物標(biāo)志的訓(xùn)練數(shù)據(jù)。因所獲得的質(zhì)譜之受試者變化性(目測檢查)，先實行非監(jiān)督式聚類分析(MATLAB)，根據(jù)一般蛋白質(zhì)表達(dá)模式識別任何潛在患者子群。觀察兩個聚類，一個由檢體C6、C14、N32、N33及N36(群組A)所組成。另一個由檢體Cll、C16、C26、N4及N15(群組B)所組成。之后在每個亞群使用ProPeak(3ZInformatics,Charleston,SC)實行監(jiān)督式聚類分析，且選擇可有效地區(qū)分癌癥與非癌癥數(shù)據(jù)的生物標(biāo)志。ProPeak執(zhí)行統(tǒng)一最大分離性分析(UMSA)演算法的線性版，該技術(shù)最先被報告用于微陣列數(shù)據(jù)分析(Zhang,Z.s丄In:LinSMandJohnsonKF(eds.)，MethodsofMicroarraydataanalysis:papersfromCAMDA'00.Boston:KluwerAcademicPublishers;2001.p.125-136)。應(yīng)用ProPeak于SELDI蛋白質(zhì)陣列數(shù)據(jù)分析已于先前報導(dǎo)中詳細(xì)描述(Li，J."s丄(2002)Clin.Chem.48:1296-1304)。簡言之，分析每個檢體且當(dāng)作一獨(dú)立點投射于三維組成空間，其中每個點的位置使用高峰密度數(shù)據(jù)以線性回歸來源復(fù)合指數(shù)測定。各個高峰的排列代表其對癌癥及非癌癥檢體最大分類的貢獻(xiàn)。在此案中，我們用目力檢査有高區(qū)別力的高峰且選擇5個在癌癥中升高的高峰(在群組A中3個高峰，在群組B中2個高峰)做進(jìn)一步評估。(c)使用獨(dú)立測試數(shù)據(jù)確認(rèn)生物標(biāo)志。在來自約翰霍普金斯醫(yī)院所收集的DLF檢體中測試潛在生物標(biāo)志的效力。此研究所獲得的42個1mLDLF分裝中，24個產(chǎn)生超過接下來的SELDI分析所需的3Pg蛋白質(zhì)。等量組合分別來自9個癌化乳房的ll個DLF、7個非癌化乳房的13個DLF的蛋白質(zhì)以表示癌癥及非癌癥乳房。在獨(dú)立實驗中，使用如分析NAF所述之相同芯片程序產(chǎn)生組合檢體的蛋白質(zhì)圖譜。11.2.9.SELDI-T0F-MS免疫捕捉BF1至3使用對抗與人類HNP1、2及3(Alphadiagnostics,SanAntonio,TX)共有的16-aa勝肽之親和性純化兔子抗體實行免疫捕捉。遵照制造說明書，使用AminoLinkPlusImmobilizationKit(Pierce,Rockford，IL)將抗體連接至AminoLink珠子。于捕捉實驗中使用帶有高度BF1至3(C4與C14)的2個NAF檢體，且如前所述，在IMAC-Cu蛋白質(zhì)芯片陣列上分析所捕捉的勝肽。11.2.10.用ELISA定量測量HNP1至3使用夾心固相酵素連結(jié)免疫吸附分析(ELISA)測量HNP1至3的濃度。該試齊IJ盒為HyCuItBiotechnology的產(chǎn)品，由Netherlands,CellSciences,Canton,MA.銷售。將每個樣本稀釋(實行前實驗測定每個樣本適當(dāng)?shù)南♂屜禂?shù))及二重復(fù)測量。11.3.實施例3.結(jié)果11.3.1.乳房液體的蛋白質(zhì)體圖譜使用我們最佳化的芯片程序及含有1Pg全蛋白質(zhì)的乳房液體樣本能夠獲得具再現(xiàn)性的蛋白質(zhì)圖譜。圖l顯示來自5個原發(fā)侵襲性癌癥患者的癌化乳房(C6、Cll、C14、C16、C26)及5個正常控制組的乳房(N4、N15、N32、N33、N36)之乳頭吸引液體的蛋白質(zhì)圖譜假擬膠圖。不同受試者的一般蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜各異，反之相同檢體的三重復(fù)分析質(zhì)譜具有高度再現(xiàn)性。小于3000的M/Z(質(zhì)量/電荷)離子信號主要為基質(zhì)物質(zhì)的雜訊，且在135，000偵測到最大的M/Z。我們已手動選擇73個蛋白質(zhì)高峰(信號/雜訊>5，3K至135K的M/Z)作為接下來生物標(biāo)志評估。11.3.2.使用訓(xùn)練數(shù)據(jù)選擇生物標(biāo)志使用IO個NAF檢體作為訓(xùn)練樣本。首先，我們實行非監(jiān)督式聚類分析，根據(jù)其蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)辨別任何潛在患者子群。形成二個聚類，聚類A由檢體C6、C14、N32、N33及N36所組成及聚類B由檢體Cll、C16、C26、N4及N15所組成(圖2)。這些檢體全部都在標(biāo)準(zhǔn)化程序下，于2001年的4個月內(nèi)的不同天收集，且兩個亞群之間未觀察到明顯的年紀(jì)不同、更年期狀況。選擇在各亞群中有區(qū)別力的生物標(biāo)志，接著使用ProPeak實行監(jiān)督式分析。根據(jù)生物標(biāo)志在各群組中對癌癥及非癌癥檢體最大分類的貢獻(xiàn)排列高峰我們選擇5個具有最高區(qū)別力的高峰(在群組A中3個，在群組B中2個)做進(jìn)一步評估。5個所選高峰的M/Z值為3375(BF1)、3447(BF2)、3490(BF3)、4079(BF4)及4680(BF5)(于圖2箭頭所示者)。BFl至3顯示為3個高峰的聚類且在C6及C14升高，被選為群組A中最有效的辨別者。BF4在C11及C16升高，而BF5在C26升高。這2個標(biāo)志在群組B中可共同地區(qū)別癌癥與非癌癥檢體。整體來說，需要最低限度3個高峰(BF1/2/3、BF4及BF5)來正確分類全部5種癌癥病例。11.3.3.使用獨(dú)立測試數(shù)據(jù)確認(rèn)生物標(biāo)志從約翰霍普金斯醫(yī)院收集的樣本的一對經(jīng)組合DLF檢體測試確認(rèn)BF1至5。獲得的42個1mlDLF分裝中，24個產(chǎn)生超過接下來的SELDI分析所需的3ug蛋白質(zhì)。這些24個樣本包括來自9個患癌癥乳房的11個DLF、7個對側(cè)非癌癥乳房的13個DLF。因為每個癌化乳房只有1個乳管棲息腫瘤且并未采樣所有乳管，癌化乳房的液體生產(chǎn)乳管可能不必然包括帶有腫瘤的乳管。一開始，計畫使用細(xì)胞學(xué)作為辨識癌癥乳管的黃金指標(biāo)，但失敗，因為大多數(shù)樣本(33/42)缺乏細(xì)胞(〈10個細(xì)胞)。為增加獲得癌癥及非癌癥乳管真陽性及真陰性檢體代表的機(jī)率，分別等量組合9個癌化乳房(DLF-C)之全部11個乳管及7個非癌化乳房(DLF-N)之13個乳管的蛋白質(zhì)，創(chuàng)造出一對組合DLF檢體。如圖2C所示，組合DLF樣本的一般蛋白質(zhì)表達(dá)模式類似群組A的NAF，且與非癌癥控制組比較，確認(rèn)在癌癥中BF1至3及BF5的上升。應(yīng)注意先前在群組A或B中都觀察到BF1至3及BF5的上升，組合DLF樣本因此呈現(xiàn)兩個亞群的特征。在組合DLF檢體中，不見相對應(yīng)于BF4的高峰，此標(biāo)志的效力因而仍未經(jīng)證實。經(jīng)確認(rèn)，BF1至3為人類中性粒細(xì)胞多肽1至3(HNP1至3)。通過搜尋蛋白質(zhì)資茅斗庫(NationalCenterforBiotechnolgyInformationandSwiss-Prot，兩者于網(wǎng)路上均可獲得)，我們發(fā)現(xiàn)BF1至3的分子量3375(BF1)、3447(BF2)及3490(BF3)與人類中性粒細(xì)胞多肽1至3(HNP1至3)的分子量相符。雖然一些腫瘤亦可產(chǎn)生相同能力的HNP1至a然HNP1至3主要為由人類嗜中性白血球制造的勝肽抗生素。HNP1至3除了在天生的抗微生物免疫力中所具有的作用活性不同的，最近的研究亦已暗示著其在腫瘤細(xì)胞增殖上的影響。使用對抗HNP1至3的單株抗體而經(jīng)由SELDI-T0F-MS免疫捕捉證實BF1至3的身份為HNP1至3。將抗體胺基連結(jié)至珠子，并與2個帶有高度BF1至3高峰的NAF檢體(NAF-C6及NAF-C14)培養(yǎng)。NAF-C6及C14的原始質(zhì)譜以及從2個樣本中各自所捕捉之蛋白質(zhì)的光譜如圖3所示。3個勝肽經(jīng)抗體捕捉且顯示出與BFl至3完全相同的分子量及表達(dá)模式(注意在NAF-C14中，BF3的相對強(qiáng)度與BF1及2有關(guān))。用定量免疫檢定法測量HNP1至3的濃度證實SELDI的發(fā)現(xiàn)。以ELISA定量分析HNP1至3進(jìn)一步確認(rèn)在NAFC4及C14中HNP1至3的上升。BFl至3的高度高峰振幅關(guān)聯(lián)于ELISA所測得的高濃度HNPl至3(圖4)。在C6中，HNP的濃度為11905ng/ml、C14為8816ng/ml;比正?？刂平M的平均值172ng/ml(范圍19至643ng/ml)高出50倍以上。為研究在乳房液體中升高的HNP濃度是否是因為血液污染，亦測量商業(yè)組合標(biāo)準(zhǔn)血清樣本以及4位外觀上健康的女性、4位患有良性乳房疾病的女性、4位患有原位乳管癌及4位患有侵襲性乳腺癌女性的20個儲存血清樣本中之HNP1至3。在組合(pooled)商業(yè)血清中的HNP1至3濃度經(jīng)測定為41ng/ml(數(shù)值繪圖于圖4)。在儲存血清中的HNP范圍為11ng/ml至456ng/ml且平均值為44ng/ml。不管癌癥/非癌癥狀況，血清中相對低濃度的麗P顯示這些液體樣本中HNP的來源不可能是因為血液污染。來自乳腺癌高危險群女性的DLF中之HNP1至3濃度。以ELISA在來自13個乳腺癌高危險群女性的42個DLF檢體(在6至12個月間隔重復(fù)雙側(cè)乳房灌洗，在西北大學(xué)收集)中進(jìn)一步測試HNP1至3對乳腺癌的特異性。只在一位女性(患者11)中觀察到HNP1至3的上升，反之來自其他12位女性的所有36個樣本經(jīng)測試為陰性(圖五A)。在相距8個月的2個時間點，收集來自患者11左乳房2個乳管及右乳房1個乳管總共6個液體樣本。在第一個時間點所有3個乳管中及在第二個時間點2個乳管中觀察到高濃度的HNP1至3(圖5A)。根據(jù)此患者的細(xì)胞學(xué)及組織學(xué)數(shù)據(jù)，未偵測到癌癥。為剔除測量HNP1至3上蛋白質(zhì)產(chǎn)量的可能影響，亦在圖5B繪制每個樣本中相對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度。未觀察到HNP1至3濃度與蛋白質(zhì)產(chǎn)量之間的關(guān)聯(lián)性，低量HNP的表達(dá)并不是因為樣本中缺乏蛋白質(zhì)。11.4.實施例4完成每個標(biāo)準(zhǔn)程序的NAF樣本收集。在每個類型中的樣本數(shù)目總結(jié)于表2。表2:雙側(cè)NAF收集患者數(shù)目NAF數(shù)目(N)第i期/n期侵襲性癌癥28成對NAF(22*2)未成對末癌化(3)未成對非末癌化(3)原位4成對NAF(2*2)未成對末癌化(l)未成對非末癌化(l)ADH5成對NAF(3氺2)未成對ADH(3)未成對ADH控制組(l)控制組33成對NAF(2C^2)未成對(13)總數(shù)70117獲得來自西北大學(xué)的乳管灌洗檢體。這群組由收集自58位乳腺癌高危險群女性(5年蓋爾危險率〉1.6或先前有小葉癌病史)的149個雙側(cè)乳管灌洗檢體所組成。11.4.1.蛋白質(zhì)體圖譜于蛋白質(zhì)芯片陣列上實施三重復(fù)的所有NAF樣本的蛋白質(zhì)體圖譜。在目前的數(shù)據(jù)中偵測到先前已辨識的2個潛在生物標(biāo)志(HNP1至3及BF5,圖6)并分別以高峰強(qiáng)度(BF-5，圖7)及ELISA(HNP1至3，圖8)評估其表達(dá)程度。11.4.2.HNP1至3的表達(dá)在高危險群中觀察到HNP1至3的表達(dá)升高，其與先前在癌癥病例上的觀察相比較呈現(xiàn)較顯著的程度。11.4.3.辨識BF5分離含有BF5的單一膠體條紋。將從膠體洗提出來的物質(zhì)送到JohnsHopkinsCoreFacility(故勝肽指紋法(fingerprinting)及勝肽定序。BF5經(jīng)辨識為a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段(AAT)。單一條紋含有2個C端片段被命名為BF-5-1及BF-5-2。BF-5-1經(jīng)測定為a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段(AAT)，帶有胺基酸序列LEAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIDQNTKSPLFMGK麗PTQK。BF-5-2經(jīng)測定為a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段(AAT)，帶有胺基酸序列EAIPMSIPPEVKFNKPFVFLMIDQNTKSPLFMGKWNPTQK。本文已顯示胰蛋白酶分解的質(zhì)譜及胰蛋白酶片段1842的Mascot片段模式(加底線者)，以及比較所觀察與所預(yù)測的BF5-1及2的質(zhì)量。在4679.4、4694.0、4707.9的多個高峰與在母離子4663.6中1、2及3個氧化甲硫胺酸(M)相符(見圖9及10)。收集額外的檢體確認(rèn)標(biāo)志。從患有侵襲性乳腺癌、DCIS、ADH及目前未患癌癥的女性收集雙側(cè)NAF做比較。從西北大學(xué)獲得來自乳腺癌高危險群女性的額外DLF檢體。評估2個先前已辨識的生物標(biāo)志。在4個患有侵襲性癌癥受試者(4/25)、1個患有DCIS受試者(l/3)及1個患有ADH受試者(1/3)的癌癥/患病乳房中觀察到BF5上升。沒有1任何對側(cè)控制組乳房顯示BF5陽性，包括所有控制組受試者的乳房。BF5顯然為特異性(除了1位患有ADH的受試者例外)以及具有限的敏感性。在高危險群中觀察到HNP1至3，與在癌癥病例上的觀察比較呈現(xiàn)較高的濃度。權(quán)利要求1.一種鑒定受試者乳腺癌狀況的方法，包括(a)測量來自受試者的生物樣本中的至少一種生物標(biāo)志，其中，該至少一種生物標(biāo)志選自表1生物標(biāo)志所組成群組；以及(b)關(guān)聯(lián)測量與乳腺癌狀況。2.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，該至少一種生物標(biāo)志是通過在SELDI探針吸附劑表面捕捉生物標(biāo)志以及以激光解析電離質(zhì)譜測定法偵測所捕捉的生物標(biāo)志而測量。3.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，該至少一種生物標(biāo)志是由免疫檢定法測量。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，該樣本為乳頭吸引液體(NAF)。5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，該樣本為乳管灌洗液體(DLF)。6.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，該關(guān)聯(lián)是由軟體分類演算法實施。7.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，乳腺癌狀況選自乳腺癌及非乳腺癌。8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，若該測量與乳腺癌相關(guān)，該方法進(jìn)一步包括投予至少一種治療至受試者，該治療選自下列群組手術(shù)、放射治療及化學(xué)療法。9.如權(quán)利要求1所述的方法其中，該乳腺癌狀況選自第I期或第II期原發(fā)性原位乳腺癌及非乳腺癌。10.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，該至少一種生物標(biāo)志為ci-防御素。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，該a-防御素為a-防御素-l、a-防御素-2或a-防御素-3。12.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，測量至少2種生物標(biāo)志。13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，該至少2種生物標(biāo)志選自下列所組成的群組a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、a-1_抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。14.如權(quán)利要求l所述的方法，其中，測量至少三種生物標(biāo)志。15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中，該至少三種生物標(biāo)志為a-防御素-1、a-防御素-2及a-防御素-3。16.如權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括測量至少一種生物標(biāo)志，其中，該生物標(biāo)志能夠區(qū)別乳腺癌及非癌癥，且其中，該生物標(biāo)志不是a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1或a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。17.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，該吸附劑為頂AC-Cu2+吸附劑。18.如權(quán)利要求2所述的方法，其中，該吸附劑為生物特異性吸附劑。19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中，該生物特異性吸附劑包括抗防御素-1、a-防御素-2及a-防御素-3的抗體。20.—種決定乳腺癌進(jìn)程的方法，包括(a)第一次測量來自受試者的生物樣本的至少一種選自下列群組的生物標(biāo)志a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2;(b)第二次測量受試者生物樣本的該至少一種生物標(biāo)志；以及(c)比較第一次測量及第二次測量，其中，由該比較測量決定乳腺癌的進(jìn)程。21.如權(quán)利要求20所述的方法，進(jìn)一步包括(d)在處理受試者后，測量至少一種生物標(biāo)志，并關(guān)聯(lián)該測量與疾病進(jìn)展。22.—種包括測量來自受試者的樣本的至少一種生物標(biāo)志的方法，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-l、a-防御素-2、a-防御素_3、BF_4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。'23.—種包括純化的生物標(biāo)志的組合物，其中，該生物標(biāo)志選自于下列群組a-防御素-l、a-防御素-2、a-防御素_3、BF-4、a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。24.—種包括生物特異性捕捉劑的組合物，該捕捉劑特異結(jié)合到選自下列群組的生物標(biāo)志a-防御素-l、a—防御素-2、a—防御素一3、BF_4、a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。25.—種包括結(jié)合到生物標(biāo)志的生物特異性捕捉劑的組合物，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。26.—種試劑盒包括(a)包括至少一種捕捉劑附著于其上的固相載體，其中，該捕捉劑與至少一種生物標(biāo)志結(jié)合，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、d-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2;以及(b)使用該固相載體偵測該至少一種生物標(biāo)志的說明書。27.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中，該包括捕捉劑的固相載體為SELDI探針。28.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中，該捕捉劑為IMAC-&2+吸附劑。29.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，進(jìn)一步包括(c)含有至少一種選自下列群組的生物標(biāo)志的容器a-防御素-l、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。30.如權(quán)利要求26所述的試劑盒，進(jìn)一步包括(c)一種1Kd阻斷透析劑。31.—種試劑盒包括(a)包括至少一種捕捉劑附著于其上的固相載體，其中，該捕捉劑與至少一種生物標(biāo)志結(jié)合，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-l、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段l及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2;以及(b)含有至少一種生物標(biāo)志的容器。32.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中，該包括捕捉劑的固相載體為SELDI探針。33.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中，該捕捉劑為頂AC-Cu2+吸附劑。34.—種軟件產(chǎn)品，包括(a)存取樣本數(shù)據(jù)的程式，該數(shù)據(jù)包括至少一種生物標(biāo)志的測量，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2;以及(b)執(zhí)行分類演算法的程式，其分類該樣本的乳腺癌狀況作為該測量的函數(shù)。35.—種包括以質(zhì)譜測定法或免疫檢定法偵測至少一種生物標(biāo)志的方法，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-l、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及ci-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。36.—種包括將關(guān)于乳腺癌狀況的診斷結(jié)果傳達(dá)至受試者的方法，該乳腺癌狀況由來自受試者的樣本的至少一種生物標(biāo)志的關(guān)聯(lián)性決定，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中，該診斷結(jié)果經(jīng)電腦產(chǎn)生的媒介物傳達(dá)至受試者。38.—種辨識與生物標(biāo)志相互作用的化合物的方法，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、ci-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2，其中，該方法包括(a)將該生物標(biāo)志與測試化合物接觸；以及(b)測定該測試化合物是否與該生物標(biāo)志相互作用。39.—種調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物標(biāo)志濃度的方法，該生物標(biāo)志選自下列群組a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-1_抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2，其中，該方法包括將該細(xì)胞與化合物接觸，其中，該化合物調(diào)節(jié)生物標(biāo)志的表達(dá)或轉(zhuǎn)翻譯后處理。40.—種治療受試者癥狀的方法，其中，該方法包括投予治療有效量的化合物至受試者，其中，該化合物調(diào)節(jié)生物標(biāo)志的表達(dá)或翻譯后處理，該生物標(biāo)志選自下列所組成的群組a-防御素-1、a-防御素-2、a-防御素-3、BF-4、a-1-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段1及a-l-抗胰蛋白酶抑制物的C端片段2。41.如權(quán)利要求40所述的方法，其中，該癥狀為乳腺癌。全文摘要本發(fā)明提供以蛋白質(zhì)為主的生物標(biāo)志及生物標(biāo)志組合，其用于鑒定患者體內(nèi)的乳腺癌狀況。特別是，本發(fā)明生物標(biāo)志用于將受試者樣本分類為乳腺癌或非乳腺癌。該生物標(biāo)志可由SELDI質(zhì)譜測定法測定。文檔編號G01N33/574GK101223445SQ200680026379公開日2008年7月16日申請日期2006年5月25日優(yōu)先權(quán)日2005年5月26日發(fā)明者D·W·尚,J·李,S·蘇庫馬爾申請人:約翰·霍普金斯大學(xué)