專利名稱：：用于標(biāo)記或處理包含目的生物分子特別是核酸的生物樣品的方法用于標(biāo)記或處理包含目的生物分子特別是核酸的生物樣品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于純化包含已被標(biāo)記的目的核酸(合成或天然的核糖核酸(RM)或脫氧核糖核酸(DM))的生物樣品的新方法。術(shù)語"合成的RNA或DNA"應(yīng)當(dāng)理解為是指通過由人開發(fā)的技術(shù)例如擴增技術(shù)(PCR，然后任選地轉(zhuǎn)錄)或轉(zhuǎn)錄擴增技術(shù)(TMA或NASBA)而獲得的RM或DNA。術(shù)語"天然的RNA或DNA"應(yīng)當(dāng)理解為是指通過細胞的提取而獲得的RNA或DNA，例如信使RNA、核糖體RNA、轉(zhuǎn)運RNA或基因組DM。現(xiàn)有技術(shù)顯示，存在許多用于標(biāo)記這些核苷酸、寡核苷酸或核酸的方法。寡核苷酸和核酸在下文中都稱為多核苷酸?？稍诤铣善陂g，或者通過整合至少一個經(jīng)標(biāo)記的核苷酸來進行標(biāo)記。第一種方法包括將標(biāo)記附著至堿基上，無論堿基是天然的還是經(jīng)修飾的。第二種方法提出將標(biāo)記物附著至糖上，同樣無論糖是天然的還是經(jīng)修飾的。第三種方法的目的在于將標(biāo)記物附著至磷酸上。特別地，已將在堿基上進行標(biāo)記用于通過整合直接經(jīng)標(biāo)記的核苷酸來標(biāo)記核酸的方法。通常在通過化學(xué)合成來制備核酸探針的情況下使用在糖上進行標(biāo)記。也已將在磷酸上進行標(biāo)記用于在寡核苷酸的化學(xué)合成期間導(dǎo)入官能化的臂和標(biāo)記物。事實上，必須進行核苷酸或核苷酸類似物或多核苷酸的標(biāo)記的本領(lǐng)域技術(shù)人員傾向于在堿基或糖上進行該附著，這為他們提供更大的方便和更多的選擇。此外，這是出自許多參考文件的研究，例如對于堿基有EP-A-O，329，198、EP-A-O，302，175、EP-A-O，097，373、EP-A-O，063，879、US-A-5，449，767、US-A-5，328，824、WO-A-93/16094、DE-A-3，910,151、EP-A-O，567，841,或?qū)τ谔怯蠩P-A-0，286，898。標(biāo)記物與磷酸的結(jié)合是比包括官能化堿基或糖的技術(shù)更復(fù)雜的技術(shù)，并且使用范圍更窄，這特別是由于磷酸的低反應(yīng)性(參見，例如，JencksW.P.等人J.Amer.ChemSoc.，82，1778-1785，1960)。類似地，在由O，Donnel和McLaughlin發(fā)表的涉及將4笨針導(dǎo)入寡核苷酸片段中的方法的綜述("Reportergroupsfortheanalysisofnucleicacidstructure"，p216-243，在"BioorganicChemistry:NucleicAcids"，EdHechtS.M.，OxfordUniversityPress,1996中)中，核苷酸之間的磷酸二酯的有效烷基化被認為是不可能的。本申請者已開發(fā)了基于新試劑的標(biāo)記技術(shù)，所述試劑從標(biāo)記產(chǎn)率的觀點來看是有效的，所述試劑就標(biāo)記的位置來說具有特異性，并且特別是所述試劑不影響參與通過氫鍵來形成雙螺旋的堿基的雜交特性，所述試劑可同時用于DNA和RNA，并且，最終所述試劑使得能夠無差別地標(biāo)記天然的多核苷酸或通過酶促擴增而制備的多核苷酸。因此，專利申請WO-A-02/090319描述了許多標(biāo)記物，其滿足上述條件并使用重氮基甲基官能團作為用于標(biāo)記的反應(yīng)性官能團。重氮基甲基官能團(式-C(N》-)已被用于磷酸基團的烷基化，但存在一定數(shù)量的問題。一方面，重氮基衍生物自身通常是不穩(wěn)定的，這對于在標(biāo)記試劑盒中使用這些標(biāo)記試劑產(chǎn)生了問題，和另一方面，偶聯(lián)產(chǎn)物是不穩(wěn)定的，如果經(jīng)標(biāo)記的產(chǎn)物的功能是證明任何樣品中生物靶分子的存在，那么這是完全無法接受的。最后，具有重氮基曱基官能團的衍生物是不溶于水的，這導(dǎo)致使用兩相條件來與僅在水或水性緩沖液中可溶或穩(wěn)定的生物分子進行偶聯(lián)，但這些條件減慢了反應(yīng)速率，從而使偶聯(lián)效率受到損害。描述于申請W0-A-02/090319中的那個發(fā)明的新型標(biāo)記試劑也解決了這些技術(shù)問題。根據(jù)一個實施方案，溫度穩(wěn)定性標(biāo)記試劑具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>中R'表示H或烷基、芳基或取代的芳基，R2表示可檢測的標(biāo)記物或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)相互連接的可檢測標(biāo)記物，L是包含線性鏈接的至少兩個共價鍵的連接臂，n是等于0或1的整數(shù)，W和114相互獨立地表示H、N02、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、0R、SR、NR2、R、NHC0R、C0NHR、C00R，其中R=烷基或芳基，A是包含至少一個允許重氮基官能團與芳族環(huán)綴合的共價雙鍵的連接臂，u是0至2的整數(shù)，優(yōu)選是Q或l,和-Y-X-表示-CONH-、-NHC0-、-CH20-、-CH2S-。在由本申請者于2004年3月26日以編號FR04/S0600提交的標(biāo)題為"R6actifsdemarquage，pro"d谷sdesynthesedetels"actifsetpro""sded"ectiondemoleculesbiologiques"的一個新的專利申請中，進一步改進了這些基于重氮基官能團的分子，所述分子仍然是溫度穩(wěn)定的，并且具有下式其中r表示H或烷基、芳基或取代的芳基，、R2表示可檢測的標(biāo)記物或至少兩個通過至少一個多聚體結(jié)構(gòu)相互連接的可檢測標(biāo)記物，丫L是包含線性鏈接的至少兩個共價鍵的連接臂，n是等于0或l的整數(shù)，W和114相互獨立地表示H、N02、Cl、Br、F、I、R2-(L)n-Y-X-、0R、SR、NR2、R、NHC0R、C0NHR、C00R、-C0-NH-(CH2)3-(0-CH廣CH2)廣CH2-NH-R2、-CO-NH-(CH2)3-(0-CH2-CH2)rCH2-NH-R2,其中R=烷基或芳基，A是包含至少一個允許重氮基官能團與芳族環(huán)綴合的共價雙鍵的連接臂，u是0至2的整數(shù)，優(yōu)選是O或l，-Y-X-表示-C0NH-、-NHCO-、-CH20-、-CH2S-，-Z-表示-NH-、-魔O-、-CONH-或-O-，m是1至10，優(yōu)選1至3的整數(shù)，和p是1至10，優(yōu)選1至3的整數(shù)。此外，為了使該標(biāo)記過程更有效，還使天然的或合成的多核苷酸片段化也是有利的。這些核酸的大小減少使其更容易接近從而被標(biāo)記。關(guān)于核酸的片段化，在現(xiàn)有技術(shù)中描述了許多方法。首先，片段化可以是酶促的，即可使用核酸酶(DNA酶或RNA酶)來進行核酸的片段化。從而產(chǎn)生具有3'-0H、5'-0H、3'-磷酸或5'-磷酸末端的小尺寸片段。第二，片段化可以是化學(xué)的。例如，在DM的情況下，可實施DNA的脫噤呤或脫嘧啶，然后所述DNA在堿存在下通過稱為消除"的機制片段化。除其他以外，可通過氧化、烷基化、加入自由基的機制來進行DNA片段化。為了片段化RM或DM，如分別在我們的專利US-A-6，376，179和專利申請W0-A-01/44507中所描述的，使用通常與用作化學(xué)催化劑的有機分子例如咪唑相結(jié)合的金屬陽離子。該片段化優(yōu)選地在堿性介質(zhì)中進行，并且產(chǎn)生具有3'-磷酸末端的片段。在該情況下，標(biāo)記物的附著在核酸片段的在切割期間被釋放出來的該唯一磷酸上發(fā)生。不存在任何特異性，片段化可以在任何類型的核酸上并且隨機地進行。事實上，我們的方法使得能夠例如制備檢測探針。最后，所述磷酸只是核酸和標(biāo)記物之間的連接臂。術(shù)語"可檢測的標(biāo)記物"表示至少一種能夠直接或間接地產(chǎn)生可檢測信號的標(biāo)記物。這些標(biāo)記物的非限制性列表如下產(chǎn)生可例如通過比色法、熒光或發(fā)光進行檢測的信號的酶，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、p-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，生色團，例如熒光化合物、發(fā)光化合物或染料化合物，可通過電子顯微鏡或通過它們的電學(xué)性質(zhì)如電導(dǎo)率、電流分析法、伏安法、阻抗進行檢測的電子密集性基團，可檢測基團，例如其分子的大小足以引起它們的物理和/或化學(xué)特性的可檢測改變；該檢測可通過光學(xué)方法例如衍射、表面等離子體共振、表面變化或接觸角變化，或通過物理方法例如原子力光諳學(xué)、隧道效應(yīng)來進行，放射性分子例如32p、"S或1251。優(yōu)選地，為了避免與這些標(biāo)記物相關(guān)的安全問題，所述標(biāo)記物不是放射性標(biāo)記物。例如，標(biāo)記物可以是具有低位阻的熒光化合物例如熒光素，丹磺酰基，IR類型的生色團(Li-C0RInc，LincolnNE，USA)，花青苷衍生物例如Cy5和Cy3(RandolphJ.B.等人，NucleicAcidsRes.，25(14)，p2923-2929，1997),特別是Cy5衍生物，或者示蹤物是具有低位阻的半抗原，例如生物素或松香烷衍生物(參見申請WO-A-00/07982)。術(shù)語"低位阻"表示低于2000g/mol的分子量(例如，具有1064g/mol的重量的bis-bioPDAM)。在熒光團的情況下，與激發(fā)波長大于450nm優(yōu)選大于600nm的熒光團一起工作是優(yōu)選的。當(dāng)示蹤物是自身不產(chǎn)生信號的半抗原例如生物素時，通過如上述進行標(biāo)記的抗配體的識別來進行檢測。在生物素的情況下，優(yōu)選使用偶聯(lián)至熒光化合物例如螢光素、Cy5或藻紅蛋白的鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素抗體。在松香烷的情況下，使用專利申請WO-A-00/07982中描述的單克隆抗體。這是被稱為標(biāo)記前體的物質(zhì)。術(shù)語"標(biāo)記前體"表示具有至少一個任選地經(jīng)保護的反應(yīng)性官能團的化合物，所述反應(yīng)性官能團不同于重氮基曱基官能團并且可與允許標(biāo)記物隨后附著的所述官能團相容，即在所述方法的任一步驟之后，特別是在使用Mn02進行氧化的步驟之后的附著。特別地，標(biāo)記前體可包含在上面的化學(xué)式中描述的連接臂L。使用標(biāo)記前體的策略的實例通常與信號擴增的情形相關(guān)，但通過使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種不同的保護基團，其他變化形式是可能的。也可使用間接系統(tǒng)，例如能夠與抗配體反應(yīng)的配體。配體/抗配體對對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，例如下列對就是這樣的情況生物素/鏈霉抗生物素蛋白，參半抗原/抗體，抗原/抗體，肽/抗體，糖/凝集素，多核苷酸/該多核苷酸的互補序列。在該情況下，配體攜帶有連接試劑?？赏ㄟ^前面段落中描述的標(biāo)記物直接檢測抗配體，或其自身可通過配體/抗配體來檢測。在某些條件下，這些間接檢測系統(tǒng)可通過例如使用多聚體結(jié)構(gòu)來導(dǎo)致信號擴增。該信號擴增技術(shù)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的，可參考本申請者以前的專利申請FR98/10084或WO-A-95/08000或者參考論文J.Histochem.Cytochem.45:481-491，1997。術(shù)語"多聚體結(jié)構(gòu)"是指由化學(xué)或生物合成子的重復(fù)單元形成的聚合物。在本發(fā)明中可用的此類結(jié)構(gòu)的許多變體是已知的，例如線性聚合物(EP-A-0,561,722，EP-A-O，669，991)，支化聚合物(W0-A-01/92361)，,顆粒(EP-A-0827552)，樹枝狀聚合物(US-A-4，507，466;US-A-4，568,737;US-A-6，083，708)，多核苷酸，和多肽。間接系統(tǒng)的另一個實例利用配體和抗配體例如甲基甲酮和烷氧基胺之間的特異共價鍵。該系統(tǒng)的實例描述于專利申請W0-A-00/40590和W0-A-98/05766中。這些間接檢測系統(tǒng)在某些條件下可導(dǎo)致信號擴增，關(guān)于例如使用聚合體的化學(xué)修飾的實例可參考以前的專利申請W0-A-00/07982、WO-A-01/92361和WO-A-95/08000,或關(guān)于通過堆疊進行化學(xué)擴增的系統(tǒng)可參考申請WO-A-01/44506。在信號擴增的一個具體方式中，至少兩個標(biāo)記物存在于標(biāo)記試劑上。此外，本發(fā)明的標(biāo)記試劑在極性且可與水混溶的溶劑例如DMF、DMSO、CH3CN、THF、DMA(二甲基乙酰胺)、NMP(N-甲基吡咯烷酮)或DME(二甲氧基乙烷)中是可溶的。優(yōu)選地，標(biāo)記試劑在DMSO或水中是可溶的。術(shù)語"可與水混溶的溶劑"表示可以以至少5體積°/。的比例與水或包含鹽的水性緩沖液混溶的溶劑。術(shù)語"生物分子"表示具有至少一個允許其與生物目的靶分子反應(yīng)的識別位點的化合物。例如，可以提及核酸、抗原、抗體、多肽、蛋白質(zhì)和半抗原作為生物分子。術(shù)語"核酸，，表示至少兩個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的鏈串，其任選地包含至少一個經(jīng)修飾的核苷酸，例如至少一個包含經(jīng)修飾的堿基例如肌苷、5-甲基-脫氧胞苷、5-二曱基氨基-脫氧尿苷、脫氧尿苷、2,6-二氨基-嘌呤、5-溴-脫氧尿苷或允許雜交的任何其他經(jīng)修飾的堿基的核苷酸。該多核苷酸也可在核苷酸間的鍵例如硫代磷酸酯、H-膦酸酯(H-phosphonates)或烷基膦酸酯的水平上被修飾，或在主鏈水平上被修飾，例如oc-寡核苷酸(FR-A-26075(H)或PNA(M.Egholm等人，J.Am.Chem.Soc.，114，1895-1897，1992)或2'-^烷基核糖核甘酸。核酸可以是天然的或合成的，通過如下的酶促擴增技術(shù)獲得的寡核苷酸、多核苷酸、核酸片段、核糖體RM、信使RNA、轉(zhuǎn)運RNA、核酸.PCR(聚合酶鏈反應(yīng))，描述于專利US-A-4，683，195、US-A-4，683，202和US-A-4，800，159中，和其衍生方法RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)，特別是一步形式的RT-PCR，如專利EP-B-O，569，272中所描述的，LCR(連接酶鏈反應(yīng))，公開于例如專利申請EP-A-0，201,184中，RCRn務(wù)復(fù)鏈反應(yīng)(RepairChainReaction))，描述于專利申請WO-A-90/01069中，3SR(自動維持序列復(fù)制(SelfSustainedSequenceReplication))，專利申請WO-A-90/06995,MSBA(基于核酸序列的擴增)，專利申請WO-A-91/02818,和TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增)，專利US-A-5，399,491。因而，術(shù)語"擴增子"用于表示通過酶促擴增技術(shù)產(chǎn)生的核酸。只要有至少一個磷酸存在于核酸中，就可以以組合的方式采用這些修飾中的每一種。術(shù)語"半抗原"是指非免疫原性化合物，即其自身不能通過產(chǎn)生抗體來促進免疫反應(yīng)，但能夠被通過在已知的條件下免疫動物特別是通過用半抗原-蛋白質(zhì)綴合物進行免疫而獲得的抗體識別。這些化合物通常具有低于3000Da，最常見地低于2000Da的分子量，并且可以例如是糖基化的肽、代謝產(chǎn)物、維生素、激素、前列腺素、毒素或各種藥劑、核苷和核苷酸。術(shù)語"純化步驟"特別地表示微生物的核酸和在純化核酸之前的裂解步驟中釋放的細胞組分之間的分離。這些裂解步驟是熟知的并且，作為示例性的例子，可使用在下列專利申請中描述的裂解方法-關(guān)于通過超聲波處理進行裂解的WO-A-00/60049，-關(guān)于磁力和機械混合裂解的WO-A-00/05338,-關(guān)于電裂解的WO-A-99/53304,和-關(guān)于機械裂解的WO-A-99/15621。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用其他熟知的裂解方法，例如熱或滲透壓休克或者使用離液劑如胍鹽的處理，特別是在屬于本申請者的專利US-A-5，234,809中描述的。該步驟通常使得能夠濃縮核酸。例如，可能使用磁性顆粒(關(guān)于該方面，參見本申請者的專利US-A-4，672，040和US-A-5，750，338),并因而通過洗滌步驟來純化結(jié)合在這些磁性顆粒上的核酸。如果期望隨后擴增所述核酸，那么這種核酸純化步驟是特別有利的。此類磁性顆粒的一個特別有利的實施方案描述于專利申請WO-A-97/45202和WO-A-99/35500中。此處使用的術(shù)語"固體支持物"，包括在其上可附著分子的所有材料，所述分子攜帶重氮基甲基官能團或從其衍生的官能團，例如重氮基的降解或重排產(chǎn)物，例如在標(biāo)記反應(yīng)期間釋放并需要被去除的吖溱類。任選地經(jīng)化學(xué)修飾的合成材料或天然材料可用作固體支持物特別地，多糖，例如基于纖維素的材料，例如紙、纖維素衍生物例如醋酸纖維素和硝酸纖維素，或葡聚糖，特別地，基于苯乙烯類型的單體的，天然纖維例如棉花，和合成纖維例如尼龍；礦物材料例如二氧化硅、石英、玻璃、陶瓷；膠乳；磁性顆粒；金屬衍生物；凝膠等。固體支持物可以以玻璃或硅或衍生物制成的微量滴定板、膜、顆粒或幾乎平的板的形式存在。這些支持物也可以用可與重氮基官能團或從其衍生的官能團反應(yīng)的目的陰離子和/或酸基團進行官能化，下文中將對此進行解釋。如上所述，現(xiàn)有技術(shù)也描述了攜帶重氮基官能團的化合物在標(biāo)記核酸(通過連接在其磷酸基團上)方面，在使它們可被檢測(特別是通過讀取熒光)方面的用途。在該情況下，所述重氮基化合物攜帶熒光基團(螢光素，Cy5)或允許與熒光分子共價或非共價結(jié)合的基團(生物素、半抗原或反應(yīng)性官能團的類型)?，F(xiàn)有技術(shù)描述了許多與標(biāo)記過程相關(guān)的純化方法的用途。在這些方法中，可以提及用有機相提取、過濾和凝膠過濾。然而，參考技術(shù)是，在導(dǎo)致通過特異性雜交(涉及DNA芯片，還有ELOSA板或快速測試形式)進行檢測的過程中，在標(biāo)記之前或之后，使用粉末形式的二氧化硅、凝膠或磁性顆粒來純化核酸。標(biāo)記前的純化使得能夠顯著地改善標(biāo)記產(chǎn)率，標(biāo)記后的純化使得能夠以決定性的方式改善雜交的產(chǎn)率，并從而改善所述測試的對于良好靈敏度所需的信號/噪聲比。這是因為，在標(biāo)記期間使用的且未反應(yīng)的過量標(biāo)記物可顯著地影響雜交。二氧化硅上的純化需要固相的洗滌和洗脫的步驟。因而，三個步驟(結(jié)合/洗滌/洗脫)的存在需要液體的轉(zhuǎn)移，這可能是污染、材料損失和通常可適度地自動化的因素。此外，該方法在整個操作過程中需要操作者的干預(yù)和使用離液序列高的(刺激性的)鹽。概括地說，關(guān)于所有這些具有純化步驟的標(biāo)記方法的本質(zhì)問題在于下列事實，即為了使標(biāo)記過程真正有效，必需使用過量的標(biāo)記物以使所有核酸具有被標(biāo)記的可能性。在經(jīng)處理的液體溶液中，經(jīng)標(biāo)記的核酸以及未反應(yīng)的標(biāo)記物的存在意味著該液體樣品隨后不能用于特異性檢測步驟。必需預(yù)先除去過量存在的標(biāo)記物。為此，可以將所述核酸結(jié)合至二氧化硅顆粒(任選地包含磁性材料)上以固定經(jīng)標(biāo)記的或未標(biāo)記的核酸，并通過除去不想要的組分來對它們進行洗滌。上面已提到的本申請者的專利US-A-5，234，809允許進行該類型的方法。然而，這產(chǎn)生了在實踐者的工作時間和材料方面耗費巨大的額外步驟。因而，本發(fā)明在于利用標(biāo)記物或標(biāo)記前體的化學(xué)特性，以允許其優(yōu)先結(jié)合目的核酸，并且任選地，如果這樣的結(jié)合未發(fā)生，允許其在固體相上的捕獲，而不引起任何洗滌相。此外，對于該純化過程，刺激性離液劑不是必需的。同樣，本發(fā)明的方法不需要任何旨在使液體通過固相的泵或離心機類型的額外系統(tǒng)。該過程可能需要磁化或過濾系統(tǒng)，如果純化相由顆粒(磁性或非磁性的)組成；然而，該裝置不是必須的并且可使用完全被動的過程(使標(biāo)記介質(zhì)通過固相)。最后，由于使用固相及其簡單性(接觸、溫育、經(jīng)歷雜交)的原因，可容易地使該方法自動化。所述方法可用于使用連續(xù)流的系統(tǒng)，.從而使得能夠簡化在"Lab-on-Card"類型或完全集成在單個管中的獨立裝置(用于利用在芯片上雜交來進行核酸純化)之中的整合。這意味著污染的風(fēng)險將減小，并且所使用的消耗品的數(shù)目將減少。為此，根據(jù)第一個實施方案，本發(fā)明涉及用于標(biāo)記生物樣品中所包含的目的生物分子的方法，其包括a)提供反應(yīng)容器，b)在所述容器或引入該容器中的固體支持物的所有或部分內(nèi)表面上固定捕獲分子，所述捕獲分子能夠結(jié)合目的生物分子的標(biāo)記物或才示t己前體，c)將生物樣品引入所述反應(yīng)容器中，還引入1)目的生物分子的至少一種標(biāo)記物或標(biāo)記前體，和2)任選地，標(biāo)記或預(yù)標(biāo)記目的生物分子所需的任何成分，d)溫育反應(yīng)容器的內(nèi)容物，e)通過與捕獲分子的結(jié)合來固定未與目的生物分子反應(yīng)的標(biāo)記物或才示t己前體，和f)使用經(jīng)標(biāo)記的目的生物分子即與所述標(biāo)記物或標(biāo)記前體反應(yīng)的目的生物分子進行隨后的步驟。根據(jù)第二個實施方案，本發(fā)明還涉及用于處理生物樣品的方法，所述生物樣品包含目的生物分子和目的生物分子的至少一種標(biāo)記物或標(biāo)記前體的混合物，任選地還組合有標(biāo)記目的生物分子所需的任何成分，所述方法包括a)提供反應(yīng)容器，b)在所述容器或引入該容器中的固體支持物的所有或部分內(nèi)表面上固定捕獲分子，所述捕獲分子能夠結(jié)合目的生物分子的標(biāo)記物或標(biāo)記前體，c)將生物樣品引入所述反應(yīng)容器中，d)溫育反應(yīng)容器的內(nèi)容物，e)通過與捕獲分子的結(jié)合來固定未與目的生物分子反應(yīng)的標(biāo)記物或標(biāo)記前體，和.f)使用經(jīng)標(biāo)記的目的生物分子即與所述標(biāo)記物或標(biāo)記前體反應(yīng)的目的生物分子進行隨后的步驟。在上述的兩種情況中，根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，未與目的生物分子反應(yīng)的標(biāo)記物或標(biāo)記前體與捕獲分子的所述結(jié)合通過共價鍵發(fā)生。在一個特定的實施方案中，在上述的步驟a)之前，按照下列步驟中的至少一個步驟處理生物樣品從上游的另一個反應(yīng)容器轉(zhuǎn)移，裂解復(fù)雜的生物材料，以使目的生物分子可接近和/或可檢測，捕獲或分離目的生物分子，和/或處理目的生物分子以使得能夠檢測它們或改善它們的檢測；該處理可由例如熱處理組成。在另一個特定的實施方案中，在上述步驟f)之后進行至少一個下列的隨后步驟轉(zhuǎn)移至下游的另一個反應(yīng)容器，標(biāo)記經(jīng)預(yù)標(biāo)記的目的生物分子，純化經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)預(yù)標(biāo)記的目的生物分子，和/或檢測與捕獲探針雜交的經(jīng)標(biāo)記的目的生物分子。例如可在與檢測分子(例如，核酸探針)雜交或不雜交的情況下，以均相有利地進行目的生物分子的檢測。在所有上述的情況下，可能的是，所述容器或引入該容器中的固體支持物的內(nèi)表面攜帶有陰離子和/或酸官能團，并且標(biāo)記物或標(biāo)記前體包含重氮基官能團(-N-N)。在該最后一個實施方案中，所述容器或引入該容器中的固體支持物的內(nèi)表面所攜帶的官能團由羧基和/或磺基官能團組成。在所有這些情況中，目的生物分子由核酸和/或核酸片段組成。在該最后一個實施方案中，所述核酸和/或核酸片段由DNA、RNA、DNA-RNA嵌合多聚體組成，所述核酸和/或核酸片段可任選地包含至少一個核苷酸硫代磷酸酯、LNA、2'-0-Me和/或甲基膦酸酯衍生物("riv6m6thylphosphonates)。在其中目的生物分子是核酸或核酸片段的實施方案中，在上述步驟a)之前，按照下列步驟中的至少一個步驟處理生物樣品從上游的另一個反應(yīng)容器轉(zhuǎn)移，裂解生物樣品所包含的復(fù)雜生物材料，以使核酸可接近，從所述復(fù)雜的生物材料中提取核酸，特異性擴增目的核酸，使所述目的核酸或擴增子的片段化，和/或轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄目的核酸，無顯著的擴增現(xiàn)象。仍然在相同的情況下，在上述步驟f)之后進行至少一個下列的隨后步驟轉(zhuǎn)移至下游的另一個反應(yīng)容器，標(biāo)記經(jīng)預(yù)標(biāo)記的核酸，純化經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)預(yù)標(biāo)記的核酸，檢測與捕獲探針雜交的經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)預(yù)標(biāo)記的核酸，轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄目的核酸，無顯著的擴增現(xiàn)象，和/或在使用或不使用檢測探針的情況下，均相檢測經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)預(yù)標(biāo)記的核酸。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，捕獲分子相對于標(biāo)記物以過量存在，和標(biāo)記物相對于待標(biāo)記的目的生物分子以過量存在。更特別地，捕獲分子相對于不與核酸反應(yīng)的游離標(biāo)記物以過量存在，和標(biāo)記物相對于待標(biāo)記的核酸以過量存在。為了使得能夠檢測和/或定量和/或純化目的核酸，經(jīng)標(biāo)記的核酸能夠形成與靶充分互補的復(fù)合物，從而根據(jù)反應(yīng)條件，特別是溫度或反應(yīng)介質(zhì)的鹽濃度條件，特異性地進行雜交。另一方面，然而，如果該反應(yīng)不是特異性的，那么未反應(yīng)的標(biāo)記物或游離的標(biāo)記物保持它們的反應(yīng)性官能團完整，從而能夠隨后與自身攜帶有互補反應(yīng)性官能團的捕獲分子反應(yīng)。因此，反應(yīng)性官能團與互補反應(yīng)性官能團形成共價鍵，這使得能夠固定游離的標(biāo)記物，從而生物樣品只包含與核酸結(jié)合的標(biāo)記物。附圖顯示本發(fā)明的純化方法的不同步驟。它們代表了特定的實施方案，并且不能認為其限定了本發(fā)明的范圍。圖1顯示了在其中進行純化方法的反應(yīng)容器的橫截面視圖。該容器包括上部的蓋子和下部的主體，該主體被挖空從而產(chǎn)生在其中可進行本發(fā)明方法的空間。該空間包括位于左邊的允許待處理的生物樣品進入的引入通道和位于右邊的允許所述經(jīng)處理的生物樣品離開的排出通道。處理或包被容器的內(nèi)部空間以展示出具有羧基反應(yīng)性官能團的捕獲分子。蓋子的內(nèi)側(cè)空間也可進行所述處理。如上所述，引入通道允許以箭頭指向?qū)胍后w生物樣品，其包含尤其是核酸和攜帶有重氮基官能團的標(biāo)記物。在該圖所示的情況下，所述核酸仍未被標(biāo)記，但也可以將它們預(yù)先與標(biāo)記物接觸。圖2顯示了與圖1相同的視圖，其中存在于反應(yīng)容器的內(nèi)部空間中的生物樣品包含經(jīng)標(biāo)記的核酸和游離的標(biāo)記物，即未與核酸反應(yīng)的標(biāo)記物。由于標(biāo)記物相對于核酸過量存在，因而所有這些核酸將被標(biāo)記，相反的情況是存在許多游離的標(biāo)記物。圖3仍然與圖1和2相同，但注意到，在一段時間后，即，通常，在Ms-BioPDAM的情況下，在至少IO分鐘后(但在1小時內(nèi))，大部分游離的標(biāo)記物結(jié)合至存在于容器的內(nèi)部空間中的羧基反應(yīng)性官能團。術(shù)語"大部分"表示游離的標(biāo)記物被捕獲從而使它們低于抑制濃度(低于2mM)。很明顯，這些反應(yīng)性官能團相對于未與核酸反應(yīng)的游離標(biāo)記物過量存在。圖4仍然與圖1至3相同。如上所述，排出通道允許經(jīng)處理的液體生物樣品按該圖右方的箭頭指向排出，所述生物樣品尤其包含經(jīng)標(biāo)記的核酸，但沒有游離的標(biāo)記物。圖5顯示了N，N'-雙(13-生物素?；被?4，7，10-三"惡十三烷基)-5-(重氮基甲基)間苯二酰胺分子的結(jié)構(gòu)式，為有助于理解本說明書所述分子在后面也稱作"bis-BioPDAM"。最后，圖6顯示示了N，N'-雙(13-生物素?；被?4，7，10-三"惡十三烷基)-5-(二曱氧基甲基)間苯二酰胺分子的結(jié)構(gòu)式，為有助于理解本說明書所述分子在后面也稱作"縮醛"。實施例1:RT-PCR擴增產(chǎn)物的標(biāo)記和在羧基顆粒上的純化，然后在DNA芯片(Affymetrix，SantaClara，CA)上的分析在本實施例中，游離標(biāo)記物的結(jié)合不直接發(fā)生在固體支持物上，但其使得能夠通過測試標(biāo)記物與磁性顆粒的反應(yīng)性來檢查本發(fā)明的構(gòu)思的有效性。A-PCRInfluenzaB在稱為"http://7/7i/e/2z<sB"的模型上進行本實驗。該名稱表示通過RT-PCR從B型流感病毒RNA的190個堿基的基因片段序列產(chǎn)生的擴增子。關(guān)于抽取物制備、病毒RNA提取、它們的擴增和引物序列的情況描述于論文"EffectivenessofReverseTranscription-PCR，VirusIsolation,andEnzyme-1inkedImmunosorbentAssayfordiagnosisofInfluenzaAVirusInfectionindifferentAgeGroups"，SteiningerC.等人，/.C7/幾#2.cro6/o/.，(2002);40(6)，205卜2056。采用TitanOneTubeRT—PCRSystem試齊寸盒(RocheDiagnosticCorporation,Basle,Switzerland,參考號11855476001)，用0.2mM每種脫氧核糖核苷酸、0.3nM引物和O.4pi酶，使用病毒RNA制備物(每次擴增103個拷貝)作為起始模板來進行RT-PCR。RT-PCR的循環(huán)參數(shù)如下60C下進行30分鐘以進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后按照下列方案進行40個循環(huán)94X:20秒，隨后，50X:30秒，最后，72X:30秒，然后在4X:下直至熱循環(huán)儀停止工作。從上述RT-PCR中產(chǎn)生的擴增子以后稱為"PCR//3/7we刀zaB"。B-均相標(biāo)記(參照方案)將均相標(biāo)記用作相對本發(fā)明的參照或"對照"技術(shù)。使用足以允許DNA的充分標(biāo)記但低于閾值(從該閾值開始，游離標(biāo)記物將影響雜交)的標(biāo)記物終濃度(2mM)來進行該方案。將5體積的PCR//3/7ye;2wB與5pl在二曱亞砜(下文中稱為"DMS0")中稀釋至6mM的N，N'-雙(13-生物素?；被?4，7，10-三喁十三烷基)-5-(重氮基甲基)間苯二酰胺(在下文中稱為"bis-BioPDAM，，，參見圖5)和5H20混合，然后在80。C下溫育10分鐘。然后采用供應(yīng)商的方案將反應(yīng)介質(zhì)與DNA芯片(Affymetrix，SantaClara，CA)接觸以進行雜交步驟。所使用的DNA芯片被設(shè)計用于分析在RT-PCR期間擴增的區(qū)域。由A.Troesch等人"Mycobacteriumspeciesidentificationandrifampinresistancetestingwithhigh—densityDNAprobearrays"/."2'/7.#/cr<6/o7.(1999)，37，49-55描述了雜交實方案的說明和用于結(jié)果分析的技術(shù)的說明。使用由Genechip⑧Instrumentsystem和GenechipInformationSystem(Affymetrix,SantaClara,CA)所提供的讀取系統(tǒng)和軟件，在標(biāo)記和雜交后讀取在DM芯片表面上發(fā)射出的熒光，以及產(chǎn)生關(guān)于信號強度和同源性百分比的數(shù)據(jù)。該讀取系統(tǒng)提供了以RFU("相對熒光單位")表示的信號和本底噪聲強度。相對于參照序列(相應(yīng)于通過測序獲得的經(jīng)擴增的靶序列)來給出同源性百分比。在結(jié)果表中集中了關(guān)于信號(I)、本底噪聲(B)的中位強度以及同源性百分比(％同源性)的結(jié)果。一般地，認為高于90%的同源性百分比是令人滿意的結(jié)果，盡管通常尋找高于95%的結(jié)果。高強度和低本底噪聲(高的I/B比)是在所述設(shè)置中所找到的第二個結(jié)果。C-在抑制性標(biāo)記物濃度下的均相標(biāo)記(對照)在本實驗中，使用更高的標(biāo)記物bis-BioPDAM終濃度(5mM)。該濃度在不存在純化的情況下影響雜交，但當(dāng)該相同的反應(yīng)介質(zhì)^L有效純化時，該濃度使得能夠獲得更強的信號(由于更高的標(biāo)記物產(chǎn)率)。將5jil體積的PCR/力/7we/7zaB與5pibis-BioPDAM(在DMS0中稀釋至15mM)和5pl比0混合，然后在8(TC下溫育IO分鐘。然后，照上面的段落B中所描述的方案，將反應(yīng)介質(zhì)與芯片接觸以進行雜交和檢測。D-在二氧化硅膜上進行純化的情況下的均相標(biāo)記(對照)在本實驗中，使用由QIAgenGmbH(Hilden，Germany)銷售的包含二氧化硅膜的核酸純化柱。該技術(shù)構(gòu)成了參照方法。在該情況下，使用更高的bis-BioPDAM終濃度(5mM)來進行標(biāo)記方案，該標(biāo)記物濃度在不存在有效純化的情況下影響芯片上的雜交。將5pl體積的PCR//7/7"e/7zaB與5pibis-BioPDAM(在DMSO中稀釋至15mM)和5pi1120混合，然后在80匸下溫育10分鐘。然后，采用供應(yīng)商推薦的方案，使用QIAQuick試劑盒(QIAgenGmbH，Hilden，Germany.參考號28306)來純化反應(yīng)介質(zhì)，然后按照在已描述的段落B中所述的方案將該反應(yīng)介質(zhì)與DNA芯片接觸以進行雜交。E-在羧基顆粒上進行純化的情況下的均相標(biāo)記(本發(fā)明)在本實驗中，用羧基固相(本發(fā)明)來純化通過使用更高的bis-BioPDAM終濃度(5mM)而獲得的標(biāo)記產(chǎn)物。5mM的標(biāo)記物濃度在不存在有效純化步驟的情況下影響雜交。因此，這是選擇用于研究純化效能的濃度。將5pl體積的PCRZo/7z/e"zsB與5pibis-BioPDAM(在DMSO中稀釋至15mM)和5jilH20混合，然后在S0X:下溫育10分鐘。然后，使用2,5mg標(biāo)準的Carboxyl-Adembeads(參考號0213，Ademtech，Pessac，F(xiàn)rance,在下文中稱為"羧基顆粒")在環(huán)境溫度下溫育反應(yīng)介質(zhì)IO分鐘，然后通過使反應(yīng)介質(zhì)磁化來分離顆粒，按照上文中在段落B中所述的方案將反應(yīng)介質(zhì)與DNA芯片接觸以進行雜交。F-結(jié)果和結(jié)論在下面的表l中給出了關(guān)于同源性百分比、信號強度(I)和本底噪聲(B)的結(jié)果表1:使用本發(fā)明方案的方法與不進行純化或在二氧化硅膜上進行純化的對照相比的比較研究才示卡己方-法%同源性IBI/BB-均相標(biāo)記(參照)93.116993085.5C-在影響雜交的標(biāo)記物濃度(5mM)下的均相標(biāo)記(對照)47.51353390.3D-在二氧化硅膜上進行純化的情況下的均相標(biāo)記(對照)97.9590529719.9E-在羧基顆粒上進行純化的情況下的均相標(biāo)記(本發(fā)明)97.9816743418，7結(jié)果表示為同源性百分比、信號強度(I)和本底噪聲(B)?？傊?，使用參照方法獲得的結(jié)果基本上與采用在二氧化硅膜上純化而獲得的結(jié)果相同。此外，觀察到，使用"羧基純化"而獲得的結(jié)果在強度(I)方面比不進行純化或釆用在二氧化硅膜上純化而獲得的結(jié)果更好。芯片上信號的增強使得能夠獲得更可靠的測試，減少對局部影響本底噪聲的因素(例如芯片上的塵埃、沉積物)的依賴。此外，純化方案的運作的便利明顯地使操作過程更輕松。實施例2:標(biāo)記，和經(jīng)標(biāo)記并且被所述標(biāo)記物的非反應(yīng)性等價物污染的RT-PCR擴增產(chǎn)物在羧基顆粒上的純化本實施例用于證明，固體支持物和標(biāo)記分子之間形成的鍵完全是標(biāo)記物的共價捕獲的結(jié)果而不是其在所述支持物上吸附的結(jié)果。A-目的在本實驗中，用bis-BioPDAM的合成中間產(chǎn)物N，r-雙(13-生物素?；被?4，7，10-三喁十三烷基)-5-(二甲氧基甲基)間苯二酰胺(在下文中稱為"縮醛"，圖6)污染經(jīng)純化的標(biāo)記產(chǎn)物。該反應(yīng)物不具有重氮基曱基官能團，從而不能與羧基官能團反應(yīng)。在另一方面，其具有bis-BioPDAM的結(jié)構(gòu)的完整性，因而當(dāng)觀察到的純化現(xiàn)象是非特異性吸附現(xiàn)象，而不是牽涉特定性結(jié)合的現(xiàn)象時，可以以與bis-BioPDAM相似的方式吸附至表面。所述縮醛以與bis-bioPDAM相同的方式影響核酸的雜交，這使得能夠判斷其消除的性質(zhì)。B-實驗將5體積的PCR//3/7wei3zaB與5jilbis-BioPDAM(在DMSO中稀釋至15mM)和5pi仏0混合，然后在80T下溫育10分鐘。然后，采用供應(yīng)商的方案，使用QIAQuick試劑盒(QIAgenGmbH，Hilden，Germany.參考號28306)來純化反應(yīng)介質(zhì)。為了具有足以進行幾個對照實驗的經(jīng)純化的產(chǎn)物的體積，對已經(jīng)歷RT-PCR擴增的樣品的幾個等份平行進行該制備。混合純化產(chǎn)物以消除由所述樣品的制備引起的變化。然后按下列方法處理15pi(相應(yīng)于在通過混合物的二氧化硅膜純化進行純化后獲得的洗脫物的體積)的級分a)如實施例1/B中所描述的，在Affymetrix芯片上進行直接雜交(對照)。b)加入5mM縮醛，然后如實施例1/B中所描述的，在Affymetrix芯片上進行雜交(通過縮醛進行抑制的對照)。c)如實施例1/E中所描述的，于環(huán)境溫度下在羧基顆粒上進行IO分鐘的純化，然后如實施例1/B中所描述的，在Affymetrix芯片上進行雜交(顆粒對標(biāo)記產(chǎn)物的作用的對照)。d)加入5mM縮醛，然后如實施例1/E中所描迷的，于環(huán)境溫度下在羧基顆粒上進行IO分鐘的純化，并如實施例1/B中所描述的，在Affymetrix芯片上進行雜交(顆粒對縮醛的作用的對照)。C-結(jié)果和結(jié)論在下面的表2中給出了關(guān)于同源性百分比、信號強度(I)和本底噪聲(B)的結(jié)果表2:在不能與羧基官能團反應(yīng)的抑制化合物存在的情況(B和D)下，使用本發(fā)明方案的方法(C和D)與不使用本發(fā)明方案的兩個對照(A和B)相比的比較研究<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>結(jié)果也表示為同源性百分比、信號強度(I)和本底噪聲(B)?？傊?，無論是否存在使用羧基顆粒的預(yù)處理(D)，縮醛衍生物影響核酸的雜交(B和D)。該結(jié)果表明，在與羧基官能團的反應(yīng)不存在的情況下，縮醛不能反應(yīng)。因此，不存在通過吸附而引起縮醛化合物的顯著消除。因而可得出這樣的結(jié)論導(dǎo)致形成共價鍵的重氮基甲基-羧酸反應(yīng)是參與反應(yīng)介質(zhì)的純化的主要機制。實施例3:標(biāo)記，和經(jīng)標(biāo)記的RT-PCR擴增產(chǎn)物在羧基膜上的純化A-目的在本實驗中，使用攜帶有羧基官能團的膜(BiodyneC，參考號S60314,PallGelmanSciences,NewYork,USA,在下文中稱為BiodyneC)來純化用5mM的bis-BioPDAM終濃度獲得的標(biāo)記產(chǎn)物。5mM的標(biāo)記物濃度在不存在有效純化步驟的情況下影響雜交。因此，這是選擇用于研究純化效能的濃度。B-實驗將5pi體積的PCR//7/7"e/3zaB與5pibis-BioPDAM(在DMSO中稀釋至15mM)和5piH20混合，然后在80*C下溫育10分鐘。以一式兩份進行本實驗，然后將標(biāo)記產(chǎn)物混合并分成兩份等體積，以限制由于該操作方案中的可變性而引起的可能不利的影響。然后使用6mm2的BiodyneC在環(huán)境溫度下溫育反應(yīng)介質(zhì)10分鐘(b)，或讓其在環(huán)境溫度下放置(參照a)，然后按照實施例1/B中所述的方案將經(jīng)如此處理的該介質(zhì)與DNA芯片接觸以進行雜交步驟。C-結(jié)果和結(jié)論在下面的表3中給出了關(guān)于同源性百分比、信號強度(I)和本底噪聲(B)的結(jié)果表3:使用本發(fā)明方案的方法(b)與不使用本發(fā)明方案的參照(a)相比的比較研究標(biāo)記方法°/同源性IBI/Ba-參照94.742525647.5b-羧基膜純化94.723811217411.0結(jié)果再次表示為同源性百分比、信號強度(I)和本底噪聲(B)?？傊瑪y帶有羧基官能團的BiodyneC膜使得能夠以與使用磁性顆粒相同的性質(zhì)來純化樣品。實施例4:標(biāo)記，'和使用羧酸聚合物進行的經(jīng)標(biāo)記的RT-PCR擴增產(chǎn)物'的純化A-目的在本實驗中，使用攜帶有羧基官能團的聚合物(聚丙烯酸鈉鹽，標(biāo)準28，000，參考號81124，F(xiàn)luka，Buchs，Switzerland;在下文中稱為APA)來純化使用5mM的bis-BioPDAM終濃度而獲得的標(biāo)記產(chǎn)物。如上所述，5raM的標(biāo)記物濃度在不存在有效純化步驟的情況下影響雜交。B-PCRMyco16S在稱為"Myco16S"的模型上進行本實驗，其表示通過PCR從編碼結(jié)核分枝桿菌(拳o6a"eW咖"6ercw/o"s)的16S核糖體腿的基因的180個堿基的片段序列產(chǎn)生的擴增子。由A.Troesch等人"Mycobacteriumspeciesidentificationandrifampinresistancetestingwithhigh—densityDNAprobearrays"/.V/croWo/.(1999)，37,49-55提供了分枝桿菌的培養(yǎng)、提取的條件以及擴增引物。采用FastStartHighFidelityPCRSystem試劑盒(RocheDiagnosticCorporation,Basle,Switzerland,參考號03553426001)，用G.2mM每種脫氧核糖核苷酸、0.3引物和0.4pi酶，使用基因組DNA制備物(每次PCR103個拷貝)作為起始模板來進行PCR。PCR的循環(huán)參數(shù)如下95r下進行4分鐘，然后按照下列方案進行35個擴增循環(huán)95€30秒，隨后30秒，最后，72'C30秒。最后，在4。C下保持直至熱循環(huán)儀停止，以避免擴增產(chǎn)物在環(huán)境溫度下的可能的降解。在下文中將上述的包含PCR產(chǎn)生的擴增子的溶液稱作"PCR16S"。C一實驗將5jil體積的PCR16S與5plbis-BioPDAM(在DMS0中稀釋至2.5mM)和l5pl仏0混合，然后在80。C下溫育10分鐘。以一式兩份進行本實驗，然后將標(biāo)記產(chǎn)物混合并分成兩份等體積以限制由于該操作方案中的可變性而引起的可能不利的影響。然后，將反應(yīng)介質(zhì)在環(huán)境溫度下溫育10分鐘(a),或用在真空中干燥產(chǎn)生的10jul20%APA的溶液的沉淀進行溫育(b)，然后按照實施例1/B中所述的方案將其與DM芯片接觸以進行雜交步驟。D-結(jié)果和結(jié)論在下面的表4中給出了關(guān)于同源性百分比、信號強度(I)和本底噪聲(B)的結(jié)果表4:使用本發(fā)明方案的方法(b)與不使用本發(fā)明方案的參照(a)相比的比較研究<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>總之，具有羧基官能團的聚合物使得能夠獲得與使用磁性顆粒進行的純化相當(dāng)?shù)臉悠芳兓?。實施?:標(biāo)記，和使用磺酸聚合物進行的經(jīng)標(biāo)記并且被所述標(biāo)記物的非反應(yīng)性等價物污染的RT-PCR擴增產(chǎn)物的純化A-目的在本實驗中，使用攜帶有磺基官能團的聚合物(參考號29"6-7，Sigma-Aldrich，Saint-Louis;MI，USA,在下文中稱為Nafion)來純化使用5mM的bis-BioPDAM終濃度而獲得的標(biāo)記產(chǎn)物。B-實驗將5體積的PCR16S與5bis-BioPDAM(在DMSO中稀釋至2.5mM)和l5H力混合，然后在80。C下溫育10分鐘。以一式兩份進行本實驗，然后將標(biāo)記產(chǎn)物混合并分成兩份等體積以限制由于該操作方案中的可變性而引起的可能不利的影響。然后溫育反應(yīng)介質(zhì)在環(huán)境溫度下溫育IO分鐘(a),或用在真空中干燥產(chǎn)生的10pl5%Nafion曱醇溶液的沉淀進行溫育(b),然后按照實施例1/B中所述的方案將其與DNA芯片接觸以進行雜交步驟。C-結(jié)果和結(jié)論在下面的表5中給出了關(guān)于同源性百分比、信號強度(I)和本底噪聲(B)的結(jié)果表5:使用本發(fā)明方案的方法(b)與不使用本發(fā)明方案的參照(a)相比的比較研究<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>結(jié)果再次表示為同源性百分比、信號強度(I)和本底噪聲(B)?？傊哂谢腔倌軋F的聚合物使得能夠獲得與使用磁性顆粒而獲得的純化相當(dāng)?shù)臉悠芳兓??？偨Y(jié)論根據(jù)我們的發(fā)明的方法基于，利用重氮基甲基官能團對酸(特別是羧基官能團)的反應(yīng)性來在標(biāo)記步驟后捕獲過量的標(biāo)記物。該反應(yīng)性對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的。例如，可提及4-(重氮基甲基)苯氧基甲基-聚苯乙烯(參考號17338，F(xiàn)luka，Buchs，Switzerland),其用于通過它們的羧基鍵來共價結(jié)合蛋白質(zhì)。在核酸捕獲實驗的情況中，本申請者使用了該樹脂。在標(biāo)記后的純化過程中利用重氮基甲基官能團對固體支持物的反應(yīng)性的想法至今是不為人所知的。所述反應(yīng)基于在標(biāo)記步驟后重氮基官能團的反應(yīng)性的保留。該反應(yīng)性的保留一點也不明顯，因為在最初的標(biāo)記步驟期間一部分官能團可能在反應(yīng)介質(zhì)中被水解。相當(dāng)一部分的未與核酸反應(yīng)的標(biāo)記物仍然具有反應(yīng)性，并且在固相上的固定以足以允許樣品雜交的產(chǎn)率來進行，這是令人吃驚的結(jié)果。重氮基官能團與羧基官能團的高反應(yīng)性使得能夠在環(huán)境溫度下在限制在數(shù)分鐘內(nèi)的一段時間之內(nèi)進行反應(yīng)。基于共價結(jié)合的該方法與等同的技術(shù)相比是個創(chuàng)新。因為標(biāo)記分子在固體支持物或可溶性聚合物上以共價方式隔離，因此不需在純化后進行洗涂。洗滌步驟的取消與現(xiàn)有的純化方法相比是個創(chuàng)新。因為作為本發(fā)明的主題的方法基于化學(xué)反應(yīng)，因此其比過濾、相排除純化(purificationparexclusiondephase)或在固體支持物上的吸附更具特異性和選擇性。由于吸收而導(dǎo)致的生物樣品的損失的風(fēng)險被降低。最后，可容易地將純化支持物整合入消耗品中，無論該消耗品是試管(在手工方法的情況下)還是用于自動化方案的卡類型的組件。權(quán)利要求1.用于標(biāo)記生物樣品中所包含的目的生物分子的方法，其包括a)提供反應(yīng)容器，b)在所述容器或引入該容器中的固體支持物的所有或部分內(nèi)表面上固定捕獲分子，所述捕獲分子能夠結(jié)合目的生物分子的標(biāo)記物或標(biāo)記前體，c)將生物樣品引入所述反應(yīng)容器中，還引入1)目的生物分子的至少一種標(biāo)記物或標(biāo)記前體，和2)任選地，標(biāo)記或預(yù)標(biāo)記目的生物分子所需的任何成分，d)溫育反應(yīng)容器的內(nèi)容物，e)通過與捕獲分子的結(jié)合來固定未與目的生物分子反應(yīng)的標(biāo)記物或標(biāo)記前體，和f)使用經(jīng)標(biāo)記的目的生物分子即與所述標(biāo)記物或標(biāo)記前體反應(yīng)的目的生物分子進行隨后的步驟。2.用于處理生物樣品的方法，所述生物樣品包含目的生物分子和目的生物分子的至少一種標(biāo)記物或標(biāo)記前體的混合物，任選地還組合有標(biāo)記目的生物分子所需的任何成分，所述方法包括a)提供反應(yīng)容器，b)在所述容器或引入該容器中的固體支持物的所有或部分內(nèi)表面上固定捕獲分子，所述捕獲分子能夠結(jié)合目的生物分子的標(biāo)記物或標(biāo)記前體，c)將生物樣品引入所述反應(yīng)容器中，d)溫育反應(yīng)容器的內(nèi)容物，e)通過與捕獲分子的結(jié)合來固定未與目的生物分子反應(yīng)的標(biāo)記物或標(biāo)記前體，未與目的生物分子反應(yīng)的標(biāo)記物或標(biāo)記前體與捕獲分子的所述結(jié)合通過共價鍵發(fā)生，和f)使用經(jīng)標(biāo)記的目的生物分子即與所迷標(biāo)記物或標(biāo)記前體反應(yīng)的目的生物分子進行隨后的步驟。3.權(quán)利要求l的方法，其特征在于，未與目的生物樣品反應(yīng)的標(biāo)記物或標(biāo)記前體與捕獲分子的所述結(jié)合通過共價鍵發(fā)生。4.權(quán)利要求1至3中任一項的方法，其特征在于，在步驟a)之前，按照下列步驟中的至少一個步驟處理生物樣品從上游的另一個反應(yīng)容器轉(zhuǎn)移，裂解復(fù)雜的生物材料，以使目的生物分子可接近和/或可檢測，捕獲或分離目的生物分子，和/或處理目的生物分子以使得能夠檢測它們或改善它們的檢測。5.權(quán)利要求1至4中任一項的方法，其特征在于，在步驟f)之后進行至少一個下列的隨后步驟轉(zhuǎn)移至下游的另一個反應(yīng)容器，標(biāo)記經(jīng)預(yù)標(biāo)記的目的生物分子，純化經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)預(yù)標(biāo)記的目的生物分子，和/或檢測與捕獲探針雜交的經(jīng)標(biāo)記的目的生物分子。6.權(quán)利要求1至5中任一項的方法，其特征在于，所述容器或引入該容器中的固體支持物的內(nèi)表面攜帶有陰離子和/或酸官能團，并且標(biāo)記物或標(biāo)記前體包含重氮基官能團(-N=N)。7.權(quán)利要求6的方法，其特征在于，所述容器或引入該容器中的固體支持物的內(nèi)表面所攜帶的官能團由羧基和/或磺基官能團組成。8.權(quán)利要求1至7中任一項的方法，其特征在于，目的生物分子由核酸和/或核酸片段組成。9.權(quán)利要求8的方法，其特征在于，所述核酸和/或核酸片段由DNA、RNA、DNA-MA嵌合多聚體組成，所述核酸和/或核酸片段可任選地包含至少一個核苷酸硫代磷酸酯、LNA、2'-0-Me和/或曱基膦酸酯衍生物。10.權(quán)利要求8或9中任一項的方法，其特征在于，在權(quán)利要求1或2中所定義的步驟a)之前，按照下列步驟中的至少一個步驟處理生物樣品從上游的另一個反應(yīng)容器轉(zhuǎn)移，裂解生物樣品所包含的復(fù)雜生物材料，以使核酸可接近，從所述復(fù)雜的生物材料中提取核酸，特異性擴增目的核酸，使所述目的核酸或擴增子的片段化，和/或轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄目的核酸，無顯著的擴增現(xiàn)象。11.權(quán)利要求8至10中任一項的方法，其特征在于，在權(quán)利要求1或2中所定義的步驟f)之后進行至少一個下列的隨后步驟轉(zhuǎn)移至下游的另一個反應(yīng)容器，標(biāo)記經(jīng)預(yù)標(biāo)記的核酸，純化經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)預(yù)標(biāo)記的核酸，檢測與捕獲探針雜交的經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)預(yù)標(biāo)記的核酸，轉(zhuǎn)錄或逆轉(zhuǎn)錄目的核酸，無顯著的擴增現(xiàn)象，和/或在使用或不使用檢測探針的情況下，均相檢測經(jīng)標(biāo)記或經(jīng)預(yù)標(biāo)記的核酸。12.權(quán)利要求1至11中任一項的方法，其特征在于，捕獲分子相對于標(biāo)記物以過量存在，和標(biāo)記物相對于待標(biāo)記的目的生物分子以過量存在。13.權(quán)利要求12的方法，其特征在于，捕獲分子相對于不與核酸反應(yīng)的游離標(biāo)記物以過量存在，和標(biāo)記物相對于待標(biāo)記的核酸以過量存在。全文摘要本發(fā)明涉及用于標(biāo)記生物樣品中所包含的目的生物分子的方法，其包括a)提供反應(yīng)容器，b)在所述容器的固體支持物上固定能夠結(jié)合目的生物分子的標(biāo)記物的捕獲分子，c)將生物樣品以及目的生物分子的至少一種標(biāo)記物，和任選地，標(biāo)記或預(yù)標(biāo)記目的分子所需的任何成分引入所述容器中，d)溫育反應(yīng)容器的內(nèi)容物，并通過與捕獲分子的結(jié)合(例如利用重氮基甲基官能團對固體支持物的反應(yīng)性)來固定未與目的分子反應(yīng)的標(biāo)記物，和e)使用經(jīng)標(biāo)記的目的分子進行隨后的步驟。本發(fā)明還用于處理生物樣品的方法。本發(fā)明優(yōu)選地在用于純化核酸的人工或自動化方法中應(yīng)用。文檔編號G01N33/532GK101233410SQ200680027983公開日2008年7月30日申請日期2006年5月31日優(yōu)先權(quán)日2005年6月1日發(fā)明者A·拉尤恩,E·伯納爾-門德茲,L·米諾申請人:拜奧默里克斯股份有限公司