專利名稱：：肝病的診斷方法和用于篩選治療這種疾病的分子的方法肝病的診斷方法和用于篩選治療這種疾病的分子的方法本申請的目的是肝病的診斷方法。其另一個(gè)目的是篩選用于治療這種疾病的分子的方法。載脂蛋白A4(ApoA4)是一種大量流通的載脂蛋白。這種蛋白質(zhì)的表達(dá)在嚙齒目動(dòng)物的下丘腦、小腸和肝臟中一皮證實(shí)。在小鼠血漿中存在的ApoA4的大部分被認(rèn)為是腸源的(Wu等人，JBC254,7316-73221979)。在人類中，Elshourbagy(JBC2621987)名又述ApoA4的合成一皮限制在小腸中。ApoA4具有多種功能。它借助于不同的機(jī)理調(diào)節(jié)脂類的運(yùn)輸和代謝，比如活化自肝組織流出的膽固醇和刺激脂蛋白脂肪酶的活性(Stan等人，BiochimBiophysActa,16312003,177-187)。ApoA4還已知是飽脹感因子。肝病成為公眾健康的重大問題。因此借助于特定的敏感測定方法在盡可能早的時(shí)期診斷各種肝病是非常必要的。本申請人意外地發(fā)現(xiàn)，ApoA4在人的肝臟中被表達(dá)，在肝病時(shí)編碼ApoA4的基因的肝臟表達(dá)水平明顯地增高。本發(fā)明的目的是肝病的檢測、診斷或預(yù)測的方法，該方法包括測量在肝細(xì)胞或肝組織中，或者在這些細(xì)胞和組織的提取物中，或者在血液及其衍生物中ApoA4的表達(dá)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是不僅測量在該細(xì)胞或肝組織中ApoA4的表達(dá)，而且還測量在存在肝源ApoA4的血液中的表達(dá)。一種方法可包括如下的步驟-分離肝細(xì)j包、肝組織或者這些細(xì)i包和組織的提取物，或者血液或其書f生物，以及一測量ApoA4的表達(dá)。通過溶解肝細(xì)胞和肝組織就能夠得到這種提取物。肝病應(yīng)該理解為對肝組織和肝細(xì)胞具有影響的各種疾病，可以是慢性的，也可以是病原性的(酒精性、病毒性、毒性、飲食性、環(huán)境性等)。更具體說，本發(fā)明的目的是對脂肪肝、肝癌發(fā)生、肝硬化、病毒性肝炎、肝細(xì)胞功能不足、膽汁郁積、門靜脈高血壓、脂肪變性和脂肪肝、肝臟靜脈和動(dòng)脈疾病、纖維化、月巴胖癥和代j射綜合癥的才全測、診斷或預(yù)測的方法。血液書f生物應(yīng)當(dāng)理解為通過物理處理(比如離心)或生物處理(例如，凝結(jié))或化學(xué)或其它能夠得到這些衍生物的處理方法得到的來源于血液的各種細(xì)胞或非細(xì)胞部分。這樣的衍生物優(yōu)選是血漿和血清。按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，所述方法包括測量從在希望診斷或預(yù)測肝病的個(gè)體的肝細(xì)胞或肝組織中編碼ApoA4的基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA(mRNA)的量。將所述哺乳動(dòng)物.的肝細(xì)力包或肝組織，或者在其血液或其衍生物中的細(xì)胞提取，并且用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行處理，特別是為了避免信使RNA和蛋白質(zhì)降解，然后測量由編碼ApoA4的基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的量。按照特別有利的方式，按照所謂定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)即QPCR方法，通過擴(kuò)增來測量轉(zhuǎn)錄的信使RNA的量。按照這種技術(shù)，提取全部RNA并將其提純，借助于反向轉(zhuǎn)錄酶，將在提取液中所含的信使RNA在第一時(shí)間;波轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNAs(cDNAs)。在本發(fā)明中優(yōu)選使用的聚合酶是Taq聚合酶，但也可以是具有聚合酶活性并可在PCR操作條件下可以使用的各種其它酶。由于其性能，這種酶可4吏在每一個(gè)合成周期中初始的DNA的量倍增。對由生物試樣中所含的mRNA衍生得到的cDNA的分析是通過定量PCR實(shí)時(shí)進(jìn)行的。按照基本上包括周期重復(fù)的方法，借助于ApoA4序列的特定引物和探針對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，該周期包括如下步驟-通過對由試樣制備的cDNA進(jìn)行加熱來分離待擴(kuò)增的鏈，-對探針和一對正義引物和反義引物進(jìn)行雜交，以及-通過用聚合酶延長來進(jìn)行DNA鏈的新的合成。正義引物和反義引物有利地含有至少15個(gè)核苷酸，并與相應(yīng)于SEQIDN。13(基因數(shù)據(jù)庫No.NM000482)的人的ApoA4序列或與其互補(bǔ)序列具有至少80%,優(yōu)選90%,和更優(yōu)選95%的同一性。在擴(kuò)增反應(yīng)過程中，反應(yīng)產(chǎn)物或amplimdre借助于探針進(jìn)行^^僉測，該探針由寡核香酸組成，該寡核苷酸包括至少15個(gè)核苷酸和與相應(yīng)于SEQIDN。13(基因數(shù)據(jù)庫No.NM000482)人ApoA4的序列或與其互補(bǔ)序列具有至少80%的同一性，優(yōu)選90%,更優(yōu)選95%。對于正義片段和反義片段分別選擇兩種引物，使得能夠進(jìn)行DNA片段的擴(kuò)增。探針本身的目標(biāo)是為了與通過兩種引物的位置界定的擴(kuò)增產(chǎn)生的DNA片段進(jìn)行雜交。該探針有利地具有比引物的理論Tm高大約10°C±0.5的理論融合溫度Tm。所述寡核苷酸(引物和探針)優(yōu)選含有15~25個(gè)核苷酸。該方法實(shí)施多個(gè)周期，足可以得到能夠測量數(shù)量的擴(kuò)增產(chǎn)物(n=40)。用于編碼人ApoA4的基因擴(kuò)增的引物優(yōu)選具有如下序列SEQIDN01:gcagctggctccctatgct以及SEQIDN。2:ggaaggtcaggccctcaag。探針優(yōu)選具有SEQIDN°3的序列cacgcaggagaagctcaaccacca,。按照本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施模式，該探針含有顯示的分子或者分子系統(tǒng)。所述顯示系統(tǒng)優(yōu)選由報(bào)道基因著色劑和焚光淬滅著色劑構(gòu)成，它們分別固定在探針的5，和3'末端上。按照一個(gè)有利的實(shí)施方式，可顯示系統(tǒng)由分別固定在探針的5，和3，末端上的6-羧基熒光素(FAM)和6-羧基四甲基羅丹明(TAMRA)表示的"報(bào)道基因/淬滅基團(tuán)，，對構(gòu)成。為了在本發(fā)明的范圍內(nèi)實(shí)施PCR,可以參考PCR技術(shù)的一般性綜述，試劑和熱循環(huán)器制造商和銷售商的i兌明書，特別是由PerkinElmerAppliedBiosystem出片反的才示題為《QuantitationofDNA/RNAUsingReal-TimePCRDetection》的說明書(1999)和PCR操作規(guī)程(AcademicPress出版社New-York1989)。4吏用QPCR才企測法的優(yōu)點(diǎn)之一就是對PCR產(chǎn)物的分析可通過讀出在該周期的過程中得到的熒光而直接在PCR周期的末尾進(jìn)行。因此，不必使用PCR產(chǎn)物，對于后面的分析，這種產(chǎn)物是具有被污染的風(fēng)險(xiǎn)的。另外，對在反應(yīng)開始時(shí)使用的靶的數(shù)目進(jìn)行定量是很可靠的并且是可重現(xiàn)的。借助于熒光探針在PCR周期的過程中進(jìn)行PCR產(chǎn)物的檢測。這對于檢測PCR的產(chǎn)物這是必要的，且該檢測剛好在PCR指數(shù)期而不是在最終點(diǎn)進(jìn)行。因此，此檢測原理是更為靈敏而具有特異性的。QPCR的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，由于"熱啟動(dòng)"的原理，避免了非特異性的擴(kuò)增，PCR是在初期變性時(shí)活化的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶存在下實(shí)時(shí)進(jìn)4亍的。按照本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施模式，按照本發(fā)明的方法包括測量在肝細(xì)胞或肝組織中，或者在血液或其衍生物中存在的ApoA4蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的量。按照一種特別有利的方式，借助于至少一種此蛋白質(zhì)的特異性抗體，進(jìn)行ApoA4蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段數(shù)量的測定。此抗體可通過一種方法得到，該方法在于任選在比如Freund助劑的助劑存在下，向比如嚙齒目的動(dòng)物注射提純的人的ApoA4蛋白質(zhì)乳液或者大約20個(gè)氨基酸的ApoA4肽序列。注射重復(fù)進(jìn)行，收集抗血清。對于希望對肝的ApoA4進(jìn)行定量的個(gè)體，測量在此類抗體與在其肝細(xì)月包或肝組織中或者在血液及其書f生物中存在的ApoA4之間的聯(lián)系，可通過各種適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)4亍。優(yōu)選可通過ELISA4支術(shù)("Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay"的縮寫)進(jìn)行,更優(yōu)選是通過所謂"三明治(enSandwich)"的方法進(jìn)行。所謂"三明治"法利用兩種抗體第一種捕捉抗體與比如微型板的固定相相連接，而第二種檢測抗體能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)定量。按照此技術(shù)，檢測抗體與過氧化酶偶聯(lián)。與ApoA4蛋白質(zhì)相結(jié)合的抗體就與沒有結(jié)合的抗體分離，并與過氧化酶底物相接觸，優(yōu)選為O-苯二胺二鹽酸鹽。比色反應(yīng)能夠?qū)Y(jié)合的抗體數(shù)定量，因此就對結(jié)合的蛋白質(zhì)定量。借助于適當(dāng)?shù)膬x器測量此比色反應(yīng)，比如測定光密度。通過使用至少兩種抗體進(jìn)行反應(yīng)的擴(kuò)增，一種是沒有與過氧化酶偶聯(lián)的抗ApoA4抗體，另一種是識(shí)別第一種抗體的與過氧化酶偶聯(lián)的抗體。另外，可使用另一種抗ApoA4抗體來固定ApoA4抗體在載體上的復(fù)合物，如此使此復(fù)合物容易分離和分離出非固定的抗體。也可以使用由放射性同位素標(biāo)記的抗體來測定此抗體與ApoA4之間的連接。在此實(shí)施方式中，與蛋白質(zhì)ApoA4結(jié)合的抗體被分離，借助于適合于所用同位素的測量設(shè)備來測量抗體-ApoA4復(fù)合體的放射性?？梢允褂肊LISA技術(shù)和放射性同位素技術(shù)以外的技術(shù)為蛋白質(zhì)ApoA4進(jìn)行測定含量，比如比濁法和濁度測定法。特別地，為了得到抗體和使用ELISA技術(shù)以及放射性同位素技術(shù)，可以參考手冊《Antibodies,ALaboratoryManual》(ColdSpringHarborPress(1988))。本發(fā)明的另一個(gè)目的是篩選用來預(yù)防或治療肝病的化合物的方法，該方法包括如下步驟-使所述化合物與哺乳動(dòng)物接觸，以及-測定在所述哺乳動(dòng)物的所述肝源細(xì)胞中或在血液和血細(xì)胞衍生物中ApoA4的表達(dá)。肝臟)表達(dá)的各^t哺乳^/物:、它有利地可是嚙齒目動(dòng)物，優(yōu)選是小鼠:、有利地使用具有肥胖癥天然傾向的動(dòng)物系。因此，比如優(yōu)選4吏用BalbcByJ、DIOBalbcByJ、DIOBalbcAnN或DIOC57BI/6J系小鼠?？扇缭谏厦嫠鶖⑹龅模ㄟ^測量在所述哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞或肝組織或者在血液及其^"生物中表達(dá)的ApoA4的量或者通過測量由在所述哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞或肝組織中編碼ApoA4的基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的量來進(jìn)行ApoA4表達(dá)的測定。下面的實(shí)施例用來說明本發(fā)明而不對其構(gòu)成限制。實(shí)施例1:通過對轉(zhuǎn)錄的信使RNA和血漿ApoA4蛋白質(zhì)定量，來測定正常小鼠(C57B16)或肥胖小鼠(C57B16/obob)的ApoA4表達(dá)l.材料和方法實(shí)驗(yàn)的操作程序?qū)φＰ∈?C57B16)或肥胖小鼠(C57B16/obob)進(jìn)4亍血液提取，并在10，000rpm下離心IO分鐘，取出血漿。取一'J、塊肝臟(75~130mg)放入裝有1.5mLRNALater(Ambiom)的2mL試管中。在-20。C下保存肝臟和血漿，以對mRNA和蛋白質(zhì)ApoA4進(jìn)4亍測定含量。用QPCR實(shí)時(shí)分4斤小鼠ApoA4的表達(dá)此技術(shù)分兩個(gè)主要步驟，涉及到l.提取并才是純?nèi)縍NA,然后將在試樣中所含的ARNm轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA(cDNA)。2.用定量PCR實(shí)時(shí)分析cDNA。以相對于不變內(nèi)參照基因(比如P2-微球蛋白或18S核糖體RNA)的％給出該基因的相對表達(dá)。序列分析儀7900HTFastReal-TimePCRSystem和擴(kuò)增試劑都由AppliedBiosystem公司提供。方法制備組織溶解液(lysats)切下80mg小鼠的肝臟并立即浸入到2mL的RNALater中，以在操作之前盡可能保存RNA的完整性。將一小塊肝臟在保持千燥下被轉(zhuǎn)移到加入了2mL溶解緩沖液(全RNA提取試劑盒，由QIAGEN^>司出售的RNeasyMidiKit)和兩個(gè)鋼球(直徑3mm)的Eppendorf試管中。使用組織溶解機(jī)(QIAGEN公司出售)通過在30Hz下震蕩5分鐘進(jìn)行組織溶解。在此步驟中溶解液可保存在-2(TC。提取全RNA在14,000xg下將溶解液離心3分鐘，用QIAshredder(QIAGEN公司出售)(3x0.7mL)過濾。按照RNeasyMidi試劑盒的操作^L程和Dnase步驟進(jìn)行提取。最后一步是將全RNA洗脫在150jliL水中。通過測定在260nm的光密度(DO)得到RNA的濃度。合成互補(bǔ)DNA(cD圃使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperscriptIII(INVITROGEN公司出售)，從5jxg全RNA合成cNDA。將得到的cDNA回收在20pL的最終體積中。用7900HT通過PCR分析基因表達(dá)將5|uLcDNA的稀釋液添加到15pL特別含有如下物質(zhì)的反應(yīng)混合物中緩沖液、PCR反應(yīng)必需的聚合酶以及引物和對待定量基因的特定探針。后者可以TaqmanGeneExpressionAssays的形式從供應(yīng)商那里得到。P2-微球蛋白(B2-m)或18S核糖體RNA可用作內(nèi)標(biāo)。用于人和小鼠編碼ApoA4和0的基因的擴(kuò)增的引物和探針的序列列在表VII中(SEQIDN°.1至SEQIDN°.12)?；驍U(kuò)增反應(yīng)使用溫度循環(huán)(變性95°C/15s，然后雜交和合成60°C/1分鐘)在96穴或384穴的微型板上進(jìn)行。分析時(shí)間為90分鐘。將擴(kuò)增的動(dòng)力學(xué)(作為循環(huán)數(shù)函數(shù)的擴(kuò)增信號(hào))在指數(shù)期線性表示法中進(jìn)行分析(軟件SDS企業(yè)數(shù)據(jù)庫)。在此期間內(nèi)定義了Ct,這是在恒定擴(kuò)增信號(hào)時(shí)測量的循環(huán)數(shù)，Ct反比于在源試樣中存在的信使RNA的量。粑基因(ApoA4)和內(nèi)參照(B2-m)之間Ct的差值(ACt),通過方程式Q二(2)-^t給出了相對多度(給出的值用相對于參照基因的％表示)。通過ELISA三明治法測定小鼠血漿中ApoA4的量抗體4乾才足#元體是由(SantaCruzBiotechnology^〉司,2145DelawareAvenueSantaCruz,California95060,USA)出售的山羊抗-ApoA4。從由對應(yīng)于小鼠ApoA4的C-封端序列(氨基酸361-380)的肽免疫的兔子得到針對小鼠ApoA4的抗血清。經(jīng)皮下給動(dòng)物注射與載體蛋白(KLH)偶聯(lián)的肽在Freund氏完全佐劑中的乳液。用在Freund氏不完全佐劑偶聯(lián)的肽的乳液進(jìn)行后面的注射。在第三次接種10天之后收集抗血清，并且用對與色鐠凝膠偶聯(lián)的肽具有親合性的色譜提純此抗血清。實(shí)施ELISA三明治法在2(TC下，在96穴板的穴中培養(yǎng)100jiL在PBS中濃度為4|ag/mL的山羊抗ProA4抗體4小時(shí)。在用含有0.1%的Tween20的PBS清洗之后，在環(huán)境溫度下，在60分鐘中，用含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖溶液阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入100iuL血漿試樣(在含有0.1%BSA的PBS稀釋液，1/3000~1/20000)，并在4。C下培養(yǎng)過夜。在清洗之后，加入100juL濃度為0.1jug/mL的抗小鼠ApoA4的兔多克隆抗體，并在環(huán)境溫度下培養(yǎng)1小時(shí)。在清洗之后，加入100juL抗兔IgG-過氧化酶結(jié)合物(P正RCE1/200在含有0.:r/。BSA的PBS中)，并在環(huán)境溫度下培養(yǎng)1小時(shí)。在清洗之后加入150juL含有O-苯二胺和過氧化氬的溶液，作為過氧化酶(Sigma)的底物。在20分鐘之后，加入50juL的3M的石克酸中止反應(yīng)，測量在492nm處的光密度。2.結(jié)果表IA顯示出ApoA4在小鼠中組織分布，ApoA4表達(dá)于平滑月幾、小腸、肝、結(jié)腸、胎盤、胃、卵巢、直腸、脂肪組織等當(dāng)中。注意到在小腸中有很強(qiáng)的表達(dá)。表IB證實(shí)了在小腸中的強(qiáng)烈表達(dá)和ApoA4在不同區(qū)域(十二指腸、空腸、回腸)中的定^i。表II顯示出Apo在肝和血漿中的表達(dá)，還顯示出如果將正常小鼠和肥胖小鼠進(jìn)行比較，則在肝和血漿中此表達(dá)增加。實(shí)施例2:通過對轉(zhuǎn)錄的信〗吏RNA定量來測定ApoA4在人中的表逸從人的肝制備cDNA,如在前面的實(shí)施例中所述的對于從小鼠的肝進(jìn)行制備那樣進(jìn)行測量。通過QPCR對人ApoA4表達(dá)進(jìn)行實(shí)時(shí)分析的結(jié)果表m顯示出ApoA4在人中的組織分布存在于子宮底部、食道、視網(wǎng)膜、胎盤、附睪和脂肪組織中。注意到在小腸當(dāng)中的強(qiáng)烈表達(dá)，這與文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)是符合的。在整個(gè)肝中的很小表達(dá)，但似乎集中在肝靜脈(hepatoportale)區(qū)。表IV-A證實(shí)了ApoA4在小腸區(qū)(空腸、回腸、十二指腸)定位的結(jié)果。還顯示出ApoA4在肝臟中的局部表達(dá)更與某些病理生理狀態(tài)(肝臟的門靜脈系統(tǒng))有密切聯(lián)系(表IV-B)。這個(gè)結(jié)果在表V-A和VI中得到證實(shí)，這兩個(gè)表匯總了對病理肝臟和正常肝臟的不同試樣進(jìn)行的ApoA4分析結(jié)果。比4支高的值與如下的疾病相關(guān)肝硬化、《良瘡、梗塞。通過對其4也載脂蛋白ApoAl、ApoA2和ApoA5的ApoA4的比較分析(表IV和V-B)，顯示出ApoA4作為這些疾病潛在標(biāo)記物的特異性。實(shí)施例3:通過ELISA三明治法測量人血漿中ApoA4蛋白的量抗體4乾才足4元體是由(SantaCmzBiotechnology,Inc.2145DalawareAvenueSantaCruz,California95060，USA)銷售的山羊抗ApoA4抗體。如WeibergRB、HopkinsRA、JonesJB(MethodsEnzymol.1996;263:282-96.Purification,isoformCharacterization,andquantitationofhumanapolipoproteinA4)所述乂人人血漿得到純^i的人ApoA4。從兔子得到針對人ApoA4的抗血清。對動(dòng)物皮下注射純化的人ApoA4在Freund氏完全佐劑中的乳液。用純化的ApoA4在Freund氏不完全佐劑中的乳液進(jìn)行后面的注射。在第三次接種10天之后采集抗血清。實(shí)施ELISA三明治法在20。C下用100juL濃度為4jug/mL的在PBS中的山羊抗ApoA4抗體培養(yǎng)96穴板的穴4小時(shí)。在用含有0.1%的Tween20的PBS清洗之后，在環(huán)境溫度下，用含有0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS緩沖液阻斷非特異性結(jié)合位點(diǎn)60分鐘。加入100ml血漿試樣(稀釋在含有0.1%bsa的pbs,1/3000~1/20000),并在4。C下培養(yǎng)過夜。在清洗之后加入100juL兔的抗人ApoA4的多克隆血清抗體(在PBSSAB中稀釋到1/5000),并在環(huán)境溫度下培養(yǎng)1小時(shí)。在清洗之后，加入100pL抗兔IgG-過氧化酶結(jié)合物(PIERCE1/200在含有0.1%BSA的PBS中)，并在環(huán)境溫度下培養(yǎng)1小時(shí)。在清洗之后，加入150iuL含有O-苯二胺和過氧化氫的溶液作為過氧化酶(Sigma)的底物。在20分鐘之后，加入50juL的3M硫酸中止反應(yīng)，并測量在492nm的光密度。實(shí)施例4:月巴胖癥和人的肝臟ApoA4通過分析ApoA4在超重病人肝臟中的表達(dá)，進(jìn)行著眼于肥胖癥的研究。此病理與體重指數(shù)(IMC二體重(kg)/身高(m)2)相關(guān)。正常的體重對應(yīng)于IMC<25。通過實(shí)驗(yàn)，用前面敘述的QPCR技術(shù)，從Asterand公司(TechOneBidg,Suite501,440Burroughs,DetroitMI48202,USA)提供的人類肝臟RNA的采集來分析載脂蛋白的表達(dá)。體重指數(shù)(IMC,或BMI(身體質(zhì)量指數(shù)))由Asterand給出。結(jié)果列于表VIII中?？梢钥闯鲈贏poA4的表達(dá)的百分?jǐn)?shù)和體重指數(shù)之間的正相關(guān)關(guān)系。此結(jié)果顯示使用ApoA4作為診斷或預(yù)測和治療性跟蹤肥胖癥的是恰當(dāng)?shù)摹?lt;table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表IB:ApoA4在小腸各段的表達(dá)(%|32-m,平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差(4種動(dòng)物))<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表II:ApoA4的mRNA在肝臟中的表達(dá)和在正常小鼠(C57B16)或肥胖小鼠(C57B16/obob)的血漿中ApoA4的測量<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表IVA:載脂蛋白在腸中的表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表VA:人ApoA4在肝臟試樣中的表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表VB:人ApoAl、A2和A5在肝臟試樣中的表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表VI:ApoA4在人體試樣中的表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表VII:通過定量PCR用于人和小鼠P2-微球蛋白和ApoA4計(jì)量的底物和探針的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>權(quán)利要求1.肝臟病的診斷或預(yù)測的方法，該方法包括測定ApoA4在肝細(xì)胞或肝組織中或者在血液及其衍生物中的表達(dá)。2.按照權(quán)利要求1的方法，該方法包括如下步驟-分離肝細(xì)胞、肝組織或者這些細(xì)胞和組織的提取物，或者血液或其其衍生物，以及-測量ApoA4的表達(dá)。3.按照權(quán)利要求1和2中之任一項(xiàng)的方法，其特征在于，該方法包括測定在肝細(xì)胞或肝組織中表達(dá)的、由編碼ApoA4的基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的量。4.按照權(quán)利要求3的方法，其特征在于，此轉(zhuǎn)錄信使RNA的量是通過PCR法測定的。5.按照權(quán)利要求4的方法，其特征在于，此轉(zhuǎn)錄信使RNA的量是通過定量PCR法測定的。6.按照權(quán)利要求1和2中之任一項(xiàng)的方法，其特征在于，該方法包括測定在肝細(xì)胞或肝組織中，或者在血液及其衍生物中表達(dá)的蛋白質(zhì)ApoA4的量。7.按照權(quán)利要求6的方法，其特征在于，借助于此種蛋白質(zhì)的至少一種特異性抗體來測定ApoA4的量。8.按照權(quán)利要求7的方法，其特征在于，將此特異性抗體與過氧化酶偶聯(lián)關(guān)并且用放射性同位素標(biāo)記。9.按照權(quán)利要求7和8中之任一項(xiàng)的方法，其特征在于，通過ELISA技術(shù)測定該抗體與該蛋白質(zhì)的結(jié)合。10.篩選或檢測用于預(yù)防或治療肝臟病的化合物的方法，該方法包4舌如下步驟-使所述化合物與哺乳動(dòng)物4妻觸，以及胞衍生物中的表達(dá)。11.按照權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該方法包括測量在所述哺乳動(dòng)物的肝細(xì)l包或肝組織中，或者在血液及其々亍生物中表達(dá)的ApoA4的量。12.按照權(quán)利要求10的方法，其特征在于，該方法包括測量由一種或多種編碼ApoA4的基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA的量，ApoA4在所述哺乳動(dòng)物的肝細(xì)胞或肝組織中或者在血液及其書f生物中表達(dá)。13.按照權(quán)利要求10至12中之任一項(xiàng)的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物是BalbcByJ、DIOBalbcByJ、DIOBalbcAnN或DIOC57BI/6J系小鼠。全文摘要本申請的目的是肝臟病的診斷方法，該方法包括測定載脂蛋白A4在肝細(xì)胞或肝組織中，或者在循環(huán)系統(tǒng)(血液、血漿、血清)中的表達(dá)。本發(fā)明還涉及篩選用于治療此類疾病的化合物的方法，即使所述化合物與哺乳動(dòng)物接觸，測量載脂蛋白A4在所述哺乳動(dòng)物的所述肝源細(xì)胞或循環(huán)系統(tǒng)中的表達(dá)。文檔編號(hào)G01N33/92GK101310187SQ200680042567公開日2008年11月19日申請日期2006年11月10日優(yōu)先權(quán)日2005年11月10日發(fā)明者D·西蒙,H·維達(dá)爾,I·布伊森,J·馬錢德,P·卡塞拉斯,S·加利古申請人:賽諾菲-安萬特