專利名稱：：包括破壞血球成分的步驟的樣品中親和物質(zhì)的測定方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及利用了載體顆粒的凝集反應的親和物質(zhì)的測定方法。
背景技術(shù)：
：作為檢測或測定生物學的特異反應性物質(zhì)存在的方法，目前一直使用著例如酶免疫測定法或放射線免疫測定法等。這些方法具有高的靈敏度，且精度也高。但是，由于使用酶或放射性同位素作為標記，故試劑不穩(wěn)定。另外，在利用放射性同位素時，由于保管及保存上受限，故在測定時要求認真的考慮和熟練的技術(shù)。因此，要求更為簡便的測定方法。而且，由于這些方法在測定時需要較長的時間，故難以應對緊急的檢查。在這樣的背景下，高靈敏度且迅速的測定方法的研究開始盛行。1970年以后，以載體顆粒的凝集為指標測定免疫反應的分析方法得到實用化。該方法可通過光學測定載體顆粒的凝集程度來進行定量的分析。利用膠乳顆粒作為載體顆粒的光學測定免疫學的顆粒凝集反應的方法稱為膠乳凝集比濁法。這些分析方法的反應溫度通常在37-45。C的范圍內(nèi)進行，通過利用攪拌翼等進行攪拌，進行特異性凝集反應。此時，測定(反應)所需要的時間約為10~20分鐘，比酶免疫測定法或放射線免疫測定法快。另一方面，在測定靈敏度或測定范圍方面，據(jù)說不如酶免疫測定法等。膠乳凝集法中的粒度分布測定法也是公知的(非專利文獻1/CambiasoCL，J.Immunol.Methods.1977,18(1~2):33~44;非專利文獻2/松澤等，化學和工業(yè)，第36巻，第4號，206-208頁，1983)。膠乳凝集比濁法測定顆粒懸濁液的透光率，與此相對，在粒度分布測定法中測定分散后各個顆粒的狀態(tài)和數(shù)量。在Cambiaso等的報告中，在37。C下使抗體結(jié)合于粒徑0.8/mi的膠乳的試劑與抗原反應20分鐘。對反應后的顆粒數(shù)進行計數(shù)，根據(jù)凝集造成的顆粒數(shù)的減少水平測定抗原。顆粒數(shù)利用以激光散射光為原理的計數(shù)器進行測定。另一方面，松澤等使抗體與粒徑l戶的膠乳顆粒結(jié)合的試劑與抗原反應6小時。在反應后，利用電阻法測量平均顆粒容積，測定抗原。但是，實用化且普及了的只有使用了鞘流型激光散射法的PAMIA系統(tǒng)(SYSMEX抹式會社)。PAMIA中使用粒徑0.78//m的膠乳顆粒。在45'C下反應15分鐘后，對膠乳顆粒進行計數(shù)，進行免疫測定。PAMIA與膠乳凝集比濁法相比，具有高的靈敏度，但據(jù)說與放射免疫測定法(RIA)和酶免疫測定法(EIA)等高靈敏度免疫測定相比，則靈敏度不好。在膠乳凝集比濁法中，通常使用粒徑0.05~0.6/im的膠乳顆粒。在膠乳凝集粒度分布解析法的情況下，這樣小的顆粒容易受到測定干擾物質(zhì)的影響。例如，在血液和尿等體液中共存有脂質(zhì)、蛋白、血球成分等。這些共存物質(zhì)難以與載體顆粒識別。因此，存在不能對栽體顆粒進行正確計數(shù)的情況，為避免這些測定干擾物質(zhì)的影響，開始使用較大的顆粒。另一方面，如松澤等所述，當粒徑為1//m左右時，由于難以產(chǎn)生凝集反應，故使用了0.8/mi左右的膠乳顆粒。另外，松澤等在測量平均顆粒容積時使用的小孔(細孔)的口徑為30//m。該尺寸容易受到小孔堵塞的影響。但是，利用口徑比其大的小孔不能^:測0.8~的顆粒。另外，為促進生物學的特異性凝集反應，且容易地檢測到形成的凝集塊，對反應系統(tǒng)施加交流電壓的方法是公知的(專利文獻1/日本特開平7-83928號)。該方法通過載體顆粒的生物學的特異性凝集反應檢測或測定生物學的特異反應性物質(zhì)的存在，特征在于對該反應系統(tǒng)施加交流電壓，在10mM以上的鹽共存下達到5~50V/mm的電場強度。電場中的載體顆粒沿電場直線排列(珠鏈化)。之后，當將電場停止時，則直線排列的載體顆粒再分散。在珠鏈化時，若生物學的特異反應性物質(zhì)存在，則在將電場停止后也不會引起載體顆粒的再分散，進一步確認了珠鏈化的載體的存在。上述測定方法利用該現(xiàn)象。即，在電場中，生物學的特異反應性物質(zhì)的反應得到促進。而且，如能在將電場停止后使載體顆粒再分散，則可檢測到反應生成物。利用了珠鏈化的免疫學測定方法，通過以三維信息為指標對載體顆粒進行計數(shù)，可以進一步改善其測定精度(專利文獻2/PCT小冊子WO2004/111649)。專利文獻1:日本特開平7-83928專利文獻2:WO2004/111649專利文獻3:日本特開平10-48214專利文獻4:日本特開2002-107365專利文獻5:WO2001/96868非專利文獻l:CambiasoCL，J.Immunol.Methods.1977,18(1~2):33-44非專利文獻2:松澤等，化學和工業(yè)，第36巻，第4號，206~208頁，198
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題不僅利用載體顆粒的方法，在血液樣品的分析中，通常利用分離了血球成分的血清或血漿作為樣品。其理由之一是血球成分妨礙測定。例如，光學性檢測載體顆粒的凝集時，若樣品中存在紅細胞等著色成分，則有可能干擾測定結(jié)果。或者，如利用了珠鏈化的免疫測定，在包括對顆粒進行計數(shù)的步驟的方法中，也可能將血球成分誤計為載體顆粒。血球成分的分離需要離心分離操作或使用過濾器的分離操作。如果能提供可利用全血作為樣品的免疫測定方法，可以省略上述操作。特別是對非常緊急的檢查，如果能實現(xiàn)可利用全血作為樣品的免疫測定方法，將會是有用的。為了解決上迷課題，有人提出了利用溶血后的全血樣品光學測定栽體顆粒凝集的方法(日本特開平10-48214)。該方法中，利用表面活性劑作為溶血劑。但是表面活性劑有可能阻礙免疫反應?；蛘?，在免疫反應后添加溶血劑進行溶血的方法(日本特開2002-107365)中，也許表面活性劑對免疫反應的影響小。但需要制備含有溶血劑的特殊的稀釋液。如果能提供不改變試劑組成即可以分析全血樣品和血清樣品的方法，將會是有用的?；蛘撸部梢酝ㄟ^超聲波處理等物理性破壞血球成分。然而為了上迷目的，必須在分析裝置中裝備物理性破壞血球成分的設備。另外，在對凝集顆粒和非凝集顆粒進行光學計數(shù)的方法中，利用比血球小的載體顆粒，將全血樣品作為樣品的嘗試是已知的(PCT小冊子WO2001/96868;日本公表2004-503779)。該方法中，沒有利用溶血劑。如果在利用了珠鏈化的免疫學測定方法中，也能實現(xiàn)將全血樣品作為樣品的方法，將會是有用的。即，本發(fā)明的課題在于提供在利用了珠鏈化的親和物質(zhì)的測定方法中，使用含有血球成分的樣品作為樣品的方法。解決課題的手段本發(fā)明人等為了解決上述課題，對不易受血球成分干擾的測定方法反復進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過電破壞血球成分，即使在血球成分的存在下，也可以對凝集的、或者未凝集的載體顆粒進行特異性計數(shù)，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及以下的測定方法。一種包括以下步驟的親和物質(zhì)的測定方法，其中測定對象親和物質(zhì)包含在含血球成分的介質(zhì)中，該測定方法在步驟(i)或(r)中、或步驟(i)或(r)之前、或者步驟(i)或(r)中和步驟(i)或(r)之前包括電破壞血球成分的步驟，(1)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的載體顆粒和測定對象親和物質(zhì)混合得到的反應液施加電壓脈沖的步驟；(2)在進行步驟(i)后，對通過與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及不與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而未形成凝集塊的載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3)在進行步驟(2)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的載體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟，或者(r)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的載體顆粒、測定對象親和物質(zhì)與凝集試劑成分混合得到的反應液施加電壓脈沖的步驟，其中上述栽體顆粒通過凝集試劑凝集，并且利用測定對象親和物質(zhì)阻礙其凝集；(2，)在進行步驟(r)后，對通過與凝集試劑結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及利用與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而阻礙凝集的載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3，)在進行步驟(2，)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的載體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟。[l]所述的方法，其中血球成分通過10~70V/mm的交流電壓脈沖破壞。〖3〗[2]所述的方法，其中血球成分通過40~70V/mm的交流電壓脈沖破壞。[3]所述的方法，其中血球成分通過50~60V/mm的交流電壓脈沖破壞。[l]所述的方法，其中在步驟(2)或(2，)中，物理性測定凝集塊或載體顆粒的三維信息。[5j所述的方法，其中用于物理性測定三維信息的方法為選自電阻法、激光衍射散射法和三維圖像解析法中的任一種方法。(7〗[1]所述的方法，其特征在于，在步驟(2)或(2，)中，將電場停止后，對載體顆粒進行計數(shù)。所述的方法，其中在步驟(2)或(2，)中，將電場停止后，進一步包括對載體顆粒進行稀釋的步驟。所述的方法，其特征在于，施加多次電壓脈沖。[9]所述的方法，其中施加電壓脈沖后，包括使載體顆粒分散，再施加隨后的電壓脈沖的步驟。[9]所述的方法，其中多次電壓脈沖為不同方向的電壓脈沖。[l]所迷的方法，其中載體顆粒的平均粒徑為1拜以上。[13][12]所述的方法，其中載體顆粒的平均粒徑為l/im~20/mi。發(fā)明效果成分的樣品中的親和物質(zhì)的方法。在本發(fā)明中，即使樣品含有血球成分也可以測定親和物質(zhì)。因此，例如將全血樣品作為樣品，不必分離血球成分，也可測定血液中的親和物質(zhì)。分離血球成分的操作耗時且費事。因此，例如在緊急的檢查中，提供可利用全血作為樣品的測定方法是有用的。另一方面，利用了珠鏈化的免疫測定通過電場強化了載體顆粒的免疫學凝集。其結(jié)果是，使用在通常條件下被認為不適合凝集反應的、較大的載體顆粒就可以實現(xiàn)有效的免疫反應。使用大的載體9顆粒有助于提高測定精度。另外，利用了珠鏈化的免疫測定也是可以使用微量樣品、在短時間內(nèi)、且以高敏感度檢測親和物質(zhì)的方法。因此，通過利用了珠鏈化的免疫測定來實現(xiàn)以全血作為樣品的測定方法的本發(fā)明意義重大。另外，本發(fā)明的測定方法中血球成分被電破壞。為此，可能干擾免疫反應的溶血劑在本發(fā)明中是不需要的。或者也不必準備含有溶血劑的特殊試劑。此外，在原本利用了珠鏈化的免疫測定中，使用用于對反應液施加電場的電才及。因此，通過同樣的電4及施加電場可以電破壞血球成分。即不必為了破壞血球成分而裝備附加的設備。并且，本發(fā)明的優(yōu)選方案中，通過用血球成分的體積校正測定值，也可以確定測定對象物質(zhì)的血清濃度。全血中所含血球成分的比例在不同受檢者之間差異很大。或者即使是同一受檢者，血球成分比例的變動幅度也較大。例如即使血清濃度沒有差異，在血球成分比例不同的情況下，全血中的物質(zhì)濃度存在差異。即，血球成分多的受檢者的全血中的物質(zhì)濃度較血球成分少的受檢者的全血中的物質(zhì)濃度低。為此，血液中的物質(zhì)濃度通常基于血清濃度進行比較。由于血清濃度是除去了血球成分比例的影響的數(shù)值，故能夠更準確地比較受檢者之間的數(shù)值。本發(fā)明的優(yōu)選方案中，除了對載體顆粒進行計數(shù)，另外可以確定在作為測定對象的含有血球成分的介質(zhì)中的血球成分體積。根椐確定的血球成分的體積校正測定對象物質(zhì)的測定值，可以明確測定對象物質(zhì)的血清濃度。即，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，即使使用全血作為樣品，也可以在不必進行血清分離操作的條件下分析測定對象物質(zhì)，進而可以求出血清濃度。圖1(A)表示本發(fā)明的設備的構(gòu)成，(B)表示脈沖施加槽的截面。圖2表示通過本發(fā)明的方法破壞全血成分、進行血球成分的粒度分布測定的結(jié)果?？v軸表示數(shù)出的顆粒數(shù)，橫軸表示顆粒的體積圖3表示通過超聲波或表面活性劑(Tween20或TritonX-lOO)破壞血球成分、進行血球成分的粒度分布測定的結(jié)果?？v軸表示數(shù)出的顆粒數(shù)，^f黃軸表示顆粒的體積/mi3。符號說明1:分注+攪拌設備2:溫度控制機構(gòu)3:反應槽4:電極(脈沖施加設備)5:稀釋設備6:粒度分布測定設備實施發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及包括以下步驟的親和物質(zhì)的測定方法，該測定方法的特征在于測定對象親和物質(zhì)包含在含血球成分的介質(zhì)中，該測定方法在步驟(i)或(r)中、或步驟(i)或(r)之前、或者步驟(i)或(r)中和步驟(i)或(r)之前包括電破壞血球成分的步驟，(1)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的載體顆粒和測定對象親和物質(zhì)混合得到的反應液施加電壓脈沖的步驟；(2)在進行步驟(l)后，對通過與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及不與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而未形成凝集塊的載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3)在進行步驟(2)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的載體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟，或者(r)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的載體顆粒、測定對象親和物質(zhì)與凝集試劑成分混合得到的反應液施加電壓脈沖的步驟，其中上述載體顆粒通過凝集試劑凝集，并且利用測定對象親和物質(zhì)阻礙其凝集；(2，)在進行步驟(r)后，對通過與凝集試劑結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及利用與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而阻礙凝集的載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3，)在進行步驟(2，)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的栽體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟。本發(fā)明中的親和物質(zhì)及與親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體包括可構(gòu)成結(jié)合反應的所有物質(zhì)的組合。即，在某種物質(zhì)和某種物質(zhì)結(jié)合時，一種為親和物質(zhì)，另一種為結(jié)合配偶體。本發(fā)明中的親和物質(zhì)及結(jié)合配偶體既可以為天然物質(zhì)，也可以為人工合成的化合物。另外，親和物質(zhì)及結(jié)合配偶體既可以為純化的物質(zhì)，也可以允許雜質(zhì)共存。而且，親和物質(zhì)及結(jié)合配偶體也可以存在于細胞或病毒的表面。在本發(fā)明中，作為親和物質(zhì)和結(jié)合配偶體的結(jié)合反應的例子，例如有如下所示的反應。構(gòu)成這些反應的物質(zhì)都可以作為本發(fā)明的親和物質(zhì)或結(jié)合配偶體抗原或半抗原和抗體的反應(免疫反應)，具有互補核苷酸序列的核酸之間的雜交，凝集素和其受體的反應，凝集素和糖鏈的反應，配位體和受體的反應，DNA和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的反應。在上述結(jié)合反應中，作為本發(fā)明中優(yōu)選的結(jié)合反應，例如有免疫反應。作為構(gòu)成免疫反應的抗原，有如下所示的物質(zhì)。這些抗原不僅是抗原分子本身，也可以是其片段或存在于細胞表面的狀態(tài)。應說明的是，這些物質(zhì)是抗原物質(zhì)的例子，本發(fā)明當然也可應用于其它抗原物質(zhì)。例如，可基于使用膠乳、血球等作為載體的免疫學腫瘤標記AFP、CEA、CA19-9、PSA等，凝固纖維蛋白溶解系統(tǒng)標記蛋白質(zhì)C、蛋白質(zhì)S、抗凝血酶(AT)III、FDP、FDP-D-二聚物等，感染癥標記CRP、ASO、HBs抗原等，激素促甲狀腺素(TSH)、催乳激素、胰島素等，組織成分肌紅蛋白、肌球蛋白、BNP(腦鈉尿肽)、血紅蛋白等，其它DNA等核酸等?？梢詫⒖乖晕镔|(zhì)和識別該抗原性物質(zhì)的抗體的任一種作為親和物質(zhì)，另一種作為結(jié)合配偶體利用。在本發(fā)明中的親和物質(zhì)是在將該物質(zhì)作為測定對象時稱為親和物質(zhì)。另一方面，結(jié)合配偶體是指可作為用于測定親和物質(zhì)的探針使用的、相對該親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的物質(zhì)。因此，在測定抗原時，可將抗體作為結(jié)合配偶體來利用。相反，在測定抗體時，可將識別該抗體的抗原作為結(jié)合配偶體來利用。例如，可基于使用膠乳、血球等作為載體的免疫學凝型肝炎病毒表面抗原)、HBc(B型肝炎病毒核心抗原)、HCV(C型肝炎)、HIV(AIDS病毒)、TP(梅毒)等的抗體利用免疫學凝集反應進行測定。用于以載體顆粒的凝集作為指標測定親和物質(zhì)和結(jié)合配偶體的反應的若干反應原理是公知的。這些反應原理都可以在本發(fā)明中應用。下面例舉以載體顆粒的凝集作為指標的、利用了親和物質(zhì)和結(jié)合配偶體的反應的測定原理。直接凝集反應利用測定對象物質(zhì)和載體顆粒上的結(jié)合配偶體的反應檢測栽體顆粒的凝集。例如，利用作為結(jié)合配偶體的抗體測定抗原分子的情況屬于該原理?；蛘吲c之相反，以結(jié)合了抗原的栽體顆粒的凝集作為指標，測定作為親和物質(zhì)的抗體的情況也屬于該原理。在直接凝集反應中，通常凝集水平和作為測定對象物質(zhì)的親和物質(zhì)的量成正比。即，在凝集塊的形成水平高時，親和物質(zhì)的水平(即濃度)高。相反，在未形成凝集塊的載體顆粒的水平高時，親和物質(zhì)的水平(即濃度)低。凝集抑制反應抗原介導的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。為此，利用直接凝集反應原理不能檢測半抗原。因此，利用將多個分子的半抗原或含有其表位的片段結(jié)合于載體上而成的多聚半抗原與載體顆粒上的抗體的結(jié)合引起的凝集反應。多聚半抗原由于可將多個抗體分子交聯(lián)，故使載體顆粒凝集。但是，當半抗原存在時，多聚半抗原和抗體的反應被抑制，且載體顆粒的凝集被抑制。凝集抑制的水平與半抗原的存在成正比。換言之，測定對象物質(zhì)的量和凝集反應的水平成反比。即，在凝集塊的形成水平高時，親和物質(zhì)的水平(即濃度)低。相反，在未形成凝集塊的載體顆粒的水平高時，親和物質(zhì)的水平(即濃度)高?！し诸悶榘肟乖臏y定對象抗原例如有如下成分激素雌激素、雌二醇，藥劑茶堿在本發(fā)明中，為了根據(jù)凝集抑制反應的原理測定半抗原，可以使結(jié)合有抗半抗原抗體的栽體顆粒凝集的成分是必要的。在本發(fā)明中，將可使結(jié)合了抗半抗原抗體的載體顆粒凝集的成分稱為凝集試劑。凝集試劑定義為具有與抗體的特異親和性并且具有通過與抗體結(jié)合將載體顆粒交聯(lián)的作用的試劑。如前所述的多聚半抗原在半抗原的測定中可以作為凝集試劑使用。不管是直接凝集反應，還是凝集抑制反應，對預先含有一定量的親和物質(zhì)的標準試劑，都可以相同的反應系統(tǒng)進行測定，測定凝集塊或未凝集的載體顆粒的水平，制作標準曲線或回歸式。若通過測定樣品得到的凝集塊的形成水平或未凝集的載體顆粒的水平適用于標準曲線或回歸式，則可確定樣品中親和物質(zhì)的水平。在本發(fā)明中，結(jié)合配偶體與栽體顆粒結(jié)合使用。本發(fā)明的載體顆粒例如有膠乳顆粒、高嶺土、膠體金、明膠、脂質(zhì)體等。膠乳顆?？墒褂迷谀磻型ǔＪ褂玫念w粒。聚苯乙烯類膠乳、聚乙烯基甲苯類膠乳、聚曱基丙烯酸酯類膠乳顆粒是公知的。優(yōu)選的顆粒載體是聚苯乙烯類膠乳顆粒。也可以使用通過具有官能團的單體的共聚將官能團導入膠乳顆粒表面的膠乳顆粒。例如，具有_COOH、-OH、-NH2、-S03等官能團的膠乳顆粒是公知的?？稍诰哂泄倌軋F的膠乳顆粒上化學性結(jié)合結(jié)合配偶體。例如在膠乳顆粒的情況下，載體顆粒的平均粒徑優(yōu)選0.5~20/mi。當平均粒徑為0.5//m以下或20戶以上時，難以形成珠鏈，不優(yōu)選。例如在膠乳顆粒的情況下，載體顆粒的平均粒徑具體地為1—10//m，進一步4尤選為1.4~10拜，最4尤選為1.4~5//m，例如為1.4~1.6//m。另外，通過使用電介質(zhì)極化大的橢圓形顆粒，也可以使用更小的載體顆粒。這樣，與公知的膠乳凝集比濁法中的載體顆粒為0.05~0.6//m相比，在本發(fā)明的方法中，可利用l//m以上的大尺寸的顆粒。通過利用施加電壓脈沖的步驟促進了凝集反應，其結(jié)果是，即使為大尺寸的顆粒，也可以在短時間內(nèi)進行充分的反應。載體顆粒大具有如下所述的優(yōu)點首先，可將用于測量顆粒的孔徑增大，其結(jié)果是小孔難以堵塞。另外，通過增大載體顆粒，與體液中含有的測定干擾物質(zhì)的識別變得容易，其結(jié)果是測定精度提高。合。從業(yè)者可適當選擇兩者的結(jié)合方法。例如，可在膠乳顆粒上物理吸附抗原或抗體、或它們的片段等蛋白質(zhì)。在表面具有官能團的膠乳顆粒上，可化學結(jié)合可與該官能團共價結(jié)合的取代基。例如，可在具有-COOH的膠乳上結(jié)合蛋白質(zhì)的-NH2。結(jié)合了結(jié)合配偶體的載體顆?？筛鶕?jù)需要進行封閉。具體地說，通.過由非活性蛋白質(zhì)處理載體顆粒表面，可防止相對于載體顆粒表面的非特異性蛋白質(zhì)的結(jié)合。作為非活性蛋白質(zhì)，可使用牛血清白蛋白或脫脂乳粉等。另外，為提高栽體顆粒的分散性，可向分散介質(zhì)中添加表面活性劑或糖類。另外，為防止微生物的繁殖，也可以向顆粒載體中添加抗菌劑。另一方面，本發(fā)明中的血球成分是指血液中存在的固形成分。具體地說，紅細胞、白細胞、或血小板等包括在血球成分中。lmm3成人血液中各血球成分的數(shù)量和大小如下。應說明的是，紅細胞數(shù)女性為450萬個、幼兒為690萬個，與成人男性不同。紅細胞約500萬個(男性)大小約8戶、厚度約2/im白細月包平均約7,500個大小約614/mi血小板約1436萬個大小約2-3/mi(直徑約2//m，圓盤狀)因此，含有血球成分的介質(zhì)是指含有上迷的存在于血液中的固形成分的介質(zhì)。具體地說，在含有血球成分的介質(zhì)中例如含有如下的介質(zhì)。其中，全血是本發(fā)明的優(yōu)選介質(zhì)。全血、稀釋的全血、或含有全血的血球成分的部分在本發(fā)明中，為了實現(xiàn)含有血球成分的樣品的測定，利用了電破壞血球成分的步驟。血球成分的電破壞是指對含有血球成分的樣品施加電場、物理性破壞血球。本發(fā)明中的破壞是指使血球處于如下狀態(tài)即在上述步驟(2)或(2，)中，以三維信息為指標對載體顆粒進行計數(shù)時，血球成分不能作為顆粒計數(shù)。紅細胞或白細胞通過細胞膜的破壞，作為細胞的形狀不能維持。該狀態(tài)也可稱為血球成分的破裂。其結(jié)果是，細胞膜被破壞的血球細胞不能以三維信息為指標計數(shù)。即，本發(fā)明的血球細胞的破壞包括血球細胞的細胞膜的破壞。當本發(fā)明的介質(zhì)是全血時，介質(zhì)中所含血球成分的大部分為紅細胞。紅細胞的細胞膜的破壞特稱為溶血。溶血是指紅細胞的細胞膜被破壞、細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)漏出的狀態(tài)。因此，本發(fā)明的血球成分的破壞包括溶血。本發(fā)明中，應破壞的血球成分為介質(zhì)中所含血球成分的至少50%以上，例如70%以上、或80%以上，優(yōu)選為介質(zhì)中所含血^泉成分的至少85~95%。破壞的血球成分的比例可通過在電破壞前后比較血球成分來確認。通常，如果載體顆粒濃度(w/v。/。)是相同的，包含小載體顆粒的懸浮液在相同體積中的顆粒數(shù)多。一般情況下，載體顆粒數(shù)多的懸浮液與少的懸浮液比4交，反應液中血J求成分的數(shù)目相對變少。即可以說顆粒數(shù)多的懸浮液不易受血球成分的影響。例如，當使用粒徑(()))為1~4.5//m的膠乳顆粒作為載體顆粒時，其與紅細胞數(shù)的比例如下變化。應說明的是，反應液的組成基于(全血樣品+第1試劑Rl):第2試劑R2-(l+9):10進行計算。膠乳顆粒數(shù)/紅細胞數(shù)0.125%0.250%0.500%2戶1.152.34.64.5戶0.10.20.4在對栽體顆粒進行計數(shù)時未破壞的血球成分殘留的條件下，優(yōu)選反應液中所含血球成分的比例低。具體地說，破壞前的反應液中膠乳顆粒數(shù)與血球成分之比可以調(diào)整為例如1:1-30:1、或4:120:1。但是，當幾乎徹底進行血球破壞時，即使混入更大量的血球成分，當然也可以防止血^求成分的干擾。另夕卜，本發(fā)明中，通過電破壞血球，血球成分的容積通常變化為3//m以下。因此，使用粒徑為3/im以上的載體顆粒時，不易受血球成分的影響。在本發(fā)明中，血球成分被電破壞。電破壞血球成分是指對含有血球的液體施加電場，通過電刺激破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)。具體地說，電破壞血球成分包括向含血球成分的液體所接觸的電極通電的步驟。施加條件可以考慮以下條件，在不造成應測定的親和物質(zhì)或施加電壓的液體電變性或分解的范圍內(nèi)適當調(diào)節(jié)。首先，與電壓的高低成正比，介質(zhì)電解的可能性提高。當電壓和施加時間恒定時，與電源頻率成反比，介質(zhì)電解的可能性提高。而頻率低的情況血球成分容易破壞。而且當電壓和頻率恒定時，與施加時間成正比，介質(zhì)電解的可能性提高。具體地說，可以利用例如為10~70V/mm、通常為30~70V/mm,優(yōu)選為50~60V/mm的電壓。本發(fā)明中，電破壞所利用的電源可以是直流也可以是交流。優(yōu)選的電源為含有交流成分的電源、或交流電源。交流電源的頻率例如為10KHz10MHz、通常為100KHzlMHz，優(yōu)選為300KHz~600KHz。在上述條件下，可以在5秒-3分鐘、或5秒~60秒，例如10~30秒之間選擇破壞血球成分的施加條件。本發(fā)明中，血球成分可以在對載體顆粒進行計數(shù)的步驟(2)或(2，)之前破壞?？梢詢?yōu)選在上述步驟(l)或(l，)之前破壞血球成分。通常，用于親和物質(zhì)和結(jié)合配偶體的反應所施加的電場與用于破壞血球所提供的電場的條件不同。為此，優(yōu)選上述步驟(i)或(r)之前提供用于破壞血球成分的電場條件。但提供給反應液的電場可以連續(xù)地變化。因此，在步驟(i)或(r)中，可以連續(xù)地施加用于親和物質(zhì)和結(jié)合配偶體的反應所施加的電場及用于破壞血球所提供的電場。本發(fā)明包括對含有親和物質(zhì)和載體顆粒的反應液施加電壓脈沖的步驟。使載體顆粒在電場中排列進行凝集反應的方法是公知的(特開平7-83928號)。即，通過對含有親和物質(zhì)和栽體顆粒的反應液施加電壓脈沖，可使載體顆粒沿電場排列。此時，在利用凝集抑制反應的原理的情況下，使親和物質(zhì)和載體顆粒在凝集試劑的共存下排列。凝集試劑可在栽體顆粒和測定對象親和物質(zhì)接觸后接觸?；蛲ㄟ^在預先混合測定對象親和物質(zhì)和凝集試劑后添加載體顆粒，可同時使三種成分接觸。電壓脈沖可利用交流成分或直流成分。也可以將兩者任意組合。反應液由于容易產(chǎn)生電解，故優(yōu)選交流電壓。交流電壓可使用方形波、矩形波、或正弦波等?？筛Х磻?試劑)的離子強度任意設定交流電壓的電源頻率。施加交流電壓以得到用峰值表示時為5-50V/mm的電解強度。當電解強度小于5V/mm時，難以引起載體的珠鏈化，因此，凝集反應的促進不充分。當電解強度超過50V/mm時，反應液容易引起電解，難以測定凝集反應。更優(yōu)選施加交流電壓以得到10~20V/mm的電場強度。交流的頻率優(yōu)選為10KHzlOMHz的頻率。更優(yōu)選為50KHzlMHz的頻率。在本發(fā)明中，電壓脈沖通常是指具有電壓從穩(wěn)定狀態(tài)轉(zhuǎn)換，僅持續(xù)有限的時間就返回至U原來的狀態(tài)的波或波形的電壓。交流電壓是代表性的電壓脈沖。交流電壓是電壓平均值為0的時間的周期函數(shù)。例如，具有正弦波、矩形波、方形波、或鋸齒波等的電壓的振幅明顯是周期性的，包括在交流電壓中。通常，在交流電壓中，在任意一個周期，正電位側(cè)的面積和負電位側(cè)的面積相等，兩者合計為0。各面積是橫軸(電位差為O)和上側(cè)的曲線、或下側(cè)的曲線限定的面積。在本發(fā)明中，為防止反應液的電解，施加電壓脈沖。因此，在不會引起反應液的電解，或即使引起電解也可以被抑制在實質(zhì)上不千擾反應的水平的情況下，也可以使用正電位和負電位的合計不為0的電壓》P中。在本發(fā)明中，方形波或矩形波的電壓脈沖指包括重復正電位/電位差0/負電位，并且正電位及負電位的至少一個的電壓為一定狀態(tài)的電源。而且，方形波或矩形波的電位差從o狀態(tài)到下一個o狀態(tài)之間的時間是脈沖寬度。應說明的是，方形波是指，在將電壓的變化畫成縱軸為電壓、橫軸為時間的圖表時，大致形成四角形的形狀的電壓脈沖。四角形包括正方形和長方形。與此相對，矩形波是不包括正方形的長方形的電壓脈沖。因此，矩形波包括在方形波中。在本發(fā)明中，優(yōu)選的脈沖寬度通常為50//秒以下。優(yōu)選的脈沖寬度可例舉0.1~10//秒。構(gòu)成方形波或矩形波的電位差為0的狀態(tài)的時間沒有限制。一般地說電位差為O是在正電位和負電位之間轉(zhuǎn)換的瞬間。但是，電如，在具有0.1~10/y秒的脈沖寬度的正電位/負電位的循環(huán)之間，可包含O.l~100/^秒的電位差為0的狀態(tài)。本發(fā)明中，對電壓脈沖施加時反應液的溫度沒有限定。通?？梢允荗~2(TC，例如為0~15°C、優(yōu)選為1~8。C或2~4°C。通過電壓脈沖的施加，反應液的溫度上升。因此，為了使反應液的溫度保持低溫，利用冷卻設備是有利的。用于制造局部低溫環(huán)境的優(yōu)選冷卻設備有例如珀耳帖元件。珀耳帖元件是采用利用了珀耳帖(JeanCharlesA.Peltier)發(fā)現(xiàn)的珀耳帖效應的半導體構(gòu)成的電子元件。當直流電流通過N型和P型的半導體時，其中一個半導體的溫度被吸收，另一個半導體發(fā)生放熱(熱交換現(xiàn)象)。溫度被吸收的一側(cè)的溫度降低、冷卻。市售的珀耳帖元件通常具有-l(TC左右的冷卻能力。珀耳帖元件的冷卻能力可以通過供給半導體的電流而自由控制。因此，在施加電壓脈沖期間，通過溫度傳感器監(jiān)測反應液的溫度，根據(jù)需要使珀耳帖元件運轉(zhuǎn)，從而可以在規(guī)定的溫度范圍內(nèi)維持反應液的溫度?；蛘?，在電壓脈沖施加時充分冷卻反應液，電壓脈沖的施加后反應液的溫度仍在規(guī)定范圍內(nèi)的情況下，電壓脈沖施加時未必需要冷卻。例如電壓脈沖的施加結(jié)束時，如果反應液的溫度為20。C以下，即使施加期間不冷卻也可以滿足必要的溫度條件。如果可以預先充分冷卻反應液，再根據(jù)需要抑制反應液放置的環(huán)境的溫度上升，在電壓脈沖施加期間，積極的冷卻不是必需的。本發(fā)明中，施加電壓脈沖的反應液可以預先溫育。溫育的條件如后所述。反應液在37-90。C的高溫下進行溫育的情況下，施加電壓脈沖前充分冷卻。通常，反應液的體積為ImL以下，故反應液在極短的時間可以冷卻。將高溫下溫育的反應液冷卻，然后在0~20°C施加電壓脈沖的條件是本發(fā)明的優(yōu)選條件。電壓脈沖施加時的溫度上升阻礙凝集反應的作用機制可考慮如下。在施加了電壓脈沖的反應液中，載體顆粒的排列和分散重復發(fā)生。栽體顆粒上的結(jié)合配偶體及反應液中的親和物質(zhì)(或凝集試劑成分)的接觸機會增加，因此載體顆粒的分散有效。同時，多個栽體顆粒與親和物質(zhì)(或凝集試劑成分)結(jié)合而交聯(lián)，形成凝集塊，因此載體顆粒的排列有效。但是，在反應液中的載體顆粒運動激烈的情況下，載體顆?？赡懿荒艹浞峙帕小７磻簻囟壬仙臓顟B(tài)可以說是反應液中所含的載體顆粒的布朗運動變得激烈，電壓施加時載體顆粒難以排列的狀態(tài)。其結(jié)果，通過施加電壓阻礙了載體顆粒的排列，阻礙了凝集反應。在基于本發(fā)明的電壓脈沖施加時反應液的溫度被控制的情況，通過電壓施加可以充分得到載體顆粒的排列效果，可以抑制因溫度上升而導致的對凝集反應的阻礙。為了抑制施加了電壓脈沖的反應液中的載體顆粒的運動，提高反應液的粘度也是有效的。一般的凝集反應的反應液不足0.75mPas(帕斯卡'秒或泊(P))。上述粘度不能抑制載體顆粒的運動，可能阻礙凝集反應。與此相對，本發(fā)明人確認，在0.8mPas以上的粘度可以有效地促進凝集反應。即本發(fā)明提供用于凝集載體顆粒的方法，該方法包括對反應液施加電壓脈沖的步驟，其中所述反應液含有栽體顆粒和特定物質(zhì)，所述載體顆粒結(jié)合有與上述特定物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體，該方法的特征在于，施加電壓期間反應液的粘度為0.8mPas以上。更具體地說，本發(fā)明提供包括上述步驟(l)~(3)或(1，)(3，)的親和物質(zhì)的測定方法，其中反應液的粘度為0.8mPas以上。本發(fā)明中，反應液的粘度通常為0.8mPas以上、例如為1~3mPas,優(yōu)選為12mPas。反應液的粘度可以通過添加可調(diào)節(jié)粘度的化合物進行調(diào)節(jié)。可調(diào)節(jié)粘度的化合物可以利用不干擾親和物質(zhì)與結(jié)合配偶體的結(jié)合的任意的化合物。例如，可以通過添加牛血清白蛋白、酪蛋白、甘油、蔗糖或氯化膽堿等來提高反應液的粘度。上述化合物的添加量，例如可以/人0.05~5%的范圍適當選擇。更優(yōu)選為0.1~3%，進一步優(yōu)選為0.3~1%。另外，即使反應液的組成相同，如果反應液的溫度降低，則一般情況下粘度增高。因此，在提高反應液的粘度方面，在低溫條件下施加電壓脈沖是有效的。從業(yè)者通過將上述化合物添加到反應液中，在施加電壓脈沖的溫度條件下測定其粘度，可以設定適當?shù)奶砑恿?。確定液體粘度的方法是公知的。通常使用旋轉(zhuǎn)粘度計、超聲波粘度計或振蕩粘度計等。在本發(fā)明中，可對反應液從任意方向施加電壓U^沖。例如，也可以施加多個不同方向的電壓脈沖。具體地說，例如可將兩組電極組合，對反應液施加電壓脈沖?；蛘?，可通過使電極相對于反應液移動，給予不同方向的電壓脈沖。例如，可通過使電極旋轉(zhuǎn)，給予任意角度的電壓脈沖。移動的電極數(shù)既可以為一組，也可以使兩組以上的電極移動。通常，由于反應系統(tǒng)中載體顆粒的濃度越高，越容易形成珠鏈，因此凝集得到促進。但在另一方面，伴隨載體顆粒的濃度上升，在生物學的特異反應性物質(zhì)不存在的情況下，進行再分散時載體顆粒的凝集率(背景)有變大的傾向。在根據(jù)二維信息觀測凝集顆粒的公知的方法(特開平7-83928號)中，載體顆粒的濃度越高，未凝集的顆粒誤被作為凝集顆粒捕捉的可能性越高。在顆粒濃度高的情況下，由于顆粒接近，故單純顆粒的重疊與因凝集而形成的顆粒塊的識別變得困難。因此，為特異性識別凝集塊，必須使顆粒濃度保持為低濃度。具體地說，特開平7-83928號中公開的反應系統(tǒng)中的栽體顆粒的濃度，在例如為膠乳顆粒的情況下，優(yōu)選為0.011重量％，更優(yōu)選為0.025~0.5重量％，最優(yōu)選為0.05~0.1重量％。這樣的顆粒濃度在珠鏈化中未必是最優(yōu)的條件。即，在根據(jù)二維信息對凝集塊進行計數(shù)的方法中，通過犧牲顆粒濃度來實現(xiàn)凝集塊的特異性識別。本發(fā)明由于基于三維信息測量凝集顆粒，故可以與顆粒濃度無關地對凝集塊進行特異性識別。其結(jié)果是，可給予形成珠鏈的最適宜條件。即，可考慮測定對象親和物質(zhì)和具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的平衡，確定載體顆粒的濃度。即使選擇高的載體顆粒濃度，凝集塊也會被特異性檢測到。在本發(fā)明中，通常反應系統(tǒng)中載體顆粒的濃度，例如在膠乳顆粒的情況下優(yōu)選為0.01~5重量％，更優(yōu)選為0.1~2重量％。該濃度范圍是基于二維信息的方法的2倍~10倍。最適宜的載體顆粒的濃度可相應于載體顆粒的大小或測定對象親和物質(zhì)的測定靈敏度等適宜調(diào)節(jié)。在本發(fā)明中，可向反應液中添加促進凝集反應的鹽。例如，通過以10mM以上較高的濃度添加鹽，可促進凝集反應。但是，當鹽的濃度在反應系統(tǒng)中以600mM以上的濃度存在時，由于容易發(fā)生反應液的電解，故不優(yōu)選。更優(yōu)選的鹽的濃度為10~300mM,最優(yōu)選的鹽的濃度為25~150mM。生物體祥品自身可能含有促進凝集反應的鹽的情況下，可以調(diào)整試劑的鹽濃度，使反應液中的最終鹽濃度達到上述范圍。應說明的是，在使用直流成分作為電壓脈沖的情況下，由于在鹽濃度約6mM的反應液中也發(fā)生電解，故在鹽存在下難以測定生物學的特異性凝集反應。本發(fā)明的鹽可從促進生物學的特異性凝集反應的物質(zhì)中選擇。例如有氯化鈉、氯化鉀、硝酸鈉、硝酸鉀、氯化銨，但不限于此。在10mM、25。C水溶液中的摩爾電導率為100cn^/(amol)以上的鹽優(yōu)選作為用于本發(fā)明的鹽。更具體地說，例如氯化鈉、氯化鉀、及氯化銨等可作為優(yōu)選的鹽。在本發(fā)明中，含有血球成分的介質(zhì)可以為原液，或者自動稀釋后在測定時使用。稀釋倍率可任意設定。反應所需要的試劑為多種時，也可以按順序添加多種的試劑。作為構(gòu)成在此所說的多種試劑的試劑，例如可示出如下試劑。在本發(fā)明中，可使用用于預先分解和/或吸收導致非特異反應的物質(zhì)的試劑。這種試劑作為包含非特異抑制劑的試劑是有用的。包含非特異抑制劑的試劑與包含載體顆粒的試劑組合，構(gòu)成多種的試劑。包含非特異抑制劑的試劑例如可預先與檢樣混合。非特異抑制劑例如可使用現(xiàn)有技術(shù)公知的試劑。在免疫測定中，導致非特異反應的各種物質(zhì)包含在樣品中是已經(jīng)明確的。例如，類風濕因子等球蛋白類有時干擾構(gòu)成兔疫測定的免疫反應。為防止球蛋白類干擾免疫測定，使用非特異抑制劑。例如，利用識別球蛋白類的抗體可以吸收該非特異作用。類風濕因子是來自IgG或IgM的球蛋白。因此，通過使用抗人IgG抗體、或抗人IgM抗體，可吸收類風濕因子。另外，利用導致非特異的物質(zhì)的分解防止干擾的方法也是公知的。具體地說，已知通過還原將球蛋白類分解，可以抑制該干擾作用。球蛋白類被二硫蘇糖醇或2-巰基乙醇等還原。偶體的載體顆粒的試劑。通過這種組成，可同時測定不同種類的測定對象親和物質(zhì)。各試劑可分別各自進行添加?；蛘?，也可以預先將多種試劑混合后，與檢樣混合。優(yōu)選檢樣和試劑在施加電壓之前預先混合?？墒褂脭嚢杵鲗烧呶锢砘旌?。或者也可以利用電的方法將兩者混合。電的方法例如有通過斷續(xù)地施加不同方向的電壓脈沖，使載體顆粒的位置物理性移動的方法。本發(fā)明中，可以對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的栽體顆粒、測定對象親和物質(zhì)混合得到的反應液預先溫育。本發(fā)明人通過溫育施加電壓脈沖前的反應液，確認到可以促進施加電壓脈沖后的凝集塊的形成。即，通過施加電壓脈沖前的溫育可以使反應得到促進。在以促進反應為目的的溫育步驟中，可以施加用于破壞血球成分的電壓脈沖?；蛘撸部梢栽跍赜盎蛑箅娖茐难?。當在溫育之前破壞血球時，通過施加電壓脈沖使反應液的溫度上升。其結(jié)果是，可以調(diào)節(jié)為適合溫育的溫度。反應液的溫育例如在室溫以上的溫度下實施。溫育的溫度只要能維持反應液中所含的各種反應成分的活性即可，優(yōu)選盡可能高的溫度。對溫育的時間沒有限定。即，在溫育的溫度下，可以在不造成反應成分變性的范圍內(nèi)進行溫育。溫育的時間越長，促進效果也隨之增強。因此，優(yōu)選預先設定可預期必要水平的促進效果的溫度和時間條件。具體地說，例如作為溫育的溫度條件，通常為37~90°C、優(yōu)選為40卯。C,或者45-80。C。例如，可以使用作為結(jié)合配偶體的抗體，基于本發(fā)明來測定作為親和物質(zhì)的蛋白質(zhì)抗原。已知構(gòu)成抗體或抗原的蛋白質(zhì)在高溫下發(fā)生變性。但是，例如在用于滅活血清的一般條件，即56。C、30分鐘的溫育條件下許多蛋白質(zhì)不發(fā)生變性。本發(fā)明人等進一步確認到在免疫測定這樣的低蛋白質(zhì)濃度條件下，如果實施短時間的處理，即使在90。C左右的溫度下，蛋白質(zhì)的變性也可忽略不計。例如在45~8(TC的范圍內(nèi)，溫育5~180秒，可以確認能得到幾乎同等水平的反應促進效果。因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選溫育條件，優(yōu)選為45~80°C、更優(yōu)選為50~65°C,溫育5秒以上、例如5~30秒。本發(fā)明中，當然也包括更長的溫育時間。但是，在希望縮短反應時間的情況下，通過采用5秒以上的短時間可以在不犧牲反應時間的情況下預期希望的反應促進效果。另外，例如在超過8CTC的高溫條件下，通過使溫育時間為5180秒可避免蛋白質(zhì)的變性。或者，在將本發(fā)明的方法應用于耐熱性物質(zhì)的反應的情況下，高溫條件不成問題。例如DNA即使在高溫條件下也極其穩(wěn)定。因此，在欲利用載體顆粒的凝集測定DNA間的結(jié)合的情況下，作為溫育的溫度也可選擇更高的溫度。本發(fā)明中，通過溫育促進反應的機制可如下說明通過施加電壓脈沖而排列的載體顆粒由于其上固定的結(jié)合配偶體經(jīng)由親和物質(zhì)與其它栽體顆粒上的結(jié)合配偶體交聯(lián)而構(gòu)成凝集塊。可以認為在載體顆粒排列時發(fā)生了一系列的反應。但是，根椐本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，可以確認施加電壓脈沖前的溫育提高了反應的效率。另外判明在該溫育期間，形成了親和物質(zhì)與載體顆粒上的結(jié)合配偶體結(jié)合的狀態(tài)。即，可以認為在通過施加電壓脈沖使栽體顆粒排列前，形成結(jié)合配偶體捕捉了親和物質(zhì)的狀態(tài)，可提高反應效率。認為在不施加電壓脈沖的條件下，與施加電壓月永沖時相比，載體顆粒的自由度大得多。因此，載體顆粒上的結(jié)合配偶體與親和物質(zhì)可以接觸，結(jié)合配偶體可以捕"t足親和物質(zhì)。在這里，若施加電壓脈沖，則具有捕捉了親和物質(zhì)的結(jié)合配偶體的載體顆粒與其它栽體顆粒一同沿電場排列。此時結(jié)合配偶體已經(jīng)捕捉了親和物質(zhì)，因此通過與接近的其它載體顆粒的結(jié)合配偶體的結(jié)合迅速形成凝集塊。通過間斷性施加電場，使栽體顆粒的排列和分散反復進行，增加接觸的機會，促進凝集塊的形成。即，在施加電壓脈沖之后檢測栽體顆粒的凝集，以該凝集為指標測定親和物質(zhì)的方法中，載體顆粒的凝集塊可以說是經(jīng)由以下的初級反應和次級反應形成的。初級反應載體顆粒上的結(jié)合配偶體捕捉親和物質(zhì)的反應。此時，未必一定形成經(jīng)由親和物質(zhì)的栽體顆粒間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。次級反應多個載體顆粒上的結(jié)合配偶體與親和物質(zhì)結(jié)合的反應。其結(jié)果是，形成經(jīng)由親和物質(zhì)的栽體顆粒間的交聯(lián)結(jié)構(gòu)(即凝集塊)。次級反應通過施加電壓脈沖而促進。但是，至今為止用于促進初級反應的具體條件仍然不明。因此本發(fā)明也可以理解為提供了用于促進初級反應的條件。即本發(fā)明中的施加電壓脈沖前的溫育步驟也可以說是用于促進初級反應的步驟。本發(fā)明中，可以在施加電壓脈沖前的反應液中添加水溶性高分子化合物。在水溶性高分子化合物的存在下，通過顆粒凝集反應檢測親和物質(zhì)與結(jié)合配偶體的結(jié)合，由此可以強化或穩(wěn)定凝集反應。反應液中的水溶性高分子化合物的濃度可以在例如0.05~5%的范圍適當選擇。更優(yōu)選為0.1~3%,進一步優(yōu)選為0.3~1%。凝集反應的強化作用強的化合物，在超過5%的濃度下，很可能發(fā)生非特異性凝集反應。另外，在0.05%以下的低濃度下，有時不能充分期待其效果。水溶性高分子化合物可以使用聚乙二醇、葡聚糖、羧甲基纖維素等。聚乙二醇的分子量優(yōu)選6000-2000000。這些水溶性高分子化合物可以是一種，也可以將二種以上組合。為了將水溶性高分子化合物添加到反應液中，可以預先在含有顆粒載體的試劑中添加需要的量?；蛘撸部梢詫⑺苄愿叻肿踊衔镒鳛榕c顆粒載體不同的試劑進行混合。例如，可以將水溶性高分子化合物添加到樣品的稀釋液中。并且，還可以將其添加到混合的多種試劑、以及稀釋液中。優(yōu)選制備雙試劑系統(tǒng)，使水溶性高分子化合物包含在緩沖液等的第一試劑中，再與含有載體的第二試劑混合用于測定。此時，在第一試劑中可以添加吸收嗜異性抗體等非特異物質(zhì)的非特異吸收劑或用于吸收類風濕性因子的物質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，通過施加電壓脈沖前的溫育來提高反應效率也可以應用于凝集抑制反應。即，在包括上述步驟(r)(3，)的本發(fā)明方法中，也同樣可以在將含有測定對象親和物質(zhì)的反應液與凝集試劑成分混合前或混合后進行溫育。溫育的條件與上迷的條件相同。另外在凝集抑制反應系統(tǒng)中，也可以向反應液中添加水溶性高分子化合物。如上所述，施加電壓脈沖前的反應液的溫育對促進載體顆粒的凝集反應有效。如前所述，此時溫育的溫度高則效果更大。另一方面，施加了電壓脈沖的反應液的溫度由于焦耳熱量而上升。當導體通電時，導體中產(chǎn)生的熱量為焦耳熱量。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，溫育中的高溫條件對凝集反應具有促進作用，而施加電壓脈沖時的溫度上升對凝集反應具有阻礙作用。因此，在施加電壓時，維持低的反應液溫度是有利的。本發(fā)明是包括以下步驟的親和物質(zhì)的測定方法，該測定方法的特征在于測定對象親和物質(zhì)包含在含血球成分的介質(zhì)中，在步驟(i)或(r)中、或步驟(i)或(r)之前、或者步驟(i)或(r)中和步驟(i)或(r)之前包括電破壞血球成分的步驟。(1)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的載體顆粒和測定對象親和物質(zhì)混合得到的反應液施加電壓月永沖的步驟；(2)在進行步驟(l)后，對通過與作為測定對象的親和物質(zhì)的結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及不與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而未形成凝集塊的載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3)在進行步驟(2)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的載體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟；或者(1，)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的載體顆粒、測定對象親和物質(zhì)與凝集試劑成分混合得到的反應液施加電壓脈沖的步驟，其中上述載體顆粒通過凝集試劑凝集，并且利用測定對象親和物質(zhì)阻礙其凝集；(2，)在進行步驟(l，)后，對通過與凝集試劑結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及利用與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而阻礙凝集的栽體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3，)在進行步驟(2，)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的載體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟。下面，具體說明構(gòu)成本發(fā)明測定方法的各步驟?；旌虾蟮姆磻弘S后轉(zhuǎn)移到裝有電極的槽內(nèi)，施加電壓脈沖。電壓脈沖可以是用于破壞血球成分的條件和用于使載體顆粒珠鏈化的條件的任一種條件。通常，在用于破壞血球成分的條件下施加電壓脈沖后，在用于珠鏈化的條件下施加電壓脈沖。當施加電場時，載體顆粒發(fā)生極化，互相靜電吸引，排列成直鏈狀。該現(xiàn)象被稱為珠鏈化。然后，當將電場停止時，直鏈排列的載體顆粒瞬間再分散。另一方面，在進行珠鏈化時，若生物性特異性反應物質(zhì)存在，參與生物性特異性反應的載體顆粒在將電場停止后也不分散，一直以形成凝集塊的狀態(tài)存在。通過測定這些參與生物性特異凝集反應的凝集顆粒和/或未參與的分散的載體顆粒，可檢測到或測定生物性特異性反應物質(zhì)的存在。本發(fā)明的測定方法中，對通過與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、及不與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而未形成凝集塊的載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息作為指標進行計數(shù)。在本發(fā)明中，可在將電場停止后進行顆粒測定?；蛘咭部梢圆煌Ｖ闺妶鰜頊y定置于電場中的顆粒。例如，置于電場中的顆?？梢酝ㄟ^從電場中取出進行計數(shù)。而且，在對顆粒進行計數(shù)前，可實施使顆粒分散的步驟。通過計數(shù)前的分散步驟，可使由于非特異性的原因而凝集的顆粒分散。其結(jié)果是，可期待測定精度的提高。顆粒通過攪拌或稀釋反應液一皮分散。本發(fā)明中，稀釋反應液時，可以在上述步驟(3)或(3，)之前強化親和物質(zhì)和結(jié)合配偶體、或者凝集試劑和結(jié)合配偶體之間的結(jié)合。通過強化結(jié)合可以防止伴隨稀釋的凝集塊的破裂。例如，在施加電具體地說，通過在施加電壓脈沖的稀釋液中添加反應液來進行稀釋。稀釋液配置在電極之間，施加有電壓脈沖。換句話說，將稀釋液配置在相向的電極間。反應液可以在施加電壓脈沖的條件下進行稀釋。此時，對電擬^尺寸或電極間隔沒有特別限定。即珠鏈化后的反應液和稀釋液之間的初期接觸在夾有相向電極的電場中進行。稀釋步驟中，電壓脈沖優(yōu)選交流電壓。電壓脈沖的施加條件可以是不誘發(fā)反應液和稀釋液電解的任意條件。電壓脈沖的電壓例如為0.1V~1.2V、更優(yōu)選為0.3~0.9V。電壓脈沖的頻率例如為100KHz~10MHz、更優(yōu)選為400KHz~lMHz。電壓脈沖中可以使用任意的波形。具體地說，可以舉出方形波、正弦波、三角波等。更優(yōu)選電壓脈沖為方形波。本發(fā)明中，希望在至少包括反應液和稀釋液接觸的瞬間的時間帶施加電壓脈沖。施加時間即使很短也可以期待對稀釋中結(jié)合的強化作用。更具體地說為0.5~30秒、通常為1~10秒，例如為1~5秒。稀釋液可以使用含鹽的溶液。具體地il，可以使用添加有50mM600mM鹽的生理鹽水、甘氨酸緩沖液、磷酸緩沖液等，鹽可以舉出氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。稀釋液中也可以含有疊氮化鈉等防腐劑或TritonX-100等表面活性劑、甘油、蔗糖等。通過在施加有電壓脈沖的狀態(tài)下進行稀釋，可以使構(gòu)成凝集塊的親和物質(zhì)(或凝集試劑)和結(jié)合配偶體的結(jié)合反應得到強化。認為如何，確認到通過在施加電壓脈沖的條件下進行稀釋，凝集塊的破裂得到抑制，可以在維持凝集塊的狀態(tài)下實現(xiàn)反應液的稀釋。或者，作為可以強化親和物質(zhì)和結(jié)合配偶體、或凝集試劑和結(jié)合配偶體的結(jié)合的稀釋方法，可以利用能夠強化兩者結(jié)合的結(jié)合強化劑。結(jié)合強化劑是指添加到反應液中可以強化兩者結(jié)合的成分。例如，蛋白質(zhì)間的結(jié)合可以通過添加戊二醛或》友化二亞胺等化合物得到強化。因此，蛋白質(zhì)抗原和抗體之間的免疫結(jié)合可以通過戊二醛或碳化二亞胺強化。優(yōu)選這些化合物作為結(jié)合強化劑。結(jié)合強化劑作用于親和物質(zhì)和結(jié)合配偶體的官能團，將兩者化學結(jié)合?；蛘咴谀种品磻到y(tǒng)中，強化凝集試劑和結(jié)合配偶體之間的結(jié)合。其結(jié)果是，兩者結(jié)合形成的凝集塊獲得物理上的高度穩(wěn)定性。例如，當親和物質(zhì)或凝集試劑和結(jié)合配偶體是蛋白質(zhì)時，分子內(nèi)具有氨基或羧基。這些官能團被戊二醛或碳化二亞胺等化學物質(zhì)交聯(lián)。反應液中結(jié)合強化劑的濃度可以根據(jù)結(jié)合強化劑的種類適當設定。更具體地說，例如為戊二醛時，反應液的最終濃度通常為0.1~25%、優(yōu)選為0.2~18%?？梢栽谙♂尯杏H和物質(zhì)和結(jié)合配偶體的結(jié)合體的反應液之前，向反應液中添加結(jié)合強化劑。添加結(jié)合強化劑之后的反應液優(yōu)選可以在37。C下溫育數(shù)秒20秒左右、優(yōu)選210秒、或25秒后進行稀釋。當結(jié)合強化劑中使用戊二醛或碳化二亞胺時，也可以在添加到反應液中后立即進行稀釋。結(jié)合強化劑的添加在本發(fā)明的稀釋步驟中是有效的。本發(fā)明中，還可以將結(jié)合強化劑和上迷的在施加電壓脈沖條件下的稀釋步驟組合。即，可以將結(jié)合強化劑添加到反應液中，然后按照上述的條件，在施加電壓脈沖的條件下稀釋反應液?；蛘撸部梢岳锰砑佑薪Y(jié)合強化劑的稀釋液，按照上述的條件，在施加電壓脈沖的條件下稀釋反應液。通過將兩者組合可以加強結(jié)合的強化作用。本發(fā)明中，反應液的稀釋是指通過混合反應液和稀釋液，使反應液中載體顆粒的濃度降低。反應液中載體顆粒的濃度根據(jù)樣品的量和作為試劑供給的載體顆粒的量來確定。而且，在本發(fā)明中，反應液中載體顆粒的濃度通常設定在通過珠鏈化可促進載體顆粒凝集的范圍。具體地說，反應液中栽體顆粒的濃度通常為0.01~5重量％、更優(yōu)選為0.1-2重量％。與此相對，例如可以稀釋為100倍以上、通常1000倍以上，具體地說可以稀釋為1000~100000倍、優(yōu)選為2000-40000倍。稀釋后載體顆粒的濃度為0.1xl(T5-0.005重量％、優(yōu)選為0.00001~0.001重量％。在本發(fā)明中，顆粒以三維信息為指標進行計數(shù)。在本發(fā)明中，以三維信息為指標進行計數(shù)是指，測定顆粒和/或凝集塊的三維信息，基于其結(jié)果對顆粒和/或凝集塊進行計數(shù)。解析顯微鏡圖像的公知的方法根據(jù)二維信息來確定凝集水平。因此，以三維信息為指標的本發(fā)明與公知的方法有明顯區(qū)別。對用于測定三維信息的方法沒有限制。另外，本發(fā)明的計數(shù)是指求出顆粒和/或凝集塊的數(shù)量。顆粒和/或凝集塊的數(shù)量也可以僅簡單地測定數(shù)量?；蛘咭部梢詫⒛念w粒與未凝集的顆粒區(qū)別開來進行測定。而且，對于凝集的顆粒，也可以對每個凝集的顆粒測定凝集塊的數(shù)量。用于以三維信息為指標對顆粒進行計數(shù)的若干方法是公知的?？捎糜诒景l(fā)明的顆粒的計數(shù)方法中，基于物理原理的測定方法是有利的。在本發(fā)明中，物理的測定方法是指可以評價顆?；蚰瘔K固有的物理信息的測定方法。顆粒或凝集塊固有的物理信息也可以說成是真實的測定結(jié)果。與此相對，解析從圖像信息得到的二維信息的方法實際上會誤將未凝集的顆粒的重疊作為凝集塊測出。這樣的檢測結(jié)果不能稱為顆粒固有的物理信息。要物理測定顆?；蚰瘔K，利用流動系統(tǒng)是有利的。流動系統(tǒng)是可以解析通過微小流動池的顆粒的物理信息的系統(tǒng)。通過利用流動系統(tǒng)，可容易地進行物理測定。即，本發(fā)明中的物理測定包括下述步驟通過流動系統(tǒng)對顆粒和凝集塊的任一方或兩方的三維信息進行測定、計數(shù)。用于以三維信息為指標對顆粒進行物理計數(shù)的方法例如有庫爾特原理或激光衍射散射法。庫爾特原理(USPA2656508，l953年)是在小孔(細孔)的兩側(cè)設置電極，并基于通過小孔內(nèi)的顆粒引起的電阻的變化檢測顆粒的體積的分析方法。通過電解液在兩電極間流過微小電流時，若電解液中懸濁的顆粒4皮吸引而通過小孔，相當于顆粒體積的電解液^皮顆粒置換。其結(jié)果是，由于兩電極間的電阻發(fā)生變化，故可通過測定該變化測定顆粒的數(shù)量和尺寸(體積)。作為檢測體積的方法，有靜電容量法，但已實用化的方法幾乎都是電阻法?？讖娇梢愿鶕?jù)成為解析對象的顆粒進行適宜調(diào)節(jié)。在檢測用于通常的免疫學顆粒凝集反應的載體顆粒的凝集時，孔徑通?？蔀?0~1000/rni，更優(yōu)選為50-200/mi。孔徑相對于載體顆粒的平均粒徑為數(shù)倍~數(shù)百倍，例如為數(shù)倍-100倍，優(yōu)選為5倍50倍是有利的。此時，可檢測到與體積成正比的信號，可實現(xiàn)高精度、高靈敏度的測定?？讖较鄬α降谋堵试叫。`敏度越好，但當其過小時，顆粒容易堵塞，而當其過大時，顆粒的檢測靈敏度降低，故不優(yōu)選。更具體地說，例如在對粒徑為l~5//m，特別是23/zm的載體顆粒進行計數(shù)時，孔徑可/人30~100/im,優(yōu)選為50~80/rni，例如65~75//m的范圍選擇。在本發(fā)明的親和物質(zhì)的測定方法中，作為特別優(yōu)選的顆粒尺寸可列舉出2~3//m的載體顆粒。即，本發(fā)明提供包括以下步驟(l)-(3)或(l，)-(3，)的親和物質(zhì)的測定方法，該測定方法的特征在于測定對象親和物質(zhì)包含在含血球成分的介質(zhì)中，在步驟(i)或(r)中、或步驟(i)或(r)之前、或者步驟(i)或(r)中和步驟(l)或(l，)之前包括電破壞血球成分的步驟。Ci)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的平均粒徑為2~3//m的載體顆粒、測定對象親和物質(zhì)混合得到的反應液施加電壓脈沖的步驟；(2)在進行步驟(l)后，對通過與作為測定對象的親和物質(zhì)的結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及不與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而未形成凝集塊的栽體顆粒的任一方或兩方，利用具有50~80/mi孔徑的庫爾特原理，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3)在進行步驟(2)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的載體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟；或者(1，)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的平均粒徑為23//m的載體顆粒、測定對象親和物質(zhì)與凝集試劑成分混合得到的反應液施加電壓脈沖的步驟，其中上述載體顆粒通過凝集試劑凝集，并且利用測定對象親和物質(zhì)阻礙其凝集；(2，)在進行步驟(l，)后，對通過與凝集試劑結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及利用與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而阻礙凝集的栽體顆粒的任一方或兩方，利用具有50-80//m孔徑的庫爾特原理，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3，)在進行步驟(2，)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的載體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟。通常，孔徑小的可更準確地對非凝集顆粒進行計數(shù)。相反，通過增大孔徑，凝集顆粒難以堵塞小孔。小孔的堵塞引起解析效率的下降。降低堵塞頻率與提高解析效率有關。例如，在預測凝集顆粒大量生成的情況下，通過較大地設定孔徑，可以防止小孔堵塞?；蛘?，通過使用粒徑小的載體顆粒，可期待相同的效果。另外，通過稀釋樣品，降低凝集顆粒的比例，也可以防止小孔的堵塞。通常，根據(jù)所預期的檢測靈敏度、所預想的檢測對象物質(zhì)的濃度、以及設備結(jié)構(gòu)(特別是孔徑)，可以選擇各種適宜的條件。這樣，通過對凝集顆粒進行計數(shù)，可以了解凝集顆粒的比例。凝集顆粒的比例是指凝集的顆粒占所計數(shù)的全部顆粒的比例。另外，將凝集顆粒的比例稱為凝集率。而且，對預先了解濃度的標準試劑求取凝集率，將兩者的關系作成圖表，由此，可得到標準曲線。相對于標準曲線，對照檢樣的凝集率，則可明確檢樣含有的測定對象親和物質(zhì)的濃度。或者，也可以將上述標準曲線作為回歸式來表示。如果可得到回歸式，也可以將凝集率代入回歸式，從而算出測定對象親和物質(zhì)的濃度。另一方面，激光衍射散射法是指檢測對顆粒照射激光時產(chǎn)生的搖動，由此測定顆粒的數(shù)量和平均直徑。無論何種情況，為提高測定精度，為了抑制顆粒的誤測定，優(yōu)選對反應顆粒進行稀釋、施加超聲波或/和使用鞘流方式等。另外，可將以下的方法作為顆粒體積的測定方法。離心沉淀法是利用表示液體中的顆粒沉淀速度和粒徑關系的斯托克斯公式測定粒徑分布的方法(在光透過式離心沉淀法中，使用斯托克斯法則，如果為相同比重的顆粒，則可利用大粒比小粒沉淀快的事實。可將此時的顆粒濃度解析為光透過引起的混濁度變化，求出粒度分布)。毛細管方式在流過毛細管中的粘性流體的雷諾數(shù)小的情況下，在其中產(chǎn)生哈根-泊肅葉(Hagen-Poiseuille)流體。該流動越靠近毛細管中央越快，越靠近管壁越慢，因此，大的顆粒在平均較快的流束中流動，小的顆粒在平均較慢的流束中流動。即，顆粒在流過一定長度的毛細管中時，由于其運動速度不同，從而可按尺寸分離檢測。三維圖像解析對從不同方向進行攝影的多個圖像信息進行解析，可求出顆粒的三維信息?；蛘?，通過使xy平面的圖像信息向z軸方向掃描，可求出顆粒的三維信息。本發(fā)明的測定方法以三維信息為指標對凝集(或未凝集)的載體顆粒進行計數(shù)。根據(jù)計數(shù)的結(jié)果定性或定量地測定作為測定對象的親和物質(zhì)。在定性的測定中，存在凝集顆粒意味著存在作為測定對象的親和物質(zhì)?；蛘撸谀种品磻那闆r下，在檢測到凝集的抑制時，證明存在測定對象。另外，在定量的測定中，可使凝集的水平與作為測定對象的親和物質(zhì)的量相關聯(lián)。更具體地說，對預先了解親和物質(zhì)的量的樣品實施本發(fā)明的測定方法，基于三維信息明確凝集顆粒的檢測結(jié)果和親和物質(zhì)的量的關系。其次，對樣品進行同樣的測定，可從基于體積的凝集顆粒的檢測結(jié)果明確親和物質(zhì)的量。即使在凝集抑制反應的情況下，也同樣可以進行定量的測定。作為顆粒和/或凝集塊的計數(shù)方法，在對一定顆粒數(shù)進行計數(shù)的方法中，可根據(jù)[形成兩個以上顆粒的凝集塊的顆粒數(shù)/總顆粒數(shù)]或[單顆粒數(shù)/總顆粒數(shù)]等目的選擇運算式。總顆粒數(shù)可以是在某測量時間內(nèi)所測量的全部顆粒的數(shù)量，在以反應液的總量為解析對象的情況下，與其字面含義一樣，也可以是反應液中所含顆粒的總數(shù)。對于反應液中所含的顆?？倲?shù)來說，在反應液總?cè)萘棵鞔_的情況下，也可以通過對其一部分進行計凄i近似地計算出來。而且，本發(fā)明中，可求出在作為樣品的含有血球成分的介質(zhì)中所含血球成分的體積。本發(fā)明中，和載體顆粒一起溫育的反應液中所含血球成分被破壞。因此，對于作為測定對象的反應液中混合的介質(zhì)，另外求出其血球成分的體積即可。血球成分通過以三維信息為指標進行計數(shù)，還可以知道其體積。如果知道了血3求成分的體積還可以確定樣品介質(zhì)中所含血球成分的比例。如此確定的全血成分中所含血球成分的比例與血細胞比容值幾乎具有相同的含義。因此，例如將全血作為樣品利用時，從全血的體積中除去血球成分的體積所得的體積相當于血清(或血漿)的體積。基于兩者的體積比，通過本發(fā)明測定的全血中所含測定對象物質(zhì)的濃度可以》務正為血清濃度。例如使用庫爾特原理(USPA2656508，1953年)的檢測方法可以測定顆粒的數(shù)量和尺寸(體積)，因此可以同時測量未凝集和凝集塊的粒度分布、以及血球成分的容積和個數(shù)。即，由于能夠測定反應溶液中的血球成分的容積和個數(shù)，可以算出血球成分的總?cè)萘?。由此，可以求出測定使用的全血樣品中血球成分的容量的比例。血漿(或血清)樣品是從全血中除去血球成分得到的，因此通過用血球成分的比例進行修正，可以換算成血漿(或血清)的測定值。AR(血漿)=AR(全血)x100/(100-血球成分的比例％)或者，利用電阻法或激光衍射散射法等，基于間隔一定時間檢測到的顆粒和/或凝集塊的數(shù)量，可以檢測或測定親和物質(zhì)。即，因為通過凝集反應使單顆粒凝集，形成凝集塊，故計數(shù)的顆粒數(shù)隨時間減少?；蛘?，也可以將對預定數(shù)量的顆粒和/或凝集塊進行計數(shù)所需要的時間作為指標。在本發(fā)明使用這種計數(shù)方法的情況下，可將各顆粒和/或凝集塊的數(shù)量和親和物質(zhì)的量之間的關系作為回歸式來表示。對于抗體被敏化的顆粒來說，根據(jù)抗原的濃度，包含兩個以上顆粒的凝集塊的比例增大。這樣，由[形成兩個以上顆粒的凝集塊的顆粒數(shù)/總顆粒數(shù)]表示的凝集率收斂于1.00(100%)。無論是庫爾特原理還是激光衍射散射法，測量顆粒三維信息的方法與解析二維圖像數(shù)據(jù)的方法相比，由簡單的設備配置可期待高精度的解析。如上所述，在二維圖像數(shù)據(jù)的解析中，反應液的容積受到限制。與此相對，因為測量三維信息的方法可應用流動式的解析方法，故反應液的容積不受限制。另外，反應空間的物理形狀也沒有限制。根據(jù)這些理由，設備配置變得簡單。而且，可自由設定反應液量，對再現(xiàn)性和檢測靈敏度的提高有利。或者，本發(fā)明提供包括以下步驟(r)(3，)的親和物質(zhì)的測定方法，該測定方法的特征在于測定對象親和物質(zhì)包含在含血球成分的介質(zhì)中，在步驟(r)中、或步驟(r)之前、或者步驟(r)中和步驟(r)之前包括電破壞血球成分的步驟。(r)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的栽體顆粒、測定對象親和物質(zhì)與凝集試劑成分混合得到的反應液施加電壓脈沖的步驟，其中上迷載體顆粒通過凝集試劑凝集，并且利用測定對象親和物質(zhì)阻礙其凝集；(2，)在進行步驟(r)后，對通過與凝集試劑結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及利用與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而阻礙凝集的載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3，)在進行步驟(2，)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的載體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟?；诶媚噭┑哪种品磻拿庖邔W顆粒凝集反應法的原理已在前面敘述。利用上述步驟，可將本發(fā)明應用在免疫學顆粒凝集反應中。構(gòu)成上述步驟的施加電壓脈沖或解析凝集塊的形成水平、或未形成凝集塊的載體顆粒的水平可利用先前具體敘述的方法進行。在根據(jù)凝集抑制反應的原理實施本發(fā)明的情況下，優(yōu)選選擇生成更多兩個以上顆粒凝集成的凝集塊的條件?；蛘?，優(yōu)選以單顆粒數(shù)/總顆粒數(shù)作為指標來評價凝集水平的方法。在基于凝集抑制反應的原理的情況下，與基于[形成兩個以上顆粒的凝集塊的顆粒數(shù)/總顆粒數(shù)]的運算式的解析相比，利用這樣的運算式可期待高的靈敏度。本發(fā)明的方法可以通過具備有保持反應液施加電壓脈沖的機構(gòu)和對載體顆粒進行計數(shù)的機構(gòu)的裝置來實施。例如，作為用于實施本發(fā)明方法的裝置，可以使用包含以下設備的親和物質(zhì)的測定裝置。(a)保持結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的載體顆粒和測定對象親和物質(zhì)的空間，(b)用于對保持在上述空間的載體顆粒施加電壓脈沖的電極，以及(c)對通過保持于上述空間的載體顆粒的凝集而產(chǎn)生的凝集塊、以及未凝集的上述載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的設備。在本發(fā)明中，在(a)保持結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的栽體顆粒和測定對象親和物質(zhì)的空間中，可以利用用于保持反應液的任意空間。為使微量的樣品反應，小容量的空間是有利的。例如，可利用1//L10mL，優(yōu)選10-500//L左右的空間。該空間根據(jù)需要也可以裝備樣品或試劑的供給設備、或后述的載體顆粒的測量設備。其次，對本發(fā)明的(b)用于對保持在上述空間的載體顆粒施加電壓脈沖的電極進行說明。用于使載體顆粒在電場中排列的電極也被用在例如前面記載的現(xiàn)有技術(shù)文獻中?？稍诒景l(fā)明中利用這些公知的電極。在本發(fā)明的裝置中可裝備用于向電極供給電壓的電源。用于實施本發(fā)明的裝置中，用于施加電壓脈沖的電極至少由一組(兩個)電極構(gòu)成。為給予多個不同方向的電壓脈沖，也可以具備三個以上的電才及。例如，可配置三個電才及A、B、C,并在A-B間、39B-C間、A-C間三個方向上施加電壓脈沖。除此之外，也可以配置兩組(四個)電極，并施加正交的電壓脈沖。而且，為施加不同方向的電壓脈沖，可具備驅(qū)動電極的機構(gòu)。例如，通過使電極在反應液中旋轉(zhuǎn)，可從多個不同的方向施加電壓脈沖。在從不同的方向施加電壓脈沖時，施加的方向可為任意角度。另外，用于實施本發(fā)明的裝置包括(c)對通過保持在上述空間的載體顆粒的凝集而產(chǎn)生的凝集塊、以及未凝集的上述載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的設備。該計數(shù)設備可裝備于上述空間內(nèi)?；蛘?，也可以在將保持于上述空間的反應液從上述空間內(nèi)取出，導入計數(shù)裝置后，進行計數(shù)。作為以三維信息為指標對凝集的、或未凝集的載體顆粒進行計數(shù)的設備，可利用基于庫爾特原理或激光衍射散射法的測量設備。為了使用庫爾特原理，例如將上述空間內(nèi)的反應液導入具備應用庫爾特原理的電極的小孔內(nèi)，進行必要的解析。小孔的尺寸可根據(jù)先前描述的基準進行適宜調(diào)節(jié)。也可以采用下述機構(gòu)根據(jù)用于試劑的粒徑或預測的凝集顆粒的比例，切換利用具有不同尺寸的多個小孔。而且，也可以具備和載體顆粒分開的、用于對血球成分進行計數(shù)的小孔。例如，本發(fā)明的設備可具備用于向多個小孔導入反應液的流路切換機構(gòu)。另外，也可以根據(jù)試劑的種類或預測的凝集顆粒的比例等，組合自動選擇流路的機構(gòu)。或者，用于實施本發(fā)明的裝置可以具備通過切換孔徑來自動調(diào)節(jié)檢測靈敏度的機構(gòu)。檢測靈敏度的調(diào)節(jié)機構(gòu)例如有首先利用較大的孔徑進行解析，在預測凝集顆粒的比例小的情況下，切換為更小的d、孔的機構(gòu)。在利用激光衍射散射法的情況下也同樣，只要將反應液導入用于解析的光學單元進行解析即可。在本發(fā)明中，在電場中珠鏈化的載體顆粒根據(jù)需要被再分散后，可得到三維信息。在用于實施本發(fā)明的裝置中，可裝備用于使栽體顆粒再分散的機構(gòu)。載體顆?？赏ㄟ^稀釋或超聲波處理進行再分散。構(gòu)成用于實施本發(fā)明的裝置的上述(a)-(C)的要素可配置在一個連續(xù)的流路內(nèi)?；蛘?，將各要素作為不連續(xù)的空間來配置，通過使反應液在各要素間移動，也可實施本發(fā)明的測定方法。在用于實施本發(fā)明的裝置中，可將用于實施上述測定方法的附加機構(gòu)進行組合。下面示出可在本發(fā)明的裝置中組合的附加機構(gòu)。才羊品的分配4幾構(gòu)，才羊品的稀釋才幾構(gòu)，測定結(jié)果的記錄機構(gòu)，測定結(jié)果的顯示機構(gòu)，測定結(jié)果的印刷機構(gòu)。本il明書中。實施例下面，根據(jù)實施例更具體地說明本發(fā)明。[實施例1]全血的破裂性試驗1(1)測定裝置使用圖l(A)的裝置，檢驗全血中所含血球成分的破裂性。將全血檢樣和試劑l分注、混合，隨后將混合液移動到反應槽3(脈沖施加槽)內(nèi)，通過電極4施加數(shù)秒到數(shù)分鐘的脈沖電壓，使血球成分破裂。此時沒有使用試劑2(膠乳試劑)。之后，將混合液在稀釋槽5中稀釋，用粒度分布計6測定血球成分的粒度分布。溫度控制機構(gòu)1和2設定為關閉。圖l(B)表示脈沖施加槽的截面。電極間的距離為0.8mm,電極的厚度為0.03mm，電極的長度為20mm。(2)測定方法將健康者的全血樣品作為檢樣進行測定。將2.0//L檢樣和18/iL甘氨酸緩沖液(含有50mM甘氨酸，50mM氯化鈉，0.09。/。疊氮化鈉，下面簡稱為GBS)混合，立即注入到帶有電極的反應池中，使用上述裝置，在電解強度為0~60V/mm下施加30秒交流電壓(頻率400KHz、矩形波)，然后立即切斷電場，用生理鹽水稀釋反應液，通過粒度分布計6測定全血檢樣的粒度分布。應說明的是，粒度分布計6通過聚苯乙烯膠乳珠校正后使用。(3)結(jié)果結(jié)果示于圖2。另外，從測定結(jié)果求出測定顆粒的平均容積，示于表1。在OV~33V的條件下對血球成分進行計數(shù)。判明在39V~42V的條件下血^^的數(shù)量大幅度減少，其大小也變小。而且，在45V以上的條件下，幾乎不能對血球成分進行計數(shù)。因此，在頻率400KHz下、施加30秒左右的脈沖電壓的條件中，明確了電源電壓為35V以上、優(yōu)選為40V以上、更優(yōu)選為45V以上。l表l<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>全血的破裂性試驗2與實施例1同樣使用全血樣品和裝置，在下述條件下破壞血球成分。脈沖電壓頻率400KHz的交流電壓(矩形波)電場強度48V/0.8mm施力口日于間0~60秒結(jié)果示于表2。所計數(shù)的顆粒的平均容積在施加10秒左右的脈沖電壓下顯著變小。而且，還確認到相當于血球成分的大于3戶的顆粒數(shù)通過1030秒的施加幾乎不能計數(shù)。因此，確認到在頻率400KHz的交流電壓(矩形波)、48V/0.8mm的電解強度下，施加時間為IO秒左右是足夠的。即，通過本發(fā)明，可以迅速簡便地破壞血球成分。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>[比較例1]將0.5^L實施例1的全血樣品和25/iL的GBS分配到微管中進行混合。將混合液通過超聲波清潔器(SND公司制)超聲波(高頻電力120W、傳輸頻率38KHz)處理5分鐘使血球成分破裂。使用實施例1的粒度分布計6測定血球成分的粒度分布。結(jié)果示于圖3。將0.5//L實施例1的全血樣品和含有0.5%表面活性劑(Tween20、或TritonX-100)的GBS分配到微管中進行混合，通過在25。C下溫育5分鐘使血球成分破裂。使用實施例1的粒度分布計6測定血球成分的粒度分布。結(jié)果示于圖3。根據(jù)本發(fā)明可知和目前一直用于破壞全血成分的使用超聲波或表面活性劑等藥劑的方法同樣，可在比較短的時間、且容易地破壞血5求成分。[實施例3](1)抗CRP抗體敏化膠乳試劑的制備將含有0.15mg/mL抗CRP抗體(Shibayagi公司制)的甘氨酸緩沖液(含有50mM甘氨酸，50mM氯化鈉，0.09%疊氮化鈉，下面簡稱為GBS)作為抗體溶液制備膠乳試劑。至于膠乳顆粒，將0.9mLGBS加入到O.lmL的膠乳(積水化學公司制，固體成分10%的懸浮液)中制備膠乳懸浮液。將lmL的抗體溶液和膠乳懸浮液混合，在37。C下攪拌2小時后，離心敏化的膠乳，除去上清液。使沉淀懸浮在2mL含0.5。/。牛血清白蛋白的甘氨酸緩沖液(0.5。/。BSA-GBS)中，制備抗CRP抗體敏化膠乳試劑。(2)測定裝置使用圖l(A)的裝置，測定生物學的特異性凝集反應(抗原抗體反應)。該裝置具備用于將檢樣和試劑1分注混合、再將試劑2(膠乳試劑)分注混合的分注/攪拌槽溫度控制機構(gòu)1。試劑1為用于雙試劑系統(tǒng)時的緩沖液。在單試劑系統(tǒng)(僅含膠乳試劑)中不使用緩沖液?；旌系姆磻弘S后^皮移動到反應槽(脈沖施加槽)3中，通過電極4施加數(shù)秒至數(shù)十秒的脈沖電壓，使膠乳顆粒珠鏈化。反應液珠鏈化后，在稀釋槽(5)中稀釋，使用粒度分布計6測定載體的凝集狀態(tài)。溫度控制機構(gòu)1和2設定為關閉。圖l(B)表示脈沖施加槽的截面。電極間的距離為0.8mm,電極的厚度為0.03mm，電極的長度為20mm。(3)測定方法將健康者的全血樣品作為檢樣進行測定。將2.0aL檢樣和18/^L的GBS混合，將2.0//L所得混合液和2.0//L上述的抗CRP抗體敏化膠乳試劑加入到微管中進行混合。將混合后的反應液立即注入到帶有電極的反應池中，使用上述裝置，在電解強度為48Vp-p(±24V)下施加30秒交流電壓(頻率400KHz、矩形波)，形成珠鏈。該30秒施加之后立即切斷電場，用生理鹽水稀釋反應液，使用粒度分布計6(MultisizerIII,BeckmanCoulter公司)測定膠乳顆粒的粒度分布，膠乳凝集度(AR)由下述的公式求出。AR=(形成兩個以上顆粒的凝集塊的顆粒數(shù))/(總顆粒數(shù))xio0(%)(4)結(jié)果結(jié)果示于表3。[表31__電破壞冷凍溶血破壞形成兩個以上顆粒的884893凝集塊的顆粒數(shù)AR20.6%20.8%[比4交《列3〗將基于本發(fā)明得到的測定結(jié)果和通過冷凍使血球成分溶血時的測定結(jié)果進行比較。通過冷凍溶血使實施例2的全血檢樣的血球成分破壞制備溶血檢樣。使用實施例2的抗CRP敏化膠乳試劑，通過同樣的操作測定CRP。結(jié)果示于表3。由表3可知，本發(fā)明的方法(電破壞血球成分)和比4史例(使用通過冷凍溶血破壞血球成分的檢樣的方法)的凝集率幾乎一致。通過冷凍的溶血是幾乎可以完全破壞血球成分的方法。因此，本發(fā)明顯示可簡便地測定全血樣品。產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明的測定方法或測定裝置對測定所有在含血球成分的介質(zhì)中存在的具有親和性的物質(zhì)有用。具體地說，例如通過全血樣品的解析可以得到對各種疾病的診斷有用的信息。更具體地說，激素、腫瘤標記、酶、藥劑、感染性病原體、或它們的抗體經(jīng)常在醫(yī)療機構(gòu)測定。這些測定對象成分均包括在本發(fā)明的親和物質(zhì)中。權(quán)利要求1.一種包括以下步驟的親和物質(zhì)的測定方法，其中測定對象親和物質(zhì)包含在含血球成分的介質(zhì)中，該測定方法在步驟(1)或(1’)中、或步驟(1)或(1’)之前、或者步驟(1)或(1’)中和步驟(1)或(1’)之前包括電破壞血球成分的步驟，(1)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的載體顆粒和測定對象親和物質(zhì)混合得到的反應液施加電壓脈沖的步驟；(2)在進行步驟(1)后，對通過與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及不與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而未形成凝集塊的載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3)在進行步驟(2)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的載體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟，或者(1’)對將結(jié)合有與測定對象親和物質(zhì)具有結(jié)合活性的結(jié)合配偶體的載體顆粒、測定對象親和物質(zhì)與凝集試劑成分混合得到的反應液施加電壓脈沖的步驟，其中上述載體顆粒通過凝集試劑凝集，并且利用測定對象親和物質(zhì)阻礙其凝集；(2’)在進行步驟(1’)后，對通過與凝集試劑結(jié)合所形成的載體顆粒的凝集塊、以及利用與作為測定對象的親和物質(zhì)結(jié)合而阻礙凝集的載體顆粒的任一方或兩方，以其三維信息為指標進行計數(shù)的步驟；和(3’)在進行步驟(2’)后，基于凝集塊的形成水平、以及未形成凝集塊的載體顆粒的水平的任一方或兩方，確定測定對象物質(zhì)的水平的步驟。2.權(quán)利要求1所述的方法，其中血球成分通過10~70V/mm的交流電壓脈沖破壞。3.權(quán)利要求2所述的方法，其中血^求成分通過40~70V/mm的交流電壓脈沖破壞。4.權(quán)利要求3所述的方法，其中ioj求成分通過50~60V/mm的交流電壓脈沖破壞。5.權(quán)利要求1所述的方法，其中在步驟(2)或(2，)中，物理性測定凝集塊或載體顆粒的三維信息。6.權(quán)利要求5所述的方法，其中用于物理性測定三維信息的方法為選自電阻法、激光衍射散射法和三維圖像解析法中的任一種方法。7.權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(2)或(2，)中，將電場停止后，對載體顆粒進行計數(shù)。8.權(quán)利要求7所述的方法，其中在步驟(2)或(2，)中，將電場停止后，進一步包括對載體顆粒進行稀釋的步驟。9.權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，施加多次電壓脈沖。10.權(quán)利要求9所述的方法，其中施加電壓脈沖后，包括使載體顆粒分散，再施加隨后的電壓脈沖的步驟。11.權(quán)利要求9所述的方法，其中多次電壓脈沖為不同方向的電壓脈沖。12.權(quán)利要求1所述的方法，其中載體顆粒的平均粒徑為1//m以上。13.權(quán)利要求12所述的方法，其中載體顆粒的平均粒徑為l//m~20//m。全文摘要本發(fā)明提供一種利用了載體顆粒的珠鏈化的親和物質(zhì)的測定方法，該方法包括電破壞血球成分的步驟。干擾載體顆粒計數(shù)的血球成分被電破壞。而且，無需添加干擾免疫反應的溶血劑，即可破壞血球成分。無需分離血清或血漿可將全血樣品直接用作測定樣品。因此，當分析血液成分時沒有必要分離血清或血漿。文檔編號G01N33/49GK101317094SQ20068004424公開日2008年12月3日申請日期2006年9月29日優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日發(fā)明者巖田惠助申請人:脈沖-免疫技術(shù)株式會社