專利名稱：檸檬酸測(cè)定試劑盒及檸檬酸濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檸檬酸測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定檸檬酸濃 度的方法，屬于食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景檸檬酸主要用于食品、飲料行業(yè)作為酸味劑、調(diào)味劑及防腐劑、保鮮 劑，也用于制備醫(yī)藥清涼劑，還在化工行業(yè)、化妝品行業(yè)及洗滌行業(yè)中 用作抗氧化劑、增塑劑、洗滌劑。強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB17203-1998《食品添加劑擰檬酸f5》規(guī)定，檸檬酸 鈣含量為98. 0 100. 5。％。國(guó)家質(zhì)檢總局組織對(duì)食品添加劑劑檸檬酸其鹽 類(檸檬酸、檸檬酸鉀、檸檬酸鈉、檸檬酸鈣)產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行了國(guó)家監(jiān)督抽 查。抽查中發(fā)現(xiàn)的主要質(zhì)量問(wèn)題是檸檬酸鈣含量不合格。抽查中有個(gè)別產(chǎn) 品食品添加劑劑檸檬酸鈣含量超過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的要求。主要是原料碳酸 鈣轉(zhuǎn)化不完全，成品中存在雜質(zhì)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還 原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè) 定檸檬酸濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的檸檬酸測(cè) 定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行檸檬酸濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得 到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明檸檬酸濃度測(cè)定方法原理如下
檸檬酸檸檬酸裂解酶乙酸+草酰乙酸
草酰乙酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶 L-蘋果酸+輔酶
這種方法應(yīng)用檸檬酸裂解酶(citrate lyase ; EC4丄3.6)酶(偶)聯(lián)蘋果 酸脫氫酶(Malate dehydrogenase ; EC l丄1.37)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法/速 率比色法。檸檬酸裂解酶酶解檸檬酸反應(yīng)產(chǎn)生草酰乙酸，再通過(guò)(偶)聯(lián) 合蘋果酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧 化成為輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm 處吸光度下降的程度/速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的程度/速度， 可以測(cè)算檸檬酸的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮， 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明檸檬酸測(cè)定試劑盒較 為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
擰檬酸裂解酶 10000 U/L
蘋果酸脫氫酶 12000 U/L
本發(fā)明的擰檬酸測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括-試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶。
還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以 配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、擰檬酸裂解酶。
還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用; 也可以配制成液體試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定檸檬酸濃度的方法，其還原 型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的檸檬酸測(cè)定試劑為單試劑，包括: 三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 檸檬酸裂解酶廳mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L10000U/L 12000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使 用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8士0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm,測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)檸檬酸樣卩a與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大 約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出擰檬酸 的濃度大小。 實(shí)施例二本實(shí)施例的檸檬酸測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑l三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100 mmol/L穩(wěn)定劑
50 mmol/L
還原型輔酶
0,25 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
畫mmol/L 500 mmol/L 10000U/L
蘋果酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸
光度1.8土0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)檸檬酸樣品
與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，
延遲時(shí)間大約0分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分
析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出檸檬酸
的濃度大小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的檸檬酸測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 試劑2
100 mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L蘋果酸脫氫12000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L檸檬酸裂10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定檸檬酸濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時(shí) 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm， 被測(cè)檸檬酸樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng) 方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約O分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘 左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分 析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出檸檬酸 的濃度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色 原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類 同，不另一一例舉?？傊?，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析 儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的檸檬酸濃度測(cè)定方法，其方法原理如下檸檬酸 檸檬酸裂解酶 乙酸+草酰乙酸草酰乙酸+還原型輔酶 蘋果酸脫氫酶 L-蘋果酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度/速度，測(cè)算出檸檬酸的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種檸檬酸測(cè)定試劑盒，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶 檸檬酸裂解酶 蘋果酸脫氫酶其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也 可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述檸檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶組成 單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述檸檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶組成 雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶組成。還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述檸檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由 緩沖液、穩(wěn)定劑、蘋果酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、 檸檬酸裂解酶組成。還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶在試 劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述檸檬酸測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、 乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的檸檬酸測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定檸檬酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、檸檬酸裂解酶、蘋果酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的程度/速度，從而測(cè)算出檸檬酸的濃度大小。
文檔編號(hào)G01N21/31GK101324505SQ20071002321
公開日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司