一種測定肌紅蛋白的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)學及生物化學技術領域，具體來說是一種測定肌紅蛋白的試劑盒。本試劑盒由R1、R2雙試劑組成，試劑R1的組分為：Tris緩沖液15~145 mmol/L、氯化鈉50~200 mmol/L、聚乙二醇?8000 5~20 g/L、疊氮鈉0.4~1.2 g/L、牛血清白蛋白12~32 g/L、溶劑為純化水；試劑R1的組分為：Tris緩沖液50~150 mmol/L、牛血清白蛋白4~26 g/L、甘油5~15 g/L、疊氮鈉0.6~1.2 g/L、乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體1~4 g/L、溶劑為純化水。樣品中肌紅蛋白（MYO）可與試劑R2中相應的特異性抗?MYO抗體結合形成抗原?抗體復合物，產(chǎn)生一定濁度。該濁度高低在一定抗體存在時與抗原的含量成正比。在一定波長下測定濁度并通過多點定標曲線可進行肌紅蛋白的定量測定。本發(fā)明具有準確度高、操作方便等優(yōu)點。
【專利說明】
一種測定肌紅蛋白的試劑盒
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學及生物化學技術領域，具體來說是一種測定肌紅蛋白的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 肌紅蛋白（Myoglobin,Mb)是一種氧結合血紅素蛋白，主要分布于心肌和骨豁肌組 織約占肌肉總量的0.1%~0.2%。在急性心肌損傷時，Mb最先被釋放入血液中，在癥狀出現(xiàn)約 2-3小時后，血中Mb可超出正常上限，9-12小時達到峰值，24-36小時后恢復正常。對于懷疑 ACS的病人建議連續(xù)采樣測定，因為癥狀出現(xiàn)和蛋白標志物釋放到血液之間有一段延遲。Mb 陰性有助于排除心梗。
[0003] 測定血清肌紅蛋白肌紅蛋白可作為急性心肌梗死(AMI)診斷的早期最靈敏的指 標。但特異性差，骨骼肌損傷、創(chuàng)傷、腎功能衰竭等疾病，都可導致其升高。Myo陽性雖不 能確診AMI，但可用于早期排除AMI診斷的重要指標，如Myo陰性，則基本排除心肌 梗死，還可用于再梗死的診斷，結合臨床，如Myo重新升高，應考慮為再梗死或者梗死 延展。
[0004] 目前肌紅蛋白的檢測方法主要有放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、化學發(fā)光等。放射 免疫法有放射性物質，會造成放射性污染;酶聯(lián)免疫吸附法操作復雜、耗時長，對操作人員 有較高的專業(yè)要求;化學發(fā)光成本較高，且檢測所需儀器較為昂貴。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術中肌紅蛋白檢測過程操作復雜、以及測定準確度 低的問題，提供一種測定肌紅蛋白的試劑盒。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術問題提供的技術方案是:一種測定肌紅蛋白的試劑盒，包括 彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑R1: Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 50~200 mmol/L 聚乙二醇-8000 5~20 g/L 疊氮鈉 0.4~1.2 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水。
[0007] 試劑 R2: Tris緩沖液 5CK150 mmol/L 牛血清白蛋白 4~26 g/L 甘油 5~15 g/L 疊氮鈉 0.6~1.2 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體 1~4 g/L 其溶劑為純化水。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含 量為： 試劑R1: Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 125 mmol/L 聚乙二醇-8000 13 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水。
[0009] 試劑 R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 甘油 10 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體3 g/L 其溶劑為純化水。
[0010] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體為含有能與人肌紅蛋白特異性結合 的Fab功能部位的完整抗體或抗體片段。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體的粒徑在40~500nm之間。
[0012] 作為優(yōu)選，試劑盒的制備方法和使用方法包括以下步驟： (a)按照下列組分含量配制好R1試劑： Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 50~200 mmol/L 聚乙二醇-8000 5~20 g/L 疊氮鈉 0.4~1.2 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水。
[0013] (b)按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 4~26 g/L 甘油 5~15 g/L 疊氮鈉 0.6~1.2 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體 1~4 g/L 其溶劑為純化水。
[0014] (c)將待測樣本與試劑R1和試劑R2混合，使其充分反應作為進一步的優(yōu)選，試劑R1 與試劑R2的體積比為3:1，待測樣本與試劑R1和試劑R2的總體積的體積比在1:20到1:60之 間。
[0015] (d)用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (e)根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的人肌紅蛋白的值。
[0016] 作為優(yōu)選，所述的乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體制備步驟如下： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到3 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應2小時，在離心機內15000 rpm轉速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機內15000rpm轉速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的抗人肌紅蛋白抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應2小時，膠乳顆粒最終濃度為 3.0 g/L； (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機內15000 rpm轉速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmo 1 /L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4 °C封閉過夜;離心去上清，用步驟(b )制得的分 散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為3g/l，超聲分散即可制得乳膠包被抗人肌紅蛋白 抗體。
[0017] 本發(fā)明所采用的膠乳增強免疫比濁法的反應原理是利用抗原抗體反應，樣品中肌 紅蛋白（MY0)可與試劑中相應的特異性抗-MY0抗體結合形成抗原-抗體復合物，產(chǎn)生一定濁 度。該濁度高低在一定抗體存在時與抗原的含量成正比。在一定波長下測定濁度并通過多 點定標曲線可進行肌紅蛋白的定量測定。
[0018] 樣本中肌紅蛋白（MY0)的活性（
式中：A AT以空白管吸光度作對照的樣品管吸光度值 A AS以空白管吸光度作對照的校準管吸光度值 CS校準液中al-MG的濃度 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下有益優(yōu)點:對肌紅蛋白的檢測靈敏度更高，檢測準確 性更好，另外檢測也比較方便。
[0019]
【附圖說明】： 圖1為本試劑盒與化學發(fā)光法的檢測結果對比。
【具體實施方式】
[0020] 以下結合具體實施例進一步說明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。
[0021] 實施例1 本發(fā)明的試劑盒包括彼此獨立的試劑R1和試劑R2雙液體組分，其中 試劑R1: Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 125 mmol/L 聚乙二醇-8000 13 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水。
[0022] 試劑 R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 甘油 10 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體3 g/L 其溶劑為純化水。
[0023] 實施例2 試劑盒的制備和使用方法 1、乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體制備： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到3 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應2小時，在離心機內15000 rpm轉速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機內15000rpm轉速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的抗人肌紅蛋白抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應2小時，膠乳顆粒最終濃度為 3.0 g/L； (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機內15000 rpm轉速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmo 1 /L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4 °C封閉過夜;離心去上清，用步驟(b )制得的分 散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為3g/l，超聲分散即可制得乳膠包被抗人肌紅蛋白 抗體。
[0024] 2、按照下列組分含量配制好試劑： (a) 按照下列組分含量配制好R1試劑： Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 125 mmol/L 聚乙二醇-8000 13 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水 (b) 按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 甘油 10 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體3 g/L 其溶劑為純化水。
[0025] 3、全自動生化分析儀參數(shù)設置 (a) 檢測溫度:37°C; (b) 檢測波長:主波長570nm; (C)反應時間：10min，其中，孵育時間5min，加入試劑R2后立即測定讀取吸光度 Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化AA = A2-A1 ; (d)反應方向：正反應； 4、檢測步驟 (a) 取180yl試劑R1與6yl待測樣本混勻； (b) 將混勻后的溶液在37°C的條件下孵育5min; (c) 加入60yl試劑R2,立即測定讀取吸光度Al，5min后讀取吸光度A2,計算吸光度變化 AA = A2-A1;
(d)肌紅蛋白（MYO)的活性 計算出樣本中的肌紅蛋白 的活度。
[0026]參照附圖1，附圖1為用實施例1所制得的一種測定肌紅蛋白的試劑盒多次測定不 同樣本中肌紅蛋白的測定結果，以及在同等條件下與化學發(fā)光法測定結果的對比分析。從 相關性實驗結果可見，本試劑盒與化學發(fā)光檢測結果相關性很好，相關方程y=〇.9781x+ 1.165，R 2=0.9955,從結果可以看出本試劑盒結果準確性可靠，相關性良好，可以應用于肌 紅蛋白的檢測。
【主權項】
1. 一種測定肌紅蛋白的試劑盒，包括彼此獨立的試劑Rl和試劑R2雙液體組分，其特征 在于:所述的彼此獨立的試劑Rl和試劑R2包括的成分及相應含量為： 試劑Rl: Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 50~200 mmol/L 聚乙二醇-8000 5~20 g/L 疊氮鈉 0.4~1.2 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水； 試劑R2: Tris緩沖液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 4~26 g/L 甘油 5~15 g/L 疊氮鈉 0.6~1.2 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體 1~4 g/L 其溶劑為純化水。2. 如權利要求1所述的一種測定肌紅蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的彼此獨立的試 劑Rl和試劑R2雙液體組分，包括的成分及相應含量為： 試劑Rl: Tris緩沖液 80 mmol/L 氯化鈉 125 mmol/L 聚乙二醇-8000 13 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水； 試劑R2: Tris緩沖液 100 mmol/L 牛血清白蛋白 15 g/L 甘油 10 g/L 疊氮鈉 0.8 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體3 g/L 其溶劑為純化水。3. 如權利要求1所述的一種測定人肌紅蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被抗 人肌紅蛋白抗體為含有能與人肌紅蛋白特異性結合的Fab功能部位的完整抗體或抗體片 段。4. 如權利要求1所述的一種測定人肌紅蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被抗 人肌紅蛋白抗體的粒徑在40~500nm之間。5. 如權利要求1所述的一種測定人肌紅蛋白的試劑盒，其特征在于:試劑盒的制備方法 和使用方法包括以下步驟： (a) 按照下列組分含量配制好Rl試劑： Tris緩沖液 15~145 mmol/L 氯化鈉 50~200 mmol/L 聚乙二醇-8000 5~20 g/L 疊氮鈉 0.4~1.2 g/L 牛血清白蛋白 12~32 g/L 其溶劑為純化水； (b) 按照下列組分含量配制好R2試劑： Tris緩沖液 50~150 mmol/L 牛血清白蛋白 4~26 g/L 甘油 5~15 g/L 疊氮鈉 0.6~1.2 g/L 乳膠包被抗人肌紅蛋白抗體 1~4 g/L 其溶劑為純化水； (c) 將待測樣本與試劑Rl和試劑R2混合，使其充分反應； (d) 用全自動生化分析儀測定反應后的吸光度差值； (e )根據(jù)吸光度變化值計算出樣本中的人肌紅蛋白的值。6. 如權利要求1所述的一種測定人肌紅蛋白的試劑盒，其特征在于:所述的乳膠包被抗 人肌紅蛋白抗體制備步驟如下： (a) 將粒徑為80nm的膠乳顆粒，用50 mmol/L的MES緩沖液稀釋膠乳顆粒到3 g/L，每mL 溶液中加入EDAC 1.0 mg，室溫反應2小時，在離心機內15000 rpm轉速下離心30分鐘，去上 清，將沉淀懸浮于50 mmol/L的MES緩沖液中，超聲分散； (b) 將步驟(a)的產(chǎn)物在離心機內15000rpm轉速下離心30分鐘，棄上清，將沉淀懸浮于 50 mmol/L的MES緩沖液中，使得膠乳顆粒最終濃度為6.0 g/L，超聲分散，邊攪拌邊加入等 體積的抗人肌紅蛋白抗體的MES稀釋液，混合攪拌，室溫反應2小時，膠乳顆粒最終濃度為 3.0 g/L； (c) 將步驟(b)的產(chǎn)物在離心機內15000 rpm轉速離心30分鐘，棄上清，沉淀懸浮于50 mmo I /L的MES緩沖液中超聲分散，加入BSA，4 °C封閉過夜;離心去上清，用步驟(b )制得的分 散液溶解膠乳顆粒，使膠乳顆粒終濃度為3g/l，超聲分散即可制得乳膠包被抗人肌紅蛋白 抗體。7. 根據(jù)權利要求5所述的一種測定肌紅蛋白的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于:步驟(c)中，所述的試劑Rl與試劑R2的體積比為3:1。8. 根據(jù)權利要求5所述的一種測定肌紅蛋白的試劑盒的制備方法和使用方法，其特征 在于：步驟（c)中，所述的待測樣本與試劑Rl和試劑R2的總體積的體積比在1:20到1:60之 間。
【文檔編號】G01N33/72GK105911298SQ201610359613
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月27日
【發(fā)明人】蔡曉輝, 莊慶華, 吳錚, 徐運
【申請人】安徽伊普諾康生物技術股份有限公司