專利名稱：血樣的測定方法及測定裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血樣的測定方法及測定裝置，該血樣的測定方法及測定裝置可以將幼稚白細胞特別是骨髓原始細胞與其他血細胞精確地區(qū)分開并計數(shù)。
背景技術(shù)：
血液的細胞成份大致分為血小板、白細胞和紅細胞，白細胞又分為粒細胞(嗜酸性細胞、嗜中性細胞和嗜堿性細胞)、單核細胞和淋巴細胞。這些細胞在骨髓中生成，從未成熟細胞分化、成熟，移動到末梢血液。正常健康人末梢血中不會出現(xiàn)未發(fā)育成粒細胞、單核細胞和淋巴細胞等正常血液中白細胞(以下有時稱這些細胞為“成熟白細胞”)的未成熟白細胞(幼稚白細胞)，但是白血病、癌細胞骨髓轉(zhuǎn)移和重癥感染病患者的末梢血中會出現(xiàn)骨髓原始細胞等幼稚白細胞。特別是檢出骨髓原始細胞對于診斷所述的疾病很重要。
臨床檢查、健康診斷等時常采用的血液自動測定方法有應(yīng)用流式細胞技術(shù)的測定方法。流式細胞技術(shù)將細胞膜和核等經(jīng)熒光染色的試樣放入流動室，向通過流動室的細胞照射色素的勵起光，獲取關(guān)于從通過流動室的各個細胞發(fā)出的散射光和熒光的有關(guān)信息，根據(jù)這些信息測定細胞的種類和個數(shù)等。
在應(yīng)用流式細胞技術(shù)的血樣測定方法中，提供了各種方法來區(qū)別于其他血液細胞檢測血液中所含血細胞特別是血細胞類疾病時出現(xiàn)的幼稚白細胞和變形血細胞等。
比如，根據(jù)WO2004/001408所述技術(shù)，血液中的血細胞按以下(1)～(3)步驟分類。(1)先在以前向散射光峰值和前向散射光幅度為二軸的二維散點圖中將血小板凝集與白細胞和紅細胞血影區(qū)別開。(2)再將在(1)中識別出的白細胞和紅細胞血影在以前向散射光強度和熒光強度為二軸的二維散點圖展開，區(qū)分白細胞和紅細胞血影。(3)再將在(2)區(qū)分出來的白細胞以熒光強度和側(cè)向散射光強度為二軸的二維散點圖展開，將白細胞細分為淋巴細胞、單核細胞、粒細胞、骨髓原始細胞和幼稚粒細胞。
然而，根據(jù)WO2004/001408所述技術(shù)，雖然在所述的(3)中可以對骨髓原始細胞進行分類，但如果測定含少量血小板凝集的試樣，則血小板凝集在(1)步驟中可能出現(xiàn)在白細胞和紅細胞血影的區(qū)域，在(3)中可能出現(xiàn)在骨髓原始細胞區(qū)域。因此，人們希望開發(fā)出更精確測定骨髓原始細胞的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的范圍只由后附權(quán)利要求書所規(guī)定，在任何程度上都不受這一節(jié)發(fā)明內(nèi)容的陳述所限。
本發(fā)明是基于以上情況所開發(fā)的技術(shù)，其目的是提供一種測定裝置和測定方法，它能夠在應(yīng)用流式細胞技術(shù)的血樣測定中，不受以血小板凝集為首的試樣中的其他成份的影響，更準確地分類、計數(shù)骨髓原始細胞。
本發(fā)明的發(fā)明者們找出了將骨髓原始細胞與其他血細胞區(qū)分測定的方法，完成了本發(fā)明。即，破損血樣中成熟白細胞的細胞膜，使其比幼稚白細胞更強烈地染色，然后將其放入流式細胞儀檢測，根據(jù)所得角度不同的二種散射光信息和熒光信息，根據(jù)所述的二種散射光信息，特定含骨髓原始細胞的細胞群，以排除血小板凝集，再根據(jù)一種散射光信息和熒光信息特定含骨髓原始細胞細胞群，以進一步區(qū)分成熟白細胞。
即，本發(fā)明的血樣測定方法當中，第一個測定方法包括以下步驟試樣處理步驟，破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞，用能對核酸染色的熒光色素進行染色處理；信息獲取步驟，用光束照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；第一特定步驟，根據(jù)所述的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群；第二特定步驟，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定含骨髓原始細胞的第2細胞群；以及計數(shù)步驟，對既含在所述的第1細胞群又含在所述的第2細胞群的細胞作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。
在所述的計數(shù)步驟中，也可以將所述的既含在第1細胞群又含在第2細胞群的細胞在以所述的熒光信息和所述的第二散射光信息為二軸的散點圖中展開，對出現(xiàn)在所述的散點圖的細胞作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。
所述的第一測定方法中的第二特定步驟也可以根據(jù)所述的第1細胞群的第一散射光信息和熒光信息，從所述的第1細胞群中特定第2細胞群?；蛘咚龅牡谝粶y定方法中的所述的第一特定步驟也可以根據(jù)所述的第2細胞群的第一散射光信息和熒光信息從所述的第2細胞群中特定第1細胞群(第二測定方法)。
在所述的第一和第二測定方法中，最好所述的第一特定步驟在以所述的第一散射光信息和所述的第二散射光信息為二軸的第一散點圖中劃定骨髓原始細胞出現(xiàn)候補區(qū)域，將出現(xiàn)在所述的候補區(qū)域內(nèi)的細胞群特定為所述的第1細胞群；所述的第二特定步驟則在以所述的第一散射光信息和所述的熒光信息為二軸的第二散點圖中劃定骨髓原始細胞出現(xiàn)候補區(qū)域，將出現(xiàn)在所述的候補區(qū)域內(nèi)的細胞群特定為所述的第2細胞群。
本發(fā)明的血樣測定方法也可以第一特定步驟和第二特定步驟同時進行。即，第三測定方法包括以下步驟試樣處理步驟，破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞，用能夠染色核酸的熒光色素進行染色處理；信息獲取步驟，用所述的熒光色素的勵起光照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、角度不同于第一散射光的第二散射光信息和熒光信息；特定步驟，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群，同時根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定含骨髓原始細胞的第2細胞群；以及計數(shù)步驟，將既存在于所述的第1細胞群又存在于所述的第2細胞群的細胞作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。
本發(fā)明的血樣測定方法的第四測定方法適用于非特定含有骨髓原始細胞的第2細胞群、取而代之特定含全白細胞的第3細胞群作為根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定的細胞群的情況。即，第四測定方法包括試樣處理步驟，破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞，用能夠染色核酸的熒光色素進行染色處理；信息獲取步驟，用所述的熒光色素的勵起光照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、角度不同于第一散射光的第二散射光信息和熒光信息；第一特定步驟，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群；第三特定步驟，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定血影群以外的細胞群作為第3細胞群；第四特定步驟，根據(jù)所述的第3細胞群的第二散射光信息和熒光信息，從所述的第3細胞群中特定至少實際上不含成熟白細胞的第4細胞群；以及計數(shù)步驟，對既存在于所述的第1細胞群又存在于所述的第4細胞群的細胞進行計數(shù)。
在本發(fā)明的所述的血樣測定方法中，最好所述第一散射光信息是前向散射光強度，所述第二散射光信息是側(cè)向散射光強度，所述熒光信息是熒光強度。
所述的處理步驟最好是將用于破損紅細胞和成熟白細胞細胞膜的表面活性劑、收縮受損血細胞的增溶劑、染色核酸的熒光色素和血樣混合起來。
本發(fā)明的骨髓原始細胞和血小板凝集區(qū)分法即區(qū)分血樣中所含骨髓原始細胞和血小板凝集的方法，包括以下步驟破損所述的試樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞；光照經(jīng)過所述的處理的試樣，獲取由此產(chǎn)生的前向散射光信息和側(cè)向散射光信息；以及根據(jù)所述的前向散射光信息和側(cè)向散射光信息區(qū)分所述的骨髓原始細胞和血小板凝集。
本發(fā)明的血樣測定裝置包括試樣處理系統(tǒng)，用于破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞，用能夠?qū)怂崛旧臒晒馍剡M行染色處理；信息獲取系統(tǒng)，用于用所述的熒光色素的勵起光照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；第一特定系統(tǒng)，根據(jù)所述的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群；第二特定系統(tǒng)，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定含骨髓原始細胞的第2細胞群；以及計數(shù)系統(tǒng)，對既含在所述的第1細胞群又含在所述的第2細胞群的細胞作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。
最好所述的第1細胞群是出現(xiàn)在以所述的第一散射光信息和所述的第二散射光信息為二軸的第一散點圖中劃定的骨髓原始細胞出現(xiàn)候補區(qū)域的細胞群；第2細胞群是出現(xiàn)在以所述的第一散射光信息和所述的熒光信息為二軸的第二散點圖中劃定的骨髓原始細胞出現(xiàn)候補區(qū)域的細胞群。
所述的計數(shù)系統(tǒng)最好將既含在所述的第1細胞群又含在所述的第2細胞群的細胞在以所述的熒光信息和所述的第二散射光信息為二軸的第三散點圖中展開，對出現(xiàn)在所述的第三散點圖中的細胞作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。
本發(fā)明的測定裝置也可以配備顯示器，用于顯示有既含在所述的第1細胞群又含在所述的第2細胞群的細胞出現(xiàn)的散點圖以及所述的骨髓原始細胞的計數(shù)結(jié)果中的至少一項，還可配備發(fā)射所述的勵起光的光源。
所述第一特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第2細胞群的第一散射光信息和第二散射光信息從所述第2細胞群中特定第1細胞群。
所述第二特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第1細胞群的第一散射光信息和熒光信息從所述第1細胞群中特定出第2細胞群。
所述第一特定系統(tǒng)和所述第二特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第一散射光信息和所述第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群、并根據(jù)所述第一散射光信息和所述熒光信息特定含骨髓原始細胞的第2細胞群的單獨特定系統(tǒng)。
所述第一散射光信息為前向散射光強度，所述第二散射光信息為側(cè)向散射光強度，所述熒光信息為熒光強度。
所述試樣處理系統(tǒng)用于將破損紅細胞和成熟白細胞細胞膜的表面活性劑、收縮受損紅細胞和成熟白細胞的增溶劑、給核酸染色的熒光色素與血樣混合起來。
本發(fā)明還提供一種血樣測定裝置，其包括試樣處理系統(tǒng)，破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞，用能夠染色核酸的熒光色素進行染色處理；
信息獲取系統(tǒng)，用光束照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、角度不同于第一散射光的第二散射光信息和熒光信息；第一特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和所述第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群；第三特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和所述熒光信息特定血影群以外的細胞群作為第3細胞群；第四特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第3細胞群的第二散射光信息和熒光信息，從所述第3細胞群中特定至少實際上不含成熟白細胞的第4細胞群；計數(shù)系統(tǒng)，對既存在于所述第1細胞群又存在于所述第4細胞群的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)。
本發(fā)明所謂“幼稚白細胞”指存在于普通骨髓、不存在于末梢血液的未成熟細胞。比如指骨髓原始細胞、前骨髓細胞、骨髓細胞、后骨髓細胞。前骨髓細胞、骨髓細胞、后骨髓細胞有時統(tǒng)稱為幼稚粒細胞。另外，原始細胞以前的分化階段中的骨髓系干細胞、嗜中性-巨噬細胞系干細胞、嗜酸性粒細胞系干細胞等白細胞系造血祖細胞也包含在本發(fā)明的幼稚白細胞范圍內(nèi)。
本發(fā)明所謂“成熟白細胞”指成熟淋巴細胞、單核細胞、粒細胞(嗜中性、嗜酸性、嗜堿性細胞)。
本發(fā)明所謂“血小板凝集”指血小板凝聚了2個以上者。
本發(fā)明所謂“細胞膜破損”指在細胞膜上打開能通過特定物質(zhì)的微孔。
本發(fā)明所謂“血樣”主要指末梢血液，但此外也指包含骨髓液、單采血液成份技術(shù)回收的血液成份的試樣或腹腔液、尿樣等含白細胞成份的生物試樣。
本發(fā)明的血樣測定方法在用通過流式細胞技術(shù)測得的血樣熒光信息和兩種散射光信息區(qū)分細胞群時，可以排除血小板凝集的影響，特定含有骨髓原始細胞的細胞群，因此，與可區(qū)分含骨髓原始細胞細胞群和成熟白細胞細胞群的特定方法適當組合，即可準確分類并計數(shù)骨髓原始細胞。
本發(fā)明的血樣測定裝置適用本發(fā)明的血樣測定方法，故可精確地測定骨髓原始細胞。


圖1為說明第1細胞群的散點圖。
圖2為說明第2細胞群的散點圖。
圖3為說明既含在第1細胞群又含在第2細胞群的細胞的散點圖。
圖4為說明第3細胞群的散點圖。
圖5為說明第4細胞群的散點圖。
圖6為本發(fā)明測定裝置外觀的示意圖。
圖7為本發(fā)明測定裝置使用的流式細胞儀的示意。
圖8為用于本發(fā)明測定裝置的控制部分的結(jié)構(gòu)框圖。
圖9為本發(fā)明測定裝置采用的信息處理一例的流程示意圖。
圖10為本發(fā)明測定裝置采用的信息處理其他例的流程示意圖。
圖11為本發(fā)明測定裝置采用的信息處理其他例的流程示意圖。
圖12為本發(fā)明測定裝置采用的信息處理其他例的流程示意圖。
圖13(A)為從實施例1制備的測定用試樣測得的第一散點圖；(B)為從同樣測定用試樣測得的第二散點圖。
圖14為就實施例1中第1細胞群和第2細胞群二者都含有的細胞繪制的第三散點圖。
圖15(A)為從實施例2制備的測定用試樣測得的第一散點圖；(B)為從同樣測定用試樣測得的第二散點圖。
圖16為就實施例2的測定用試樣中第1細胞群和第2細胞群二者都含有的細胞繪制的第三散點圖。
具體實施例方式本發(fā)明的血樣測定方法包括試樣處理步驟，破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞，用能對核酸染色的熒光色素進行染色處理；信息獲取步驟，用所述的熒光色素的勵起光照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；特定步驟，用取得的熒光信息和兩種散射光信息，排除血小板凝集的影響，區(qū)別與其他血細胞特定含骨髓原始細胞的細胞群；計數(shù)步驟，對得以特定的骨髓原始細胞群作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。
以下具體說明。
本發(fā)明的測定方法中的試樣處理步驟最好通過將血樣和后面所述處理試劑混合來進行。該處理試劑指破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞細胞膜、收縮細胞膜受損的血細胞并能夠?qū)怂崛旧脑噭?。具體而言即含有能破損試樣中所含血細胞細胞膜的表面活性劑和能對核酸進行熒光染色的熒光色素。
本發(fā)明使用的表面活性劑能夠破損紅細胞和成熟白細胞的細胞膜。其作用機制尚不明確，但可以認為是通過抽出特定細胞膜脂質(zhì)成份的一部分，打開足以讓特定物質(zhì)通過的細孔(將此稱為破損)。熒光色素可以滲透到被表面活性劑破損的細胞內(nèi)部對核酸染色。
表面活性劑也可損傷幼稚白細胞，但損傷時間比紅細胞和成熟白細胞長。因此，在血樣與處理試劑混合后的一定時間內(nèi)，受損的成熟白細胞比未受損的骨髓原始細胞和幼稚粒細胞等更易被染色。如此一來，骨髓原始細胞和幼稚粒細胞與受損并核染色的成熟白細胞相比，幾乎不能被用于染色核酸的熒光色素染色，因此比成熟白細胞熒光強度低。
本發(fā)明所用表面活性劑為聚氧乙烯非離子型表面活性劑。具體而言為以R1R2(CH2CH2O)nH表示的非離子型表面活性劑。式中R1代表碳原子9～25的烷基、烯基或炔基，R2為-O-或-COO-或 n為10～40的整數(shù)。
作為碳原子數(shù)9～25的烷基比如有壬基、癸基、十一烷基、十二(烷)基、十三烷基和十四烷基等。作為碳原子數(shù)9～25的烯基有十二碳烯基、十四碳烯基等。作為碳原子數(shù)9～25的炔基有十二炔基、十三炔基、十四炔基等。
具體而言，有聚氧乙烯(20)月桂醚、聚氧乙烯(15)油烯基醚、聚氧乙烯(16)油烯基醚等等。
表面活性劑可以以水溶液的形態(tài)使用。比如關(guān)于聚氧乙烯非離子型表面活性劑的水中濃度，因所用表面活性劑的種類不同而各異，但前述聚氧乙烯(16)油烯基醚可以在5～50g/l(最好15～35g/l)范圍內(nèi)使用。聚氧乙烯非離子型表面活性劑如果疏水基的碳原子數(shù)相同，則n的值越小，損傷細胞的能力越強，n的值越大，損傷細胞的能力越弱。如果n的值相同，則損傷細胞的能力隨疏水基的碳原子數(shù)減少而增強?？紤]到這一點，以所述的值為目標，必要的表面活性劑濃度通過實驗適當求得即可。
本發(fā)明使用的熒光色素為能對核酸染色的色素。對于細胞膜受損的成熟白細胞，熒光色素透過其細胞膜對核酸染色。
具體而言，有溴化乙錠、碘化丙啶、moleculer公司銷售的溴化乙錠-吖啶異(源)二聚體、二迭氮乙錠、乙錠同型二聚體-1、乙錠同型二聚體-2、一迭氮乙錠、TOTO-1、TO-PRO-1、TOTO-3、TO-PRO-3等。當以He-Ne和紅色半導(dǎo)體激光等為光源時，作為合適的色素可以使用下述結(jié)構(gòu)式(1)表示的色素。
式中，R3為氫原子、低級烷基或低級烷氧基，R4為氫原子、?；虻图壨榛?，R5為氫原子或可被取代的低級烷基，R6為氫原子或低級烷基，R7為氫原子、低級烷基或低級烷氧基，Z為硫原子、氧原子或低級烷基取代的碳原子，m為1或2，X為陰離子。
R3、R4、R5、R6和R7中的低級烷基意指碳原子1～6的直鏈或支鏈烷基，比如，甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、仲丁基、叔丁基、苯基、辛基等，其中尤以甲基、乙基為宜。
R3和R7中的低級烷氧基指碳原子1～6烷氧基，比如甲氧基、乙氧基、丙氧基等，其中尤以甲氧基和乙氧基為宜。另外，R3和R7最好是氫原子。
R4中的?；詈脼橹咀宕妓嵫苌孽；热缫阴?、丙酰等等，其中尤以乙?；鶠橐恕?br> R5中的可被取代的低級烷基指可以用1～3個氫氧基、鹵原子(氟、氯、溴或碘)取代的低級烷基，其中以用1個氫氧基取代的甲基、乙基為官。
Z中的低級烷基即Z最好是硫原子。
X-中的陰離子有鹵離子(氟、氯、溴或碘離子)、鹵化硼離子(BF4-、BCl4-、BBR4-等)、磷化合物離子、鹵氧酸離子、氟硫酸離子、甲硫酸離子以及芳香環(huán)中有鹵或含鹵的烷基作為置換基的四苯基硼化物離子。最好為溴離子或BF4-。
作為所述的結(jié)構(gòu)式(1)中色素的具體舉例，以下述色素A、色素B、色素C為宜。
色素濃度可根據(jù)所用色素適當決定。試劑中的濃度以0.01～500ppm為宜，最好為0.1～200ppm。
細胞膜因所述的表面活性劑受損，細胞內(nèi)的一部分因此而排出細胞外從而引起細胞收縮，或細胞膜表面狀態(tài)的變化引起細胞收縮，為了使白細胞以外的血細胞特別是紅細胞成為不提供有用的散射光信息和熒光信息的血影團，最好在試劑中添加增溶劑以讓受損細胞充分收縮。
作為增溶劑具體而言可以使用以下結(jié)構(gòu)式(2)所表示的?；毖苌锘蚱潲}； 式中，R10為碳原子10～22的烷基，P為1～5的整數(shù)；以下結(jié)構(gòu)式(3)所表示膽酸衍生物； 式中，R11為氫原子或氫氧基；及選自以下結(jié)構(gòu)式(4)所表示的甲基葡萄糖之一或更多。
式中，q為5～7。
作為碳原子10～22的烷基有癸基、十二烷基、十四烷基和油烯基等。具體而言有N-月桂酰肌氨酸鈉、月桂甲β-丙氨酸鈉、月桂酰肌氨酸、CHAPS(3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基-氨基]丙磺酸)、CHAPSO(膽汁酸誘導(dǎo)體膠束)、MEGA8(辛酰基-N-甲基葡萄糖)、MEGA9(N-壬?；?N-甲基葡萄糖)和MEGA10(N-癸酰基-N-甲基葡萄糖)等。
至于增溶劑的濃度，酰肌氨酸衍生物或其鹽為0.2～2.0g/l，膽酸衍生物為0.1～0.5g/l，甲基葡萄糖為1.0～8.0g/l。
作為增溶劑，除所述的外，還可用辛基葡萄糖苷、蔗糖單癸酸酯和N-甲酸基甲基亮氨酰丙胺酸等，最好以0.01～50.0g/l濃度使用。
另外，最好含有用于調(diào)節(jié)試劑pH值的pH調(diào)節(jié)劑和緩沖液，根據(jù)需要最好含有滲透壓調(diào)整劑。
作為緩沖劑可以使用HEPES等良好緩沖劑和磷酸緩沖液等?？梢允褂脷溲趸c等作為pH調(diào)節(jié)劑。作為滲透壓調(diào)整劑可以使用糖、氨基酸、有機溶劑和氯化鈉等。作為糖可以使用葡萄糖、木糖醇、甘露糖醇、樹膠醛醣、核糖醇等。氨基酸可以使用氨基丙酸、脯氨酸、甘氨酸、纈氨酸等。有機溶劑可以使用乙二醇、丙三醇等。試劑中的滲透壓調(diào)節(jié)劑濃度根據(jù)分子量適當調(diào)節(jié)，比如當使用木糖醇時濃度以10～75g/l為宜，使用丙三醇時以5～45g/l為宜，使用甘氨酸時最好5～45g/l。
有以上成份的處理試劑以pH5.0～9.0、滲透壓150～600mOSm/kg為宜。
另外，處理試劑也可以既是含有表面活性劑、色素和其他成份的混合型試劑，也可以將含有熒光的染色液和含有所述的表面活性劑的溶液(溶血劑)分別裝入不同的容器，做成試劑盒。此時，為了提高色素的保存穩(wěn)定性，最好用乙二醇等水溶性有機溶劑作為熒光色素的溶劑。

通過將含有所述的處理試劑的溶液和血樣混合，制備測定用試樣。如果使用所述的試劑盒，首先將含表面活性劑的溶液(溶血劑)和血樣混合，再混合染色劑制備測定用試樣。
血樣和處理試劑混合時，以試樣處理試劑的比為1∶10～1∶1000、反應(yīng)溫度20～40℃、反應(yīng)時間3秒～5分為宜，最好為4秒～1分。
在如此制備的測定用試樣中，紅細胞和成熟白細胞細胞收縮變小。特別是紅細胞無核，細胞膜受損所帶來的溶血和細胞收縮更甚，熒光色素無法染色，因此，前向散射光、側(cè)向散射光和熒光都變?nèi)?，可以作為血影對待?br> 另一方面，成熟白細胞雖然也因試樣和試劑反應(yīng)一定時間后細胞膜受損，而引起細胞收縮，但是，核實際上并不收縮，因此，不會象紅細胞那樣變小。而且，熒光色素可以穿透受損的膜，從而使核染色。
幼稚白細胞比成熟白細胞和紅細胞對溶血劑更有耐性，要破損細胞膜需要時間。因此，在一定反應(yīng)時間內(nèi)細胞收縮實際上不發(fā)生，加上熒光色素不能穿透，因此，核幾乎不被染色。
關(guān)于一個一個的血小板細胞，用處理試劑處理和幼稚白細胞一樣破損細胞膜需要時間，而且色素不會進入血小板內(nèi)對血小板本身染色，而血小板凝集體不同，色素會物理性地吸附于凝集體的周圍，從而染色。
用流式細胞儀測定制備的測定用試樣，獲取試樣中所含細胞和血小板等的散射光信息和熒光信息。
獲取信息最好是將測定用試樣加入到流式細胞儀的流動室，向流經(jīng)該流動室的試樣照射能夠勵起所述的熒光色素的勵起光。這樣即可獲取流經(jīng)流動室的細胞發(fā)出的散射光信息和熒光信息。
照射光一般包含能勵起所用熒光色素的波長的光。也可以根據(jù)所用流式細胞儀所配光源的光的波長，選擇能用該光束勵起的熒光色素。
散射光信息，一般是獲取角度不同的兩種散射光。具體而言，最好將前向散射光和側(cè)向散射光組合使用。
在這里，所謂前向散射光可以認為是反映細胞大小的信息。即，細胞越大前向散射光也越強。所謂側(cè)向散射光指對于前向散射光來說角度相差80～100度、最好相差85～95度的散射光。從側(cè)向散射光可以獲得細胞內(nèi)部信息、特別是核的信息。當試樣含有顆?；蚝俗冃螘r，側(cè)向散射光變強。
在一定反應(yīng)時間內(nèi)，熒光色素幾乎無法進入血小板內(nèi)部，因此，血小板本身幾乎不會被染色。但是，熒光色素會結(jié)合到血小板凝集體周圍和血小板之間連接的部分，因此，在測定試樣中，凝集體越大，熒光強度就越大。而當血小板凝集少或小的時候，側(cè)向散射光變?nèi)?，吸附的熒光色素減少，結(jié)果是熒光強度也變小。
用獲取的散射光信息和熒光信息特定目標細胞群，對骨髓原始細胞進行計數(shù)。本發(fā)明的測定方法從特定步驟的角度看可以分為以下第一測定法～第四測定法。下面依次說明。
(1)第一測定法在第一測定法中，根據(jù)獲取的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群(第一特定步驟)，再根據(jù)獲取的第一散射光信息和熒光信息，特定含骨髓原始細胞的第2細胞群(第二特定步驟)，然后對既存在于第1細胞群又存在于所述的第2細胞群的細胞進行計數(shù)作為骨髓原始細胞。第一特定步驟和第二特定步驟的順序無一定，誰先都可。
(1-1)第1細胞群第1細胞群根據(jù)獲取的兩種散射光信息、最好是前向散射光強度和側(cè)向散射光強度來特定。特定第1細胞群最好是在以這兩種散射光信息為二軸繪制的散點圖(第一散點圖)中，劃定骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的區(qū)域。由于因樣品的不同，骨髓原始細胞的染色程度和大小都會不同，因此，最好不同的樣品分別劃定第1細胞群出現(xiàn)的區(qū)域。
關(guān)于第1細胞群出現(xiàn)區(qū)域的具體劃定方法，首先，當在以兩種散射光信息為二軸繪制的散點圖中骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的位置上確認有細胞群時，特定此細胞群的中心。然后，將骨髓原始細胞的細胞群中心與其他細胞群出現(xiàn)區(qū)域之間從該中心處到骨髓原始細胞群的細胞出現(xiàn)截止的位置可以劃定為第1細胞群出現(xiàn)區(qū)域的界限。同樣，如果確認其他細胞群(幼稚粒細胞、粒細胞、淋巴細胞和單核細胞)可能出現(xiàn)的位置上有細胞群，則可以在特定各細胞群中心的同時，特定其出現(xiàn)區(qū)域。這些區(qū)域也可根據(jù)各種大小的骨髓原始細胞針對所用色素和濃度累積的數(shù)據(jù)預(yù)先劃定。
本發(fā)明使用的測定用試樣，當在縱軸為前向散射光強度(第一散射光信息)、橫軸為側(cè)向散射光強度(第二散射光信息)的散點圖中劃定各細胞可能出現(xiàn)的區(qū)域時，一般如圖1所示。圖1中，「BlAST」為骨髓原始細胞出現(xiàn)區(qū)域，「IG」為幼稚粒細胞出現(xiàn)區(qū)域，「GRAn」為粒細胞出現(xiàn)區(qū)域，「Ly」為淋巴細胞出現(xiàn)區(qū)域，「MO」為單核細胞出現(xiàn)區(qū)域。
骨髓原始細胞因側(cè)向散射光強度較弱，一般出現(xiàn)在散點圖中比較偏左的區(qū)域，而粒細胞和幼稚粒細胞因其核形態(tài)變形，一般出現(xiàn)在側(cè)向散射光較強的右側(cè)，這些細胞群均出現(xiàn)在遠離骨髓原始細胞出現(xiàn)區(qū)域的區(qū)域。因此，作為第1細胞群的出現(xiàn)區(qū)域，只要劃定用圍繞BlAST部分的長短虛線表示的區(qū)域即可。
血小板凝集因凝集方式不同，側(cè)向散射光強度有小有大，且凝集體的大小也從幾個到幾十個不等，前向散射光強度也有大有小。但是，凝集體的大小和變形有相關(guān)性，因此，在圖1所示散點圖中，會出現(xiàn)在從左下方向右上方的區(qū)域(虛線區(qū)域)，不會與BlAST區(qū)域(第1細胞群出現(xiàn)區(qū)域)重疊。
根據(jù)圖1，也可以認為，第1細胞群因為與血小板凝集及其他血細胞成份區(qū)分開，可以將其作為骨髓原始細胞計數(shù)。然而，有的試樣會含有大個淋巴細胞，雖然不多，但是淋巴細胞出現(xiàn)區(qū)域的一部分會與第1細胞群的出現(xiàn)區(qū)域重疊。
(1-2)第2細胞群第2細胞群依據(jù)獲取的第一散射光信息和熒光信息、最好根據(jù)前向散射光信息和熒光信息特定。第2細胞群為在以前向散射光信息和熒光信息為二軸的散點圖(第二散點圖)中骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的區(qū)域中的細胞群。
骨髓原始細胞和幼稚粒細胞在一定反應(yīng)時間內(nèi)細胞膜實際上都不會因處理試劑而受損，核不被染色，都會出現(xiàn)在熒光強度低的左側(cè)區(qū)域。因此，骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的區(qū)域有時也會有其他幼稚白細胞出現(xiàn)。另一方面，粒細胞、淋巴細胞和單核細胞在一定反應(yīng)時間內(nèi)會被處理試劑損傷細胞膜而使核染色，因此，出現(xiàn)在熒光強度高的右側(cè)區(qū)域，從而明確地區(qū)分出在一定反應(yīng)時間內(nèi)實際上未進行核染色的幼稚白細胞團。也就是說，包括骨髓原始細胞在內(nèi)的幼稚白細胞的出現(xiàn)區(qū)域?qū)嶋H上沒有成熟白細胞出現(xiàn)。
因此，作為第2細胞群出現(xiàn)區(qū)域的具體特定方法，首先，當確認在散點圖中骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的位置有細胞群出現(xiàn)時，特定此細胞群中心。然后，將骨髓原始細胞的細胞群中心到成熟白細胞團出現(xiàn)區(qū)域之間從細胞中心到骨髓原始細胞群細胞出現(xiàn)截止的部分可以劃定為第2細胞群出現(xiàn)區(qū)域的界限。同樣，如果確認其他細胞群(幼稚粒細胞、粒細胞、淋巴細胞和單核細胞)出現(xiàn)的位置上有細胞群，也可以在特定各細胞群中心的同時，特定其出現(xiàn)區(qū)域。這些區(qū)域也可根據(jù)各種大小的骨髓原始細胞相對于所用色素和濃度累積的數(shù)據(jù)預(yù)先劃定。
具體而言，如圖2所示，當在以熒光強度為橫軸、前向散射光強度為縱軸的散點圖中，第2細胞群為出現(xiàn)在熒光強度較低的左側(cè)區(qū)域中長短虛線區(qū)域中的細胞群。圖2中，「BlAST」為骨髓原始細胞出現(xiàn)區(qū)域，「IG」為幼稚粒細胞出現(xiàn)區(qū)域，「GRAn」為粒細胞出現(xiàn)區(qū)域，「Ly」為淋巴細胞出現(xiàn)區(qū)域，「MO」為單核細胞出現(xiàn)區(qū)域。
另外，血小板凝集染色只是一種物理性吸附，故出現(xiàn)在左側(cè)區(qū)域。且依凝集的程度，可能有大于或小于骨髓原始細胞的細胞，因此，如圖2所示，出現(xiàn)在從前向散射光強度小的位置到大的位置縱向伸長的區(qū)域。
(1-3)骨髓原始細胞的計數(shù)既包含在如上特定的第1細胞群也存在于第2細胞群的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)。
有可能包含在第1細胞群的淋巴細胞未包含在第2細胞群，而可能包含在第2細胞群的血小板凝集和幼稚白細胞未包含在第1細胞群。因此，既包含在如上特定的第1細胞群又存在于第2細胞群的細胞不包括淋巴細胞、血小板凝集和幼稚白細胞，可以說實際上只有骨髓原始細胞。因此，通過將既包含在如上特定的第1細胞群也存在于第2細胞群的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)，可以正確地計數(shù)骨髓原始細胞。
另外，也可以將所述的既包含在如上特定的第1細胞群又存在于第2細胞群的細胞在以熒光信息和第二散射光信息為二軸的散點圖(第三散點圖)中展開。出現(xiàn)在此第三散點圖中的細胞實際上就是僅含骨髓原始細胞的細胞群。
第一散射光信息最好是前向散射光強度，第二散射光信息最好是側(cè)向散射光強度。關(guān)于既包含在如上特定的第1細胞群又存在于第2細胞群的細胞，在以熒光信息和第二散射光信息為二軸的散點圖(第三散點圖)中展開，則得到如圖3所示散點圖。此散點圖中僅出現(xiàn)既包含在如上特定的第1細胞群又存在于第2細胞群的細胞、即實際上為骨髓原始細胞，因此，也可以將出現(xiàn)在此區(qū)域的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)。
(2)第二測定法在第一測定法和第二測定法中，第一特定步驟和第二特定步驟均為分別進行，分別特定第1細胞群和第2細胞群，但是也可以先特定第1細胞群(或第2細胞群)，再從先特定的第1細胞群(或第2細胞群)中特定第2細胞群(或第1細胞群)。
即，第二測定法是根據(jù)獲取的第一散射光信息和熒光信息，特定含有骨髓原始細胞的第2細胞群(第二特定步驟)，然后根據(jù)特定的第2細胞群的第一散射光信息和第二散射光信息，從所述的第2細胞群中特定第1細胞群(當特指第二測定法時，則將此特定步驟稱為“第1’特定步驟”，在第1’特定步驟特定的第1細胞群稱為第1’細胞群)，并將此第1’細胞群作為骨髓原始細胞計數(shù)?；蛘吒鶕?jù)第一散射光信息和第二散射光信息，特定含有骨髓原始細胞的第1細胞群(第一特定步驟)，然后根據(jù)特定的第1細胞群的第一散射光信息和熒光信息，從所述的第1細胞群中特定第2細胞群(當特指第二測定法時，則將此特定步驟稱為“第2’特定步驟”，在第2’特定步驟特定的第2細胞群稱為“第2’細胞群)，并將此第2’細胞群作為骨髓原始細胞計數(shù)。
第一特定步驟及在此步驟特定的第1細胞群和第二特定步驟及在此步驟特定的第2細胞群分別根據(jù)在信息獲取步驟中獲取的散射光信息和熒光信息特定，其具體方法同前述第一測定法，故在此省略說明。
(2-1)第2’細胞群的特定及骨髓原始細胞的計數(shù)第2’特定步驟先根據(jù)已特定的第1細胞群的第一散射光信息(最好是前向散射光信息強度)和熒光信息(最好是熒光強度)從所述的第1細胞群中特定含骨髓原始細胞的細胞群(第2’細胞群的特定)。如此特定的第2’細胞群是在第一測定法和第二測定法中既包含在第1細胞群又包含在第2細胞群的細胞。
第2’細胞群的特定具體如下進行。
首先以第一散射光信息和第二散射光信息為軸繪制散點圖(第一散點圖)，在此散點圖展開所有有形成份(細胞、血小板等)。在此第一散點圖中劃定骨髓原始細胞的候補區(qū)域，特定出現(xiàn)在此區(qū)域內(nèi)的第1細胞群。然后，以第一散射光信息和熒光信息為二軸繪制散點圖(第2’散點圖)，在此散點圖中只展開第1細胞群，在第2’散點圖中，出現(xiàn)在骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的區(qū)域中的細胞群即為第2’細胞群。在以第一散射光信息和熒光信息為二軸的第2’散點圖中，成熟白細胞和幼稚白細胞被明確分開，因此，即使第1細胞群含有淋巴細胞，展開在第2’散點圖中的第2’細胞群也不會含有淋巴細胞。也就是說第2’細胞群實際上是不含血小板凝集、淋巴細胞等其他成份的骨髓原始細胞群。因此，只要將包含在第2’細胞群的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)即可。
(2-2)第1’細胞群的特定及骨髓原始細胞的計數(shù)第1’特定步驟先按第二特定步驟特定第2細胞群，根據(jù)特定的第2細胞群的第一散射光信息(最好是前向散射光強度)和第二散射光信息(最好是側(cè)向散射光強度)從所述的第2細胞群中特定含骨髓原始細胞的細胞群(第1’細胞群的特定)。如此特定的第1’細胞群是在第一測定法和第二測定法中既包含在第1細胞群又包含在第2細胞群的細胞。
第1’細胞群的特定具體如下進行。首先將第一散射光信息(最好是前向散射光強度)和熒光信息(最好是熒光強度)繪制成以第一散射光信息和熒光信息為二軸的散點圖(第二散點圖)，在此散點圖展開所有有形成份(細胞、血小板等)。在此第二散點圖中劃定含骨髓原始細胞的第2細胞群的候補區(qū)域。然后，以第一散射光信息和第二散射光信息為二軸繪制散點圖(第1’散點圖)，在此散點圖中只展開所述的特定的第2細胞群。在第1’散點圖中，出現(xiàn)在骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的區(qū)域中的細胞群即為第1’細胞群。在以第一散射光信息和第二散射光信息為二軸的第1’散點圖中，幼稚白細胞和血小板凝集出現(xiàn)在可以明確區(qū)別于骨髓原始細胞出現(xiàn)區(qū)域的區(qū)域，因此，第1’細胞群實際上是不含血小板凝集、淋巴細胞和幼稚白細胞等其他成份。因此，只要將包含在第1’細胞群的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)即可。
(3)第三測定法在第一和第二測定法中，特定第1細胞群(或第1’細胞群)和第2細胞群(或第2’細胞群)時無論哪個步驟都是根據(jù)兩種信息分別特定各細胞群后，再特定既含在第1細胞群又含在第2細胞群的細胞群，并以此作為骨髓原始細胞計數(shù)。但是本發(fā)明的血樣測定方法也可以用獲取的第一散射光信息、第二散射光信息和熒光信息在一個步驟中特定第1細胞群和第2細胞群，確定同時含在第1細胞群和第2細胞群二者中的細胞，并以此為骨髓原始細胞計數(shù)。
即，根據(jù)第三測定法，在根據(jù)獲取的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群的同時，根據(jù)獲取的第一散射光信息和熒光信息特定含骨髓原始細胞的第2細胞群，將既含在第1細胞群又含在第2細胞群的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)。
具體而言，將第一散射光信息、第二散射光信息和熒光信息展開在以三者為軸繪制的三維散點圖中，在根據(jù)第一散射光信息(最好是前向散射光強度)和第二散射光信息(最好是側(cè)向散射光強度)特定含骨髓原始細胞的第1細胞群的同時，根據(jù)獲取的第一散射光信息(最好是前向散射光強度)和熒光信息(最好是熒光強度)特定含骨髓原始細胞的第2細胞群。此時的第1細胞群的特定方法和第2細胞群的特定方法可以和第一測定法的步驟相同。
總之，在三維散點圖中，可以同時特定第1細胞群和第2細胞群，還可以特定既含在第1細胞群又含在第2細胞群的細胞。如在第一測定法中所述，既含在第1細胞群又含在第2細胞群的細胞實際上不含血小板凝集、淋巴細胞等其他細胞成份。因此，在三維散點圖只要將既含在第1細胞群又含在第2細胞群的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)，即可非常精確地對骨髓原始細胞計數(shù)。
(4)第四測定法第四測定法適用于不是根據(jù)獲取的第一散射光信息和熒光信息特定含骨髓原始細胞的第2細胞群，而是取而代之特定含血影群以外細胞(本發(fā)明中使用的測定用試樣中紅細胞由于細胞收縮而變成血影細胞群，因此實際上為全白細胞)的第3細胞群的情況。
即，第四測定法是根據(jù)獲取的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群(第一特定步驟)，根據(jù)第一散射光信息和熒光信息特定含全白細胞的第3細胞群(第三特定步驟)，根據(jù)所述的第3細胞群中的第二散射光信息和熒光信息，從所述的第3細胞群中特定至少實際上不含成熟白細胞的第4細胞群(第四特定步驟)，對既含在所述的第1細胞群又含在所述的第4細胞群的細胞進行計數(shù)。
第一特定步驟和第1細胞群同第一測定法，在此省略說明。
(4-1)第三特定步驟和第3細胞群第3細胞群是在以前向散射光強度和熒光強度為二軸的散點圖中出現(xiàn)在除紅細胞血影群出現(xiàn)區(qū)域之外的區(qū)域的細胞群、即實際上為全白細胞群。具體而言，如果以熒光強度為橫軸、前向散射光強度為縱軸繪制散點圖，則如圖4所示，出現(xiàn)在長短虛線區(qū)域的細胞群即為第3細胞群。第3細胞群出現(xiàn)區(qū)域如圖2所示，還包含血小板凝集。
(4-2)第四特定步驟及第4細胞群第4細胞群根據(jù)第3細胞群的第二散射光信息和熒光信息、最好是側(cè)向散射光信息和熒光信息特定。當在以熒光強度和側(cè)向散射光強度為二軸的散點圖中展開第3細胞群時，成熟白細胞出現(xiàn)的區(qū)域和幼稚白細胞出現(xiàn)的區(qū)域會明確分開，因此，如果要在以熒光強度和側(cè)向散射光強度為二軸的散點圖中特定可能含骨髓原始細胞的區(qū)域，可以特定含幼稚白細胞細胞群、進而特定含骨髓原始細胞細胞群出現(xiàn)的區(qū)域。在此，骨髓原始細胞候補區(qū)域的特定與第1細胞群和第2細胞群的特定一樣，最好每個樣品分別進行。另外，也可以根據(jù)各種大小的骨髓原始細胞和成熟白細胞按不同使用色素和濃度積累的數(shù)據(jù)預(yù)先劃定。
在以側(cè)向散射光強度為橫軸、熒光強度為縱軸的散點圖中，展開第3細胞群，則如圖5所示，成熟白細胞(淋巴細胞、單核細胞及粒細胞)因為核被染色而出現(xiàn)在上方，可以和實際上核未被染色的幼稚白細胞明確區(qū)分。成熟白細胞按核的形態(tài)等從左起依次為淋巴細胞群(Ly)、單核細胞群(MO)、粒細胞群(GRAn)。血小板凝集自左向右出現(xiàn)在下方。因此，在側(cè)向散射光強度低的左側(cè)區(qū)域，只要將位于從熒光強度較低的位置到熒光強度中等位置、長短虛線區(qū)域內(nèi)的含骨髓原始細胞細胞群作為第4細胞群特定即可。骨髓原始細胞和幼稚粒細胞核的形態(tài)、復(fù)雜性均不同，因此，可以根據(jù)側(cè)向散射光強度的大小來區(qū)分二者，但是當應(yīng)用區(qū)分二者的設(shè)門法有困難時，也可以將出現(xiàn)在骨髓原始細胞和幼稚粒細胞都有的幼稚粒細胞出現(xiàn)區(qū)域的細胞群作為第4細胞群。
(4-3)骨髓原始細胞的特定及計數(shù)對既含于如上特定的第1細胞群又含于第4細胞群的細胞進行計數(shù)。第1細胞群不含血小板凝集，第4細胞群不含成熟白細胞，因此，既含于第1細胞群又含于第4細胞群的細胞實為不含血小板凝集和成熟白細胞的骨髓原始細胞或幼稚白細胞的細胞群。即，即使第1細胞群含有淋巴細胞，既含于第1細胞群又含于第4細胞群的細胞也不包括淋巴細胞，故實際上可以精確地對骨髓原始細胞或幼稚白細胞計數(shù)。
本發(fā)明的區(qū)分血樣所含骨髓原始細胞和血小板凝集的方法，是通過以下步驟區(qū)分含有骨髓原始細胞的細胞群和血小板凝集本發(fā)明測定方法中的試樣處理步驟；光照經(jīng)所述的處理的試樣，取得由此產(chǎn)生的前向散射光信息和側(cè)向散射光信息；根據(jù)所述的前向散射光信息和所述的側(cè)向散射光信息特定含有骨髓原始細胞的第1細胞群。
如上所述，在以前向散射光信息和側(cè)向散射光信息為二軸的散點圖中，當特定了骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的區(qū)域，就與血小板凝集可能出現(xiàn)的區(qū)域明確分開了，從而可以區(qū)分血樣中所含骨髓原始細胞和血小板凝集。
本發(fā)明的測定裝置包括以下系統(tǒng)試樣處理系統(tǒng)，用于破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞，用能夠?qū)怂崛旧臒晒馍剡M行染色處理；信息獲取系統(tǒng)，用于用所述的熒光色素的勵起光照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；第一特定系統(tǒng)，根據(jù)所述的第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群；第二特定系統(tǒng)，根據(jù)所述的第一散射光信息和所述的熒光信息特定含骨髓原始細胞的第2細胞群；以及計數(shù)系統(tǒng)，對既含在所述的第1細胞群又含在所述的第2細胞群的細胞作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。
本發(fā)明的測定裝置從其外觀上來說，例如有如圖6所示外觀。圖6所示裝置包括測定單元1、分析單元2、連接分析單元2和測定單元1的信號線3。本發(fā)明測定裝置的試樣處理系統(tǒng)和信息獲取系統(tǒng)包含在測定單元1中，分析單元2則包括本發(fā)明的第一特定系統(tǒng)、第二特定系統(tǒng)及計數(shù)系統(tǒng)。
測定單元1有供操作者進行各種設(shè)定輸入的液晶觸摸屏10、用于開始測定的啟動開關(guān)11及用于加樣采樣的探針12。測定單元1內(nèi)部還配置有圖7所示流式細胞儀。分析單元2有處理測定單元1輸出的信息、控制測定單元1運行的控制部分6、作為顯示各種測定結(jié)果的顯示器使用的輸出部分7及輸入供操作者輸入樣品信息的鍵盤8。
下面就圖7所示流式細胞儀進行說明。從光源(比如紅半導(dǎo)體激光波長633nm)21射出的光束通過準直儀透鏡22照射到鞘液流動室23的銳孔。從管嘴20吐出、流經(jīng)銳孔的血細胞發(fā)出的前向散射光通過聚光鏡24和微孔板25射入前向散射光檢測器(發(fā)光二極管)26。另一方面，通過銳孔的血細胞發(fā)出的側(cè)向散射光通過聚光鏡27和二向色鏡28射入側(cè)向散射光檢測器(光電倍增管)29。通過銳孔的血細胞發(fā)出的側(cè)向熒光通過聚光鏡27、二向色鏡28、濾光器28’及微孔板30射入側(cè)向熒光檢測器(光電倍增管)31。從前向散射光檢測器26輸出的前向散射光信息、從側(cè)向散射光檢測器29輸出的側(cè)向散射光信息和從側(cè)向熒光檢測器31輸出的側(cè)向熒光信息分別被放大器32、33、34放大，輸入控制部分6。
另外，所述的光源21主要用于將能勵起試樣處理中所用色素的光束照射到加入有所制備的測定用試樣的流動室銳孔，根據(jù)染色試樣中血細胞的熒光色素來選擇。因此，可根據(jù)所用熒光色素的種類不同，除紅色半導(dǎo)體激光外，還可選擇氬激光、He-Ne激光、蘭色半導(dǎo)體激光等。
圖8為顯示控制部分6結(jié)構(gòu)的框圖。此控制部分6主要由以下部分構(gòu)成CPU6a、ROM6B、RAM6C、硬盤6d、輸出入接口6e、圖象輸出接口6F和通信接口6g，其中CPU6a、ROM6B、RAM6C、硬盤6d、輸出入接口6e、輸出接口6F和通信接口6g通過通道6H相接，可進行數(shù)據(jù)通信。
CPU6a可執(zhí)行存儲在ROM6B和硬盤6d中的系統(tǒng)程序和讀到RAM6C的系統(tǒng)程序。因此，可根據(jù)從測定系統(tǒng)1、具體地說是流式細胞儀輸入的前向散射光信息、側(cè)向散射光信息和熒光信息按預(yù)設(shè)程序進行演算處理，特定第1細胞群和第2細胞群等細胞群，進而對骨髓原始細胞計數(shù)。
ROM6B存儲有供CPU6a執(zhí)行的系統(tǒng)程序和用于執(zhí)行該系統(tǒng)程序的數(shù)據(jù)等。RAM6C讀取存儲于ROM6B和硬盤6d中的系統(tǒng)程序及作為執(zhí)行系統(tǒng)程序時的運行區(qū)域。硬盤6d存儲供CPU6a執(zhí)行的系統(tǒng)程序和用于執(zhí)行該系統(tǒng)程序的數(shù)據(jù)。此系統(tǒng)程序發(fā)揮分析光學信息、輸出分析結(jié)果等功能。
輸出入接口6e接有鍵盤8。作為輸入設(shè)備的鍵盤8也用于在輸出畫面上的操作等。輸出接口6F與由液晶顯示屏構(gòu)成的輸出部分7連接。輸出部分7用于輸出和顯示在控制部分6取得的分析結(jié)果。通信接口6g與測定系統(tǒng)1連接，發(fā)揮接收光學信息的作用。
下面就在控制部分6中的信息處理實施方式進行說明。圖9為本發(fā)明第一測定方法的信息處理流程圖?？刂撇糠?采取第二測定方法的話，首先，通過信號線3接收測定系統(tǒng)1檢測出的前向散射光信號、側(cè)向散射光信號和熒光信號(步驟S1)?？刂撇糠?分析這些信號，計算出各個信號強度(步驟S2)。接著，用試樣中有形成份(細胞和血小板等)的前向散射光強度和側(cè)向散射光強度繪制以前向散射光強度和側(cè)向散射光強度為二軸的第一散點圖(步驟S3)。在第一散點圖中，劃定骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細胞候補區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第1細胞群(步驟S4)。再用試樣中有形成份的前向散射光強度和熒光強度繪制以前向散射光強度和熒光強度為二軸的第二散點圖(步驟S5)。在第二散點圖中劃定骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細胞候補區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第2細胞群(步驟S6)。接下來，用既含在第1細胞群又含在第2細胞群的細胞的熒光強度和側(cè)向散射光強度繪制以熒光強度和側(cè)向散射光強度為二軸的第三散點圖(步驟S7)。將出現(xiàn)在此第三散點圖的細胞(既含在第1細胞群又含在第2細胞群的細胞)作為骨髓原始細胞計數(shù)(步驟S8)，將此計數(shù)結(jié)果和第三散點圖輸出到輸出部分7(步驟S9)。
圖10為本發(fā)明第二測定法中相應(yīng)于先特定第1細胞群方法的信息處理流程圖?？刂撇糠?采取這種第二測定法時，首先通過信號線3接收測定系統(tǒng)1檢測出的前向散射光信號、側(cè)向散射光信號和熒光信號(步驟S1)。控制部分6分析這些信號，計算出各個信號強度(步驟S2)。接著，用試樣中有形成份(細胞和血小板等)的前向散射光強度和側(cè)向散射光強度繪制以前向散射光強度和側(cè)向散射光強度為二軸的第一散點圖(步驟S3)。在第一散點圖中，劃定骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細胞候補區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第1細胞群(步驟S4)。再用試樣中有形成份的前向散射光強度和熒光強度繪制以前向散射光強度和熒光強度為二軸的散點圖(第2’散點圖)(步驟S5)。在第2’散點圖中劃定骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細胞候補區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第2’細胞群(步驟S6)。將此第2’細胞群作為骨髓原始細胞計數(shù)(步驟S7)，將此計數(shù)結(jié)果和第2’散點圖輸出到輸出部分7(步驟S8)。
圖11為本發(fā)明第二測定方法中對應(yīng)先特定第2細胞群方法的信息處理流程圖。當控制部分6采用這種第二測定方法時，首先通過信號線3接收測定系統(tǒng)1檢測出的前向散射光信號、側(cè)向散射光信號和熒光信號(步驟S1)。控制部分6分析這些信號，計算出各個信號強度(步驟S2)。接著，用試樣中有形成份(細胞和血小板等)的前向散射光強度和熒光強度繪制以前向散射光強度和熒光強度為二軸的第二散點圖(步驟S3)。在第二散點圖中，劃定骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細胞候補區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第2細胞群(步驟S4)。再用第2細胞群的前向散射光強度和側(cè)向散射光強度繪制以前向散射光強度和側(cè)向散射光強度為二軸的散點圖(第1’散點圖)(步驟S5)。在第1’散點圖中劃定骨髓原始細胞可能出現(xiàn)的骨髓原始細胞候補區(qū)域，特定出現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)的第1’細胞群(步驟S6)。將此第1’細胞群作為骨髓原始細胞計數(shù)(步驟S7)，將此計數(shù)結(jié)果和第1’散點圖輸出到輸出部分7(步驟S8)。
圖12為本發(fā)明第三測定法相應(yīng)的信息處理流程圖。當控制部分6采用這種第三測定法時，首先通過信號線3接收測定系統(tǒng)1檢測出的前向散射光信號、側(cè)向散射光信號和熒光信號(步驟S1)?？刂撇糠?分析這些信號，計算出各個信號強度(步驟S2)。接著，以試樣中有形成份(細胞和血小板等)的前向散射光強度、側(cè)向散射光強度和熒光強度為三軸，繪制三維散點圖(步驟S3)。在此三維散點圖中，根據(jù)前向散射光強度和側(cè)向散射光強度特定第1細胞群，根據(jù)前向散射光強度和熒光強度特定第2細胞群(步驟S4)。在此三維散點圖中劃定既含在第1細胞群又含在第2細胞群的細胞出現(xiàn)的骨髓原始細胞區(qū)域，對出現(xiàn)在該區(qū)域的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)(步驟S5)，將此計數(shù)結(jié)果和三維散點圖輸出到輸出部分7(步驟S8)。
在所述的實施方式的裝置中，控制部分6將用于統(tǒng)計骨髓原始細胞計數(shù)結(jié)果和計數(shù)的散點圖輸出并顯示在輸出部分7的顯示屏上，也可以僅輸出其中的某一項。而且輸出散點圖時，還可以最終不僅輸出用于骨髓原始細胞計數(shù)的散點圖，還輸出繪制的全部散點圖。
以上實施方式的測定裝置采用了所述的本發(fā)明的第一～第三測定法，當采用第四測定法時，還包括根據(jù)取得的熒光信息和第二散射光信息特定至少不含成熟白細胞的第4細胞群這一第三特定步驟，所述的計數(shù)步驟最好將既含在所述的第1細胞群又含在所述的第2細胞群、且含在第三特定步驟特定的細胞群中的細胞作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。
關(guān)于采用第四測定法的裝置，具體而言，只要改變所述的實施方式控制部分6中信息處理即可。但在第二特定步驟，要特定包括骨髓原始細胞在內(nèi)的全白細胞的細胞群(相當于第3細胞群)作為根據(jù)第一散射光信息和熒光信息特定的第2細胞群；在第三特定步驟，為了特定第4細胞群，以第二散射光信息(側(cè)向散射光強度)和熒光信息(熒光強度)為二軸繪制散點圖。然后，對既含在第1細胞群、第2細胞群(在此實際上為第3細胞群)、又含在第4細胞群的細胞進行計數(shù)，并將計數(shù)結(jié)果輸出到輸出部分7。
在以上實施方式中敘述的“骨髓原始細胞計數(shù)結(jié)果”包括試樣中的骨髓原始細胞數(shù)、單位體積的骨髓原始細胞數(shù)(濃度)和骨髓原始細胞對全白細胞所占比例，控制部分6可以至少輸出其中的一項。
實驗例[血樣]
使用的血樣是大量含有骨髓原始細胞樣品(試樣A)、含有骨髓原始細胞和幼稚白細胞的樣品(試樣B)。試樣A、B含有血小板凝集。
(1)使用處理試劑A制備測定用試樣(A-1)溶血劑制備含以下成份的如下結(jié)構(gòu)的溶血劑。
甘氨酸 19.5g/l聚氧乙烯(16)油烯基醚25.0g/lN-月桂酰肌氨酸鈉0.75g/lHEPES 10mM蒸餾水 11苛性鈉 PH達7.0的量(A-2)染色劑用乙二醇溶解下式表示的熒光色素A。
混合所述的溶血劑和血樣，將所述的染色劑添加其中，直至熒光色素最終濃度達到20PPm，測定用試樣即制備完成。
(2)用處理試劑B制備測定用試樣除用含以下成份的溶血劑以外，其他均與處理試劑A一樣。
木糖醇 37.0g/l聚氧乙烯(16)油烯基醚25.0g/l
N-月桂酰肌氨酸鈉0.75g/lHEPES 10mM蒸餾水 11苛性鈉 PH達7.0的量[測定]實驗例1混合血樣A和處理試劑B，33℃反應(yīng)5秒，制備試樣，將該試樣放入流動室，用流式細胞儀(光源紅色半導(dǎo)體波長633nm)測定前向散射光、側(cè)向散射光和熒光。將測定結(jié)果繪制成以前向散射光強度和側(cè)向散射光強度為二軸的第一散點圖(圖13(A))和以熒光強度和前向散射光強度為二軸的第二散點圖(圖13(B))。
在圖13(A)中，第1細胞群出現(xiàn)的區(qū)域為實線區(qū)域。在圖13(B)中，第2細胞群出現(xiàn)的區(qū)域為實線區(qū)域。在圖13(A)中，擴展含淋巴細胞的細胞群，其中一部分與第1細胞群重疊。
第1細胞群和第2細胞群二者都含有的細胞群如圖14所示。根據(jù)圖14，在以側(cè)向散射光強度和熒光強度為二軸的第三散點圖中，第1細胞群和第2細胞群二者均含有的細胞群集中出現(xiàn)在實線的部分。
對圖14實線區(qū)域內(nèi)的細胞進行計數(shù)，計算對全白細胞數(shù)的比例，為58.5％。另一方面，在顯微鏡下觀察血樣A，計數(shù)骨髓原始細胞。求得骨髓原始細胞在視野內(nèi)對全白細胞的比例為42.0％。
因此可以確認，根據(jù)本發(fā)明的測定方法可以以與顯微鏡同樣的精度檢測出骨髓原始細胞。
實驗例2用處理試劑A在33℃下處理血樣B5秒鐘，制備測定用試樣，將該測定用試樣加入流動室，用流式細胞儀(光源紅色半導(dǎo)體波長633nm)測定前向散射光、側(cè)向散射光和熒光。將測定結(jié)果繪制成以前向散射光強度和側(cè)向散射光強度為二軸的第一散點圖(圖15(A))和以熒光強度和前向散射光強度為二軸的第二散點圖(圖15(B))。
在圖15(A)中，第1細胞群出現(xiàn)的區(qū)域為實線區(qū)域。在圖15(B)中，第2細胞群出現(xiàn)的區(qū)域為實線區(qū)域。第1細胞群和第2細胞群二者都含有的細胞群如圖16所示。根據(jù)圖16，在以側(cè)向散射光強度和熒光強度為二軸的第三散點圖中，第1細胞群和第2細胞群二者均含有的細胞群集中出現(xiàn)在實線的部分。
對圖16實線區(qū)域內(nèi)的細胞進行計數(shù)，計算對全白細胞數(shù)的比例，為2.4％。另一方面，在顯微鏡下觀察血樣B，計數(shù)骨髓原始細胞。求得骨髓原始細胞在視野內(nèi)對全白細胞的比例為2.5％。
因此可以確認，根據(jù)本發(fā)明的測定方法可以以與顯微鏡觀察同樣的精度檢測出骨髓原始細胞，特別是能夠與幼稚粒細胞區(qū)分，精確地檢測出骨髓原始細胞。
前述的詳細說明及附圖是通過文字解釋和圖示來進行的，其目的不在于限定權(quán)利要求的保護范圍。本說明書中的具體實施方式
的各個變種對于普通技術(shù)人員來說顯而易見，并處于權(quán)利要求及其等同技術(shù)的保護范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種血樣測定裝置，包括以下系統(tǒng)試樣處理系統(tǒng)，用于破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損血細胞，用能對核酸染色的熒光色素進行染色處理；信息獲取系統(tǒng)，用光束照射所述處理過的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；第一特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群；第二特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和所述熒光信息特定含骨髓原始細胞的第2細胞群；以及計數(shù)系統(tǒng)，對既含在所述第1細胞群又含在所述第2細胞群的細胞作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述測定裝置，其特征在于所述第1細胞群為出現(xiàn)在以所述第一散射光信息及所述第二散射光信息為二軸的第一散點圖中劃定的骨髓原始細胞出現(xiàn)候補區(qū)域的細胞群，所述第2細胞群為出現(xiàn)在以所述第一散射光信息及所述熒光信息為二軸的第二散點圖中劃定的骨髓原始細胞出現(xiàn)候補區(qū)域的細胞群。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述測定裝置，其特征在于所述計數(shù)系統(tǒng)是將既含于所述第1細胞群又含于所述第2細胞群的細胞在以所述熒光信息和所述第二散射光信息為二軸的第三散點圖展開，將出現(xiàn)在所述第三散點圖的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述測定裝置，其特征在于所述第二特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第1細胞群的第一散射光信息和熒光信息從所述第1細胞群中特定出第2細胞群。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述測定裝置，其特征在于所述第一特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第2細胞群的第一散射光信息和第二散射光信息從所述第2細胞群中特定第1細胞群。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述測定裝置，其特征在于所述第一特定系統(tǒng)和所述第二特定系統(tǒng)為根據(jù)所述第一散射光信息和所述第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群、并根據(jù)所述第一散射光信息和所述熒光信息特定含骨髓原始細胞的第2細胞群的單獨特定系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述測定裝置，其特征在于所述第一散射光信息為前向散射光強度，所述第二散射光信息為側(cè)向散射光強度，所述熒光信息為熒光強度。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述測定裝置，其特征在于所述試樣處理系統(tǒng)用于將破損紅細胞和成熟白細胞細胞膜的表面活性劑、收縮受損紅細胞和成熟白細胞的增溶劑、給核酸染色的熒光色素與血樣混合起來。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述測定裝置，其特征在于其還配備有顯示器，用于顯示出現(xiàn)有既含于所述第1細胞群又含于所述第2細胞群的細胞的散點圖和所述骨髓原始細胞計數(shù)結(jié)果中的至少一項。
10.權(quán)利要求1所述測定裝置，其特征在于其還有照射所述光束的光源。
11.一種血樣測定裝置，其包括試樣處理系統(tǒng)，破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞，用能夠染色核酸的熒光色素進行染色處理；信息獲取系統(tǒng)，用光束照射經(jīng)所述的處理的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、角度不同于第一散射光的第二散射光信息和熒光信息；第一特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和所述第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群；第三特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第一散射光信息和所述熒光信息特定血影群以外的細胞群作為第3細胞群；第四特定系統(tǒng)，根據(jù)所述第3細胞群的第二散射光信息和熒光信息，從所述第3細胞群中特定至少實際上不含成熟白細胞的第4細胞群；計數(shù)系統(tǒng)，對既存在于所述第1細胞群又存在于所述第4細胞群的細胞作為骨髓原始細胞計數(shù)。
12.一種血樣測定方法，包括以下步驟試樣處理步驟，破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞，用能對核酸染色的熒光色素進行染色處理；信息獲取步驟，用光束照射所述的處理過的試樣，獲取由此發(fā)出的第一散射光信息、來源于角度與第一散射光不同的散射光的第二散射光信息及熒光信息；第一特定步驟，根據(jù)所述第一散射光信息和第二散射光信息特定含骨髓原始細胞的第1細胞群；第二特定步驟，根據(jù)所述第一散射光信息和所述的熒光信息特定含骨髓原始細胞的第2細胞群；以及計數(shù)步驟，對既含在所述第1細胞群又含在所述的第2細胞群的細胞作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用流式細胞技術(shù)測定血樣、不受血小板凝集等試樣中其他成份影響、能夠更準確地對骨髓原始細胞進行分類和計數(shù)的測定方法包括破損血樣中所含紅細胞和成熟白細胞的細胞膜，收縮細胞膜受損的血細胞，用能對核酸染色的熒光色素進行染色處理，用流式細胞儀測定經(jīng)所述的處理的試樣，對既含在根據(jù)前向散射光信息和側(cè)向散射光信息特定的含骨髓原始細胞的第1細胞群又含在根據(jù)所述的前向散射光信息和熒光信息特定的含骨髓原始細胞的第2細胞群中的細胞作為骨髓原始細胞進行計數(shù)。本發(fā)明還提供其測定裝置包括以下系統(tǒng)試樣處理系統(tǒng)，信息獲取系統(tǒng)，第一特定系統(tǒng)，第二特定系統(tǒng)，以及計數(shù)系統(tǒng)。
文檔編號G01N33/48GK101046439SQ20071008699
公開日2007年10月3日 申請日期2007年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年3月29日
發(fā)明者辻智悠, 吉田步, 小國振一郎 申請人:希森美康株式會社