專利名稱：：腫瘤相關(guān)抗原242磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種腫瘤相關(guān)抗原242磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的試劑盒結(jié)合了生物素一親和素免疫放大技術(shù)、免疫磁微粒技術(shù)和化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
：癌癥自從誕生之日起就對(duì)人類的生存健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。目前醫(yī)院診斷早期腫瘤，主要是靠影像學(xué)和細(xì)胞病理學(xué)診斷技術(shù)，一般都是在具有明顯的占位性病變和臨床癥狀后才得以確診。隨著腫瘤早期診斷進(jìn)入蛋白質(zhì)時(shí)代，以血液為代表的體液蛋白質(zhì)成為腫瘤標(biāo)志研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)，從而推動(dòng)了快速、高靈敏、高特異肺瘤標(biāo)志物新型檢測(cè)技術(shù)的建立與發(fā)展。肺瘤相關(guān)抗原242(carbonhydrateantigen242,CA242)作為一種肺瘤相關(guān)抗原，是一種粘蛋白類型的糖蛋白，在健康人和良性疾病人的血清中的含量很低，當(dāng)消化道發(fā)生惡性腫瘤時(shí)，血清中CA242出現(xiàn)升高，因此CA242較其它肺瘤標(biāo)記物具有較高的特異性，在良性疾病中假陽性率很低。同時(shí)CA242也可用于胰腺癌、結(jié)直腸癌的診斷與監(jiān)測(cè)，對(duì)于惡性腫瘤治療后的療效判斷、追蹤觀察等臨床檢測(cè)，也具有重要意義。目前用于檢測(cè)CA242的免疫方法主要有酶免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定、免疫焚光測(cè)定、放射免疫顯影、抗體芯片技術(shù)以及化學(xué)發(fā)光免疫分析。根據(jù)大量的試驗(yàn)結(jié)果及臨床應(yīng)用資料，從實(shí)用性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性及發(fā)展前景來看，依次為化學(xué)發(fā)光免疫分析、焚光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析技術(shù)因其使用放射性元素作為標(biāo)記物，因此對(duì)環(huán)境有一定污染性，并存在儀器成本貴，靈敏度不高，操作復(fù)雜，測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定，試劑保存時(shí)間短等缺點(diǎn)。酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法是一種較先進(jìn)而有效的方法，可使檢測(cè)靈敏度達(dá)到10"8摩爾水平，而且檢測(cè)范圍可達(dá)6個(gè)數(shù)量級(jí)，其酶標(biāo)記物穩(wěn)定，可長期使用。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)因其高靈敏、高特異、快速、高通量等特點(diǎn)得到越來越廣泛的應(yīng)用。在實(shí)際的免疫檢測(cè)中，從含雜質(zhì)成分較多的背景中快速分離、純化出目的待測(cè)物，一直是臨床檢驗(yàn)工作者面臨的難題。免疫磁微粒技術(shù)是利用高分子材料合成微米級(jí)磁性固相微粒作載體，利用表面有機(jī)物提供的羧基活性基團(tuán)與蛋白質(zhì)氨基共價(jià)結(jié)合，包被上具有特異性親合力的各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，使其致敏為免疫磁微粒，可進(jìn)行抗原、抗體反應(yīng)。磁微粒具有分離速度快、效率高、可重復(fù)性好；操作簡(jiǎn)單、不需要昂貴的儀器設(shè)備；不影響被分離細(xì)胞或其它生物材料的生物學(xué)性狀和功能等特點(diǎn)，在外加磁場(chǎng)作用下定向運(yùn)動(dòng)，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。作為用于化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)技術(shù)的一種通用固相分離方法，磁微粒可大大提高有效包被量從而節(jié)省原料，同時(shí)可拓寬檢測(cè)的線性范圍，從而有效避免彎鉤效應(yīng)的發(fā)生。生物素-親和素系統(tǒng)具有多級(jí)的信號(hào)放大作用，并且不增加非特異性干擾，且具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高、適用性強(qiáng)和實(shí)驗(yàn)成本低等特點(diǎn)。待測(cè)反應(yīng)體系可以利用生物素化抗體，使得親和素-生物素系統(tǒng)與免疫分析檢測(cè)體系偶聯(lián)，放大終反應(yīng)先將針對(duì)不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與抗原(標(biāo)準(zhǔn)抗原和待測(cè)抗原)同時(shí)反應(yīng)，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復(fù)合物，再加入親和素與復(fù)合物中的生物素結(jié)合，最終使反應(yīng)信號(hào)放大，從而提高了免疫分析的靈敏度。化學(xué)發(fā)光免疫分析結(jié)合生物素-親和素系統(tǒng)和免疫磁微粒固相分離體系是一種檢測(cè)肺瘤相關(guān)抗原242的先進(jìn)而有效的方法，有助于促進(jìn)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在臨床檢驗(yàn)、檢測(cè)中的應(yīng)用與發(fā)展
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明同時(shí)解決了上述問題，即將生物素一親和素免疫放大技術(shù)和免疫磁微粒技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)，檢測(cè)胂瘤相關(guān)抗原242，提供了一種能夠簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定地檢測(cè)腫瘤相關(guān)抗原242的測(cè)定試劑盒，該試劑盒適于在產(chǎn)業(yè)上有效地推廣應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種生物素一親和素免疫放大技術(shù)和免疫f茲《效粒技術(shù)結(jié)合化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定腫瘤相關(guān)抗原242的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑備單。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒包括1)腫瘤相關(guān)抗原242校準(zhǔn)品；2)腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被的磁微粒和生物素標(biāo)記的肺瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體的混合液；3)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素；4)上述辣4艮過氧化物酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾；以及5)反應(yīng)管。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被的磁微粒與生物素標(biāo)記的腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體的混合比例為1:2。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述化學(xué)發(fā)光底物包含A液和B液，其中，A液是在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對(duì)石輿苯酚；B液是在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成0.1MpH值為4.6的杵檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，其中，所述試劑盒使用的反應(yīng)管材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明的制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以腫瘤相關(guān)抗原242純品配制沖交準(zhǔn)品；2)配制肺瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被磁孩i粒和生物素標(biāo)記腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體的混合液；3)以辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素；4)配制辣根過氧化物酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾；5)分裝上述校準(zhǔn)品、抗體包被磁微粒和生物素標(biāo)記抗體的混合液、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾和反應(yīng)管；以及6)組裝為成品。根據(jù)本發(fā)明的方法，在所述制備抗體包被磁微粒和生物素標(biāo)記抗體的混合液的步驟2)中所述的混合液是由腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被的磁微粒和生物素標(biāo)記的腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體以體積比為1:2混合，以20~40%的小牛血清配制而成；所述磁微粒為l-2nm粒徑、四氧化三鐵內(nèi)核、表面包裹帶有活性基團(tuán)如氨基(NH2-)、羧基(-COOH)的聚合物，其使用濃度為510mg/mL;所述抗體包被磁微粒是通過戊二搭兩步法將腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被于磁微粒上；以封閉液封閉包被的磁微粒，所述封閉液為含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、pH值為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液；所述生物素標(biāo)記腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體是通過生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗體游離賴氨酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的方法，在所述以辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素的步驟3)中，采用改良過缺酸鈉法以辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素。根據(jù)本發(fā)明的方法，所述化學(xué)發(fā)光底物包含A液和B液，其中，A液是在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對(duì)硤苯酚；B液是在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成O.lMpH值為4.6的種檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。在根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法中，使用透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃作為反應(yīng)管材料。具體的上述試劑盒可以包括校準(zhǔn)品、抗體包被磁微粒和生物素標(biāo)記抗體的混合液、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物與洗滌緩沖液等。其中，所述校準(zhǔn)品的原料為標(biāo)準(zhǔn)級(jí)，純度不低于90%;抗體包被于磁微粒上，與生物素標(biāo)記的抗體形成混合液；標(biāo)記鏈親和素的酶為辣根過氧化物酶；化學(xué)發(fā)光底物為魯米諾；洗涂緩沖液為磷酸鹽緩沖液。本發(fā)明"腫瘤相關(guān)抗原242磁孩i?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒"可以非常有效地檢測(cè)出消化道惡性腫瘤(如胰腺癌、結(jié)直腸癌等)患者體內(nèi)的腫瘤相關(guān)抗原242的含量，可以根據(jù)腫瘤相關(guān)抗原242含量的多少判斷治療效果及其病情的變化。本發(fā)明的試劑盒(化學(xué)發(fā)光法、生物素-親和素免疫放大技術(shù)與免疫磁微粒結(jié)合)具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，且各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到同類進(jìn)口試劑盒的分析法水平。并且，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)為開放式操作，簡(jiǎn)便快速，不需要昂貴的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)量儀，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價(jià)值的檢測(cè)手段。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒，腫瘤相關(guān)抗原242單抗包被的磁微粒、待測(cè)樣品中的腫瘤相關(guān)抗原242與生物素標(biāo)記的腫瘤相關(guān)抗原242單抗結(jié)合，形成"雙抗體夾心"復(fù)合結(jié)構(gòu)，之后酶標(biāo)記的鏈親和素再與該復(fù)合結(jié)構(gòu)結(jié)合，形成"磁微粒-抗體-待測(cè)抗原-抗體-生物素-親和素-酶"復(fù)合物，最后與化學(xué)發(fā)光底物作用而產(chǎn)生并放大光信號(hào)，在管式發(fā)光儀中對(duì)腫瘤相關(guān)抗原242進(jìn)行高靈敏、高特異檢測(cè)。本發(fā)明采用"雙抗體直接夾心兩步法"反應(yīng)模式，有效地利用了化學(xué)發(fā)光技術(shù)結(jié)合磁微粒和生物素-親和素免疫放大技術(shù)原理，定量檢測(cè)人體血清、血漿樣品中腫瘤相關(guān)抗原242含量，確保了檢測(cè)的靈敏度。使用的磁微粒具有超順磁、高分散、表面積大的特點(diǎn)。對(duì)樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡(jiǎn)單可靠，可快速、高通量檢測(cè)大批樣品，便于操作和生產(chǎn)。本發(fā)明的試劑盒結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，使用方便，價(jià)格便宜，攜帶便利，與市場(chǎng)上的酶聯(lián)免疫試劑盒、板式化學(xué)發(fā)光試劑盒相比，線性范圍寬，有效避免彎鉤效應(yīng)，不需樣品稀釋，適用于大批量檢測(cè)樣品。圖1為實(shí)施例1所制備的試劑盒中的校準(zhǔn)品線性圖(雙對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線)。圖2為本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒(CanAg公司ELISA試劑盒)臨床血樣測(cè)值比對(duì)的相關(guān)曲線。具體實(shí)施方式實(shí)施例1制備本發(fā)明的腫瘤相關(guān)抗原242磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒一、腫瘤相關(guān)抗原242校準(zhǔn)品的制備用馬血清將肺瘤相關(guān)抗原242純品稀釋成校準(zhǔn)品，濃度分別為0U/mL、10U/mL、30U/mL、100U/mL、300U/mL、600U/mL，共6瓶。二、腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被磁微粒與生物素標(biāo)記腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體的混合液的制備1、腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被的磁微粒的制備將粒徑為12pm的磁孩t粒用戊二醛進(jìn)行活化，室溫?cái)嚢?，混?小時(shí)后，加磁場(chǎng)，靜置2025min，倒出上清，用pH值為7.4的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，并用該溶液進(jìn)行懸浮，濃度為50~100mg/mL;每毫升懸浮液中加入腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體20~50嗎，在4。C下攪拌過夜后，加磁場(chǎng)，靜置10~15min,倒出上清，用含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、0.02mol/L的^#酸緩沖液(pH為7.2)于室溫封閉3~4小時(shí)；最后用pH值為7.4、含吐溫-20和疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽洗滌緩沖液清洗3~5次，并用該溶液配制成5~10mg/mL的工作液。磁微粒在4'C保存。2、生物素標(biāo)記的腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體的制備生物素標(biāo)記腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體以生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與單抗發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，對(duì)PBS充分透析，生物素標(biāo)記物以小牛血清稀釋，加入proclin300,-20°C以下保存。3、混合液的制備將腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被的磁微粒與生物素標(biāo)記的肺瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體以體積比為1:2混合，以20~40%小牛血清配制而成。三、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素的制備以辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素采用改良過硤酸鈉法，具體標(biāo)記過程如下溶解4.4mgHRP于lmL蒸餾水中，加入0.4mL過》典酸鈉(50mmol/L)室溫?cái)嚢?0min，經(jīng)lmmol/L醋酸鈉緩沖液，pH4.4透析后加入8mg鏈親和素，攪拌2h,最后用200mmol/LNaBH4進(jìn)行還原，經(jīng)0.02MPBS緩沖液透析后，加等體積甘油，-20。C以下保存。四、酶標(biāo)記物的濃度選定采用方陣法選擇酶標(biāo)記物的工作濃度范圍為1:3000-5000五、酶標(biāo)記物稀釋液Tris12.120gBSA5gProclinlmL雙蒸水1000mL六、化學(xué)發(fā)光底物本發(fā)明所使用的辣根過氧化物酶(HRP)的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法A液在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成O.IMpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中力口入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的對(duì)在典苯酚。B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成O.IMpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，在此溶液中加入200mg/mL的過氧化氫溶液。使用方法A、B液雙組分試劑，在使用前根據(jù)使用量等體積混合。七、洗滌緩沖液洗滌緩沖液是含有0.1~0.5%吐溫-20、0.1%疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4。使用時(shí)用蒸餾水稀釋20倍。八、半成品及成品組成上述步驟所得產(chǎn)品分裝即為半成品。抽出三份經(jīng)過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成胂瘤相關(guān)抗原242磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。實(shí)施例2本發(fā)明的試劑盒的使用方法一、樣品前處理取人的空腹晨血清樣品，3000rpm離心5min,取上層液50pL進(jìn)行分析。二、檢測(cè)方法使用本試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，需先取出抗體包被磁微粒與生物素標(biāo)記抗體的混合液、校準(zhǔn)品/待測(cè)樣品、酶標(biāo)記的親和素在室溫放置15-30分鐘，使它們平衡到室溫；之后，將恒溫溫箱或者水浴鍋調(diào)至37°C;再后，準(zhǔn)備好合適的微量加樣器及對(duì)應(yīng)吸頭并且檢查化學(xué)發(fā)光儀是否正常工作。使用本試劑盒按照實(shí)施例1的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的具體操作步驟如下將圓底聚苯乙烯試管編號(hào)后，向試管中加入50pL血清樣品或系列校準(zhǔn)品溶液，校準(zhǔn)品每管加OU/mL、10U/mL、30U/mL、100U/mL、300U/mL、600U/mL各50pL，再加入抗體包被磁微粒與生物素標(biāo)記抗體的混合液50pL，37。C振蕩反應(yīng)30min。用洗滌液清洗三遍后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素5(HiL,37。C振蕩反應(yīng)15min。之后，將試管架置于磁分離器上分離5min,然后倒轉(zhuǎn)分離器倒出上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管加入洗滌液50(HiL,充分混勻，置于磁分離器上分離5min，倒出上清液，將倒轉(zhuǎn)的試管放在濾紙上吸千，拍擊分離器以除去掛壁液體，重復(fù)3次。各管加入化學(xué)發(fā)光底物200~400nL,充分混勻，置于磁分離器內(nèi)，待磁微粒富集于底部后，暗處放置10min,而后在管式化學(xué)發(fā)光測(cè)量儀上依序測(cè)量各管的發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。以校準(zhǔn)品濃度的Log值為橫坐標(biāo)，RLU的Log值為縱坐標(biāo)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線(雙對(duì)數(shù)曲線)，以各待測(cè)血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清的CA242的濃度，見附圖1，其中，I為發(fā)光強(qiáng)度，C為CA242濃度(單位為U/mL),相關(guān)系數(shù)r=0.9998，Y=4.6896+0.7283X。實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)檢定按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對(duì)實(shí)施例1中制備的試劑盒進(jìn)行檢定，結(jié)果如下1、試劑盒精密度測(cè)定(1)校準(zhǔn)品精密度實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例1中制備的試劑盒分別取三批進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)，每批抽取IO個(gè)試劑盒。以實(shí)施例1中所抽取的試劑盒測(cè)定30U/mL的CA242校準(zhǔn)品5次。計(jì)算測(cè)定濃度的變異系數(shù)。實(shí)施例1中的三批試劑盒的測(cè)定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明變異系數(shù)在3.2%~7.6%之間。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2)樣本可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取兩份正常人血清，分別添加CA242校準(zhǔn)品至30U/mL和100U/mL。取實(shí)施例1中三個(gè)不同批次的試劑盒各3個(gè)，對(duì)樣品重復(fù)測(cè)定5次，分別計(jì)算變異系數(shù)。測(cè)定結(jié)果如表2、表3所示，表明本發(fā)明所制備的CA242磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒測(cè)定血清樣本的變異系數(shù)小于6.1%。表230U/mLCA242血清樣品可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表3100U/mLCA242血清樣品可重復(fù)性實(shí)驗(yàn)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2、試劑盒準(zhǔn)確度測(cè)定取兩個(gè)CA242臨床定值血清，濃度分別為34.8U/mL和25.6U/mL，分別向其中加入CA242的校準(zhǔn)品溶液10U/mL、30U/mL和100U/mL，按照實(shí)施例1的方法對(duì)每個(gè)濃度做3個(gè)平行，計(jì)算回收率。結(jié)果如表4所示，表明CA242的添加回收率在85.3%~98.7%之間。表4實(shí)施例1的試劑盒的回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3、試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行37。C7天加速實(shí)驗(yàn)后，測(cè)定試劑盒的最大、最低發(fā)光強(qiáng)度、待測(cè)物的加標(biāo)回收率，表明實(shí)施例1的試劑盒指標(biāo)均在正常范圍之內(nèi)。對(duì)實(shí)施例1的試劑盒主要組分(抗體包被磁微粒與生物素標(biāo)記抗體的混合液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素溶液、校準(zhǔn)品、發(fā)光底物液和洗滌緩沖液)進(jìn)行2~8°C8個(gè)月跟蹤實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明各項(xiàng)指標(biāo)完全符合臨床要求?？紤]到試劑盒冷凍情況的發(fā)生，將實(shí)施例1的試劑盒放入-20'C冷凍7天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可以看出試劑盒可以在2-8。C至少可以保存6個(gè)月以上。經(jīng)過大量的實(shí)騶、沃明，本發(fā)明試劑盒的方法學(xué)指標(biāo)如下檢測(cè)范圍0~700U/mL;靈敏度最小檢出限為0.5U/mL;精密度小于10%(n=30);準(zhǔn)確性平均回收率在85.0%~100.0%之間；特異性與CA19-9、CEA、AFP、CA50、CA125、CA153等常見的腫瘤標(biāo)志物的交叉反應(yīng)率小于0.1%;穩(wěn)定性各試劑組分置37。C,考察7天后，各組分仍穩(wěn)定。說明"腫瘤相關(guān)抗原242^茲微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒"的臨床檢測(cè)范圍、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性、特異性和穩(wěn)定性是完全符合臨床要求的。綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對(duì)所用的原材料進(jìn)行了篩選實(shí)驗(yàn)和質(zhì)量檢定，包括包被抗體的活性、磁微粒的吸附性能和變異大小、HRP的活性、化學(xué)發(fā)光底物的發(fā)光強(qiáng)度及發(fā)光持續(xù)時(shí)間等。然后對(duì)包被方法進(jìn)行了研究，用不同的包被緩沖液和封閉液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選擇出最適合的包被液和封閉液，通過抗體不同包被濃度實(shí)驗(yàn)找到最佳的濃度條件。對(duì)于HRP的標(biāo)記可以有不同的方法，通過反復(fù)探索和對(duì)比實(shí)驗(yàn)最終找到了簡(jiǎn)便、產(chǎn)率高、成本低、質(zhì)量可靠的標(biāo)記方法，并對(duì)不同的酶稀釋液進(jìn)行了長期的考察實(shí)驗(yàn)，配制出了能夠使酶標(biāo)記物長期保持活性穩(wěn)定的稀釋液。本發(fā)明的發(fā)明人還對(duì)試劑盒的反應(yīng)模式和反應(yīng)條件進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，最終確定了雙抗體夾心兩步法反應(yīng)模式，并就不同的反應(yīng)時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，確定最適合的反應(yīng)時(shí)間。利用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測(cè)范圍寬，操作簡(jiǎn)單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強(qiáng)，更適用于我國臨床檢測(cè)及篩查實(shí)驗(yàn)室，可有效地診斷消化道惡性腫瘤(如胰腺癌、結(jié)直腸癌等)，并可用于消化道惡性腫瘤手術(shù)和化療后的療效^L察。實(shí)施例4本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測(cè)值比對(duì)用本發(fā)明的試劑盒和CanAg公司的CA242ELISA試劑盒對(duì)80份腫瘤病人的臨床血清樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，所采用的80份臨床血樣來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬天壇醫(yī)院和首都醫(yī)科大學(xué)附屬友誼醫(yī)院。其檢測(cè)結(jié)果見附圖2，以本發(fā)明方法測(cè)定的血樣CA242結(jié)果為橫坐標(biāo)，以CanAg測(cè)定的結(jié)果為縱坐標(biāo)作回歸分析，相關(guān)方程為Y=1.0951+0.9520X,相關(guān)系數(shù)r-0.9872。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明，本發(fā)明方法同國外試劑盒臨床血樣測(cè)值相關(guān)性良好。權(quán)利要求1、一種腫瘤相關(guān)抗原242磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)腫瘤相關(guān)抗原242校準(zhǔn)品；2)腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被的磁微粒和生物素標(biāo)記的腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體的混合液；3)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素；4)上述辣根過氧化物酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾；以及5)反應(yīng)管。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被的磁微粒與生物素標(biāo)記的腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體的混合比例為1:2。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物包含A液和B液，其中，A液是0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對(duì)硤苯酚；B液是0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。4、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒使用的反應(yīng)管材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。5、一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以腫瘤相關(guān)抗原242純品配制校準(zhǔn)品；2)配制腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被磁〗鼓粒和生物素標(biāo)記腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體的混合液；3)以辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素；4)配制辣根過氧化物酶所作用的化學(xué)發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾；5)分裝上述校準(zhǔn)品、抗體包被磁微粒和生物素標(biāo)記抗體的混合液、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾和反應(yīng)管；以及6)組裝為成品。6、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在所述配制抗體包被磁微粒和生物素標(biāo)記抗體的混合液的步驟2)中所述的混合液是由腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包被的磁微粒和生物素標(biāo)記的腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體以體積比為1:2混合，以20~40%的小牛血清配制而成；所述磁微粒為12pm粒徑、四氧化三鐵內(nèi)核、表面包裹帶有活性基團(tuán)的聚合物，其使用濃度為5~10mg/mL;所述抗體包被磁微粒是通過戊二醛兩步法將腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體包4皮于^茲農(nóng)il立上；以封閉液封閉包被的磁微粒，所述封閉液為含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、pH值為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液；所述生物素標(biāo)記腫瘤相關(guān)抗原242單克隆抗體是通過生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗體游離賴氨酸發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。7、如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述活性基團(tuán)為氨基或羧基。8、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在所述以辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素的步驟3)中，采用改良過碘酸鈉法以辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素。9、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物包含A液和B液，其中，A液是0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.0mg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對(duì)硤苯酚；B液是0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。10、如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，使用透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃作為反應(yīng)管材料。全文摘要本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種CA242磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法。根據(jù)本發(fā)明試劑盒包括1)CA242校準(zhǔn)品；2)CA242單克隆抗體包被磁微粒和生物素標(biāo)記CA242單克隆抗體的混合液；3)辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素；4)化學(xué)發(fā)光底物；以及5)反應(yīng)管。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明制備上述試劑盒的方法為1)以CA242純品配制校準(zhǔn)品；2)配制抗體包被磁微粒和生物素標(biāo)記抗體的混合液；3)用辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈親和素；4)配制化學(xué)發(fā)光底物；5)分裝上述校準(zhǔn)品、混合液、酶標(biāo)記物、化學(xué)發(fā)光底物和反應(yīng)管；以及6)組裝為成品。本發(fā)明試劑盒具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/577GK101398429SQ20071012245公開日2009年4月1日申請(qǐng)日期2007年9月26日優(yōu)先權(quán)日2007年9月26日發(fā)明者應(yīng)希堂,李振甲,林金明,栩王,胡國茂申請(qǐng)人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司