專利名稱：鎂(離子)診斷/測定試劑盒及鎂(離子)的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鎂(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鎂(離 子)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鎂測定方法很多，概括起來有比色法、熒光法、離子層析法，離子選擇性電
極法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀釋質(zhì)譜法(ID-MS)等。
鎂測定的決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法，參考方法是原子吸收分光光度法 法。這些方法雖然結(jié)果準(zhǔn)確，但設(shè)備復(fù)雜，費用昂貴，不適合常規(guī)實驗室和自 動分析。
比色法是應(yīng)用最廣泛的方法，包括甲基麝香草酚藍(lán)法(MTB)、達(dá)旦黃法、 鄰甲酚酞絡(luò)合酮法(0CPC)、鈣鎂試劑(Calmagite)法、以及新近報道的2_ (8' -羥基喹啉-5，-磺酸-7，-偶氮)-變色酸(8Q5SAC)法。比色法操作簡便，費 用低，適合常規(guī)實驗室應(yīng)用。但存在試劑空白吸光度高，膽紅素和其它陽離子 的干擾，試劑穩(wěn)定性差及試劑中含有腐蝕性或毒性成分等缺點。
離子選擇性電極法可測定生理溶液中鎂離子活度。采用中性載體(ETH7025) 液膜離子選擇電極測定準(zhǔn)確度較高。但還存在鈣干擾(生理范圍內(nèi))&2+最大干 擾10%等不足。
離子色譜法測定血清總鎂在測定之前需對樣本進行預(yù)處理，包括酸化稀釋 和過濾。Thie叩ont等使用該法對五種國際標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)學(xué)會用火焰原子吸收分光光度法的定值血清進行了分析，結(jié)果平均偏差僅為0.35%，認(rèn)為離子色譜法 可作為總鎂測定有價值的參考方法。
Mg2+的酶法測定技術(shù)在近幾年研究非常活躍，取得較大進展。已應(yīng)用于Mg"
測定的酶學(xué)方法有①己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法；②甘油激酶、
磷酸甘油氧化酶和過氧化物酶偶聯(lián)法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶 聯(lián)法；④酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法；⑤磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)法； ⑥異檸檬酸脫氫酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶偶聯(lián)法。酶法檢測鎂結(jié)果準(zhǔn) 確，干擾影響小，適合于自動化分析。由于酶試劑不斷更新，使測定快速、靈 敏，操作簡便，因而具有較好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原 型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鎂(離 子)濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的鎂(離子)診斷/ 測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析 儀上進行鎂(離子)濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切 實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明鎂(離子)濃度測定方法原理如下
葡萄糖+腺苷三磷酸己糖激酶/^^2+葡萄糖-6-磷酸+
腺苷二磷酸
腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸甘油激酶/^^2+甘油+腺苷三磷酸 甘油+輔酶甘油脫氫酶甘油酸+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用需要鎂離子激活的己糖激酶(hexokinase; EC 2.7.1.1; EC2.7丄2)酶(偶)聯(lián)甘油激酶(Glycerokinase; EC2.7丄30)(也需要鎂離子激活)、 甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase; EC 1丄1.6; EC l丄1.72; EC 1丄1.156; EC Ll.99.22)酶促反應(yīng)速率比色法。在鎂離子的激活下，己糖激酶酶解腺苷三 磷酸反應(yīng)產(chǎn)生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯(lián)合甘油激酶、甘油脫氫酶的作用， 最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸 收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量 340nm處吸光度上升的速度，可以測算鎂(離子)的濃度大小。
實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論 是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鎂(離子)診斷/測定試劑盒較 為理想
緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
己糖激酶10000U/L
甘油激酶12000U/L
甘油脫氫酶12000U/L
葡萄糖20 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
甘油-3-磷酸3 mmol/L
本發(fā)明的鎂(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脫氫酶、葡萄糖、 腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶、甘油激酶、甘油脫氫酶。輔酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-
磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸。試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油激酶、甘油脫氫酶。試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶。
輔酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定鎂(離子)濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一
本實施例的鎂(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括:
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
輔酶3 mmol/L
己糖激酶10000U/L
甘油激酶12000U/L
甘油脫氫酶12000 U/L
葡萄糖20 mmol/L
腺苷三磷酸3 mmol/L
甘油-3-磷酸3 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37"C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鎂(離子)樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。實施例二
本實施例的鎂(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
葡萄糖 20 mmol/L
腺苷三磷酸 3 mmol/L
甘油-3-磷酸 3 mmol/L試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
己糖激酶 10000 U/L
甘油激酶 12000 U/L
甘油脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《
0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm,被測鎂(離子)樣品與試劑1、
試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約2
分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，
檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。
實施例三
本實施例的鎂(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 50 mmol/L輔酶
腺苷三磷酸
甘油-3-磷酸試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑
甘油脫氫酶
3 mmol/L20 mmol/L3 mmol/L3 mmol/L
畫mmol/L500 mmol/L12000 U/L12000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑
500 mmol/L
10000U/L
:試劑，可以直接使用,
己糖激酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體測定鎂(離子)濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時
間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鎂(離子)樣品與試劑l、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約2分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。
申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上升曲線直至終點；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可達(dá)6mmol/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過士 5%;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)O.l ± 0.04AA/mmol
/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種酶比色法及酶聯(lián)法的鎂(離子)的濃度測定方法，其方法原理如下葡萄糖+腺苷三磷酸 <u>己糖激酶/Mg</u><u>2+</u> 葡萄糖-6-磷酸+ 腺苷二磷酸腺苷二磷酸+甘油-3-磷酸 <u>甘油激酶/Mg</u><u>2+</u> 甘油+腺苷三磷酸甘油+輔酶 <u>甘油脫氫酶</u>　　甘油酸+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出鎂(離子)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種鎂(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20——500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-4000 mmol/L輔酶1—6 mmol/L己糖激酶1000———訓(xùn)OO U/L甘油激酶1000———80000 U/L甘油脫氫酶1000-——80000 U/L葡萄糖1—50 mmol/L腺苷三磷酸1—50 mmol/L甘油-3-磷酸1—50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可 以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖 激酶、甘油激酶、甘油脫氫酶組成。輔酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脫氫 酶、.葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、己糖激酶、甘油激酶、甘油脫氫酶、葡萄糖、腺 苷三磷酸、甘油-3-磷酸組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、 葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸組成；試劑2,由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油 激酶、甘油脫氫酶組成；試劑3,由緩沖液、穩(wěn)定劑、己糖激酶組成。輔酶、 己糖激酶、甘油激酶、甘油脫氫酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸在 試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鎂(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn) 定劑14000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鎂(離子)診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定鎂(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、葡萄糖、腺苷三磷酸、甘油-3-磷酸、己糖激酶、甘油激酶、甘油脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出鎂(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464384SQ20071019217
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司