專利名稱：鉀(離子)診斷/測定試劑盒及鉀(離子)的濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鉀(離子)診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定鉀 (離子)濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腎小球疾病、腎功能衰弱、糖尿病酮癥中毒、腎上腺皮質(zhì)功能減退等。當(dāng)
血鉀高達(dá)7. 5 mmol/L或以上時(shí)病人將出現(xiàn)心律失常，應(yīng)考慮確定適當(dāng)?shù)闹委?方案。血清鉀超過10 ranol/L時(shí)，即可發(fā)生心室纖顫，心臟停搏而死亡。高 鉀使心臟停跳于舒張期。
目前鉀測定常用的方法有同位素稀釋質(zhì)譜法、中子活化法、火焰光度計(jì) 法、化學(xué)測定法、離子選擇電極法、原子分光光度法、酶動(dòng)力學(xué)法。
火焰光度法1950年開始使用并一直沿用至今的火焰光度法檢測血清、尿 液、腦脊液及胸腹水的Na+和K+，是一種發(fā)射光譜分析法。測定方法分為內(nèi)標(biāo) 準(zhǔn)法和外標(biāo)準(zhǔn)法兩種。外標(biāo)準(zhǔn)法操作誤差較大， 一般不采用?，F(xiàn)在主要使用 內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)法，即標(biāo)本及標(biāo)準(zhǔn)液采用加進(jìn)相同濃度的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)元素鋰或銫進(jìn)行 測定。操作時(shí)，將含鋰的溶液作為稀釋液，同時(shí)測定K、 Na和Li的濃度，以 標(biāo)本與標(biāo)準(zhǔn)液的Na/Li與K/Li比值，計(jì)算Na、 K濃度。由于血清稀釋倍數(shù)大， 血清蛋白質(zhì)粘性的影響幾乎可忽略不計(jì)。
化學(xué)測定法主要利用復(fù)環(huán)王冠化合物如穴冠醚或球冠醚，亦稱為冠醚， 均為離子載體進(jìn)行測定，由于大環(huán)結(jié)構(gòu)內(nèi)有空穴，分子內(nèi)部氧原子有未共用 電子對可與金屬離子結(jié)合，根據(jù)空穴大小，可選擇性結(jié)合不同直徑的金屬離 子，從而可達(dá)到測出離子濃度的目的。測定血清K， 一般采用普通冠醚陰離子染料進(jìn)行比色定量。
離子選擇電極法ISE法是采用靈敏的特定專用電極，在專用儀器上進(jìn)行
血清和尿等體液的K+、 Na+的測定，因標(biāo)本用量少，快速準(zhǔn)確，幾乎有取代其 他方法的趨勢。其儀器測定原理是離子選擇電極與參比電極組合浸泡在待測 標(biāo)本溶液中，進(jìn)行檢測。目前己有的電極種類為①玻璃膜電極，感應(yīng)材料
為玻璃薄膜的有pH電極、T電極和Na+電極；②固相膜電極，由難溶性金屬物 質(zhì)加壓成型，以固體膜或單日膜作為感應(yīng)膜的電極有C1 —電極和F—電極；③液 態(tài)膜電極，將環(huán)氧樹脂或內(nèi)裝聚氯乙稀為感應(yīng)膜的Ca2+電極；④用纈氨霉素膜 制成的K+電極。上述電極均有一定的壽命，因?yàn)殡姌O使用一段時(shí)間就會(huì)自動(dòng)
老化，有效期長短不一。
原子分光光度法原子分光光度法可用于檢測血清K+、 Na+，操作繁雜，誤 差較大，不及火焰光度法簡便。
鉀測定的決定性方法是同位素稀釋質(zhì)譜法及中子活化法。冊0推薦的方法 是火焰光度計(jì)法。目前離子選擇電極法應(yīng)用較為普遍，但是電極成本昂貴。
酶測定法和火焰光度計(jì)法或離子選擇電極法均有較好的一致性，且抗干擾 性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，彌補(bǔ)了生化分析儀不能同時(shí)測定鉀鈉的不足。有較好的分 析性能，易于自動(dòng)化，在臨床化學(xué)分析中必定取代火焰光度計(jì)法成為常規(guī)分 析項(xiàng)目。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測還原型 煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定鉀(離 子)濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的鉀(離子)診斷/ 測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行鉀(離子)濃度測定，而且測定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得 到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明鉀(離子)濃度測定方法原理如下
色氨酸+水色氨酸酶化+ 丙酮酸+氨離子+吲哚
丙酮酸+輔酶八+氧 丙酮酸氧化酶過氧化氫+ 二氧化碳+
乙酰輔酶A
二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶異檸檬酸脫氫酶異擰檬酸
+輔酶
這種方法應(yīng)用需要鉀離子激活的色氨酸酶(tiyptophaiiase; EC4丄99.1)酶 (偶)聯(lián)丙酮酸氧化酶(Pyruvate oxidase; EC 1.2.3.6)、異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1.1.1.41; EC 1丄1.42)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測/速率比色法。在 鉀(離子)的激活下，色氨酸酶酶解色氨酸反應(yīng)產(chǎn)生丙酮酸，再通過(偶) 聯(lián)合丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm 處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型 輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度， 可以測算鉀(離子)的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無 論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明鉀(離子)診斷/測定試劑
盒較為理想
緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
色氨酸酶 6000 U/L
丙酮酸氧化酶 8000 U/L異檸檬酸脫氫酶 10000 U/L
色氨酸 10 mmol/L
輔酶A 4 mmol/L
酮戊二酸 10mmol/L 本發(fā)明的鉀(離子)診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸 脫氫酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫氫酶。 還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫氫酶、色氨酸、輔酶 A、酮戊二酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)， 在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸。 試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫氫酶。 試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶。
7還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫氫酶、色氨酸、輔酶 A、酮戊二酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干 粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定鉀(離子)濃度的方法，其還原
型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio- NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。 實(shí)施例一
本實(shí)施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑500 mmol/L
還原型輔酶0.25 mmol/L
色氨酸酶6000 U/L
丙酮酸氧化酶議0 U/L
異檸檬酸脫氫酶10000 U/L
色氨酸10 mmol/L
輔酶A4 mmol/L
酮戊二酸10 mmol/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前， 加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度 1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm,被測鉀(離子)樣品與試 劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2分鐘 左右，檢測時(shí)間2分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大
實(shí)施例二
本實(shí)施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為雙試劑，包括:
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 還原型輔酶
輔酶A
酮戊—酸
100mmol/L 50 mmol/L 0.25 mmol/L 10 mmol/L 4 mmol/L 10 mmol/L
100 mmol/L 500 mmol/L 6000 U/L 8000 U/L ■00 U/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑 色氨酸酶 丙酮酸氧化酶 異檸檬酸脫氫酶
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度 1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測鉀(離子)樣品與試 劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí) 間大約2分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長340nrn吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大 小。
實(shí)施例三
本實(shí)施例的鉀(離子)診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
還原型輔酶 0.25 mmol/L
色氨酸 10 mmol/L
輔酶A 4 mmol/L
酮戊二酸 10 mmol/L 試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑
丙酮酸氧化酶
100 mmol/L 500 mmol/L 8000 U/L 10000 U/L
100醒ol/L 500 mmol/L 6000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定鉀(離子)濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37-C，反應(yīng)時(shí) 間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測試主波長340nm，測試副波長405nm， 被測鉀(離子)樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)
試劑3
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約2分鐘左右，檢測時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀
下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大小。
申請人經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá) 到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀
器得出所需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.028;吸光度 時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點(diǎn)；試劑可測有效(R》0.99)線形范圍可 達(dá)llmmol/L;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏差不超過±5%;試劑測試的 精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《2%;試劑的靈敏度可達(dá)0.015 ± 0.008 AA/mmol/L——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，足以便于推廣 應(yīng)用。
權(quán)利要求
1. 一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀(離子)濃度測定方法，其方法原理如下色氨酸+水 <u>色氨酸酶/K</u><u>+</u> 丙酮酸+氨離子+吲哚丙酮酸+輔酶A+氧 <u>丙酮酸氧化酶</u> 過氧化氫+二氧化碳+乙酰輔酶A二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶 <u>異檸檬酸脫氫酶</u> 異檸檬酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的速度，測算出鉀(離子)的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種鉀(離子)診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液20—一500 mmol/L穩(wěn)定劑1——-楊0 mmol/L還原型輔酶0.1——0.35 mmol/L色氨酸酶1000———80000 U/L丙酮酸氧化酶畫O-——80000 U/L異檸檬酸脫氫酶1000-——80000 U/L色氨酸1—50 mmol/L輔酶A1—50 mmol/L酮戊二酸1_50 mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范 圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異擰檬酸脫 氫酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫氫酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、還原型輔酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫氫酶組成。還原型輔酶、 色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫氫酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸 在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫 氫酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、還原型輔酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸組成；試劑2，由緩沖液、 穩(wěn)定劑、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定 齊U、色氨酸酶組成。還原型輔酶、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異擰檬酸脫 氫酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可 以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鉀(離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二 醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的鉀(離子)診斷/測定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測定鉀(離子)濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、色氨酸、輔酶A、酮戊二酸、色氨酸酶、丙酮酸氧化酶、異檸檬酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的速度，從而測算出鉀(離子)的濃度大小。
文檔編號G01N21/31GK101464400SQ20071019219
公開日2009年6月24日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司