專利名稱：：改良的維生素d測量方法改良的維生素D測量方法
背景技術(shù)：
：本發(fā)明涉及測量樣品中維生素D代謝物的方法，該方法包括以下步驟(a)在適于從維生素D結(jié)合蛋白釋放維生素D代謝物而又不引起蛋白質(zhì)沉淀的條件下用維生素D代謝物釋放劑處理所述樣品，(b)對步驟(a)處理得到的樣品進(jìn)行色i普分離，(c)在所述色譜分離過程中或之后測量維生素D代謝物。本發(fā)明還涉及用于測量對象的維生素D狀況、用于疾病"^斷的方法以及用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑和試劑盒。如術(shù)語維生素所表明的，足夠的維生素D攝入是十分關(guān)鍵的。對象中循環(huán)維生素D或維生素D代謝物的水平稱為維生素D狀況。與維生素D有關(guān)的營養(yǎng)不良是引起很多疾病包括兒童佝僂病和骨軟化癥的重要因素，甚至可引起成人骨質(zhì)疏松癥。通過測量臨床樣本維生素D及其代謝物而了解維生素D的狀況對于評估患者非常有幫助，并可有助于臨床醫(yī)生確診。不足為奇的是，對改進(jìn)用于測量體液內(nèi)維生素D和其代謝物的方法所作的努力一直在持續(xù)增加。在我們的營養(yǎng)學(xué)中維生素D有兩種形式可利用，即作為維生素D2或維生素D3。維生素D2通過照射來自酵母和真菌的麥角固醇在體外產(chǎn)生，當(dāng)它以強(qiáng)化食品或藥物制劑的形式被吸收時(shí)可在人體中發(fā)現(xiàn)。另一方面，動(dòng)物暴露于紫外線時(shí)可從7-脫氫膽固醇形成維生素D3。該反應(yīng)發(fā)生于皮膚。維生素D3也可從飲食如魚肝油中得到。以維生素D2或D3形式的營養(yǎng)維生素D被人體吸收后迅速轉(zhuǎn)化成循環(huán)代謝物25-羥基維生素D，其被發(fā)現(xiàn)是在細(xì)胞外并與循環(huán)維生素D結(jié)合蛋白緊密結(jié)合。由于維生素D迅速轉(zhuǎn)化為其第一個(gè)代謝物25-羥基維生素D，因此對維生素D的測量不能給出對象維生素D狀況的有用指示。維生素D的其它代謝物(如la，25-二羥維生素D)以比非-la-羥基化代謝物(例如25-羥基維生素D)低至一千倍的濃度進(jìn)行循環(huán)，所以對總的循環(huán)維生素D代謝物的評價(jià)沒有顯著貢獻(xiàn)。由于這個(gè)原因，la-羥基化代謝物不對維生素D狀況提供直接或有用的指示。25-羥基維生素D是血清中濃度最高的代謝物，容易被測量。它因而成為對象中維生素D狀況最常用的標(biāo)識物。維生素D代謝物也和其它血清蛋白例如白蛋白結(jié)合，可是遠(yuǎn)不如與結(jié)合蛋白結(jié)合得緊密。普遍^皮接受的是，促使維生素D從維生素D-維生素D結(jié)合蛋白復(fù)合體釋放的方法也將適用于使其脫離其它較弱的復(fù)合體。因而各種維生素D代謝物與維生素D結(jié)合蛋白快而強(qiáng)的結(jié)合是維生素D代謝物檢測方面的主要關(guān)注內(nèi)容，且其極大地阻礙著測量。所有目前已知的方法都需要維生素D代謝物必須從維生素D結(jié)合蛋白釋放。在這樣的過程中維生素D結(jié)合蛋白通常會(huì)變性。這也往往需要萃取步驟，從目標(biāo)維生素D代謝物分離出維生素D結(jié)合蛋白和其它變性蛋白，并將變性蛋白組分從樣品中除去。這樣目標(biāo)維生素D代謝物在分離的組分中變得可用并且更容易處理和檢測。萃取可以用許多方法完成，包括通過向樣品加入有機(jī)溶劑如氯仿、正己烷或乙酸乙酯和正己烷的基于溶劑的萃取法。有機(jī)層和水層被分開而溶劑被蒸發(fā)。然后使殘存物在與水混溶的溶劑如乙醇中重組。反相柱萃取方法也被使用。其它傳統(tǒng)的方法包括利用高效液相色譜和質(zhì)譜完成個(gè)別維生素D代謝物的分離并排除樣品中的千擾因素例如結(jié)合蛋白。Armbruster，F(xiàn).P.等(WO99/6721l)教導(dǎo)可以用乙醇處理血清或血漿樣品以使維生素D代謝物從它的維生素D結(jié)合蛋白復(fù)合體中釋放。沉淀的蛋白質(zhì)經(jīng)離心沉底，在上清液里可得到維生素D代謝物。用任何基于液相色譜的方法可以很容易地檢測這種上清液里的維生素D代謝物。5在EP0753743中提出一個(gè)可選擇的解決方案。推薦用高碘酸鹽來完成使維生素D代謝物從維生素D結(jié)合蛋白的釋放。像通常一樣，含有維生素D結(jié)合蛋白的沉淀通過離心作用除去，上清液則用來檢測目標(biāo)維生素D代-射物。最近Vogeser,M.等人(Clin.Chem.50(2004)1415-1417)提出一種"用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定量循環(huán)25-羥基維生素D3的候選參考方法"。為了精確定量，提議使用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的25-羥基維生素D3。使此同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)與天然25-羥基維生素D3共純化，通過測定此內(nèi)標(biāo)就有可能補(bǔ)償在萃取和/或檢測過程中的變化。像在測量維生素D代謝物時(shí)使用的大多數(shù)常規(guī)程序一樣，Vogeser等人描述的方法是基于一種乙腈萃取步驟。BouillonR.等人(ClinChem30(1984)1731-1736)描述了關(guān)于25-羥基維生素D的兩種"直接的，，測定法。雖然所描述的測定法不需要色譜步驟，但是如在較傳統(tǒng)的方法中所需要的一樣，它們?nèi)匀恍枰萌軇┏恋碜饔脧木S生素D結(jié)合蛋白萃取維生素D。Holick，M.F.和Ray，R.(美國專利第5,981,779號)描述了測定維生素D和其代謝物的方法。他們的方法基于用純化的維生素D結(jié)合蛋白作為特定結(jié)合劑的竟?fàn)幗Y(jié)合測定。該測定法的一個(gè)先決條件也是目標(biāo)維生素D代謝物必須首先從樣品中分離，只有從它的結(jié)合蛋白中分離之后才可以被測量。在一些來自血清、血漿或其它生物體液的甾類激素的測量中，類固醇類似物被用于將這些激素從它們的結(jié)合蛋白中置換出來。這些類固醇類似物必須與相應(yīng)的類固醇結(jié)合蛋白結(jié)合，同時(shí)必須不與用于免疫測定的抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)。類固醇類似物使類固醇結(jié)合蛋白飽和；置換類固醇并允許類固醇與免疫測定抗體相結(jié)合。理論上，使用(特異性)竟?fàn)幹脫Q劑例如不與測定抗體交叉反應(yīng)的維生素D類似物應(yīng)該能夠提供"直接測定"(照直接的類固醇測量方法來推論)。可是由于血清樣本中的DBP濃度非常高，因而這種維生素6D類似物被認(rèn)為需要很高的濃度。最近，Laurie等人(US2004/0096900)表明8-苯胺基-l-萘磺酸可用于將維生素D結(jié)合蛋白上的維生素D代謝物置換下來。然后用竟?fàn)幟该庖邷y定法對維生素代謝物進(jìn)行測量。用于檢測某種維生素D代謝物的其它的免疫學(xué)測定方法(參照例如WO02/57797和US2004/0132104)必須滿足一個(gè)微妙的平衡一方面維生素D代謝物必須盡可能有效地從它的結(jié)合蛋白上釋放；另一方面用于這種釋放的試劑必須不干擾免疫測定程序?？磥磉@些程序必須以某種方式在這兩種需求之間達(dá)到妥協(xié)。已發(fā)現(xiàn)并表明的是，在經(jīng)歷了迄今為止相當(dāng)多的如Zerwekh，J.E.在Ann.Clin.Biochem.41(2004)272-281)中所描述的缺陷之后，維生素D免疫學(xué)測定法在是可用的。免疫測定是相當(dāng)復(fù)雜的，需要很多特定試劑，在大多數(shù)情況下同樣需要產(chǎn)生臨床相關(guān)結(jié)果的儀器。與此相反，色i普分離程序在所需試劑方面的要求少得多。通常測量維生素D代謝物的常規(guī)程序必須依靠后接至少一個(gè)色譜分離步驟的至少一個(gè)萃取步驟。而這樣的色譜分離通常就直接后接適當(dāng)?shù)臋z測步驟。如果目標(biāo)維生素D代謝物能夠有效地從它的結(jié)合蛋白上釋放出來，而藉此方法又不會(huì)對其它樣品組分造成如蛋白質(zhì)沉淀的負(fù)面影響，并且此后的測量無需任何人工步驟(例如不需要萃取步驟和/或離心過濾步驟)，這將代表在臨床常規(guī)程序上的一個(gè)重大改進(jìn)。本發(fā)明通過提供用于測量樣品中存在的維生素D代謝物的方法，幫助克服或至少改善一些與現(xiàn)有技術(shù)方法相關(guān)的問題，藉此所述改進(jìn)的方法容易地聯(lián)合并基于標(biāo)準(zhǔn)的液相色譜程序，且不需要任4可人工處理。發(fā)明描述本發(fā)明涉及測量樣品中維生素D的方法，該方法包含以下步驟(a)在適于從維生素D結(jié)合蛋白釋放維生素D代謝物而又不引起7蛋白質(zhì)沉淀的條件下用維生素D釋放劑處理所述樣品，(b)對步驟(a)處理得到的樣品進(jìn)行色譜分離，(c)在所述色譜分離過程中或之后測量維生素D代謝物。因此，本發(fā)明滿足對用于測定血清或血漿樣品中目標(biāo)維生素D代謝物的筒單而有效的方法的迫切需要。它基于合適的維生素D釋放劑的驚人發(fā)現(xiàn)，所述維生素D釋放劑能夠使維生素D代謝物從維生素D結(jié)合蛋白釋放并直接進(jìn)行在線色譜分離。這樣維生素D代謝物的量能夠被檢測或測量而無需從樣品中萃取。大體上，該發(fā)明第一次揭示了適當(dāng)?shù)木S生素D釋放劑可免除對在線檢測維生素D的萃取步驟的需要。另外，基于使用新型合適的維生素D釋放劑的方法適合在臨床生化實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)使用。本發(fā)明可應(yīng)用于任何血清或血漿樣品，優(yōu)選來自個(gè)體。其血清或血漿被分析的個(gè)體可以是更需要測定其維生素D狀況的個(gè)體。測量在血清或血漿中存在的目標(biāo)維生素D代謝物可以包括定性和定量測定，即分別檢測樣品中相關(guān)維生素D代謝物的存在情況，或者測量存在的維生素D代謝物的量。無論測量的量表示所述維生素D代謝物的不足還是過量，優(yōu)選將相關(guān)維生素D代謝物的量與一個(gè)關(guān)鍵"^纟田"i炎i十(keydetailing)片目t匕4交。在本發(fā)明的方法中可以測量維生素D的任何一種或多種代謝物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在樣品中測量一種特定的目標(biāo)維生素D代謝物，盡管設(shè)想的是，對某些應(yīng)用而言可優(yōu)選測定樣品中的兩個(gè)或多個(gè)類型的維生素D代謝物。優(yōu)選目標(biāo)維生素D代謝物選自25-羥基維生素D2、25-羥基維生素D3、24,25-二羥基維生素D3、25,26-二輕基維生素D和1，25-二羥基維生素D2和D3。25-二羥基維生素D2或D3是在本發(fā)明方法中待測定的優(yōu)選的維生素D代謝物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，維生素D代謝物是25-羥基維生素D3。維生素D的釋放意指一些或者所有的維生素D代謝物從維生素D結(jié)合蛋白上完全或部分分離。優(yōu)選存在于樣品中的幾乎所有維生8素D代謝物從維生素D結(jié)合蛋白釋放?，F(xiàn)在可被表明及證明的是在那些一方面允許維生素D代謝物釋放而另一方面不引起蛋白質(zhì)沉淀的條件下，使目標(biāo)維生素D代謝物從其與維生素D結(jié)合蛋白的復(fù)合體釋放出來是可能的。為了使維生素D代謝物能夠釋放，需要適當(dāng)最小濃度的釋放劑。可能的最大濃度是不引起樣品組分如蛋白質(zhì)沉淀的濃度。已發(fā)現(xiàn)和確定的是維生素D釋放劑的功效可以很容易地用813(^0^@系統(tǒng)測量出來。為了這一評定，需使用經(jīng)鏈霉抗生物素涂層的Biacore芯片。然后依次用生物素?；?5羥基維生素03和維生素D結(jié)合蛋白浸透鏈霉抗生物素芯片。其后通過將候選的維生素D釋放劑涂布到鏈霉抗生物素/生物素基-25輕基維生素Ds/維生素D結(jié)合蛋白芯片來釋放維生素D結(jié)合蛋白。維生素D釋放劑的適當(dāng)最小濃度被定義為導(dǎo)致至少99%被束縛的維生素D結(jié)合蛋白釋放的最小濃度。這些條件精細(xì)地模仿了當(dāng)維生素D從其血清或血漿樣品中的結(jié)合蛋白釋放出來時(shí)所建立的條件。在Biacore系統(tǒng)中所測定的候選維生素D釋放劑的最小濃度與用來從樣品中的維生素D結(jié)合蛋白有效釋放25-羥基維生素D3所需的此候選維生素D釋放劑的最低濃度相同。如上所述，Biacore分析的維生素D結(jié)合蛋白在候選維生素D釋放劑中被稀釋。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在維生素D釋放劑與被研究樣品的混合物中，維生素D釋放劑的最小終濃度必須至少與Biacore分析測定的濃度相同。舉例來說，如果樣品和維生素D釋放劑以1:1混合，那么釋放劑在與樣品混合以前必須為兩倍于Biacore環(huán)境的濃度。這樣上述測定的最小濃度即出現(xiàn)在樣品和釋放劑的混合物中。在本發(fā)明方法步驟(a)可使用任何能夠完成將維生素D代謝物25-羥基維生素D3從維生素D結(jié)合蛋白的置換或分離出來且不導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀的維生素D釋放劑。試劑是那些可以通過斷開或破壞維生素D代謝物與維生素D結(jié)合物之間鍵合而起作用的化學(xué)試劑。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述維生素D釋放劑基于具有基于季氮(quaternarynitrogen)的離子的陽離子的鹽。還優(yōu)選釋放劑基于含有作為陽離子的季氮雜環(huán)的鹽。優(yōu)選陽離子選自吡唑鏡陽離子、咪唑鏡陽離子、三唑鐠陽離子、吡啶鏘陽離子、噠喚鏡陽離子、嘧啶輸陽離子、吡。秦鏡陽離子和三嗪鏡陽離子。優(yōu)選的陽離子是基于咪唑鏡雜環(huán)核的陽離子。優(yōu)選陰離子選自卣化無機(jī)陰離子、硝酸根、硫酸根、碳酸根、磺酸根和羧酸根。優(yōu)選所述陰離子可選自鹽酸根、六氟磷酸根、四氟硼酸根、三氟醋酸根、苯曱酸根、水楊酸根和硫氰酸根。在大多數(shù)情況下以上陽離子和陰離子的組合物極易與水相混。很多甚至沒有水也可溶解。合適的維生素D釋放劑優(yōu)選選自四氟硼酸l-丁基-4-曱基吡啶鏡、四氟硼酸l-丁基-3-曱基咪唑鏡、辛基硫酸l-丁基-3-曱基咪唑鏡、鹽酸l-丁基-3-曱基吡啶鏡、鹽酸l-己基吡啶、鹽酸l-曱基-l-辛基吡咯烷鏡、鹽酸N-辛基吡啶鏡、鹽酸3-氨基曱?；?l-辛基氧曱基吡咬鏡、KBr、KJ、KSCN以及它們的組合物。優(yōu)選所述組合物包含5種以下的這些化合物。優(yōu)選可使用4、3或2種這些化合物的混合物。還優(yōu)選使用單一化合物。用于鑒別溶血(differentialhemolysis)的試劑也可以選自四氟硼酸l-丁基-4-曱基吡啶輸、四氟硼酸l-丁基-3-曱基咪唑鏡、辛基硫酸1_丁基_3-曱基咪唑鏡、鹽酸l-丁基-3-曱基吡啶鎖、鹽酸1-己基吡啶鏡、鹽酸l-曱基-l-辛基吡咯烷鎖、鹽酸N-辛基吡啶鏡和鹽酸3-氨基曱酰-l-辛基氧曱基吡啶輸。進(jìn)一步優(yōu)選的是使用KSCN和至少一種這些試劑的混合物。如上所述，用于在線色譜測定樣品血清或血漿中的維生素D代謝物的方法是非常需要的。令人意想不到的是，現(xiàn)在可以確定這樣的方法是可行的并且比維生素D代謝物的常規(guī)測量有明顯的優(yōu)勢。為了滿足這些需求，維生素D代謝物必須有效地釋放，但同時(shí)適當(dāng)?shù)木S生素D釋放劑必須不引起蛋白質(zhì)沉淀。本發(fā)明意義上的蛋白質(zhì)沉淀是以標(biāo)準(zhǔn)的方式通過將經(jīng)候選維生素D釋放劑處理過的血清或血漿樣品應(yīng)用到標(biāo)準(zhǔn)濾頭上(例如作為HPLC柱部件的濾頭)來評定。為了評定候選維生素D釋放劑是否不會(huì)引起蛋白質(zhì)沉淀，也就是適合于后面的在線液相色譜分析，所述試劑與血清或血漿樣品以1:1混合并于20。C保溫15-60分鐘。將10jiL如此處理的樣品的50等份應(yīng)用在直徑2mm孔徑0.5)nm的濾頭上。監(jiān)測背壓。如果注射50的背壓和第一次注射的背壓相互比較，候選維生素D釋放劑引起了背壓增加20bar或者更高，那么其將被認(rèn)為是不合適的。因而根據(jù)在上述分析中不引起任何背壓增加或者引起低于20bar的背壓增加，能夠容易地確定合適的維生素D釋放劑的最大濃度。在以上分析中優(yōu)選使用的過濾器是HPLC濾頭。優(yōu)選這樣的濾頭由不銹鋼制成且有1/32英寸厚。還優(yōu)選濾頭是20mmHPLC柱的一部分，所述HPLC柱內(nèi)柱徑為2mm，填有作為床料(bedmaterial)的孔徑為100A。的3.5|umSymmetryC18顆粒。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，用于這種評定的血清或血漿樣品獲自健康個(gè)體，即沒有已知疾病并且生化值在正常范圍內(nèi)的個(gè)體。優(yōu)選合適的維生素D釋放劑還具有的特征在于，使維生素D從維生素D結(jié)合蛋白釋放所需的(最小)濃度與可容許的并且不引起沉淀的(最大)濃度至少相差兩倍。在最大和最小濃度之間的差距越大，這種試劑可越容易被用于臨床診斷程序。還優(yōu)選的是，維生素D釋放劑以相當(dāng)于最小濃度和最大濃度的平均值加/減25%的最終濃度使用。進(jìn)一步優(yōu)選的是，最終濃度將被調(diào)至最小濃度和最大濃度的平均值加或減20%的范圍內(nèi)。盡管現(xiàn)有技術(shù)的試劑(例如乙醇或乙腈)全都在高濃度使用下引起ii沉淀，但當(dāng)下研究的數(shù)種試劑以非常高的濃度也完全不會(huì)引起蛋白質(zhì)沉淀。優(yōu)選本發(fā)明維生素D釋放劑以不超過75%(重量/體積)的濃度、還優(yōu)選以不超過50%(重量/體積)的濃度使用。經(jīng)本發(fā)明合適維生素D釋放劑處理過的血漿或血清樣品可直接進(jìn)行液相色鐠分析。液相色譜(LC)是一項(xiàng)十分重要的分析技術(shù)，用于對目標(biāo)分析物例如維生素D代謝物進(jìn)行分離、鑒定和定量。在LC分析過程中，混合物中的化學(xué)成分通過液體流動(dòng)相的流動(dòng)被攜帶經(jīng)過固定相。液相色譜分析中的分離作用是依靠分析物與流動(dòng)相和固定相之間相互作用的差異而完成的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識的是，必須選擇適合所研究分析物的固定相和流動(dòng)相。另外，隨著樣品通過固定相柱移動(dòng)到檢測器，使用者要鑒別合適的色譜分析條件以保持分析物峰或帶的清晰。高效液相色譜分析，也稱作高壓液相色譜分析，簡稱HPLC，是一種特殊的液相色譜分析形式，現(xiàn)今常被用于生物化學(xué)和分析化學(xué)。用高壓將分析物壓迫經(jīng)過液體(流動(dòng)相)中的固相柱，從而減少被分離組分在固相中停留的時(shí)間并因此減少它們必須在柱內(nèi)擴(kuò)散的時(shí)間。這會(huì)在色譜圖上產(chǎn)生窄峰從而得到比之液相色譜更好的分離度和靈敏度。流動(dòng)相的選擇應(yīng)確保樣品溶質(zhì)的溶解性。對于固定相而言，優(yōu)選使用微粒硅膠(未處理的或經(jīng)過化學(xué)修飾的)，因?yàn)槠浯蟮谋砻娣e加強(qiáng)了溶質(zhì)-固定相之間相互作用的差異。使用相對于溶質(zhì)-流動(dòng)相相互作用而言與溶質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈相互作用的固定相將產(chǎn)生非常長的保留時(shí)間，這一情形對于分析是無用的。因此必須對固定相進(jìn)4亍選擇以<更提供相對于在流動(dòng)相里的而言較微弱或者適度的溶質(zhì)相互作用。結(jié)果，溶質(zhì)的性質(zhì)決定著所選液相色譜分析的類型。較強(qiáng)的相互作用應(yīng)該發(fā)生在流動(dòng)相以確保樣品的溶解性和預(yù)備洗脫，而固定相應(yīng)該對溶質(zhì)間更細(xì)微的差異作出反應(yīng)。例如，中性極性化合物用極性流12動(dòng)相和區(qū)分溶質(zhì)分散特性中細(xì)微差異的非極性固定相通常可以得到較好的分析。HPLC的強(qiáng)勢之一是流動(dòng)相可以是各式各樣的以改變保留機(jī)理?？梢詫⒏牧紕┘尤肓鲃?dòng)相來控制滯留。例如，pH在水的流動(dòng)相里是一個(gè)重要的變量。五類普通的LC區(qū)別如下1.正相色譜法要求極性固相與非極性(M)流動(dòng)相聯(lián)用。2.反相色語法，可能性相反，要求使用非極性固相和極性流動(dòng)相(由一種或多種極性溶劑組成，如水、曱醇、乙腈和四氫呔喃)。3.離子交換色譜法涉及到離子間相互作用。在這種情況下流動(dòng)相必須支持電離作用以確保離子溶質(zhì)的溶解性。固定相也必須部分離子化以促進(jìn)滯留。結(jié)果與固定相的相互作用得以增強(qiáng)并且以較長的分析時(shí)間和寬峰反映出來。4.尺寸排阻色譜法僅僅涉及到基于分子大小的分離作用并且理想的是不需要溶質(zhì)與固定相的含能相互作用。5.親和色譜法是基于特異性相互作用，舉例來說在特異性結(jié)合配對的成員之間，如抗原和相應(yīng)的抗體或受體及相應(yīng)的配體。例如結(jié)合配對中的第一配偶體結(jié)合到適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嗖⑶矣脕聿东@結(jié)合配對中的第二配偶體。第二配偶體可通過適當(dāng)?shù)氖侄蔚玫结尫藕头蛛x。以上所述分離原理的總的分類不一定是詳盡的因而是非限制性的，有其它可用于液體樣品分離的分離原理，例如疏水作用色譜，親水作用色譜，離子對色譜，基于分子印跡材料的分離。在常規(guī)應(yīng)用中，固定相(即所謂的床料)例如在反相高效液相色譜中的硅膠粒被填充進(jìn)合適的柱子當(dāng)中，用濾頭保護(hù)起來。通常濾頭材料經(jīng)過選擇具有比床料內(nèi)部顆?？讖?、的孔徑。在HPLC方法中固定相顆粒的直徑通常在1-10pm。這些小顆粒使得用于HPLC的高壓成為必要。床料通常被濾頭所保護(hù)。典型的濾頭孔徑為1|im、0.45pm或0.2|im。通常顆粒越小濾頭的孔徑越小。如果樣品含有能夠阻塞HPLC濾頭的成分則對任何常規(guī)分析都是有害的。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所認(rèn)識的是，濾頭的孔徑以及柱子和相應(yīng)濾頭直徑越小，用于HPLC柱的濾頭就阻塞得越快。萬一濾頭沒有選擇恰當(dāng)，即孔徑太大，柱料顆粒的大小也會(huì)有關(guān)系，顆粒越小，柱子本身會(huì)更快堵塞?？墒?，本領(lǐng)域技術(shù)人員將對濾頭孔徑進(jìn)行選擇以滿足保護(hù)柱子床料的需要。如果血漿或血清樣品例如用乙腈處理而使維生素D從它與維生素D結(jié)合蛋白結(jié)合的復(fù)合體中釋放出來，那么大量蛋白質(zhì)會(huì)變性并沉淀下來。這樣的樣品不能用于以任何常規(guī)設(shè)置的HPLC柱，因?yàn)樗鼤?huì)堵塞柱子并引起系統(tǒng)關(guān)閉。用本發(fā)明維生素D釋放劑處理血清或血漿樣品，使得現(xiàn)在將這樣處理的樣品直接施用于HPLC柱成為可能而不會(huì)冒阻塞柱子的危險(xiǎn)。優(yōu)選此HPLC步驟用經(jīng)過維生素D釋;^文劑處理而獲得的樣品來在線實(shí)施。優(yōu)選用于此HPLC步驟的固相顆粒直徑在1-10pm范圍內(nèi)，還優(yōu)選2-7iim范圍內(nèi)。優(yōu)選用于此HPLC步驟的濾頭孔徑為0.5|im或者還優(yōu)選為0.2pm。如上所述，必須注意維生素D釋放劑不能引起蛋白質(zhì)沉淀。目標(biāo)分析物可以通過任何適當(dāng)?shù)姆椒?全測。適當(dāng)?shù)暮蛢?yōu)選的才企測器檢測到經(jīng)過的化合物的存在并提供電信號給記錄器或計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)站。輸出的形式通常是色譜圖，目標(biāo)物質(zhì)通常在某個(gè)峰中找到。峰面積或峰高可被用來確定存在于被研究樣品中分析物的量。HPLC系統(tǒng)的檢測器是對根據(jù)洗脫樣品化合物作出反應(yīng)且隨后在色譜圖上發(fā)出峰信號的組件。它被直接安置在固定相的后部以便檢測從柱子洗脫的混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以控制檢測過程和靈敏度參數(shù)。有很多類型的檢測器可被用于HPLC。一些較為常見的檢測器包括折光率(RI)、紫外(UV)、熒光、放射化學(xué)、電氣化學(xué)、近紅外(Near-IR)、質(zhì)譜分析(MS)、核磁共振(NMR)和光散射(LS)。14折光率(RI)檢測器測量樣品分子彎曲或折射光的能力。每種分子或化合物的這一特性叫做它的折光率。對于大多數(shù)RI檢測器而言，光通過一個(gè)雙模的流動(dòng)池進(jìn)入光電探測器。流動(dòng)池的一個(gè)通道引導(dǎo)經(jīng)過柱子的流動(dòng)相而其它的僅僅引導(dǎo)流動(dòng)相。當(dāng)光線由于從柱子里洗脫的樣品而產(chǎn)生彎曲時(shí)纟企測發(fā)生，并被讀作兩個(gè)通道之間的差異。熒光檢測器分別測量化合物吸收然后重新發(fā)出特定波長光的能力。每種能夠發(fā)出熒光的化合物具有特有的激發(fā)與發(fā)射波長。激發(fā)光通過流動(dòng)池，同時(shí)在直角位置的光電探測器測量特定波長的發(fā)射光。放射化學(xué)檢測涉及放射性同位素標(biāo)記材料的使用，通常為氖(3H)或碳—14(14C)。它通過檢測與p-粒子電離相關(guān)的熒光而起作用，在代謝物的研究方面最為流行。電器化學(xué)檢測器測量經(jīng)歷氧化或還原反應(yīng)的化合物。這通常通過測量遷移樣品在流過有特定電位差的電極之間時(shí)電子的得失來完成。質(zhì)譜分析是一種用于測量離子的質(zhì)-荷比(m/z或m/q)的分析技術(shù)。它通過產(chǎn)生代表樣品組分質(zhì)量的質(zhì)譜而最常用于分析物理樣品的組成。該技術(shù)有幾個(gè)方面的應(yīng)用，包括通過化合物和/或其碎片鑒定未知化合物；測定化合物中一種或多種元素的同位素組成；通過觀察化合物的斷裂測定化合物的結(jié)構(gòu)；用細(xì)部設(shè)計(jì)的方法測定樣品中化合物的量(質(zhì)鐠分析不是原本就可定量的)；研究氣相離子化學(xué)的基本原理(真空中離子和中子的化學(xué))；以多種其它的途徑測定化合物的其它物理、化學(xué)甚或生物學(xué)特性。質(zhì)譜儀是用于質(zhì)譜分析的產(chǎn)生樣品質(zhì)譜以分析它的組成的裝置。這通常通過使樣品離子化并分離不同質(zhì)量的離子以及通過測量離子流強(qiáng)度來記錄它們的相對豐度來完成。典型的質(zhì)譜儀由三部分組成離子源、質(zhì)量分析器和檢測器。離子源的種類是可強(qiáng)烈影響什么類型的樣品可以利用質(zhì)i普進(jìn)行分析的作用因素。電子電離和化學(xué)電離被用于氣體和蒸氣。在化學(xué)離子源中，分析物在源中的碰撞過程中通過離子-分子化學(xué)反應(yīng)而被電離。兩種常用于液體或固體生物樣品的技術(shù)包括電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)。其它技術(shù)包括快原子轟擊、熱噴涂、大氣壓化學(xué)電離(APCI)、次級離子質(zhì)譜(SIMS)和熱電離。核磁共振(NMR)檢測基于某些帶有奇數(shù)原子量的核包括H和13C繞軸隨機(jī)自旋的事實(shí)?？墒钱?dāng)置于強(qiáng)磁場時(shí)自旋則被調(diào)整成平行或反平行于磁場，帶有平行方向的偏好，因?yàn)檫@樣能量會(huì)稍微較低。磁核當(dāng)被放置于特定強(qiáng)度的磁場時(shí)能夠吸收RF能量。當(dāng)這種吸收發(fā)生時(shí)，核被稱之為在共振。分析科學(xué)家感興趣的是，分子內(nèi)不同的原子在特定磁場強(qiáng)度下以不同頻率共振。對分子共振頻率的觀察允許使用者去發(fā)現(xiàn)關(guān)于分子的結(jié)構(gòu)信息。當(dāng)光源發(fā)出平行光束擊打溶液中的粒子時(shí)，某些光就被反射、吸收、透射或散射。這些現(xiàn)象可用光散射(LS)檢測器測量。LS檢測最突出的形式叫做比濁法和濁度分析法。比濁法定義為測量從照射的懸浮液所發(fā)射的散射光的強(qiáng)度。散射強(qiáng)度與照射強(qiáng)度的比率與已知特性的標(biāo)準(zhǔn)相比較。濁度分析法定義為測量由于溶液中的粒子所造成的透射光的減少。它將光散射測量為穿過粒子溶液透射的光的減少。殘余的透射光因此被定量。近紅外4企測器通過以700-1100nm的光譜對化合物進(jìn)行掃描而起作用。每種分子里特殊化學(xué)鍵的伸長和彎曲振動(dòng)在某些波長下被檢測。優(yōu)選用質(zhì)譜分析檢測維生素D代謝物。另一方面，本發(fā)明的方法可用于測定對象的維生素D狀況。在本發(fā)明又一的實(shí)施方案中，提供了含有本發(fā)明維生素D釋放劑的試劑盒。該試劑盒優(yōu)選還包含顯示樣品中維生素D代謝物含量與測定結(jié)果之間相關(guān)性的圖解(key)。優(yōu)選試劑盒還包含使用說明16書。本發(fā)明的方法的一個(gè)大的優(yōu)勢是萬一診斷需要評定多于一種維生素D代謝物，則這是很容易完成的。優(yōu)選待分析樣品至少有兩種目標(biāo)維生素D代謝物，其選自25-羥基維生素D2、1，25-二羥基維生素D3、25-羥基維生素D3、24,25-二羥基維生素D3、25,26-二羥基維生素D3。優(yōu)選用本發(fā)明的方法一次性評定25-羥基維生素D3、1,25-二羥基維生素D3、24,25-二羥基維生素D3。本發(fā)明方法可以與使用同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及測量樣品中維生素D代謝物的方法，所述方法包括以下步驟a)將同位素標(biāo)記的維生素D代謝物加入所述樣品中，b)在適于從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D代謝物的條件下用釋放劑處理所述樣品，c)對步驟(b)得到的經(jīng)處理樣品進(jìn)行液相色譜分析d)在液相色譜分析過程中或之后測量維生素D代謝物，優(yōu)選用質(zhì)譜分析法。在又一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及適合于從維生素D結(jié)合蛋白釋放25羥基維生素D且不引起蛋白質(zhì)沉淀的維生素D釋放劑，另外包含同位素標(biāo)記的維生素D代謝物。優(yōu)選上述的同位素標(biāo)記的維生素D代謝物是同位素標(biāo)記的25羥基維生素D3。同位素標(biāo)記的維生素D代謝物的濃度是已知的，并且優(yōu)選調(diào)整到與目標(biāo)維生素D代謝物生理相關(guān)濃度相配。在再一優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含維生素D釋放劑和另外的同位素標(biāo)記的維生素D代謝物的試劑盒，其中所述的同位素標(biāo)記的維生素D代謝物可以作為單獨(dú)組分存在或者已經(jīng)包含在維生素D釋放劑之中，而其中所述的釋放劑是基于含有作為陽離子的季17N-雜環(huán)的鹽。以下實(shí)施例和圖提供作幫助理解本發(fā)明，在附加的權(quán)利要求中闡明了本發(fā)明真實(shí)的范圍。應(yīng)該理解的是，在不違背本發(fā)明的精神下可以對提出的程序進(jìn)行修改。圖1生物素?；?5羥基維生素D3的合成用流程圖描述用于合成生物素-25羥基維生素D3-綴合物的步驟。圖2維生素D結(jié)合蛋白與25羥基維生素D3的分離顯示了對于每種測試釋放劑的濃度依賴性。圖3進(jìn)樣給出有關(guān)進(jìn)樣模式和洗滌方式的自動(dòng)HPLC系統(tǒng)的閥的裝配。圖4分析物轉(zhuǎn)移顯示了用于使含有組分的分析物從萃取柱轉(zhuǎn)移到分析柱組分的自動(dòng)HPLC系統(tǒng)的閥的裝配。圖5分析物洗脫給出了從分析柱的等度洗脫分析物的自動(dòng)HPLC系統(tǒng)的閥的裝配。圖6廢棄物步驟顯示了將后期洗脫樣品組分轉(zhuǎn)至廢棄物的自動(dòng)HPLC系統(tǒng)的閥的裝配。圖7典型色譜圖在左手邊給出關(guān)于從401到257的m/z轉(zhuǎn)換的典型色譜圖。在右手邊給出關(guān)于同位素標(biāo)記的25羥基維生素D"人407到263的m/z轉(zhuǎn)換的典型色譜圖。圖8校準(zhǔn)曲線描述了基于純的25羥基維生素D3的典型校準(zhǔn)曲線。實(shí)施例1生物素?；?5幾基維生素D3-綴合物的合成圖1中流程圖式描述了用于合成生物素-25羥基維生素D3-綴合物的步驟。在這一合成中，25羥基維生素D3在式I圖示的維生素D的3位被化學(xué)激活。在25羥基維生素D3中，式I的25位帶有一個(gè)OH-基。式I1.125羥基維生素D3-3-2，-氰乙基醚的合成在配有內(nèi)置溫度計(jì)的三頸圓底燒^f瓦中，將20mg(50|imol)25羥基維生素D3(Sigma-Aldrich,編號H-4014)在氬氣環(huán)境下溶解于10ml無水乙腈中。使溶液與1.5ml叔丁醇/乙腈(9:l)混合然后在水浴中冷卻至6"C。然后加入820pl丙烯腈溶液(來自86|ul丙乙腈溶于1.0ml乙19腈的溶液)，將混合物攪拌后放置于6。C保溫15min。其后加入2051iL有機(jī)KH溶液(0.5ml叔丁醇/乙腈(9:l)溶液含25mgKH)。反應(yīng)混合物于6。C攪拌保溫45min,其后于4。C另外保溫60min。在很短的時(shí)間內(nèi)形成中間沉淀物其后得到上清液。其后反應(yīng)混合物用10ml曱基叔丁基醚稀釋然后用10mlH20洗滌兩次。加入1g無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，通過G3濾頭過濾，最后有機(jī)溶劑用真空除去。殘留的粘性固體用高真空進(jìn)一步干燥。這一步大約得到55mg無色干燥粘性物質(zhì)。1.225幾基維生素D3-3-3，-M丙基醚將從步驟1.1得到的腈溶解在15ml乙醚中。邊攪拌邊加入在7.5ml乙醚中含7.5mg氫化鋰的懸浮液?；旌衔镌谑覝?RT)下攪拌1小時(shí)。其后加入在6.6ml乙醚中含38.4mg氫化鋁鋰的懸浮液。反應(yīng)混合物變渾濁于室溫下再攪拌1小時(shí)。其后反應(yīng)混合物用水浴降溫至0-5。C并加入共35ml水慢慢稀釋。加入6.6ml10MKOH^吏pH值變?yōu)閺?qiáng)堿性。每次用65ml曱基叔丁基醚萃取有機(jī)物三次。合并的有機(jī)相加入5g無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，通過G3濾頭過濾，最后用真空將有機(jī)溶劑除去。殘留粘性固體用高真空進(jìn)一步千燥。將此步驟得到的原材料溶解于5mlDMSO和3.0ml乙腈的混合物并通過預(yù)備的HPLC純化。所用洗脫液為洗脫液A=0.1。/o三氟乙酸(TFA)水溶液；洗脫液B=95%乙腈+5%的含0.1%TFA水溶液。所用梯度為100min內(nèi)從50%洗脫液B到100%洗脫液B。柱料為VydacC18/300A/15-20jam，柱徑為5cm，柱長25cm。色譜分析在室溫下進(jìn)行，流速為30ml/min。于226nm下監(jiān)測洗脫。將如分析HPLC(VydacC18/300A/5nm/;4.6x250mm)所測的純度至少為85%的含有目標(biāo)產(chǎn)物的組分合并并凍干。目標(biāo)無色產(chǎn)物的產(chǎn)量大約為70%。1.325羥基維生素D3-3-3，-N-(半辛二酰)氨基丙基醚-生物素-(j3-丙氨20將15.9mg(35iumol)25羥基維生素D3-3-3，-氨基丙基醚(根據(jù)步驟1.2所述獲得)溶解于3.5mlDMSO。加入34.4mg(42,ol)生物素-(卩-丙氨酸)-谷氨酸-谷氨酸-賴氨酸(s)-半辛二酰-N-羥基丁二酰亞胺酯(RocheAppliedScience,Nr.11866656)和15三乙胺，混合物于室溫下攪拌過夜。反應(yīng)混合物用經(jīng)0.45pm微濾膜過濾的4.5mlDMSO稀釋，最后進(jìn)行預(yù)備HPLC。預(yù)備的HPLC所采用的條件如例1.2所述。由分析HPLC(VydacCI8/300A/5|um/;4.6x250mm)所測定的含有純度至少85%的目標(biāo)產(chǎn)物的組分被合并凍干。目標(biāo)產(chǎn)物25羥基維生素D3-3-3，-N-(半辛二酰)氨基丙醚-生物素-(P-丙氨酸)-谷氨酸-谷氨酸-賴氨酸(e)-結(jié)合物，簡稱"25羥基維生素D3-生物素"的產(chǎn)量大約是36%。實(shí)施例2維生素D從維生素D結(jié)合蛋白釋放的評定Biaco^系統(tǒng)被用來評定被考慮用于從維生素D結(jié)合蛋白釋放維生素D的潛在候選試劑是否對維生素D結(jié)合蛋白釋^L維生素D代謝物有效。涂有鏈霉抗生物素的傳感器芯片(傳感器芯片SA,BiacoreAB,BR-1000-32)被用來固定目標(biāo)生物素酰化維生素D代謝物。通過使用維生素D代謝物25OH維生素D3，所述評估得以最佳實(shí)施。首先用飽和濃度的生物素?；?5羥基維生素D3溫育傳感器芯片。然后用飽和量的維生素D結(jié)合蛋白裝載芯片。然后將維生素D結(jié)合蛋白飽和過的芯片一方面用氯化鈉溶液溫育，另一方面用各種濃度的候選維生素D釋放劑溫育。對維生素D結(jié)合蛋白的釋放監(jiān)測3min。引起上述系統(tǒng)至少99%的維生素D結(jié)合蛋白釋放的候選維生素D釋放劑適合可滿足對用于檢測血清或血漿25羥基維生素D3樣品中維生素D代謝物的維生素D釋放劑的最低要求。在每次運(yùn)行之間，用10mMpH1.7的Gly/HCl洗滌1min使涂有25羥基維生素D3的SA-芯片再生。作為非特異的對照，使用在同樣芯片涂有生物素的參比流動(dòng)池。參比流動(dòng)池的數(shù)據(jù)從生物特異流動(dòng)池的數(shù)據(jù)中減掉。從而得到無非特異影響的特定數(shù)據(jù)。表1:從250H-維生素03釋放>95°/。維生素D結(jié)合蛋白所需釋放劑的濃度<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>正如以上表1所見，用所列出的任何試劑都可能使250H-維生素D3和維生素D結(jié)合蛋白有效分離。這一分離作用的濃度依賴性在圖2中進(jìn)一步說明。實(shí)施例3用液相色鐠-串聯(lián)質(zhì)譜分析定量循環(huán)25-羥基維生素D3的方法已經(jīng)開發(fā)出用來檢測25-羥基維生素D3的直接同位素稀釋液體色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。該方法與上述Vogeser等人的方法相似，簡而言之該方法l喿作如下使用穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的25-羥基維生素D3作為內(nèi)標(biāo)。為了從維生素D結(jié)合蛋白釋放分析物，在樣品中加入乙腈。手工完成的蛋白質(zhì)沉淀，隨后直接轉(zhuǎn)移到串聯(lián)質(zhì)譜分析系統(tǒng)進(jìn)行在線自動(dòng)固相萃取。使用陽離子模式的大氣壓力化學(xué)電離(APCI)。對于天然的25-羥基維生素D3，記錄401>257m/z轉(zhuǎn)換。對于標(biāo)記了六個(gè)氖原子的內(nèi)標(biāo)，記錄407>263轉(zhuǎn)換。分析程序標(biāo)準(zhǔn)25-羥基維生素D3(25-羥膽鈣化醇)購自Sigma(Deisenhofen，德國)(純度98%;分子量400.7)。用曱醇配制成濃度為3250nmol/L的儲(chǔ)備液。對于作為內(nèi)標(biāo)的使用而言，穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的25-羥基維生素D3購自Synthetica(Sweden)26,27-六氘-25-羥基維生素03(化學(xué)純度95%，同位素純度99.9%)。用曱醇配制成濃度為570nmol/L的可用內(nèi)標(biāo)溶液。使用帶有二元梯度系統(tǒng)、脫氣裝置和自動(dòng)進(jìn)樣器的AgilentHPLC1100。所用的質(zhì)譜儀是一帶有APCI離子源的來自ThermoElectron的三級四極桿QuantumUltraEMR。用移液器將100pi血清加入2ml聚丙烯杯中，然后加入25內(nèi)標(biāo)可用溶液。漩渦混合后，室溫下將樣品放在漩渦器上5分鐘。為了平衡，樣品在37。C保持2小時(shí)。加入300)iL乙腈以從蛋白質(zhì)結(jié)合物中釋放分析物和穩(wěn)定的同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)并沉淀蛋白質(zhì)。將樣品放置在旋渦混合器上10min然后4-8。C保持1小時(shí)。在標(biāo)準(zhǔn)的臺式離心機(jī)中以16,000g離心20分鐘后，得到上清液和穩(wěn)定的蛋白質(zhì)沉淀。將上清液轉(zhuǎn)移至HPLC小瓶并放置于自動(dòng)進(jìn)樣器中。對于在線固相萃取而言，聯(lián)合使用LiChrospherRP-18ADS,25|am,25x4mm萃取柱(Merck)與Rheodyne六端口高壓開關(guān)閥。自動(dòng)固相萃取程序由5步組成231.用洗脫液A(5。/。曱醇水溶液，流速3mL/min)將去蛋白的樣品注入ADS萃取柱(圖3)。親水的樣品組分被除去并轉(zhuǎn)化成廢物。同時(shí)用洗脫液C(90。/。曱醇，10。/。0.5mM醋酸銨，流速以階梯式流動(dòng)梯度0-9min0.85mL/min和9-17min1.2mL/min)平衡分析柱。2.將從萃取柱富集的分析物轉(zhuǎn)移至以用洗脫液C反沖模式的分析柱(圖4)。3.從分析柱等度洗脫出分析物，用洗脫液C分離基質(zhì)組分，用洗脫液B再生萃取柱(曱醇/乙腈50/50，流速3mL/min)(圖5)。4.用增加流速的洗脫液C平衡系統(tǒng)(圖3)5.將后期洗脫的基質(zhì)組分轉(zhuǎn)移成廢棄物(圖6)典型色譜圖如圖7所示。柱轉(zhuǎn)換時(shí)間表:時(shí)間閥位置描述[min閥A閥B閥C0111圖3121圖44211圖510212圖611112平衡和清除17停止柱溫RT(捕集柱)30。C(分析柱)注射器溫度8°C24注射體積70|alMS/MS參數(shù)設(shè)定為了得到HVD檢測的最大靈敏度，按照廠商說明書設(shè)置并優(yōu)化大氣壓離子源(APCI)的參數(shù)和質(zhì)譜調(diào)整參數(shù)。將MS分析儀的分辨率設(shè)置成0.7amu的峰寬。使用氬氣作為碰撞氣體，氣壓設(shè)置為1.5mTorr，優(yōu)化MS/MS裂解的碰撞能量以獲得401-257(25羥基-Dg)和407-263(內(nèi)標(biāo))的離子轉(zhuǎn)換的最大的信號。校準(zhǔn)在分析系列中，使用濃度范圍包括IOng/mL-300ng/mL的25-羥基維生素D3的甲醇/水(l/l)純?nèi)芤海酝瓿闪c(diǎn)校準(zhǔn)。典型的校準(zhǔn)曲線如圖8所示。實(shí)施例4包括從維生素D結(jié)合蛋白釋放維生素D且無蛋白沉淀在內(nèi)的定量循環(huán)25-羥基維生素D3的方法所述程序的詳細(xì)內(nèi)容見實(shí)施例3，但在樣品制備上有明顯改變。用移液器將100iul血清吸到2ml聚丙烯杯中，然后加入25可用的內(nèi)標(biāo)溶液。旋渦混合后，室溫下將樣品放在旋渦器上5分鐘。為了平衡，將樣品于37TM呆持2小時(shí)。向經(jīng)過平衡的血清樣品加入一份等量的100維生素D釋放劑。在此實(shí)施例中的維生素D釋放劑由50%(重量/體積)的四氟硼酸1_丁基_4_曱基吡咬輸水溶液組成。將混合物于室溫下溫育20分鐘，轉(zhuǎn)移至HPLC系統(tǒng)的自動(dòng)進(jìn)樣器。后接的關(guān)于檢測25-羥基維生素D3的程序與實(shí)施例3中給出的相同。實(shí)施例5方法對比結(jié)果分別按照實(shí)施例3和實(shí)施例4的程序處理四名患者的血清樣本。根據(jù)新的程序(參照實(shí)施例4)重復(fù)測量一次，平均值在表2中給<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>權(quán)利要求1.測量樣品中維生素D的方法，所述方法包括以下步驟a)在適合從維生素D-結(jié)合蛋白釋放維生素D代謝物且不引起蛋白質(zhì)沉淀的條件下用釋放劑處理所述樣品，b)對經(jīng)步驟(a)處理所得到的樣品進(jìn)行液相色譜分析，并且c)在液相色譜分析過程中或者之后測量維生素D代謝物，其中所述的釋放劑基于具有作為陽離子的季N雜環(huán)的鹽。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述液相色譜分析是通過使用含有濾頭和床料的柱來進(jìn)行的柱色譜分析。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述濾頭的孔徑為0.2或0.5,。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述床料是顆粒并且粒徑為1-10拜。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述液相色譜分析為高效液相色譜分析(HPLC)。6.權(quán)利要求1的方法，其中所述釋放劑是能夠從維生素D結(jié)合蛋白釋放至少99%的25-OH維生素D3的試劑。7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述維生素D代謝物是25-OH維生素D3。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是血清或血漿。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法在評價(jià)個(gè)體的維生素D狀況中的用途。10.包含維生素D釋放劑和此外的同位素標(biāo)記維生素D代謝物的試劑盒，其中所述同位素標(biāo)記的維生素D代謝物可以以單獨(dú)組分存在或者已經(jīng)包含在維生素D釋放劑中，而其中所述釋放劑基于具有作為陽離子的季N-雜環(huán)的鹽。全文摘要本發(fā)明涉及測定樣品中維生素D代謝物的方法，該方法包含以下步驟(a)在適于從維生素D結(jié)合蛋白釋放維生素D代謝物而又不引起蛋白質(zhì)沉淀的條件下用維生素D代謝物釋放劑處理所述樣品，(b)對步驟(a)處理得到的樣品進(jìn)行色譜分離，(c)在所述色譜分離過程中或之后測量維生素D代謝物。本發(fā)明還涉及用于測定對象的維生素D狀況、用于疾病診斷的方法以及用于實(shí)施本發(fā)明方法的試劑和試劑盒。文檔編號G01N33/82GK101467048SQ200780021252公開日2009年6月24日申請日期2007年6月4日優(yōu)先權(quán)日2006年6月6日發(fā)明者H·馮德埃爾茨,L·馮普羅夫,M·格羅爾,R·赫曼,T·多爾弗,U·科博爾德申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司