專利名稱：根據(jù)rantes代表物水平檢測il-16活性和對il-16活性的調(diào)節(jié)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測IL-16的生物活性及檢測對IL-16生物活性 的調(diào)節(jié)的方法。此外，本發(fā)明涉及直接診斷IL-16相關(guān)疾病存在和/ 或易感性的方法。
背景技術(shù)：
白介素-16 (IL-16; SEQ ID NO: 3)是一種誘導(dǎo)T淋巴細胞、單核 細胞、嗜酸性粒細胞和樹突狀細胞的正趨化作用的促炎性細胞因子 (67 J. Leukocyte Biol. 757 (2000))。在應(yīng)答IL-16的真核細胞中，IL-16 刺激物還增加IL-lb表達、增加IL-6表達和增加IL-15表達(67 J. Leukocyte Biol. 757 (2000》。
IL-16肽鏈單體是通過胱天蛋白酶(caspase)-3介導(dǎo)的對一種更大 的14 kDa前體分子的蛋白水解加工而形成(273 J. Biol. Chem. 1144 (1998))。 IL-16單體形成四聚體肽鏈復(fù)合物。這些四聚體IL-16復(fù)合 物被認為是IL-16的生物活性形式(67 J. Leukocyte Biol. 757 (2000))。 產(chǎn)生IL-16的真核細胞包括表達CD4或CD8的細胞，如T細胞、月巴 大細胞、嗜酸性粒細胞、樹突狀細胞、上皮細胞、成纖維細胞以及 小腦的細胞(67 J. Leukocyte Biol. 757 (2000))。應(yīng)答IL-16的真核細胞 表達CD4和CD9肽鏈，但對IL-16的應(yīng)答也可能不依賴這些肽鏈(參 見例如164 J. Immunol. 4429 (2000))。
有報告指出，IL-16在如下疾病中發(fā)揮重要作用，如哮喘、特應(yīng) 性皮炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等等(參見例如162 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 105 (2000); 109 J. Allergy Clin. Immunol. 681 (2002); 31 J.Rheumatol. 35 (2004))。例如，在人類患者中，IL-16已被證明負責(zé)誘 集哮喘誘導(dǎo)細胞至肺部，并在觸發(fā)患者的哮喘應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用 (162 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 105 (2000))。顯然，對激活或抑制 IL-16的分子的檢測和鑒定的能力，是開發(fā)有效地治療IL-16介導(dǎo)疾 病的方法的關(guān)鍵。
因此，需要開發(fā)用于檢測IL-16的生物活性、IL-16生物活性的 激活物和IL-16生物活性的抑制物的新方法。
附圖簡述


圖1圖示，與對照比較，IL-16生物活性降低外周血單核細胞 (PBMC)的RANTES細胞因子分泌。
圖2圖示，與對照比較，IL-16生物活性降低HuT-78細胞的 RANTES細胞因子分泌。
圖3顯示，與對照比4支，IL-16生物活性的抑制物增加PBMC的 RANTES細胞因子分泌。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一方面是檢測樣本中IL-16生物活性的方法，其包括下 述步驟向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第一真核細胞群 提供第一測試樣本；向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第二 真核細胞群提供陰性對照樣本；測量由第 一和第二真核細胞群產(chǎn)生 的RANTES代表物(proxy)的量；且比較由第一和第二真核細胞群產(chǎn) 生的RANTES代表物的量，其中，相對于第二真核細胞群產(chǎn)生的 RANTES代表物水平而言，由第一真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表 物的量減少則表明在測試樣本中^^測到IL-16生物活性。
本發(fā)明的另一方面是^r測樣本中增強IL-16生物活性的分子的方 法，其包括下述步驟向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第 一真核細胞群提供第一測試樣本；向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生
6物活性的第二真核細胞群提供含有生物活性IL-16的陽性對照樣本； 測量由第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量；并且比 較由第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量，其中，相 對第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物水平而言，由第一真核細 胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量較少則表明測試樣本中存在增強IL-16 生物活性的分子。
檢測樣本中降低IL-16生物活性的分子的方法，其包括下述步 驟向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第一真核細胞群提供 第一測試樣本；向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第二真核 細胞群提供含有生物活性IL-16的陽性對照樣本；測量由第一和第二 真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量；并且比較由第一和第二真 核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量，其中，相對第二真核細胞群 產(chǎn)生的RANTES代表物水平而言，由第一真核細胞群產(chǎn)生的 RANTES代表物的量增加則表明測試樣本中存在降低IL-16生物活性 的分子。
本發(fā)明的另一方面是診斷受試者中IL-16相關(guān)疾病存在或易感性 的方法，其包括下述步驟提供源自受試者的真核細胞樣本；測量 由該真核細胞樣本產(chǎn)生的RANTES代表物的量；將該樣本產(chǎn)生的 RANTES代表物的量與參考標準(即來自無IL-16相關(guān)疾病或不易感 IL-16相關(guān)疾病的受試者的細胞)作比較，其中，相對于標準品產(chǎn)生的 RANTES代表物水平而言，由受試者樣本產(chǎn)生的RANTES代表物的 量增加則表明存在或易感IL-16相關(guān)疾病。
發(fā)明詳述
在本說明書中引用的所有出版物，包括但不限于專利和專利申 請，在此引入作為參考，如同全文敘述一樣。
除非另有明確規(guī)定，否則本文和權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式 "一"、"和，，以及"該"或"所述"包括了其復(fù)數(shù)形式。例如，提到的
7"一個細胞"是指一個或一個以上的細胞，且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的等同物。
除非另有規(guī)定，否則用于本文的所有科技術(shù)語具有本發(fā)明所屬 領(lǐng)域的一般技術(shù)人員通常理解的相同涵義。雖然，在實施或檢驗本 發(fā)明時，可以使用與本文所述類似或等同的任何組合物和方法，但 本文所述是示范性的組合物和方法。
術(shù)語"抗體"是指免疫球蛋白或抗體分子，包括多克隆抗體、單 克隆抗體(包括鼠、人、人源化和嵌合性單克隆抗體)和抗體的片段、 部分或變體?？贵w是由漿細胞組成性表達和分泌的分泌蛋白?？贵w 還可以由永生化的漿細胞產(chǎn)生，其中漿細胞通過諸如產(chǎn)生雜交瘤的 標準方法或?qū)⒖贵w重鏈和/或輕鏈基因轉(zhuǎn)染入永生化B細胞(如骨髓瘤 細胞)或其他細胞類型(諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、植物細胞和昆 蟲細月包)而7:K生4匕。
術(shù)語"生物活性"是指生物系統(tǒng)對分子的反應(yīng)。這類生物系統(tǒng)可以 是例如細胞、可復(fù)制的核酸(如病毒或質(zhì)粒)、細胞或可復(fù)制核酸的分 離成分、或摻入一種或多種這些成分的體外系統(tǒng)。
術(shù)語"CD4"是指一種肽鏈，其與SEQ ID NO: 1的1至433位殘 基至少有50°/。的同一性，并且對IL-16有應(yīng)答。兩種肽《連間的同一性 可利用Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen Corp" Carslbad, CA)的AlignX才莫 塊的默認設(shè)置進行氨基酸序列比對而確定。AlignX使用CLUSTALW 算法進行成對的氨基酸序列比對。"CD4，，是"抗原決定簇4 (Cluster of Determinant antigen 4)"的首字母縮略詞。
術(shù)語"CD9"是指一種肽鏈，其與SEQ ID NO: 2的1至228位殘 基至少有90%的同一性，并且對IL-16有應(yīng)答。"CD9"是"抗原決定 簇9"的首字母縮略詞。
術(shù)語"真核細胞"是指其中其遺傳物質(zhì)被組織入至少 一個膜包圍核 中的細胞。
術(shù)語"表達，，是指可檢出的由核酸編碼的肽鏈的產(chǎn)生。術(shù)語"IL-16"是指一種肽鏈，其與SEQ ID NO: 3的1至121位氨 基酸殘基至少有80%的同 一性，可以結(jié)合CD4并降低RANTES代表 物的產(chǎn)生。"IL-16"是"白介素16"的首字母縮略詞。
術(shù)語"IL-16相關(guān)疾病"是指傳染性或免疫介導(dǎo)的炎性疾病，如肺 結(jié)核、肺炎、呼吸道合胞體病毒、哮喘、特應(yīng)性皮炎、克羅恩病、 炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)疾病如多發(fā)性硬 化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Graves病、丙型肝炎病毒、腮腺炎、柯薩 奇病毒、埃可病毒、流感、大腸桿菌感染、李斯特菌、腦膜炎、EB 病毒以及具有相關(guān)機制和/或以IL-16上調(diào)或IL-16活性增強為特征的 疾病。
術(shù)語"肽鏈"是指包含至少兩個氨基酸的分子，其中所述至少兩個 氨基酸殘基由肽鍵相連而形成一條鏈。超過50個氨基酸的大型肽鏈 可稱為"多肽"或"蛋白質(zhì)"。不到50個氨基酸的小肽鏈可稱為"肽"。
術(shù)語"HuT-78細胞"是指ATCC⑧編號為TIB-161tm的細胞，其來 自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC, Manassas， VA);或由其衍生的 細月包。
術(shù)語"THP-1細胞"是指ATCC⑧編號為TIB-202TM的細胞，其來 自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC, Manassas, VA);或由其書f生的細胞。
術(shù)語"群"是指至少有兩個項目，如兩個細胞。
術(shù)語"RANTES代表物"也稱為CCL5，是指與SEQ ID NO: 4的1 至68位氨基酸殘基至少有75%同一性的肽鏈、所編碼的肽鏈與SEQ ID NO: 4的1至68位殘基至少有75°/。同一性的核酸、通過激活編碼 SEQ ID NO: 4的天然基因的調(diào)控區(qū)而表達的肽鏈、或通過激活編碼 SEQ ID NO: 4的天然基因的調(diào)控區(qū)而轉(zhuǎn)錄出的核酸。RANTES代表 物可以用作RANTES基因激活的指示。兩種肽鏈間的同一性可利用 Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen Corp., Carslbad, CA)的AlignX模塊的默 認設(shè)置進行氨基酸序列比對而確定。AlignX使用CLUSTALW算法
9進行成對的氨基酸序列比對。"RANTES，，是"激活時被調(diào)節(jié)的、正常 T細月包所表達的和4,測為分泌的(regulated upon activation, normal T-cell expressed, and presumably screted)，，的首字母縮略詞。
術(shù)語"應(yīng)答"是指能夠在對刺激的反應(yīng)中產(chǎn)生可檢測信號。 本發(fā)明的一方面是4全測樣本中IL-16生物活性的方法，這可以指 示IL-16相關(guān)疾病的存在情況或?qū)υ摬〉囊赘行?，其包括下述步 驟向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第一真核細胞群提供 第一測試樣本；向^L培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第二真核 細胞群提供陰性對照樣本；測量由第 一和第二真核細胞群產(chǎn)生的 RANTES代表物的量；并且比較由第 一和第二真核細胞群產(chǎn)生的 RANTES代表物的量，其中，相對于第二真核細胞群產(chǎn)生的 RANTES代表物水平而言，由第一真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表 物的量減少則表明在測試樣本中檢測到IL-16生物活性。
指示IL-16生物活性變化的RANTES代表物的改變的量值是具 統(tǒng)計學(xué)意義的量值，例如，至少約1.5倍，如2倍、3 4咅及以上的 量。
可用于本發(fā)明方法中的真核細胞可以是附著或懸浮的。這些真 核細胞可以是被適合細胞生長或維持的培養(yǎng)基(包含血清或無血清)所 包圍著。可用于本發(fā)明方法中的真核細胞能應(yīng)答IL-16。 IL-16應(yīng)答 細胞通過向IL-16源的趨化、增加IL-lb的表達、增加IL - 6、增加 IL-15的表達、或降低RANTES產(chǎn)物來應(yīng)答IL-16刺激，并基于這些 指標而被鑒定。應(yīng)答IL-16的細胞通常表達CD4、 CD9或CD4和 CD9兩者中任一種，也可根據(jù)這一點來鑒定。測試樣本和陰性對照 樣本可以包含與維持樣本中IL-16生物活性相容并與本發(fā)明方法中所 用的真核細胞相容的載體。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)就是這種載體的一 個例子，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還將認識到其它載體。理想的情況下， 已知陰性對照樣本中不含可^r出的IL-16生物活性。
RANTES代表物的產(chǎn)生可以各種不同的方式來測量。例如，如
10果RANTES代表物是肽鏈，則可以通過特異性檢測RANTES代表物 肽鏈的RANTES代表物表達分析法來測量其產(chǎn)生。這樣的分析方法 可以包括SDS-PAGE、蛋白質(zhì)印跡分析、酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)、 RANTES代表物特異性酶分析(如焚光素酶測定)、或 RANTES代表物特異性抗體綴合珠分析。這些RANTES代表物肽鏈 可以是SEQ ID NO: 4的RANTES肽鏈，或在編碼SEQ ID NO: 4的 天然基因的調(diào)控區(qū)控制下由核酸序列編碼的肽鏈。在編碼SEQ ID NO: 4的天然基因的調(diào)控區(qū)控制下由核酸序列編碼的狀鏈可以是容易 檢測到的肽，例如熒光素酶或綠色熒光蛋白。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將 認識到其它的適用于本發(fā)明方法的易于檢測的肽鏈?；蛘?，如果 RANTES代表物是RNA,則可以通過RT-PCR、 RNA印跡法、或本 領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的檢測特定RNA轉(zhuǎn)錄的其它技術(shù)來測量其產(chǎn) 生。
通過將編碼SEQ ID NO: 4的天然基因的調(diào)控區(qū)與核酸序列操作 性連接(operably linking),該核酸序列可被置于該調(diào)控區(qū)控制下。這 種操作性連接可以在可用作編碼肽鏈或RNA的染色體外報告構(gòu)建體 (諸如質(zhì)粒)的染色體外核酸背景下產(chǎn)生。這種染色體外構(gòu)建體也可采 用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過隨機重組事件被引入 染色體DNA中?；蛘撸@種操作性連接可以在諸如染色體DNA的 染色體核酸背景下產(chǎn)生。編碼SEQ ID NO: 4的天然基因就是染色體 核酸背景下的操作性連接的例子。然而，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認 識到的，位點特異性重組技術(shù)可以用來將外源基因操作性連接至染 色體DNA中天然基因的調(diào)控區(qū)。由這種染色體核酸編碼的所得肽鏈 或RNA可以充當RANTES fC表物。
在本方法的一個實施方案中，真核細胞表達CD4肽鏈或CD9肽 鏈。CD4或CD9肽鏈可以被組成性表達或誘導(dǎo)性表達，可以是由天 然基因或諸如cDNA的外源核酸編碼。例如，該cDNA可以編碼 SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2的肽《連。在本方法的另 一 實施方案中，真核細胞選自外周血單核細胞、
HuT-78細胞和THP-1細胞。這些真核細胞可以被含血清或無血清的 適合細胞生長或維持的培養(yǎng)基所包圍著。
在本方法的另一實施方案中，提供第一測試樣本，在包圍著第 一真核細胞群的培養(yǎng)基中產(chǎn)生的IL-16終濃度為100ng/ml至 1000ng/ml。此處描述的IL-16測定方法能夠檢測出包圍著真核細月包 的培養(yǎng)基中IL-16濃度至少為100ng/ml至1000 ng/ml時的IL-16生 物活性。然而，本發(fā)明的方法也適用于檢測樣本中此范圍外的更高 和更低終濃度的IL-16。
在本方法的另一實施方案中，RANTES代表物被分泌到培養(yǎng)基 中。包舍SEQ ID NO: 4的氨基酸序列的肽鏈是分泌到培養(yǎng)基中的 RANTES代表物的例子。此類RANTES代表物也可通過表達融合多 肽而產(chǎn)生，該融合多肽包含與RANTES代表物肽鏈融合的分泌信號 序列。 一個這樣的分泌信號序列就是人生長激素(HGH)分泌信號序列 (SEQ ID NO: 5)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到其它適合的分泌信號序 列。
本發(fā)明的另一方面是^f企測樣本中增強IL-16生物活性的分子的方 法，其包括下述步驟向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第 一真核細胞群提供第一測試樣本；向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生 物活性的第二真核細胞群提供含有生物活性IL-16的陽性對照樣本； 測量由第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量；比較由 第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量，其中，相對于 第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物水平而言，由第一真核細胞 群產(chǎn)生的RANTES代表物的量減少則表明在測試樣本中存在增強IL-16 生物活性的分子。本發(fā)明的這種方法可以用來檢測或鑒別激活I(lǐng)L-16 生物活性的分子，諸如藥物。這些分子可通過任一機制激活I(lǐng)L-16 生物活性。
陽性對照樣本可包含與維持樣本中IL-16生物活性相容并與在本
12發(fā)明方法中使用的真核細胞相容的載體。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)就是 這種載體的一個例子，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識到其它的載體。已
知陽性對照樣本中不含可檢出的IL-16生物活性。
在本方法的一個實施方案中，真核細胞表達CD4肽鏈或CD9肽鏈。
在本方法的另 一 實施方案中，真核細胞選自外周血單核細胞、 HuT-78細胞和THP-1細胞。
在本方法的另 一實施方案中，第 一測試樣本包含抗體分子。 在本方法的另一實施方案中，RANTES代表物被分泌到培養(yǎng)基中。
本發(fā)明的另一方面是檢測樣本中降低IL-16生物活性的分子的方 法，其包括下述步驟向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第 一真核細胞群提供第一測試樣本；向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生 物活性的第二真核細胞群提供含有生物活性IL-16的陽性對照樣本； 測量由第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量；比較由 第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量，其中，相對第 二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物水平而言，由第一真核細胞群 產(chǎn)生的RANTES代表物的量增加則表明測試樣本中存在降低IL-16 生物活性的分子。本發(fā)明的這種方法可以用來檢測或鑒別抑制IL-16 生物活性的分子，諸如藥物。這些分子可以任一機制抑制IL-16生物 活性。
參考下面的實施例對本發(fā)明作進一 步說明。這些實施例只是為 了說明本發(fā)明的多個方面，而不是限制本發(fā)明。
實施例1
根據(jù)RANTES水平的降低檢出IL-16活性及對IL-16活性的正或負
調(diào)節(jié)的測定方法
相對未暴露于含生物活性IL-16樣本的陰性對照細胞，在測試樣
13本中存在IL-16生物活性則會降低由應(yīng)答IL-16的外周血單核細胞 (PBMC)或真核細胞系分泌的RANTES趨化性細胞因子的水平(圖1 和2)。對接受了含不明分子的測試樣本的PBMC (圖l)或IL-16應(yīng)答 性真核HuT-78細胞(圖2)所分泌的RANTES細胞因子分泌水平降低 的檢測，可用于測定在測試樣本中是否存在生物活性IL-16。該測定 方法還可以用來沖企測在兩個不同的測試樣本中IL-16生物活性的增加 或降低(圖1和2)。
使用標準方法[參見例如74(4) Blood. 1348 (1989)]分離人PBMC 并將其維持于無血清AIM-V⑧細胞培養(yǎng)基(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)中。用標準真核細胞培養(yǎng)技術(shù)將表達CD4 (抗原決定簇4)并應(yīng)答 IL-16活性的永生化真核HuT-78人淋巴母細胞[ATCC⑧編號TIB-161 ;美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC), Manassas, VA]維持于 Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(D-MEM; Invitrogen Inc., Carlsbad, CA), 細胞培養(yǎng)液中含20% v/v月臺牛血清(FBS; Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)。
用分離的PBMC (圖l)或HuT-78細胞(圖2)分析測試樣本的IL-16 生物活性。首先，將約500,000個PBMC或HuT-78細胞置于96 孔組織培養(yǎng)板的孔內(nèi)，孔內(nèi)含有適合維持PBMC (圖l)或HuT-78細 胞(圖2)的細胞培養(yǎng)基(AIM-V或D-MEM)。第二，將含有具生物活 性的重組人(Z/omo sa/ /em) IL-16 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)[在石舞 酸緩沖鹽溶液(PBS)載體中]的測試樣本，添加到各組織培養(yǎng)孔中，使 生物活性IL-16在包圍所述細胞的培養(yǎng)基中的終濃度在100 ng/mL和 1000 ng/ml間(圖1和圖2)。在陰性對照PBMC或陰性對照HuT-78 細胞的培養(yǎng)孔中不添加含IL-16的樣本，而是添加僅有磷酸緩沖鹽溶 液載體的陰性對照樣本到包圍著這些細胞的培養(yǎng)基中(圖1和2)。第 三，將接受了含有生物活性IL-16之測試樣本的細胞和陰性對照細 胞，分別在標準真核細胞培養(yǎng)條件下，于37 。C孵育6個小時。第 四，用RANTES特異Luminex⑧測定法，依據(jù)制造商的指示，測定包圍著接受了測試樣本的細胞或陰性對照細胞的培養(yǎng)基中的
RANTES細胞因子分泌水平。第五，將包圍著接受了測試樣本的細 胞的培養(yǎng)基中的RANTES細胞因子分泌水平，與包圍著陰性對照細 胞的培養(yǎng)基中的RANTES細胞因子水平進行比較。相對于包圍著接 受了陰性對照細胞的培養(yǎng)基中的RANTES分泌水平而言，包圍著接 受了測試樣本的細胞的培養(yǎng)基中的RANTES分泌水平的降低，則指 示測試樣本含有生物活性IL-16 (圖1和2)。最后，將包圍著"l妄受了 含生物活性IL-16的第一測試樣本的細胞培養(yǎng)基中的RANTES細胞 因子分泌水平，與包圍著接受了含不同量生物活性IL-16的第二測試 樣本的細胞培養(yǎng)基中的RANTES細胞因子分泌水平進行比較。通過 這樣的比較，可以鑒別出含最高量IL-16生物活性的測試樣本，因為 這種樣樣本在包圍著所述細胞的培養(yǎng)基中含有最低水平的分泌
RANTES (圖1和2)。通過這樣的比較，可以鑒別出含最低量IL-16 生物活性的測試樣本，因為這種樣樣本在包圍著所述細胞的培養(yǎng)基 中含有最高水平的分泌RANTES (圖1和2)。
這些結(jié)果表明，可以通過基于細胞的測定方法，檢測樣本中的 IL-16活性，其中，相對未接受測試樣本的陰性對照細胞而言，暴露 于含生物活性IL-16的測試樣本的IL-16應(yīng)答細胞分泌的RANTES降 低。
這些結(jié)果還表明，上文所述的IL-16生物活性測定方法可用于鑒 別IL-16活性增加或降低的測試樣本。因此，上文所述的測定方法適 用于檢測或鑒定增強或降低樣本中IL-16活性的分子。這些分子可以 是增強IL-16活性的藥物，或僅yf又是已添加到樣本中的額外的生物活 性IL-16分子?；蛘?，這些分子可以是降低IL-16活性的藥物。因 此，本文所述的測定方法可以4企測測試樣本中IL-16活性的正調(diào)節(jié)或 負調(diào)節(jié)，可用于檢測或鑒別調(diào)節(jié)IL-16生物活性的分子，諸如藥物。
星號指示在Student T檢驗法中，相對陰性對照的統(tǒng)計學(xué)顯著差 異，PO.05(圖1和2)。
15實施例2
基于RANTES水平的降低檢測調(diào)節(jié)IL-16活性之分子的測定方法
可對上述實施例1中所描述的測定方法加以修改后，以便;險測 或鑒定測試樣本中調(diào)節(jié)IL-16活性的分子(如藥物)。例如，這些分子 可以是IL-16活性的抑制物。如圖3所示，相對接受只含有IL-16之 測試樣本的陽性對照細胞，接受了含IL-16生物活性抑制劑的測試樣 本的PBMC的RANTES細胞因子分泌量增加。因此，此處描述的修^ 改后測定方法可以用來^r測或鑒別調(diào)節(jié)IL-16生物活性的分子。
檢測或鑒別調(diào)節(jié)IL-16活性的分子的測定法如下進行。首先，將 約500,000個PBMC細胞置于96孔組織培養(yǎng)板的孔內(nèi)，孔內(nèi)含有 AIM-V細胞培養(yǎng)基。PBMC細胞的獲得和維持按照上述實施例1的 描述進行。第二，將測試樣本添加到各組織培養(yǎng)孔中，該樣本含有 具生物活性的、重組人IL-16 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)[在磷酸 緩沖鹽溶液(PBS)載體中]和能體外抑制IL-16生物活性的抗體。如圖 3指示，加入IL-16,使得在包圍著細胞的培養(yǎng)基中生物活性IL-16 的終濃度為100 ng/mL或1000 ng/ml。抗人IL-16抗體是能抑制IL-16 生物活性的鼠單克隆抗體。在陰性對照PBMC細胞的培養(yǎng)孔中不 加入IL-16,而是在包圍著這些細胞的培養(yǎng)基中加入僅含磷酸緩沖鹽 溶液載體或所述抑制性抗人IL-16 mAb的陰性對照樣本，濃度如圖3 中指示。陽性對照PBMC細胞僅接受生物活性IL-16，使得在包圍著 這些細胞的培養(yǎng)基中生物活性IL-16的終濃度為100 ng/mL或1000 ng/ml,如圖3所示。第三，將接受了測試樣本的PBMC細胞、陰性 對照PBMC細胞和陽性PBMC對照細胞，分別在標準真核細胞培養(yǎng) 條件下，于37 。C孵育6個小時。第四，用RANTES特異性 Luminex⑧測定法，依據(jù)制造商的指示，測定包圍著接受了測試樣本 的細胞、陰性對照細胞或陽性對照細胞的培養(yǎng)基中的RANTES細胞 因子分泌水平。第五，將包圍著接受了含生物活性IL-16和抑制性抗人IL-16 mAb的測試樣本的細胞的培養(yǎng)基中的RANTES細胞因子分 泌水平，與包圍著只接受生物活性IL-16的陽性對照細胞的培養(yǎng)基中 的RANTES細胞因子水平進行比較。相對于包圍著接受了陽性對照 細胞培養(yǎng)基中的RANTES分泌水平而言，包圍著接受了測試樣本的 細胞的培養(yǎng)基中的RANTES分泌水平增加，則指示測試樣本含有生 物活性IL-16的抑制物(圖3)。
這些結(jié)果表明，上面描述的IL-16活性測定方法，可以用于檢測 或鑒別測試樣本中調(diào)節(jié)IL-16活性的分子。這些分子可以是抑制IL-16 活性的藥物，或者是增強IL-16活性的藥物。
誤差條表示相對于平均值的標準偏差(見圖3)。
現(xiàn)在已對本發(fā)明作了全面的描述，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員顯 而易見的是，在不偏離所附權(quán)利要求書的精神或范疇下，可以對本 發(fā)明作出許多調(diào)整和改變。
權(quán)利要求
1. 檢測樣本中IL-16生物活性的方法，包括以下步驟a)向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第一真核細胞群提供第一測試樣本；b)向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第二真核細胞群提供陰性對照樣本；c)測量由第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量；和d)比較由第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量，其中，相對于第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物水平而言，由第一真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量減少則表明在測試樣本中檢測到IL-16生物活性。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中，真核細胞表達CD4肽鏈或CD9 肽鏈。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中，真核細胞選自外周血單核細 胞、HuT-78細胞和THP-1細胞。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中，提供第一測試樣本，使得在包圍 著的第一真核細胞群的培養(yǎng)基的IL-16終濃度為100 ng/mL至1000 ng/ml。
5. 權(quán)利要求1的方法，其中，RANTES代表物凈皮分泌到培養(yǎng)基中。
6. 權(quán)利要求1的方法，其中，相對第二真核細胞群而言，第一 真核細胞群所產(chǎn)生的RANTES代表物量的降低為降至至多約1/1.5。
7. 檢測樣本中增強IL-16生物活性的分子的方法，包括以下步驟a)向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第一真核細胞群 提供第一測試樣本；b) 向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第二真核細胞群 提供含有生物活性IL-16的陽性對照樣本；c) 測量由第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量；和d) 比較由第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量， 其中，相對第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物水平，由第一真 核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量降低則表明測試樣本中存在增 強IL-16生物活性的分子。
8. 權(quán)利要求7的方法，其中，真核細胞表達CD4肽鏈或CD9 肽鏈。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中，真核細胞選自外周血單核細 胞、HuT-78細胞和THP-1細胞。
10. 權(quán)利要求7的方法，其中，第一測試樣本包含抗體分子。
11. 權(quán)利要求7的方法，其中，RANTES代表物被分泌到培養(yǎng)基中。
12. 權(quán)利要求7的方法，其中，相對第二細胞群而言，第一群體 所產(chǎn)生的RANTES代表物量的降低為降至至多約1/1.5。
13. 檢測樣本中降低IL-16生物活性的分子的方法，包括以下步驟a) 向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第一真核細胞群 提供第一測試樣本；b) 向被培養(yǎng)基包圍著且應(yīng)答IL-16生物活性的第二真核細胞群 提供含有生物活性IL-16的陽性對照樣本；c) 測量由第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量；和d) 比較由第一和第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量， 其中，相對第二真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物水平而言，由第 一真核細胞群產(chǎn)生的RANTES代表物的量增加則表明測試樣本中存在降低IL-16生物活性的分子。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中，真核細胞表達CD4肽鏈或CD9肽鏈。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中，真核細胞選自外周血單核細 胞、HuT-78細胞和THP-1細胞。
16. 權(quán)利要求13的方法，其中，第一測試樣本包含抗體分子。
17. 權(quán)利要求13的方法，其中，RANTES代表物被分泌到培養(yǎng) 基中。
18. 權(quán)利要求13的方法，其中，相對第二細胞群而言，由第一 群體產(chǎn)生的RANTES代表物量的增加為至少增至約1.5倍。
19. 診斷受試者中IL-16相關(guān)疾病存在或易感性的方法，包括以 下步驟a) 提供源自受試者的真核細胞樣本；b) 測量由該真核細胞樣本產(chǎn)生的RANTES代表物的量；和c) 將該樣本產(chǎn)生的RANTES代表物的量與參考標準作比較，其 中，相對參考標準產(chǎn)生的RANTES代表物水平而言，由受試者樣本 產(chǎn)生的RANTES代表物的量降低則表明存在或易感IL-16相關(guān)疾 病。
20. 權(quán)利要求19的方法，其中，真核細胞表達CD4肽鏈或CD9 肽鏈。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中，真核細胞是外周血單核細胞。
22. 權(quán)利要求19的方法，其中，參考標準包含對IL-16相關(guān)疾 病不易感的細胞、未患IL-16相關(guān)疾病的細胞、或不以上調(diào)IL-16或 IL-16相關(guān)活性為特征的細胞。
23. 權(quán)利要求19的方法，其中，相對第二細胞群而言，由第一 群體產(chǎn)生的RANTES代表物量的降低為降至至多約1/1.5。
24. 在此描述的任一發(fā)明。
全文摘要
用于檢測IL-16生物活性、檢測對IL-16生物活性的調(diào)節(jié)以及診斷IL-16相關(guān)疾病存在情況和/或易感性的方法，包括測量和比較真核細胞所產(chǎn)生的RANTES代表物水平，其中所述真核細胞例如為CD4⁺和CD9⁺細胞系、外周血單核細胞、HuT-78細胞和/或THP-1細胞。
文檔編號G01N33/53GK101501498SQ200780029864
公開日2009年8月5日 申請日期2007年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月12日
發(fā)明者W·G·格拉斯 申請人:森托科爾公司