專利名稱：含甲狀腺素化合物的分析方法
相關(guān)申請的交叉引用
本申請是于2006年2月8日提交的名稱為“Amine-containingCompound Analysis Methods”的美國專利申請No.11/350147的部分繼續(xù)申請，并且本申請要求該申請的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，所述美國專利申請No.11/350147要求于2005年2月9日提交的名稱為“Amine-containingCompound Analysis Methods”的美國臨時申請No.60/651,734的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，這兩個申請各自的全部公開內(nèi)容通過引用并入本文中。
引言 含胺化合物代表重要的生物學(xué)和醫(yī)藥學(xué)化學(xué)物。含胺化合物的實例包括蛋白質(zhì)、肽、多胺、氨基酸、兒茶酚胺和硝基呋喃代謝物。用于定量含胺化合物的當(dāng)前方法包括利用紫外可見(UV)熒光或電化學(xué)檢測的高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜法聯(lián)用質(zhì)譜法(LC/MS)以及串聯(lián)質(zhì)譜法(MS/MS)。
通過上述方法進(jìn)行含胺化合物的絕對定量可能存在問題。例如，為通過HPLC分析多種含胺化合物，在分析之前必須進(jìn)行困難又耗時的衍生化步驟。此外，HPLC具有分析時間長、運行之間偏差大、缺乏多重能力(multiplexing capability)以及非特異性等缺點。
更近些時候，利用LC/MS和MS/MS進(jìn)行含胺化合物的檢測和定量提供了下述優(yōu)點靈敏度和特異性增加、以及具有迅速測量一種樣品中多種含胺化合物的能力。然而，這些技術(shù)缺乏多重分析能力。為進(jìn)行絕對定量，要將昂貴的同位素富集化合物用作內(nèi)標(biāo)物，所述內(nèi)標(biāo)物與某些串聯(lián)質(zhì)譜方法不相容。


發(fā)明內(nèi)容
本教導(dǎo)提供了利用同量異位(isobaric)標(biāo)記物和母離子-子離子躍遷監(jiān)測(parent-daughter ion transition monitoring，PDITM)分析一種或多種樣品中的一種或多種含胺化合物的方法。在多個方面，本教導(dǎo)提供了測定一種或多種樣品中的一種或多種含胺化合物的相對濃度、絕對濃度、或相對濃度和絕對濃度兩者的方法。在多個實施方案中，本教導(dǎo)提供了可以多重分析方式測定樣品中的多種含胺化合物、或者多種樣品中的一種或多種含胺化合物、或者它們的組合的的相對濃度、絕對濃度、或相對濃度和絕對濃度兩者的方法。
可應(yīng)用本教導(dǎo)的多個實施方案的含胺化合物可來自各種來源，例如生理流體樣品、細(xì)胞或組織裂解物樣品、蛋白質(zhì)樣品、細(xì)胞培養(yǎng)樣品、發(fā)酵液培養(yǎng)基樣品、農(nóng)產(chǎn)品樣品、動物產(chǎn)品樣品、動物飼料樣品、供人消費的食物或飲料的樣品、以及它們的組合。在多個實施方案中可將本教導(dǎo)用于廣泛的含伯胺化合物，所述含伯胺化合物包括但不限于氨基酸、兒茶酚胺、硝基呋喃代謝物、多胺、肽、蛋白質(zhì)、多肽、以及它們的組合。
術(shù)語“同量異位標(biāo)記物組”、“同量異位標(biāo)簽組”可互換使用，指例如一組試劑或化學(xué)結(jié)構(gòu)部分，其中所述組的成員(即個體的“同量異位標(biāo)記物”或“同量異位標(biāo)簽”)具有基本相同的質(zhì)量但其中所述組中每一個成員在經(jīng)受離子斷裂(例如通過碰撞誘導(dǎo)解離(CID)、光誘導(dǎo)解離(PID)等)時均可產(chǎn)生不同的子離子(daughter ion)信號?？捎糜趨^(qū)分組中成員的同量異位標(biāo)簽或標(biāo)記物的子離子可稱為所述同量異位標(biāo)簽或標(biāo)記物的報告物離子。在多個實施方案中，同量異位標(biāo)簽組包含胺衍生的含胺化合物，在缺乏斷裂的情況下，其基本上不能通過色譜學(xué)方法區(qū)分并且基本上不能通過質(zhì)譜學(xué)方法區(qū)分，但在CID后其產(chǎn)生了強的低質(zhì)量MS/MS信號離子。
術(shù)語“母-子離子躍遷監(jiān)測”或“PDITM”指例如利用質(zhì)譜法的測量，由此選擇第一質(zhì)量分離器(常稱為質(zhì)譜法的第一維)的所傳輸質(zhì)量電荷比(m/z)范圍以便將分子離子(常稱為“母離子”或“前體離子”)傳遞到離子裂解器(例如碰撞池、光解離區(qū)域等)中以產(chǎn)生片段離子(常稱為“子離子”)，并且選擇第二質(zhì)量分離器(常稱為質(zhì)譜法的第二維)的所傳輸m/z范圍以便將一種或多種子離子傳遞到測量所述子離子信號的檢測器。所監(jiān)測的母離子和子離子質(zhì)量的組合可稱為所監(jiān)測的“母離子-子離子躍遷”。對于給定的所測母離子-子離子組合而言，檢測器處的子離子信號可稱為“母離子-子離子躍遷信號”。在本教導(dǎo)的多個實施方案中，所述母離子是利用同量異位標(biāo)簽標(biāo)記的含胺化合物，所述子離子是所述同量異位標(biāo)簽的報告物離子；因此，對于給定的同量異位標(biāo)記的含胺化合物的母離子而言，在檢測器處所測量的報告物離子的離子信號可稱為“含胺化合物-報告物離子躍遷信號”。同樣，對于給定的同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物而言，在檢測器處所測量的報告物離子的離子信號可稱為“標(biāo)準(zhǔn)化合物-報告物離子躍遷信號”。
例如，母離子-子離子躍遷監(jiān)測的一個實施方案是多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)(又稱為選擇性反應(yīng)監(jiān)測)。在MRM的多個實施方案中，對給定母離子-子離子躍遷的監(jiān)測包括使用第一質(zhì)量分離器(例如停在目標(biāo)母離子m/z上的第一四極桿)來傳輸目標(biāo)母離子，利用第二質(zhì)量分離器(例如停在目標(biāo)子離子m/z上的第二四極桿)來傳輸一種或多種目標(biāo)子離子。在多個實施方案中，可通過使用所述第一質(zhì)量分離器(即停在目標(biāo)母離子m/z上的四極桿)來傳輸母離子并在其中包括所述一種或多種目標(biāo)子離子m/z值的m/z范圍內(nèi)掃描所述第二質(zhì)量分離器而進(jìn)行PDITM。
例如，串聯(lián)質(zhì)譜儀(MS/MS)儀器(或者更一般而言，多維質(zhì)譜儀(MSn)儀器)可用于進(jìn)行PDITM，例如MRM。合適的質(zhì)量分析器系統(tǒng)的實例包括但不限于含有三重四極桿、四極桿線性離子阱、四極桿TOF以及TOF-TOF中一種或多種的那些系統(tǒng)。
在多個方面，本教導(dǎo)提供了利用同量異位標(biāo)簽和母離子-子離子躍遷監(jiān)測(PDITM)來分析一種或多種樣品中的一種或多種含胺化合物的方法。在多個實施方案中，方法包括以下步驟(a)利用來自一組同量異位標(biāo)簽中的不同同量異位標(biāo)簽分別標(biāo)記一種或多種含胺化合物，所述同量異位標(biāo)簽組中的每種同量異位標(biāo)簽均包含報告物離子部分；(b)合并每種同量異位標(biāo)記的含胺化合物的至少一部分以產(chǎn)生合并樣品；(c)對所述合并樣品的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測；(d)測量一種或多種被傳輸報告物離子的離子信號；以及(e)至少基于所測的相應(yīng)報告物離子的離子信號與所測的標(biāo)準(zhǔn)化合物的一種或多種離子信號的比較，來測定一種或多種同量異位標(biāo)記的含胺化合物的濃度。因此，在多個實施方案中，可以多重分析方式來測定多種含胺化合物的濃度，例如通過合并兩種或更多種同量異位標(biāo)記的含胺化合物以產(chǎn)生合并樣品，并對所述合并樣品進(jìn)行PDITM(其中監(jiān)測兩種或更多種同量異位標(biāo)記的含胺化合物的報告物離子)。
在多個方面，提供了分析一種或多種樣品中的一種或多種含胺化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供標(biāo)準(zhǔn)化合物；(b)利用來自一組同量異位標(biāo)簽中的同量異位標(biāo)簽標(biāo)記所述標(biāo)準(zhǔn)化合物；(c)利用來自所述同量異位標(biāo)簽組中的不同同量異位標(biāo)簽分別標(biāo)記一種或多種含胺化合物；(d)合并所述同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的至少一部分與各種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物以產(chǎn)生合并樣品；(e)將所述合并樣品的至少一部分加載到色譜柱上；(f)對來自所述色譜柱的洗脫物的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測；(g)測量一種或多種所傳輸報告物離子的離子信號；以及(h)至少基于所測的相應(yīng)報告物離子的離子信號與所測的和所述同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物相對應(yīng)的報告物離子的離子信號的比較，來測定一種或多種含胺化合物的濃度。
在多個方面，提供了分析一種或多種樣品中的一種或多種含胺化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)利用來自一組同量異位標(biāo)簽中的不同同量異位標(biāo)簽標(biāo)記一種或多種含胺化合物；(b)合并所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的至少一部分以產(chǎn)生合并樣品；(c)將所述合并樣品的至少一部分加載到色譜柱上；(d)對來自所述色譜柱的洗脫物的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測；(e)測量一種或多種所傳輸報告物離子的離子信號；以及(f)至少基于所測的相應(yīng)報告物離子的離子信號與標(biāo)準(zhǔn)化合物濃度曲線的比較來測定一種或多種同量異位標(biāo)記的含胺化合物的濃度。
在多個方面，提供了分析一種或多種樣品中的一種或多種含胺化合物的方法，所述方法包括以下步驟(a)利用來自一組同量異位標(biāo)簽中的不同同量異位標(biāo)簽標(biāo)記一種或多種含胺化合物；(b)合并各種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的至少一部分以產(chǎn)生合并樣品；(c)利用基質(zhì)輔助激光解吸電離(matrix assisted laser desorption ionization)對所合并樣品的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測；(d)測量一種或多種所傳輸報告物離子的離子信號；以及(e)至少基于所測的相應(yīng)報告物離子的離子信號與所測的標(biāo)準(zhǔn)化合物的離子信號的比較來測定一種或多種同量異位標(biāo)記的含胺化合物的濃度。
在多個實施方案中，可通過以下步驟產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化合物的濃度曲線(a)提供具有第一濃度的標(biāo)準(zhǔn)化合物；(b)利用來自一組同量異位標(biāo)簽中的同量異位標(biāo)簽標(biāo)記所述標(biāo)準(zhǔn)化合物；(c)將所述同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的至少一部分加載到色譜柱上；(d)對來自所述色譜柱的洗脫物的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測；(e)測量所傳輸?shù)膱蟾嫖镫x子的離子信號；(f)針對標(biāo)準(zhǔn)化合物的一個或多個不同的濃度，重復(fù)步驟(a)～(e)；以及(g)至少基于在兩個或更多個標(biāo)準(zhǔn)化合物濃度上的所傳輸報告物離子的所測離子信號產(chǎn)生所述標(biāo)準(zhǔn)化合物的濃度曲線。
在多個實施方案中，所述測定一種或多種同量異位標(biāo)記的含胺化合物之濃度的步驟包括測定一種或多種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的絕對濃度。
雖然例如可將同位素富集的氨基酸用作絕對定量氨基酸濃度的內(nèi)標(biāo)物，但在MALDI質(zhì)譜法中使用氨基酸的穩(wěn)定同位素類似物的一個缺點在于在某些情形下，與基質(zhì)相關(guān)的信號可能干擾目標(biāo)氨基酸的m/z區(qū)域。例如與氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)相關(guān)的在約m/z＝147的信號可干擾賴氨酸及其穩(wěn)定同位素類似物；同樣地，與二羥基苯甲酸(DHB)相關(guān)的在約m/z＝175的信號可干擾精氨酸及其穩(wěn)定同位素類似物。在多個實施方案中，本教導(dǎo)提供了利用同量異位標(biāo)簽和PDITM促進(jìn)減少基質(zhì)相關(guān)信號對來自內(nèi)標(biāo)物或目的含胺化合物的信號之干擾的方法。
在多個實施方案中，所述一種或多種目的含胺化合物包含賴氨酸、賴氨酸異構(gòu)體以及翻譯后修飾賴氨酸中的一種或多種，并且所述基質(zhì)包含氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)。在多個實施方案中，所述一種或多種目的含胺化合物包含精氨酸、精氨酸異構(gòu)體以及翻譯后修飾精氨酸中的一種或多種，并且所述基質(zhì)包含二羥基苯甲酸(DHB)。
在多個方面，提供了設(shè)計用于確定一種或多種樣品中目的含胺化合物存在狀況的方法。所述方法可以是例如用于幫助發(fā)現(xiàn)各種生物化學(xué)途徑、用于藥物發(fā)現(xiàn)或診斷測試的生物標(biāo)志物驗證測試(biomarkervalidation assay)。所述測試可以是例如疾病或病癥的診斷、疾病或疾病的預(yù)測(prognostic)、或者二者皆有。
在多個方面，本教導(dǎo)提供了一種制品，其中本教導(dǎo)方法的功能作為計算機可讀指令包含于計算機可讀介質(zhì)中，所述計算機可讀介質(zhì)例如但不限于軟盤、硬盤、光盤、磁帶、PROM、EPROM、CD-ROM或DVD-ROM。
根據(jù)以下說明以及附圖，可更充分理解本教導(dǎo)的前述和其它方面、實施方案以及特征。在附圖中，同樣的附圖標(biāo)記通常指所有不同附圖中同樣的特征和結(jié)構(gòu)元件。附圖不必按比例繪制，而是重點放在舉例說明本教導(dǎo)的原理上。



圖1是分析一種或多種樣品中一種或多種含胺化合物的方法的多種實施方案的示意圖。
圖2圖示說明了同量異位標(biāo)簽的多種實施方案。
圖3是使用多種樣品類型的多種實施方案的示意圖。
圖4A和4B舉例說明了利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行同量異位標(biāo)記之步驟的多種實施方案。
圖5是在合并樣品中使用標(biāo)準(zhǔn)化合物的多種實施方案的示意圖。
圖6A圖示說明了未標(biāo)記的腐胺(putrescene)和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的腐胺的結(jié)構(gòu)，圖6B和6C描繪了在PDITM之前和之后同量異位標(biāo)記的腐胺的質(zhì)譜。
圖7A圖示說明了未標(biāo)記的尸胺和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的尸胺的結(jié)構(gòu)，圖7B和7C描繪了在PDITM之前和之后同量異位標(biāo)記的尸胺的質(zhì)譜。
圖8A圖示說明了未標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷的結(jié)構(gòu)，圖8B和8C描繪了在PDITM之前和之后同量異位標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷的質(zhì)譜。
圖9A圖示說明了未標(biāo)記的亞精胺和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的亞精胺的結(jié)構(gòu)，圖9B、9C和9D描繪了在PDITM之前和之后同量異位標(biāo)記的亞精胺的質(zhì)譜。
圖10A圖示說明了未標(biāo)記的精胺和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的精胺的結(jié)構(gòu)，圖10B、10C、10D描繪了在PDITM之前和之后同量異位標(biāo)記的精胺的質(zhì)譜。
圖11圖示說明了各自利用來自一組同量異位標(biāo)簽中的不同同量異位標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記的多胺混合物的液相色譜。
圖12A圖示說明了利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的腐胺的色譜圖。圖12B圖示說明了利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的尸胺的色譜圖。圖12C圖示說明了利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷的色譜圖。
圖13圖示說明了各自利用來自一組同量異位標(biāo)簽中的不同同量異位標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記的多胺混合物的液相色譜圖。
圖14A、14B、14C描繪了包含ACN和HCCA的基質(zhì)的樣品的正交MALDI(O-MALDI)背景質(zhì)譜。
圖15描繪了在ACN和HCCA基質(zhì)中的實施例4的四種多胺的O-MALDI質(zhì)譜。
圖16A圖示說明了未標(biāo)記的腐胺和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的腐胺的結(jié)構(gòu)，圖16B描繪了在PDITM之后同量異位標(biāo)記的腐胺的O-MALDI質(zhì)譜。
圖17A圖示說明了未標(biāo)記的尸胺和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的尸胺的結(jié)構(gòu)，圖17B描繪了在PDITM之后同量異位標(biāo)記的尸胺的O-MALDI質(zhì)譜。
圖18A圖示說明了未標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷的結(jié)構(gòu)，圖18B描繪了在PDITM之后同量異位標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷的O-MALDI質(zhì)譜。
圖19A圖示說明了未標(biāo)記的亞精胺和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的亞精胺的結(jié)構(gòu)，圖19B描繪了在PDITM之后同量異位標(biāo)記的亞精胺的O-MALDI質(zhì)譜。
圖20A圖示說明了未標(biāo)記的精胺和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的精胺的結(jié)構(gòu)，圖20B描繪了在PDITM之后同量異位標(biāo)記的亞精胺的O-MALDI質(zhì)譜。
圖21A圖示說明了未標(biāo)記的精胺和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的精胺的結(jié)構(gòu)，圖21B和21C描繪了在PDITM之后的O-MALDI質(zhì)譜。
圖22A圖示說明了未標(biāo)記的精胺和利用iTRAQTM品牌試劑進(jìn)行標(biāo)記的精胺的結(jié)構(gòu)，圖22B描繪了在PDITM之后同量異位標(biāo)記的亞精胺的O-MALDI質(zhì)譜。
圖23圖示說明了被標(biāo)記氨基酸的混合物的色譜圖。
圖24圖示說明了實施例5的被標(biāo)記氨基酸之混合物的樣品的總離子電流(TIC)色譜圖。
圖25A-25U圖示說明了實施例5中所測的多種氨基酸的PDITM圖譜。
圖26A-26B提供了實施例5所測氨基酸濃度與理論和其它多種測量體系相比較的數(shù)據(jù)。
圖27A和27B提供了關(guān)于本教導(dǎo)的多種實施方案用于氨基酸濃度測定的動態(tài)范圍和響應(yīng)的數(shù)據(jù)。

具體實施例方式 在多個方面，本教導(dǎo)提供了利用同量異位標(biāo)記物(isobaric label)和母離子-子離子躍遷監(jiān)測(PDITM)來分析一種或多種樣品中的一種或多種含胺化合物的方法。在多個實施方案中，本教導(dǎo)提供了測定一種或多種含胺化合物的濃度的方法。例如，參照圖1，在多個實施方案中，方法包括利用來自一組同量異位標(biāo)簽中的不同同量異位標(biāo)簽分別標(biāo)記一種或多種含胺化合物的步驟(步驟110)，來自所述同量異位標(biāo)簽組中的每種同量異位標(biāo)簽都包含報告物離子部分；合并每種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的至少一部分以產(chǎn)生合并樣品(步驟120)并對所述合并樣品的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測(其中所傳輸母離子的m/z范圍包括所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的m/z值，所傳輸子離子的m/z范圍包括與所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物中的同量異位標(biāo)簽相對應(yīng)的報告物離子的m/z值)以及測量一種或多種所傳輸報告物離子的離子信號(步驟130)；然后至少基于所測定的相應(yīng)報告物離子的離子信號與標(biāo)準(zhǔn)化合物的一種或多種所測離子信號的比較來測量一種或多種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的濃度(步驟140)。所述離子信號例如可以基于離子峰的強度(平均值、中值(mean)、最大值等)、離子峰的面積或者其組合。
在多個實施方案中，可在包含第一質(zhì)量分離器、離子裂解器和第二質(zhì)量分離器的質(zhì)量分析器系統(tǒng)上進(jìn)行PDITM。選擇PDITM掃描的所傳輸母離子的m/z范圍(通過所述第一質(zhì)量分離器進(jìn)行選擇)以包括一種或多種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的m/z值，選擇PDITM掃描的所傳輸子離子的m/z范圍(通過所述第二質(zhì)量分離器進(jìn)行選擇)以包括與所傳輸?shù)暮坊衔锵鄬?yīng)的一種或多種報告物離子的m/z值。
在多個實施方案中，利用選自一組同量異位標(biāo)簽中的一個或多個同量異位標(biāo)簽來標(biāo)記所述一種或多種含胺樣品，使得例如在一次實驗測量中(i)來自不同樣品(例如對照樣品、處理樣品)的多種含胺化合物可以進(jìn)行比較；(ii)可以對來自同一樣品的同一含胺化合物進(jìn)行多重濃度測量；(iii)可以對照正常組織評價癌組織的不同分離物；(iv)可對照未污染的食物或飲料評價抗生素污染的食物或飲料；(v)可將不同食物或飲料樣品間的風(fēng)味趨勢進(jìn)行比較；(vi)可監(jiān)測發(fā)酵的進(jìn)程；等等。
再次參照圖1，在多個實施方案中，所述對所述合并樣品的至少一部分進(jìn)行PDITM的步驟包括將所述合并樣品直接引入質(zhì)量分析器系統(tǒng)(流程路徑121和步驟130)中，例如通過利用電噴霧電離(ESI)離子源直接將合并樣品引入到合適的溶液中，將所述合并樣品與合適的基質(zhì)混合并利用合適的基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)離子源引入所述樣品。
再次參照圖1，在多個實施方案中，所述對所述合并樣品的至少一部分進(jìn)行PDITM的步驟包括將所述合并樣品的所述部分加載到色譜柱(例如LC柱、氣相色譜(GC)柱或其組合)上(流程路徑122和步驟125)、對所述色譜柱洗脫物的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測以及測量一種或多種所傳輸報告物離子的離子信號(流程途徑123和步驟130)。
在多個實施方案中，在利用所述合并樣品測量報告物離子信號之前凈化(clear up)所述合并樣品(例如通過高效液相色譜法(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交換分級(exchange fractionation)、陽離子交換、高分辨陽離子交換(high resolution cation exchange)等、以及它們的組合去除干擾樣品、緩沖液假陽性物(buffer artifact)等)。
在多個實施方案中，通過將所述相應(yīng)含胺化合物-報告物離子躍遷的所測離子信號(所述含胺化合物-報告物離子躍遷信號)與以下的一種或多種進(jìn)行比較而測定含胺化合物的濃度 (i)針對標(biāo)準(zhǔn)化合物-報告物離子躍遷的濃度曲線；以及 (ii)針對在與所述含胺化合物合并的樣品中標(biāo)準(zhǔn)化合物的標(biāo)準(zhǔn)化合物-報告物離子躍遷信號。
再次參照圖1，可以以多種方式提供在所述測定一種或多種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的濃度之步驟(步驟140)中使用的標(biāo)準(zhǔn)化合物的一種或多種所測離子信號。在多種實施方案中，利用來自所述同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽標(biāo)記一種或多種標(biāo)準(zhǔn)化合物，并且將所述一種或多種同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物中一種或多種的至少一部分與每種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的至少一部分相合并以產(chǎn)生合并樣品(步驟150)；然后對此合并樣品的至少一部分進(jìn)行PDITM并測量一種或多種所傳輸報告物離子的離子信號(步驟130)。
然后可以將與所述合并樣品中所述一種或多種同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的一種或多種相對應(yīng)的一種或多種報告物離子的所測離子信號用于測定一種或多種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的濃度。因此，在多個實施方案中，測定同量異位標(biāo)記的含胺化合物的濃度至少是基于所述相應(yīng)報告物離子與合并樣品中和所述一種或多種同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物中的一種或多種相對應(yīng)的一種或多種報告物離子的所測離子信號進(jìn)行比較(步驟140)。所述對此合并樣品的至少一部分進(jìn)行PDITM的步驟可包括例如直接引入到質(zhì)量分析器系統(tǒng)中(流程路徑152和步驟130)；首先將此合并樣品的至少一部分加載到色譜柱上(流程路徑153和步驟125)，然后對色譜柱洗脫物的至少一部分進(jìn)行PDITM并測量一種或多種所傳輸報告物離子的離子信號(流程路徑123和步驟130)；或者它們的組合。
在多個實施方案中，測定一種或多種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的濃度(步驟140)至少是基于所述相應(yīng)報告物離子的所測離子信號與和一種或多種標(biāo)準(zhǔn)化合物的一個或多個濃度曲線相對應(yīng)的一種或多種報告物離子的所測離子信號進(jìn)行比較。在多個實施方案中，提供具有第一濃度(步驟160)并用來自一組同量異位標(biāo)簽中的同量異位標(biāo)簽標(biāo)記(步驟170)的標(biāo)準(zhǔn)化合物。對所述同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測(其中所傳輸母離子的m/z范圍包括所述同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的m/z值，所傳輸子離子的m/z范圍包括與所述同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的同量異位標(biāo)簽相對應(yīng)的報告物離子的m/z值)并測量所述報告物離子的離子信號(步驟180)。針對不同于所述第一濃度的至少一個或多個標(biāo)準(zhǔn)化合物濃度重復(fù)所述標(biāo)記步驟(步驟170)和PDITM以及測量所傳輸報告物離子的離子信號的步驟(步驟180)，以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化合物的濃度曲線(步驟190)。
所述對同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的至少一部分進(jìn)行PDITM的步驟可包括例如直接引入質(zhì)量分析器系統(tǒng)中(流程途徑171和步驟180)(例如通過利用ESI離子源將所述合并樣品引入到合適的溶液中，將所述合并樣品與合適的基質(zhì)相混合并用合適MALDI離子源引入所述樣品)；首先將此合并樣品的至少一部分加載到色譜柱上(流程路徑172和步驟175)，然后對色譜柱洗脫物的至少一部分進(jìn)行PDITM并測量一種或多種所傳輸報告物離子的離子信號(流程路徑173和步驟180)；或者它們的組合。
在多個實施方案中，針對標(biāo)準(zhǔn)化合物的PDITM可在包括第一質(zhì)量分離器、離子裂解器和第二質(zhì)量分離器的質(zhì)量分析器系統(tǒng)上進(jìn)行。選擇PDITM掃描的所傳輸母離子m/z范圍(通過所述第一質(zhì)量分離器進(jìn)行選擇)以包含一種或多種所述同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的m/z值，選擇PDITM掃描的所傳輸子離子m/z范圍(通過所述第二質(zhì)量分離器進(jìn)行選擇)以包含與所傳輸標(biāo)準(zhǔn)化合物相對應(yīng)的報告物離子中一種或多種的m/z值。
在多個實施方案中，濃度曲線的產(chǎn)生可利用包括在所述標(biāo)準(zhǔn)化合物的至少一部分之中的一種或多種內(nèi)標(biāo)物，以便例如簡化濃度測定、解釋注射體積的差別等。
在多個實施方案中，可如下產(chǎn)生濃度曲線利用PDITM測量與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化合物相關(guān)的報告物離子的離子信號并通過所測濃度的線性外推產(chǎn)生濃度曲線，使得零濃度對應(yīng)于零報告物離子信號。在多個實施方案中，可如下產(chǎn)生濃度曲線利用PDITM測量與在兩個或更多個已知濃度下的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化合物相關(guān)的報告物離子的離子信號并通過對所測報告物離子信號進(jìn)行函數(shù)擬合而產(chǎn)生濃度曲線。合適的擬合函數(shù)可取決于例如檢測器的響應(yīng)(例如檢測器飽和、非線性等)。在多個實施方案中，所述擬合函數(shù)是線性函數(shù)。
在多個實施方案中，至少基于以下兩者來測定一種或多種所述同量異位標(biāo)記的含胺化合物的濃度(步驟140)(i)相應(yīng)報告物離子的所測離子信號與和一種或多種標(biāo)準(zhǔn)化合物中一個或多個濃度曲線相對應(yīng)的一種或多種報告物離子的所測離子信號的比較，以及(ii)相應(yīng)報告物離子的所測離子信號與和一種或多種同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物(其與同量異位標(biāo)記的含胺化合物合并)相對應(yīng)的一種或多種報告物離子的所測離子信號的比較。在多個實施方案中，提供具有第一濃度(步驟160)并用來自所述同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽(用于標(biāo)記一種或多種含胺化合物(例如步驟120))標(biāo)記(步驟170)的標(biāo)準(zhǔn)化合物。將同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的一部分與每種同量異位標(biāo)記的含胺化合物的至少一部分合并以產(chǎn)生合并樣品(流程途徑176和步驟150)，然后可如本文中所述進(jìn)一步分析此合并樣品。在多個實施方案中，還將與用來產(chǎn)生合并樣品相同的同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的一部分用于產(chǎn)生如本文中所述的濃度曲線。
用于測量報告物離子信號的同一標(biāo)準(zhǔn)化合物部分或其它部分可用來測定質(zhì)量分析器的母離子-子離子躍遷監(jiān)測條件。例如，在所述質(zhì)量分析器系統(tǒng)包含液相色譜(LC)組件的情況下，所述標(biāo)準(zhǔn)化合物可用來測定色譜保留時間。在多個實施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)化合物可用來測定在不同條件下含胺化合物在離子源中的電離效率以及在離子裂解器中的斷裂效率。
含胺化合物 可將本教導(dǎo)的方法用于多種多樣的含伯胺和含仲胺的化合物，這些化合物包括但不限于氨基酸、兒茶酚胺、硝基呋喃代謝物、多胺、肽、蛋白質(zhì)、多肽及其組合。
在多個實施方案中，目的含胺化合物包含氨基酸。氨基酸的實例包括但不限于亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甘氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸及其異構(gòu)體，以及它們的翻譯后修飾氨基酸。例如，在多個實施方案中，含胺化合物包括氨基酸衍生物，例如甲狀腺素。甲狀腺素是酪氨酸的衍生物并包括可用來監(jiān)測疾病的一類重要化合物。甲狀腺素的實例包括但不限于甲狀腺素(T4)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)和“反T3”。

在多個實施方案中，目標(biāo)含胺化合物包含一種或多種兒茶酚胺。兒茶酚胺的實例包括但不限于腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺及其組合。在多個實施方案中，目標(biāo)含胺化合物包含多胺。多胺的實例包括但不限于精胺、N-乙?；?、亞精胺、N-乙?；鶃喚?、腐胺(1，4-二氨基丁烷)、2-羥基腐胺、尸胺(1，5-二氨基戊烷)、1，6-二氨基己烷、1，7-二氨基庚烷、1，10-二氨基癸烷及其組合。在多個實施方案中，目標(biāo)含胺化合物包含蛋白質(zhì)或多肽。蛋白質(zhì)或多肽的實例包括但不限于細(xì)胞色素P450同工型(isoforms)、血管緊張素、以及乳清蛋白和乳蛋白如β-乳球蛋白。細(xì)胞色素P450同工型的實例包括但不限于Cyp1a2、Cyp1b1、Cyp2a4、Cyp2a12、Cyp2b10、Cyp2c29、Cyp2c37、Cyp2c39、Cyp2c40、Cyp2d9、Cyp2d22、Cyp2d26、Cyp2j5、Cyp2e1、Cyp3a11、Cyp4a10、Cyp4a14及其組合。在多個實施方案中，目標(biāo)含胺化合物包含硝基呋喃代謝物。硝基呋喃代謝物的實例包括但不限于3-氨基-2-噁唑烷酮(AOZ)、5-嗎啉基甲基-3-氨基-噁唑烷酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基乙內(nèi)酰脲(AHD)及其組合。

可用于本發(fā)明多個實施方案中的所述含胺化合物可具有多種來源類型，例如生理流體樣品、細(xì)胞或組織裂解物樣品、合成肽樣品、多肽樣品、蛋白質(zhì)樣品、細(xì)胞培養(yǎng)物樣品、發(fā)酵液培養(yǎng)基樣品、農(nóng)產(chǎn)品樣品、動物產(chǎn)品樣品、動物飼料樣品、供人消費的食物或飲料樣品、以及它們的組合。所述樣品可以來自不同的來源、狀況或者二者皆有；例如，對照樣品與實驗樣品、來自不同時間點的樣品(例如以形成序列)、疾病樣品與正常樣品、實驗樣品與疾病樣品、污染樣品與未污染樣品等。生理流體的實例包括但不限于血液、血清、血漿、汗液、淚液、尿、腹膜液、淋巴、陰道分泌物、精液、脊髓液、腹水、唾液、痰、乳房滲出物、以及它們的組合。供人消費的食物或飲料樣品的實例包括但不限于酒、蜂蜜、醬油、家禽、豬肉、牛肉、魚、貝類、以及它們的組合。在多個實施方案中，目的含胺化合物是氨基酸，氨基酸的來源包括例如可被水解、消化而產(chǎn)生氨基酸的蛋白質(zhì)。在多個實施方案中，目的含胺化合物是合成肽。
標(biāo)準(zhǔn)化合物 多種多樣的化合物可以用作標(biāo)準(zhǔn)化合物。在多個實施方案中，標(biāo)準(zhǔn)化合物包含目標(biāo)含胺化合物中的一種。在多個實施方案中，所述標(biāo)準(zhǔn)化合物來自一種或多種對照樣品、已知濃度的樣品或其組合。在多個實施方案中，針對分析中的每種目標(biāo)含胺化合物提供標(biāo)準(zhǔn)化合物。
在多個實施方案中，可利用PDITM測量與在兩個或更多個已知濃度下的所述標(biāo)準(zhǔn)化合物相關(guān)的報告物離子的離子信號，以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)化合物的濃度曲線。
同量異位標(biāo)簽 在多個實施方案中，同量異位標(biāo)簽可由通式(I)表示 R-L-ARG(I)， 其中R表示與胺反應(yīng)活性基團(tuán)(ARG)通過可斷裂連接物(linker)基團(tuán)(L)共價連接的報告物基團(tuán)(R)，所述連接物基團(tuán)包括平衡基團(tuán)，其具有使得R+L的質(zhì)量基本上與同量異位標(biāo)簽組中每個同量異位標(biāo)簽相同的質(zhì)量。例如，在多個實施方案中，所述連接物基團(tuán)L可由通式(II)表示 X-B-Y(II)， 其中X表示所述平衡基團(tuán)與所述報告物基團(tuán)之間的鍵，其中所述鍵X在所述被標(biāo)記分析物與中性氣體(例如通過碰撞誘導(dǎo)解離(collisioninduced dissociation))碰撞時斷裂，Y代表當(dāng)所述分析物反應(yīng)活性基團(tuán)已與分析物反應(yīng)以標(biāo)記該分析物時所述平衡基團(tuán)與所述分析物之間的鍵，并且其中B表示平衡基團(tuán)?？赏ㄟ^使分析物與式(I)試劑、其鹽和/或其水合物反應(yīng)而標(biāo)記分析物。
胺反應(yīng)活性基團(tuán) 胺反應(yīng)活性基團(tuán)的實例包括但不限于與胺官能團(tuán)選擇性反應(yīng)以與所述含胺化合物在特定位點上形成共價鍵或非共價鍵的那些基團(tuán)。所述胺反應(yīng)活性基團(tuán)可預(yù)先存在，或者其可在原位制備?？稍诓淮嬖诜治鑫锘虼嬖诜治鑫锏那闆r下進(jìn)行所述胺反應(yīng)活性基團(tuán)的原位制備。例如，可利用水溶性的碳二亞胺(例如1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；EDC)在原位修飾羧酸基團(tuán)，從而制備可與親核物(nucleophile)(如烷基或芳基胺基)反應(yīng)的親電基團(tuán)。在多個實施方案中，利用EDC活化所述標(biāo)記試劑的羧酸基團(tuán)可在含胺(親核性)分析物的存在下進(jìn)行。在多個實施方案中，也可在與EDC的初始反應(yīng)進(jìn)行之后添加所述含胺(親核性)分析物。在多個實施方案中，可通過原位除去保護(hù)基團(tuán)而原位產(chǎn)生所述反應(yīng)活性基團(tuán)。因此，可以預(yù)見到通過親核和/或親電反應(yīng)而實現(xiàn)分析物衍生化的任何現(xiàn)有或新產(chǎn)生的試劑。
在多個實施方案中，合適的胺反應(yīng)活性基團(tuán)包括活性酯?；钚怎ピ陔暮铣芍惺潜娝苤?，指在肽合成通常使用的條件下可容易地與氨基酸的N-α胺反應(yīng)的某些酯。胺反應(yīng)活性活性酯可以是例如N-羥基琥珀酰亞胺基酯(NHS)、N-羥基磺基琥珀酰亞胺基酯、五氟苯基酯(Pfp)、2-硝基苯基酯、4-硝基苯基酯、2，4-二硝基苯基酯或2，4-二鹵代苯基酯。在多個實施方案中，所述胺反應(yīng)活性基團(tuán)可以是混合酸酐，因為混合酸酐可有效地與胺基反應(yīng)從而形成酰胺鍵。
報告物基團(tuán) 用于本教導(dǎo)的多個實施方案中的所述同量異位標(biāo)簽可以是具有可被測定的獨特質(zhì)量(或質(zhì)量電荷比)的基團(tuán)。例如，組中的每個報告物可具有獨特的粗略質(zhì)量(gross mass)。不同的報告物可包含一個或多個重原子同位素，以實現(xiàn)其獨特質(zhì)量。例如，存在碳(12C、13C和14C)、氮(14N和15N)、氧(16O和18O)或氫(氫、氘和氚)的同位素并且可用于制備多種多樣的報告物部分的組。穩(wěn)定的重原子同位素的實例包括但不限于13C、15N、18O和氘。
獨特的報告物部分可以與目的樣品相關(guān)聯(lián)，從而用所述報告物標(biāo)記該樣品中的一種或多種分析物。這樣，例如可將有關(guān)報告物的信息與有關(guān)樣品中一種或全部分析物的信息相關(guān)聯(lián)。然而，在測定所述報告物時，并不必將報告物與分析物進(jìn)行物理性連接。相反，報告物的獨特粗略質(zhì)量可例如在被標(biāo)記分析物的離子被斷裂從而產(chǎn)生子片段離子和可檢測報告物之后在串聯(lián)質(zhì)量分析器的第二質(zhì)量分析中測定。所測定的報告物可用于鑒定所測定分析物所來源的樣品。此外，所述獨特報告物相對于其它報告物或相對于校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品的量(例如用具體報告物標(biāo)記的分析物)可用于測定樣品中分析物的相對量和/或絕對量(經(jīng)常表達(dá)為濃度和/或量)。因此，可將信息(例如特定樣品中一種或多種分析物的量)與用于標(biāo)記每種特定樣品的報告物部分相關(guān)聯(lián)。在還測定所述分析物的身份的情況下，可將該信息與和不同報告物相關(guān)的信息相關(guān)聯(lián)，從而協(xié)助一種或多種樣品中每種被標(biāo)記分析物的身份和量的測定。
報告物可以包含固定的電荷，或者能夠被離子化。由于報告物可以包含固定電荷或者可被離子化，因此所述標(biāo)記試劑可以是分離的或者用于標(biāo)記鹽(或鹽的混合物)或兩性離子形式的反應(yīng)活性分析物。報告物的離子化有利于在質(zhì)譜儀中對其進(jìn)行測定。因此報告物可以作為離子(有時稱為特征離子)進(jìn)行測定。當(dāng)被離子化時，報告物可包含一個或多個正或負(fù)的凈電荷。因此，報告物可包含一個或多個酸性基團(tuán)或堿性基團(tuán)，因為這些基團(tuán)很容易在質(zhì)譜儀中被離子化。例如，報告物可以包含一個或多個堿性氮原子(正電荷)或者一個或多個可離子化的酸性基團(tuán)比如羧酸基、磺酸基、或磷酸基(負(fù)電荷)。包含堿性氮的報告物的非限制性實例包括取代或未取代的嗎啉、哌啶或哌嗪。
所述報告物可以是5元、6元或7元雜環(huán)，其包含用取代或未取代的乙酸結(jié)構(gòu)部分進(jìn)行了N-烷基化的環(huán)氮原子，所述分析物通過所述N-烷基化乙酸結(jié)構(gòu)部分的羰基碳與所述乙酸結(jié)構(gòu)部分相連，其中每種不同的標(biāo)記物包含一個或多個重原子同位素。所述雜環(huán)可以是取代或未取代的。所述雜環(huán)可以是脂肪族的或芳香性的。所述雜環(huán)結(jié)構(gòu)部分的可能取代基包括烷基、烷氧基和芳基。所述取代基可包含適于將分析物與載體(support)連接的保護(hù)或未保護(hù)的基團(tuán)，例如胺、羥基或巰基。所述雜環(huán)還可包含額外的雜原子，例如一個或多個氮、氧或硫原子。
可對報告物進(jìn)行選擇，以使其在對分析物進(jìn)行分析的典型條件下基本上不發(fā)生亞斷裂(sub-fragment)?？蓪蟾嫖镞M(jìn)行選擇，以使其在質(zhì)譜儀中在施加解離能以引起被標(biāo)記分析物的至少一部分所選離子的X鍵和Y鍵均斷裂的條件下基本上不發(fā)生亞斷裂。我們用“基本上不發(fā)生亞斷裂”來表示當(dāng)對目的分析物進(jìn)行成功分析時，難于或不可能檢測到高于背景噪聲的報告物片段?？捎幸膺x擇報告物的粗略質(zhì)量，使其不同于意圖測定的分析物或該分析物的任何預(yù)計片段的質(zhì)量。例如，當(dāng)分析物為蛋白質(zhì)或肽時，可選擇報告物的粗略質(zhì)量使其不同于任何天然存在的氨基酸或肽或其預(yù)計片段。這可有利于分析物測定，因為取決于分析物，樣品中不存在具有相同一致質(zhì)量(coincident mass)的任何可能成分能夠增加分析結(jié)果的置信度。
連接物基團(tuán) 根據(jù)是否已發(fā)生與分析物的反應(yīng)，用于本教導(dǎo)多個實施方案的標(biāo)記試劑的連接物將報告物與分析物相連接或者將報告物與分析物反應(yīng)活性基團(tuán)(ARG)相連接?？蛇x擇連接物以在X鍵和Y鍵都斷裂時產(chǎn)生中性物質(zhì)(例如當(dāng)X鍵和Y鍵都斷裂時經(jīng)受中性丟失(neutral loss))。所述連接物可以是非常小的結(jié)構(gòu)部分，比如羰基或硫代羰基基團(tuán)。所述連接物可以是較大的結(jié)構(gòu)部分。所述連接物可以是聚合物或生物聚合物?？梢詫⑺鲞B接物設(shè)計成當(dāng)經(jīng)受解離能水平時發(fā)生亞斷裂；包括亞斷裂從而僅產(chǎn)生連接物的中性片段。
所述連接物基團(tuán)可包含一個或多個重原子同位素，使得其質(zhì)量補償混合物的每種被標(biāo)記分析物或所述同量異位試劑組的報告物之間的粗略質(zhì)量差異。此外，報告物/連接物組合的總粗略質(zhì)量(aggregate grossmass)(即作為總體的粗略質(zhì)量)對于混合物中每種被標(biāo)記分析物來說都是基本上相同的，或者對于成組和/或成套的所述試劑來說都是基本上相同的。因為所述連接物可用作針對標(biāo)記試劑中報告物的質(zhì)量平衡物，使得所述報告物/連接物組合的總粗略質(zhì)量與成組或成套的所有試劑都相同，所以所述連接物基團(tuán)也意在包含平衡基團(tuán)(B)。連接物的平衡基團(tuán)(B)的原子數(shù)目越大，組和/或試劑盒中不同的同分異構(gòu)/同量異位標(biāo)記試劑的可能數(shù)目就越大。
X鍵和Y鍵 X是報告物的原子和連接物的原子之間的鍵。Y是連接物的原子與胺反應(yīng)活性基團(tuán)的原子之間的鍵，或者是連接物的原子與分析物的原子之間的鍵(如果所述標(biāo)記試劑已與分析物反應(yīng)的話)。選擇X鍵使得在被標(biāo)記分析物(例如R-X-B-Y-分析物)的至少一部分選定離子中當(dāng)經(jīng)受足夠的解離能水平時X鍵斷裂。在多個實施方案中，還選擇Y鍵使得在所述被標(biāo)記分析物(例如R-X-B-Y-分析物)的至少一部分選定離子中當(dāng)經(jīng)受足夠的解離能水平時Y鍵斷裂?？稍谫|(zhì)譜儀中調(diào)節(jié)解離能水平，使得在被標(biāo)記分析物的至少一部分選定離子中X鍵、Y鍵或者X鍵和Y鍵斷裂。X鍵的斷裂從分析物中釋放出報告物，使得可獨立于分析物來測定報告物。取決于X鍵是否已經(jīng)斷裂，Y鍵的斷裂從分析物釋放出報告物/連接物組合，或者從分析物釋放出連接物。在多個實施方案中，Y鍵可比X鍵更不穩(wěn)定，X鍵可比Y鍵更不穩(wěn)定，或者X鍵和Y鍵具有基本相同的相對不穩(wěn)定性。
當(dāng)例如目的分析物是蛋白質(zhì)或肽時，可根據(jù)酰胺(肽)鍵來調(diào)整X鍵和Y鍵的相對不穩(wěn)定性。X鍵、Y鍵或其二者可以比典型酰胺(肽)鍵的不穩(wěn)定性更高、相同或更低。例如，與Z-pro二聚體或Z-asp二聚體中的肽鍵相比，在解離能條件下，X鍵和/或Y鍵可更不易于斷裂，其中Z是任何天然氨基酸，pro是脯氨酸，asp是天冬氨酸。在多個實施方案中，X鍵和Y鍵將在與典型酰胺鍵大致相同的解離能水平下斷裂。
還可存在這樣的X鍵和Y鍵，使得Y鍵的斷裂引起X鍵的斷裂，并且反之亦然。在多個實施方案中，X鍵和Y鍵可基本上同時斷裂，使得在第二質(zhì)量分析中沒有顯著量的分析物(或其子片段)包含部分標(biāo)記。我們用“顯著量的分析物”來表示在MS/MS譜中可檢測到的小于約25％、優(yōu)選小于約10％的部分標(biāo)記的分析物。
參照圖2A，舉例說明了一種示例性的同量異位標(biāo)簽200。每種標(biāo)簽包含報告物基團(tuán)212、胺反應(yīng)活性基團(tuán)214和平衡基團(tuán)218(例如平衡所述報告物基團(tuán)之間的質(zhì)量差異)，使得每種標(biāo)簽的名義質(zhì)量基本上相等。
在多個實施方案中，一組同量異位標(biāo)簽包含胺衍生化的含胺化合物，其在不存在斷裂的情況下基本上不可通過色譜方法進(jìn)行區(qū)分并且基本上不可通過質(zhì)譜方法進(jìn)行區(qū)分，但其在CID后產(chǎn)生強的低質(zhì)量MS/MS信號離子。
在多個實施方案中，一組同量異位標(biāo)簽包含分別由通式(IIIa)-(IIId)所代表的標(biāo)簽Q114、Q115、Q116和Q117

適用于本教導(dǎo)的多個實施方案中的報告物基團(tuán)、連接物基團(tuán)、平衡基團(tuán)、胺反應(yīng)活性基團(tuán)、同量異位標(biāo)簽以及同量異位標(biāo)簽組的其它實例可見于美國專利公開序號No.2004/0219686、2004/0220412、20050147982、2005/0147985、2005/0148087、2005/0148771、2005/0148773、2005/0148774和2005/0208550，所有這些文獻(xiàn)的全部內(nèi)容均通過引用并入本文。
合并樣品 可將一種或多種被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物、一種或多種被同量異位標(biāo)記的含胺化合物、或者其組合的任何合適的組合用在本教導(dǎo)的方法中。例如，合并樣品中不同的被同量異位標(biāo)記的化合物的數(shù)目N通常小于或等于同量異位標(biāo)簽組中同量異位標(biāo)簽的數(shù)目T。在任何一種合并樣品中，被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物、一種或多種被同量異位標(biāo)記的含胺化合物的可能組合可表示為 (S+C)≤T(1)， 其中T表示所述同量異位標(biāo)簽組中同量異位標(biāo)簽的數(shù)目；S表示用不同的同量異位標(biāo)記物進(jìn)行同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的數(shù)目，其范圍為0到T(包括T本身)；C表示用不同的同量異位標(biāo)記物進(jìn)行同量異位標(biāo)記的含胺化合物的數(shù)目，其范圍為0至T(包含T本身)。
例如，在多個實施方案中，將一種或多種被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物(例如來自對照樣品、來自已知濃度的樣品等)與一種或多種被同量異位標(biāo)記的目標(biāo)含胺化合物合并，所述一種或多種被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物提供可用作例如內(nèi)部濃度標(biāo)準(zhǔn)的一種或多種報告物離子信號。在多個實施方案中，加入被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物可用作合并樣品中一種或多種目的含胺化合物的內(nèi)標(biāo)物。在多個實施方案中，針對合并樣品(例如S＝C)中每種不同的目的含胺化合物添加不同的被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物，每種所述被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物例如用作不同的目的含胺化合物的內(nèi)標(biāo)物。
在多個實施方案中，合并樣品中的兩種或更多種待分析含胺化合物包含同樣的目的含胺化合物。例如，含胺化合物#1到#X(其中X＞1)可包含同樣的目的含胺化合物(但是例如來自不同樣品)，其中不同的同量異位標(biāo)簽被用于來自不同樣品的含胺化合物。例如，所述不同樣品可來自同一體系(例如患者、位置等)的不同時間點并且可用來例如監(jiān)測某些過程(例如疾病、發(fā)酵等)的進(jìn)程。
在多個實施方案中，利用用于同一含胺化合物的不同的同量異位標(biāo)簽處理樣品。例如，利用不同的同量異位標(biāo)簽一式三份地處理樣品，其中不同的同量異位標(biāo)簽用于處理這三份中的每一份，然后將其合并，以提供至少部分地所述合并樣品(其還可包含一種或多種標(biāo)準(zhǔn)化合物)；以提供例如在合并樣品的單次實驗分析中對所述含胺化合物濃度的三次測量。經(jīng)常需要三重測量、更一般地多重測量來提供統(tǒng)計學(xué)上顯著和/或準(zhǔn)確的結(jié)果。例如，由于在傳統(tǒng)技術(shù)中經(jīng)常遇到的批次間偏差和背景干擾，利用傳統(tǒng)方法的氨基酸分析結(jié)果通?；趯ν粯悠返娜胤治?。本教導(dǎo)的多個實施方案提供在單次實驗運行中對含胺化合物濃度進(jìn)行多重測量的能力可有助于降低由于這些批次間偏差而導(dǎo)致的不準(zhǔn)確性。
在多個實施方案中，不向合并樣品中加入被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物，例如在多個實施方案中，一種或多種目標(biāo)含胺化合物的濃度可至少基于含胺化合物的相應(yīng)報告物離子信號與標(biāo)準(zhǔn)化合物濃度曲線的比較來測定。
在多個實施方案中，在利用合并樣品測量報告物離子信號之前對合并樣品進(jìn)行凈化(例如以除去例如干擾樣品、緩沖液假陽性物等；采用高效液相色譜(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交換分級分離、陽離子交換、高分辨陽離子交換等，以及它們的組合等方法)。
質(zhì)量分析器 多種質(zhì)量分析器系統(tǒng)可用于本教導(dǎo)中以進(jìn)行PDITM。合適的質(zhì)量分析器系統(tǒng)包括帶有離子裂解器的兩個質(zhì)量分離器，所述離子裂解器被布置在兩個質(zhì)量分離器之間的離子飛行路徑中。合適的質(zhì)量分離器的實例包括但不限于四極桿、RF多極桿、離子阱、飛行時間(TOF)、以及與定時離子選擇器(timed ion selector)聯(lián)合的TOF。合適的離子裂解器包括但不限于按以下原理運行的那些碰撞誘導(dǎo)解離(CID，也稱為碰撞輔助解離(CAD))、光誘導(dǎo)解離(PID)、表面誘導(dǎo)解離(SID)、源后衰變、或者它們的組合。
用于質(zhì)量分析器的合適質(zhì)譜系統(tǒng)的實例包括但不限于含有以下一個或多個的那些系統(tǒng)三重四極桿、四極桿-線性離子阱(例如4000 Q

LC/MS/MS系統(tǒng)、Q

LC/MS/MS系統(tǒng))、四極桿TOF(例如

LC/MS/MS系統(tǒng))、以及TOF-TOF。
用于質(zhì)譜系統(tǒng)的合適離子源包括但不限于電噴霧電離(ESI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI)、大氣壓光電離(APPI)源。例如，ESI離子源可用作將來自LC柱的離子化樣品引入到質(zhì)量分離器設(shè)備中的手段。ESI的幾個理想特性之一在于來自色譜柱的級分可直接從柱進(jìn)入ESI離子源中。
在多個實施方案中，所述質(zhì)量分析器系統(tǒng)包含MALDI離子源。在多個實施方案中，將所述合并樣品的至少一部分與MALDI基質(zhì)材料相混合并且利用帶有MALDI電離源的質(zhì)量分析器進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測。在多個實施方案中，將合并樣品的至少一部分加載到色譜柱上，將洗脫物的至少一部分與MALDI基質(zhì)材料相混合并利用帶有MALDI電離源的質(zhì)量分析器進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測。MALDI基質(zhì)材料的實例包括但不限于表1中所列出的那些。
表1 在多個實施方案中，所述質(zhì)譜儀系統(tǒng)包含用于選擇母離子和檢測其片段子離子的三重四極桿質(zhì)譜儀。在多個實施方案中，第一個四極桿選擇母離子。第二個四極桿被維持在足夠高的壓力和電壓下，使得發(fā)生多次低能量碰撞引起一些母離子斷裂。選擇第三個四極桿以將所選的子離子傳輸?shù)綑z測器。在多個實施方案中，三重四極桿質(zhì)譜儀可包括布置在離子源和三重四極桿之間的離子阱。所述離子阱可被設(shè)置為收集離子(例如所有離子、具有特定m/z范圍的離子等)并在填充時間(fill time)后，通過給末端電極施加脈沖而將所選的離子傳輸?shù)降谝粋€四極桿以允許所選的離子離開所述離子阱。可以例如基于離子數(shù)、離子阱內(nèi)的電荷密度、不同特征肽((signature peptide)洗脫之間的時間、負(fù)載周期(dutycycle)、激發(fā)態(tài)物質(zhì)或多電荷離子的衰變速率、或其組合來確定所期望的填充時間。
在多個實施方案中，三重四極桿質(zhì)譜儀中的一個或多個四極桿可被配置為線性離子阱(例如通過加入末端電極以在所述四極桿內(nèi)提供基本上長圓柱形的捕獲體積)。在多個實施方案中，第一個四極桿選擇母離子。第二個四極桿被維持在足夠高的碰撞氣壓和電壓下使得發(fā)生多次低能量碰撞而引起一些母離子斷裂。選擇第三個四極桿捕獲片段離子并且經(jīng)過填充時間后，通過給末端電極施加脈沖而將所選的離子傳輸?shù)綑z測器以允許所選的離子離開離子阱?？衫缁陔x子數(shù)、離子阱內(nèi)的電荷密度、不同特征肽洗脫之間的時間、負(fù)載周期、激發(fā)態(tài)物質(zhì)或多電荷離子的衰變速率或其組合來確定所期望的填充時間。
在多個實施方案中，所述質(zhì)譜儀系統(tǒng)包含兩個四極桿質(zhì)量分離器和TOF質(zhì)譜儀用于選擇母離子和檢測其片段子離子。在多個實施方案中，第一個四極桿選擇母離子。第二個四極桿被維持在足夠高的壓力和電壓下使得發(fā)生多次低能量碰撞而引起一些母離子斷裂，TOF質(zhì)譜儀選擇用于檢測的子離子，例如通過監(jiān)測含有目標(biāo)子離子的質(zhì)量范圍內(nèi)的離子以及所產(chǎn)生的提取離子色譜、通過使在所選子離子的時間窗之外出現(xiàn)的離子偏轉(zhuǎn)離開檢測器、以及通過對檢測器設(shè)置時間門控為所選子離子的到達(dá)時間窗、或者通過它們的組合來進(jìn)行選擇。
在多個實施方案中，所述質(zhì)譜儀系統(tǒng)包含兩個TOF質(zhì)量分析器和離子裂解器(例如CID或SID)。在多個實施方案中，第一個TOF選擇母離子(例如通過使在所選母離子的時間窗之外出現(xiàn)的離子偏轉(zhuǎn)離開裂解器)以將其引入到離子裂解器中，第二個TOF質(zhì)譜儀選擇用于檢測的子離子，例如通過監(jiān)測含有目標(biāo)子離子的質(zhì)量范圍內(nèi)的離子以及所產(chǎn)生的提取離子色譜、通過使在所選子離子的時間窗之外出現(xiàn)的離子偏轉(zhuǎn)離開檢測器、通過對所選子離子的到達(dá)時間窗的檢測器設(shè)置時間門控或者通過它們的組合來進(jìn)行選擇。所述TOF分析器可以是線性分析器或反射分析器。
在多個實施方案中，所述質(zhì)譜儀系統(tǒng)包含飛行時間質(zhì)譜儀和離子反射器。所述離子反射器置于所述TOF的無場漂移區(qū)(field-free driftregion)的末端并用于通過改變離子飛行路徑來補償初始動能分布的作用。在多個實施方案中，離子反射器由一系列具有偏置電壓的環(huán)組成，所述電壓增加到比加速電壓稍高的水平。在操作中，當(dāng)離子進(jìn)入反射器時其被減速直到其在電場方向上的速度變?yōu)榱銥橹?。在零速度點時，離子掉轉(zhuǎn)方向并通過反射器被加速返回。離子離開反射器時的能量與它們進(jìn)入時的能量相同，只是速度在方向上相反。具有較大能量的離子更深地進(jìn)入反射器，并且隨后將在反射器中停留較長時間。選擇反射器中使用的電壓以改變離子的飛行路徑，使得同樣質(zhì)量和電荷的離子以基本上相同的時間到達(dá)檢測器。
在多個實施方案中，所述質(zhì)譜儀系統(tǒng)包含串聯(lián)MS-MS儀器，其包含具有定時離子選擇器的第一無場漂移區(qū)以選擇目標(biāo)母離子、裂解室(或離子裂解器)以產(chǎn)生子離子、以及質(zhì)量分離器以傳輸所選的子離子用于檢測。在多個實施方案中，所述定時離子選擇器包含脈沖式離子偏轉(zhuǎn)器。在多個實施方案中，所述離子偏轉(zhuǎn)器可用作脈沖式離子偏轉(zhuǎn)器。所述質(zhì)量分離器可包括離子反射器。在多個實施方案中，所述裂解室是被設(shè)計成引起離子斷裂和延遲引出的碰撞室。在多個實施方案中，所述裂解室還可用作延遲引出離子源，其用于通過飛行時間質(zhì)譜分析所述片段離子。
在多個實施方案中，所述質(zhì)譜儀系統(tǒng)包含串聯(lián)TOF-MS，其具有沿由脈沖離子源產(chǎn)生的多數(shù)離子的路徑放置的第一、第二和第三TOF質(zhì)量分離器。放置所述第一質(zhì)量分離器以接收由脈沖離子源產(chǎn)生的多數(shù)離子。所述第一質(zhì)量分離器加速由脈沖離子源產(chǎn)生的多數(shù)離子，根據(jù)其質(zhì)量電荷比分離多數(shù)離子，并基于其質(zhì)量電荷比從所述多數(shù)離子中選擇第一組離子。所述第一質(zhì)量分離器還斷裂所述第一組離子的至少一部分。放置所述第二質(zhì)量分離器以接收所述第一組離子及其通過所述第一質(zhì)量分離器產(chǎn)生的片段。所述第二質(zhì)量分離器加速所述第一組離子及其片段，根據(jù)其質(zhì)量電荷比分離所述第一組離子及其片段，并基于其質(zhì)量電荷比從所述第一組離子及其片段中選擇第二組離子。所述第二質(zhì)量分離器還斷裂所述第二組離子的至少一部分。所述第一和/或第二質(zhì)量分離器還可包括離子導(dǎo)向器(ion guide)、離子聚焦元件和/或離子操縱元件(ion-steering element)。在多個實施方案中，所述第二TOF質(zhì)量分離器使所述第一組離子及其片段減速。在多個實施方案中，所述第二TOF質(zhì)量分離器包括無場區(qū)和離子選擇器，所述離子選擇器選擇具有基本上在第二預(yù)定范圍內(nèi)的質(zhì)量電荷比的離子。在多個實施方案中，所述第一和第二TOF質(zhì)量分離器中的至少一種包括選擇斷裂后離子的定時離子選擇器。在多個實施方案中，所述第一和第二質(zhì)量分離器中的至少一種包括離子裂解器。放置所述第三質(zhì)量分離器以接收所述第二組離子及其由所述第二質(zhì)量分離器產(chǎn)生的片段。所述第三質(zhì)量分離器加速所述第二組離子及其片段并根據(jù)其質(zhì)量電荷比分離所述第二組離子及其片段。在多個實施方案中，所述第三質(zhì)量分離器利用脈沖加速來加速所述第二組離子及其片段。在多個實施方案中，放置離子檢測器以接收所述第二組離子及其片段。在多個實施方案中，將離子反射器放置在無場區(qū)中以在所述第一或第二組離子及其片段到達(dá)所述離子檢測器之前校正其中至少一種的能量。
在多個實施方案中，所述質(zhì)譜儀系統(tǒng)包含具有可在時間上同時進(jìn)行的多飛行路徑、多運行模式或者兩者都包括的TOF質(zhì)量分析器。此TOF質(zhì)量分析器包括路徑選擇離子偏轉(zhuǎn)器，其引導(dǎo)從一組樣品離子中選出的離子沿第一離子路徑、第二離子路徑或第三離子路徑進(jìn)入所述質(zhì)量分析器中。在一些實施方案中，甚至可使用更多的離子路徑。在多個實施方案中，所述第二離子偏轉(zhuǎn)器可用作路徑選擇離子偏轉(zhuǎn)器。向所述路徑選擇離子偏轉(zhuǎn)器施加時間依賴性電壓以在可用的離子路徑中選擇并允許具有預(yù)定質(zhì)量電荷比范圍內(nèi)的質(zhì)量電荷比的離子沿所選的離子路徑傳播。
例如，在運行具有多飛行路徑的TOF質(zhì)量分析器的多個實施方案中，以與第一預(yù)定質(zhì)量電荷比范圍相對應(yīng)的第一預(yù)定時間間隔向所述路徑選擇離子偏轉(zhuǎn)器施加第一預(yù)定電壓，從而導(dǎo)致在第一質(zhì)量電荷比范圍內(nèi)的離子沿所述第一離子路徑傳播。在多個實施方案中，所述第一預(yù)定電壓是零，使得離子繼續(xù)沿原路徑傳播。以與第二預(yù)定質(zhì)量電荷比范圍相對應(yīng)的第二預(yù)定時間范圍向所述路徑選擇離子偏轉(zhuǎn)器施加第二預(yù)定電壓，從而導(dǎo)致在第二質(zhì)量電荷比范圍內(nèi)的離子沿所述第二離子路徑傳播。還可以使用包括第三、第四等其它時間范圍和電壓來容納與特定測量所需的離子路徑一樣多的離子路徑。選擇所述第一預(yù)定電壓的振幅和極性以使離子偏轉(zhuǎn)進(jìn)入所述第一離子路徑中，選擇所述第二預(yù)定電壓的振幅和極性以使離子偏轉(zhuǎn)進(jìn)入所述第二離子路徑中。選擇所述第一時間間隔使之與以下時間相對應(yīng)在此期間內(nèi)在所述第一預(yù)定質(zhì)量電荷比范圍內(nèi)的離子沿所述路徑選擇離子偏轉(zhuǎn)器傳播；選擇所述第二時間間隔使之與以下時間相對應(yīng)在此期間內(nèi)在所述第二預(yù)定質(zhì)量電荷比范圍內(nèi)的離子沿所述路徑選擇離子偏轉(zhuǎn)器傳播。放置第一TOF質(zhì)量分離器以接收沿所述第一離子路徑傳播的在所述第一質(zhì)量電荷比范圍內(nèi)的所述離子組。所述第一TOF質(zhì)量分離器根據(jù)質(zhì)量分離所述第一質(zhì)量電荷比范圍內(nèi)的離子。放置第一檢測器以接收沿所述第一離子路徑傳播的第一組離子。放置第二TOF檢測器以接收所述離子組沿所述第二離子路徑傳播的部分。所述第二TOF質(zhì)量分離器根據(jù)質(zhì)量分離所述第二質(zhì)量電荷比范圍內(nèi)的離子。放置第二檢測器以接收沿所述第二離子路徑傳播的第二組離子。在一些實施方案中，還可放置第三、第四等額外的質(zhì)量分離器和檢測器以接收沿相應(yīng)路徑定向的離子。在一個實施方案中，使用第三路徑丟棄在所述第三預(yù)定質(zhì)量范圍內(nèi)的離子。所述第一和第二質(zhì)量分離器可以是任何類型的質(zhì)量分離器。例如，所述第一和第二質(zhì)量分離器中的至少一種可以包含無場漂移區(qū)、離子加速器、離子裂解器或定時離子選擇器。所述第一和第二質(zhì)量分離器還可包含多個質(zhì)量分離裝置。在一些實施方案中，包括離子反射器并將其放置為接收所述第一組離子，由此提高TOF質(zhì)量分離器對所述第一組離子的分辨能力。在多個實施方案中，包括離子反射器并將其放置為接收所述第二組離子，由此提高TOF質(zhì)量分離器對所述第二組離子的分辨能力。
在本教導(dǎo)的另一方面，可作為通用計算機上計算機可讀指令來執(zhí)行本文中所述方法的功能。所述計算機可以是與質(zhì)譜系統(tǒng)分開的、可拆分的、或者可被整合進(jìn)質(zhì)譜系統(tǒng)。所述計算機可讀指令可以以多種高級語言中的任一種來寫，所述高級語言例如FORTRAN、PASCAL、C、C++或BASIC。此外，所述計算機可讀指令可以以腳本(script)、宏(macro)或嵌入商業(yè)軟件(如EXCEL或VISUAL BASIC)中的函數(shù)來寫。另外，所述計算機可讀指令可以以匯編語言來執(zhí)行，所述匯編語言指向位于計算機上的微處理器。例如，如果配置所述匯編語言以在IBM PC或PC兼容機上運行，則可以以Intel 80x86匯編語言執(zhí)行所述計算機可讀指令。在一個實施方案中，所述計算機可讀指令可以嵌入制造品中，所述制造品包括但不限于計算機可讀程序介質(zhì)，例如軟盤、硬盤、光盤、磁帶、PROM、EPROM、CD-ROM、DVD-ROM。
實施例 根據(jù)以下實施例可進(jìn)一步理解本教導(dǎo)的各方面，所述實施例不是窮舉性的并且也不應(yīng)被視為以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。
實施例1來自不同樣品類型的化合物 以下實施例舉例說明各種樣品類型的應(yīng)用。本實施例的教導(dǎo)并非窮舉性的，并非旨在限制這些實驗或本教導(dǎo)的范圍。
舉例說明了利用本教導(dǎo)的方法對來自各種樣品類型的一種或多種含胺化合物進(jìn)行分析的多個實施方案。在多個實施方案中，所述一種或多種目的含胺化合物可以源自一種或多種不同的樣品類型，例如本實施例中的血漿、酒、蛋白質(zhì)、肽和氨基酸。通常，可處理樣品，使得樣品中的目的化合物包含適于利用同量異位標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記的一個或多個氨基，例如伯胺和仲胺。
參考圖3，在多個實施方案中，對包含在血漿樣品中的一種或多種含胺化合物進(jìn)行標(biāo)記的方案(方框305)包括沉淀所述目的含胺化合物中的一種或多種(步驟325)，然后離心并收集上清液的至少一部分(步驟340)?？衫煤芏喾椒ǔ恋沓瞿康暮坊衔铮龇椒òǖ幌抻?-10％的磺基水楊酸(SSA)溶液、乙醇、異丙醇及其組合。然后將所述上清液的至少一部分與來自一組同量異位標(biāo)簽(例如iTRAQTM品牌試劑)中的一種或多種同量異位標(biāo)簽組合(步驟350)以從所述血漿樣品制備被同量異位標(biāo)記的目的含胺化合物。
在多個實施方案中，對包含在酒樣品中的一種或多種含胺化合物進(jìn)行標(biāo)記的方案(方框310)包括利用7-10％ SSA溶液沉淀所述目的含胺化合物中的一種或多種(步驟330)，然后離心并收集上清液的至少一部分(步驟345)。然后使所述上清液的至少一部分與來自一組同量異位標(biāo)簽(例如iTRAQTM品牌試劑)中的一種或多種同量異位標(biāo)簽相組合(步驟350)以從所述酒樣品制備被同量異位標(biāo)記的目的含胺化合物。
在多個實施方案中，對包含在蛋白質(zhì)、肽或多肽樣品中的一種或多種含胺化合物進(jìn)行標(biāo)記的方案(方框315)包括水解(例如用6摩爾每升(M)的鹽酸(HCl))、消化(例如用胰蛋白酶)或水解并消化樣品的至少一部分(步驟325)(例如以產(chǎn)生肽和/或氨基酸片段)并將所處理的樣品與來自一組同量異位標(biāo)簽(例如iTRAQTM品牌試劑)中的一種或多種同量異位標(biāo)簽相組合(步驟350)以從蛋白質(zhì)、肽或多肽樣品制備被同量異位標(biāo)記的目的含胺化合物。
在多個實施方案中，所述樣品包含氨基酸或氨基酸混合物(方框320)，所述氨基酸混合物中的一種或多種氨基酸包含目的含胺化合物。在多個實施方案中，可將氨基酸樣品與來自一組同量異位標(biāo)簽(例如iTRAQTM品牌試劑)中的一種或多種同量異位標(biāo)簽相組合(步驟350)以從氨基酸樣品制備被同量異位標(biāo)記的目的含胺化合物。在多個實施方案中，利用iTRAQTM品牌試劑，可制備所述被同量異位標(biāo)記的目的含胺化合物，而基本上不改變一種或多種翻譯后修飾。
實施例2樣品制備和利用iTRAQTM品牌試劑的標(biāo)記 以下實施例舉例說明了制備并利用一種或多種同量異位標(biāo)簽(利用iTRAQTM品牌試劑)標(biāo)記含一種或多種蛋白質(zhì)或肽的一種或多種樣品的多個實施方案的實施例。本實施例的教導(dǎo)不是窮舉的，并且不意圖限制這些實驗或本教導(dǎo)的范圍。
蛋白質(zhì)或肽樣品的還原以及半胱氨酸阻斷 參照圖4A，在多個實施方案中，向至少一個至至多4個樣品管(每管含有5～100μg蛋白質(zhì))的每一管中加入20μL溶解緩沖液和1μL變性劑，然后渦旋混合(步驟405)。向每個樣品管中加入2μL還原劑，然后渦旋混合并在60℃孵育1小時(步驟410)。離心每個樣品管，然后向每個樣品管中加入1μL半胱氨酸阻斷劑，然后渦旋混合、離心并在室溫下孵育10分鐘(步驟415)。
利用胰蛋白酶消化蛋白質(zhì)或肽樣品 參考圖4A，在多個實施方案中，在多個實施方案中，其中有至少一個但至多2個的樣品管(每管含有5～100μg還原且半胱氨酸阻斷的待標(biāo)記蛋白質(zhì))，利用25μL

水或其等價物重構(gòu)一管胰蛋白酶。在另一些實施方案中，例如，其中有至少一個但至多4個的樣品管(每管含有5～100μg還原且半胱氨酸阻斷的待標(biāo)記蛋白質(zhì))，利用25μL

水或其等價物重構(gòu)兩管胰蛋白酶。通過渦旋和離心混合每管稀釋后的蛋白酶(步驟420)。
向至少一個但至多4個的樣品管(每管含有5～100μg還原且半胱氨酸阻斷的待標(biāo)記蛋白質(zhì))中的每一管中加入10μL胰蛋白酶溶液。通過渦旋混合每一樣品管，然后離心并在37℃下孵育至少12小時但至多16小時。然后離心每一個樣品管中的樣品消化液(步驟425)。
蛋白質(zhì)或肽樣品的水解 在多個實施方案中，準(zhǔn)備蛋白質(zhì)或肽樣品供水解分析。因此，在多個實施方案中，不使用還原步驟(例如步驟410)和消化步驟(例如步驟420)。參照圖4B，在多個實施方案中，例如利用酸將含有蛋白質(zhì)和/或肽的樣品水解(步驟427)。在現(xiàn)有技術(shù)中有多種多樣的技術(shù)可供用于水解適用于本教導(dǎo)的蛋白質(zhì)和肽。例如可利用強酸水解(例如利用6N鹽酸在100℃下于真空下處理)進(jìn)行水解以產(chǎn)生游離氨基酸。應(yīng)當(dāng)理解，某些水解條件可以將某些酰胺(例如Asn、Gln)轉(zhuǎn)變?yōu)樗鼈兊乃岵⑹沽硪恍┌被岱纸?。因此，在多個實施方案中，可使用強酸水解以外的水解方法。
利用iTRAQTM品牌試劑標(biāo)記氨基酸 參照圖4A和4B，在多個實施方案中，將至少一管iTRAQTM品牌的同量異位試劑但至多4管的不同iTRAQTM品牌同量異位試劑溫?zé)嶂潦覝?，并向每管iTRAQTM品牌同量異位試劑中加入70μL乙醇，然后渦旋混合并離心(步驟430)。每個氨基酸(例如來自消化的蛋白質(zhì)、水解蛋白等)樣品管使用一管iTRAQTM品牌的同量異位試劑。
向一個氨基酸樣品管中加入一管含有在乙醇中的一種iTRAQTM品牌同量異位試劑的內(nèi)容物，然后渦旋混合、離心并在室溫下孵育1小時(步驟435)。在多個實施方案中，在用于測量報告物離子信號之前，將所述每種被標(biāo)記氨基酸的至少一部分進(jìn)行凈化(步驟440)(例如以除去干擾樣品、緩沖液假陽性物等；通過高效液相色譜法(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交換分級分離、陽離子交換、高分辨陽離子交換等，以及它們的組合等方法)。將所凈化的已標(biāo)記氨基酸的至少一部分加載到色譜柱上(步驟445)(例如LC柱、氣相色譜(GC)柱或其組合)。然后將所述色譜柱洗脫物的至少一部分導(dǎo)引至質(zhì)譜儀系統(tǒng)中(步驟450)并測量一種或多種含胺化合物的含胺化合物-報告物離子躍遷信號。在多個實施方案中，未觀察到含胺化合物-報告物離子躍遷信號(步驟455)。在多個實施方案中，在未觀察到含胺化合物-報告物離子躍遷信號的情況下，對于被標(biāo)記氨基酸的樣品而言，重復(fù)所述標(biāo)記氨基酸的步驟(步驟460)。
合并所述被iTRAQTM品牌的同量異位試劑標(biāo)記的氨基酸用于分析 參照圖4A和4B，在多個實施方案中，將每種被標(biāo)記氨基酸樣品管的全部內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到一個新樣品管中以提供合并樣品，將所述合并樣品渦旋混合，然后離心(步驟465)。在用于測量報告物離子信號(步驟475)之前，將所述每種被標(biāo)記、已消化的蛋白質(zhì)的至少一部分進(jìn)行凈化(步驟470)(例如以除去干擾樣品、緩沖液假陽性物等；通過高效液相色譜法(HPLC)、反相(RP)-HPLC、交換分級分離、陽離子交換、高分辨陽離子交換等，以及它們的組合等方法)。將所凈化、已標(biāo)記氨基酸樣品的至少一部分加載到色譜柱上(例如LC柱、氣相色譜(GC)柱或其組合)。然后將所述色譜柱洗脫物的至少一部分導(dǎo)引至質(zhì)譜儀系統(tǒng)中(步驟480)并利用PDITM(例如MRM)測量一種或多種含胺化合物的含胺化合物-報告物離子躍遷信號。然后測定合并樣品中一種或多種目的含胺化合物的濃度(例如相對濃度、絕對濃度或二者皆有)(步驟485)。
實施例3與標(biāo)準(zhǔn)化合物合并 參照圖5，在多個實施方案中，可通過提供一種或多種含胺化合物(包括但不限于肽、多肽、蛋白質(zhì)、氨基酸、硝基呋喃代謝物、多胺和兒茶酚胺)來進(jìn)行一種或多種樣品中的一種或多種含胺化合物的濃度的測定。在多個實施方案中，將被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物(步驟505)(例如來自對照樣品的目的含胺化合物、來自已知濃度樣品的目的含胺化合物等)用作內(nèi)標(biāo)物，并例如與兩種或多種被同量異位標(biāo)記的待分析含胺試驗化合物合并，所述待分析的含胺試驗化合物例如試驗化合物#1(步驟510)、試驗化合物#2(步驟520)和試驗化合物#3(步驟525)。
在多個實施方案中，所述待分析含胺化合物中的兩種或更多種包含同樣的目的含胺化合物。例如，試驗化合物#1、試驗化合物#2和試驗化合物#3可包含同樣的目的含胺化合物(例如賴氨酸)，但是這些試驗化合物可來自三種不同的樣品(例如時間點1、時間點2、時間點3等，以監(jiān)測某些過程如疾病、發(fā)酵等的進(jìn)程)、同一種樣品(例如以在樣品的一次實驗運行中提供三重分析)、或者它們的組合。
測定一種或多種所述含胺化合物的濃度可通過利用來自一組同量異位標(biāo)簽(例如iTRAQTM品牌試劑)中的不同同量異位標(biāo)簽來標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)化合物和每種含胺試驗化合物來進(jìn)行。例如，可利用所述同量異位標(biāo)簽組中的第一同量異位標(biāo)簽來標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)化合物(步驟530)，利用所述同量異位標(biāo)簽組中的第二同量異位標(biāo)簽來標(biāo)記試驗化合物#1(步驟535)，利用所述同量異位標(biāo)簽組中的第三同量異位標(biāo)簽來標(biāo)記試驗化合物#2(步驟540)，利用所述同量異位標(biāo)簽組中的第四同量異位標(biāo)簽來標(biāo)記試驗化合物#3(步驟545)。
在多個實施方案中，將被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的至少一部分以及被同量異位標(biāo)記的試驗化合物的一部分合并(步驟550)以產(chǎn)生合并樣品，并對所述合并樣品的至少一部分進(jìn)行PDITM。
在多個實施方案中，加入被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物可用作所述合并樣品中一種或多種目的含胺化合物的內(nèi)標(biāo)物。在多個實施方案中，針對合并樣品中每種不同的目的含胺化合物加入不同的被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物，每種不同的同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物例如用作不同目的含胺化合物的內(nèi)標(biāo)物。
實施例4含胺化合物濃度的多重測定 以下實施例舉例說明了利用一組iTRAQTM品牌試劑中的同量異位標(biāo)簽對四種多胺的濃度進(jìn)行了多重測定。本實施例的教導(dǎo)不是窮舉性的，并非旨在限制這些實驗或本教導(dǎo)的范圍。
材料和方法 在本實施例的譜圖中，利用API 2000三重四極桿LC/MS/MS系統(tǒng)獲得圖6B至10D的譜圖，利用與配有HILC柱的HPLC系統(tǒng)偶聯(lián)的API 2000三重四極桿儀器獲得圖11至13的譜圖。所述色譜系統(tǒng)包含配有自動進(jìn)樣器、150x2.1mm C18反相柱和柱加熱器的二元梯度HPLC系統(tǒng)。通過將含胺化合物溶于甲醇中然后利用標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記方案使其與iTRAQ試劑反應(yīng)而制備含胺化合物。標(biāo)準(zhǔn)胺得自Fluka。
譜圖 實施例4舉例說明了利用合并樣品測定多種含胺化合物的濃度。圖6A～10D描繪了各含胺化合物的質(zhì)譜圖，既有未標(biāo)記的也有用一組同量異位標(biāo)簽中的同量異位標(biāo)簽標(biāo)記的。在本實施例中，所述同量異位標(biāo)簽是iTRAQTM品牌試劑。圖11和圖13描繪了合并樣品的色譜圖。在本實施例中合并樣品中的目的含胺化合物是1，4-二氨基丁烷(腐胺)、1，5-二氨基戊烷(尸胺)、N1-(3-氨基丙基)-丁烷-1，4-二胺(亞精胺)和1，7-二氨基庚烷。圖12A～12C分別描繪了1，4-二氨基丁烷(腐胺)、1，5-二氨基戊烷(尸胺)和1，7-二氨基庚烷的色譜圖。
參照圖6A～6C，獲得了未標(biāo)記的(602)以及利用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記(604)的腐胺的質(zhì)譜。在本實施例中，利用一組iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽中的114同量異位標(biāo)簽Q114來標(biāo)記腐胺的伯胺。圖6B描繪了利用所述iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的標(biāo)簽Q114標(biāo)記的腐胺的ESI-TOF質(zhì)譜。所觀察到的主峰635對應(yīng)于被標(biāo)記的腐胺(m/z約377)，雖然還觀察到了與被標(biāo)記腐胺-鈉加合物相對應(yīng)的次要峰640(m/z約399)、對應(yīng)于溶劑中所存在低質(zhì)量雜質(zhì)的次要峰630(m/z約375)、610(m/z約245)以及一簇峰615、620、625(在m/z約319至321之間)。
圖6C描繪了被標(biāo)記腐胺進(jìn)行CID的ESI TOF-TOF質(zhì)譜。所觀察到的主峰650對應(yīng)于114同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記腐胺相對應(yīng)的峰670(m/z約377)以及與腐胺結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰660(m/z約233)。
參照圖7A～7C，獲得了未標(biāo)記的(702)以及用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記的(704)尸胺的質(zhì)譜。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的115同量異位標(biāo)簽Q115來標(biāo)記尸胺的伯胺。圖7B描繪了利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q115標(biāo)記的尸胺的ESI-TOF質(zhì)譜。所觀察到的峰730對應(yīng)于被標(biāo)記的尸胺(m/z約391)，雖然還觀察到了與溶劑背景相對應(yīng)的峰710(m/z約102)和725(m/z約248)、以及與iTRAQTM反應(yīng)副產(chǎn)物相對應(yīng)的峰715(m/z約163)和720(m/z約191)。
圖7C描繪了被標(biāo)記尸胺進(jìn)行CID的ESI TOF-TOF質(zhì)譜。所觀察到的主峰740對應(yīng)于115同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記尸胺相對應(yīng)的峰760(m/z約391)以及與尸胺結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰750(m/z約247)。
參照圖8A～8C，獲得了未標(biāo)記802以及用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記804的1，7-二氨基庚烷的質(zhì)譜。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的116同量異位標(biāo)簽Q116來標(biāo)記1，7-二氨基庚烷的伯胺。圖8B描繪了利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q116標(biāo)記的1，2-二氨基庚烷的ESI-TOF質(zhì)譜。所觀察到的峰825對應(yīng)于被標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷(m/z約419)，雖然還觀察到了與溶劑背景相對應(yīng)的峰810(m/z約102)、以及與iTRAQTM反應(yīng)副產(chǎn)物相對應(yīng)的峰815(m/z約163)和820(m/z約191)。
圖8C描繪了被標(biāo)記1，7-二氨基庚烷進(jìn)行CID的ESI TOF-TOF質(zhì)譜。所觀察到的主峰830對應(yīng)于116同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記1，7-二氨基庚烷相對應(yīng)的峰850(m/z約419)以及與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰840(m/z約275)。
參照圖9A～9D，獲得了未標(biāo)記的亞精胺902以及用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記的亞精胺904的質(zhì)譜。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的114同量異位標(biāo)簽Q114來標(biāo)記亞精胺的伯胺。圖9B描繪了利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q114標(biāo)記的亞精胺的ESI-TOF質(zhì)譜。所觀察到的峰925對應(yīng)于被標(biāo)記的亞精胺(m/z約434)，雖然還觀察到了與iTRAQTM反應(yīng)副產(chǎn)物相對應(yīng)的峰908(m/z約163)、916(m/z約217)、918(m/z約245)、930(m/z約458)以及與部分標(biāo)記的仲胺相對應(yīng)的峰935(m/z約578)。
圖9C描繪了被標(biāo)記亞精胺進(jìn)行CID的ESI TOF-TOF質(zhì)譜。所觀察到的主峰945對應(yīng)于114同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記亞精胺相對應(yīng)的峰980(m/z約434)，與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰940(m/z約97)、955(m/z約202)和970(m/z約290)，與iTRAQTM標(biāo)簽相對應(yīng)的峰950(m/z約145)以及與溶劑結(jié)構(gòu)片段相對應(yīng)的峰960(m/z約216)。
圖9D描繪了被標(biāo)記亞精胺進(jìn)行CID的ESI TOF-TOF質(zhì)譜。所觀察到的峰985對應(yīng)于114同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記亞精胺相對應(yīng)的峰995(m/z約434)以及與被標(biāo)記仲胺相對應(yīng)的峰990(m/z約578)。
參照圖10A～10D，獲得了未標(biāo)記的精胺1002以及用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記的精胺1004的質(zhì)譜。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的117同量異位標(biāo)簽Q117來標(biāo)記精胺的伯胺。圖10B描繪了利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q117標(biāo)記的精胺的ESI-TOF質(zhì)譜。所觀察到的峰1035對應(yīng)于被標(biāo)記的精胺(m/z約491)，雖然還觀察到了與溶劑背景相對應(yīng)的峰1008(m/z約177)、1020(m/z約248)和1022(m/z約248)，與iTRAQTM反應(yīng)副產(chǎn)物相對應(yīng)的峰1010(m/z約185)和1012(m/z約191)，以及與利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q114標(biāo)記的亞精胺相對應(yīng)的峰1030(m/z約434)，與標(biāo)準(zhǔn)亞精胺中雜質(zhì)相對應(yīng)的峰1040(m/z約535)、1045(m/z約738)和1050(m/z約754)。
圖10C描繪了被標(biāo)記精胺進(jìn)行CID的ESI TOF-TOF質(zhì)譜。所觀察到的峰1060對應(yīng)于117同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記精胺相對應(yīng)的峰1075(m/z約491)，與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰1055(m/z約100)、1058(m/z約202)和1070(m/z約273)。
圖10D描繪了被標(biāo)記精胺進(jìn)行CID的ESI TOF-TOF質(zhì)譜。所觀察到的峰1080對應(yīng)于117同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記精胺相對應(yīng)的峰1090(m/z約491)，與伯胺上帶有標(biāo)簽的結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰1082(m/z約202)，與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰1085(m/z約273)，以及與完整胺(所有胺均被標(biāo)記)相對應(yīng)的峰1095(m/z約635)。
圖11描繪了合并樣品的色譜圖，描繪了在MRM模式下，在與配有HILC柱的HPLC系統(tǒng)偶聯(lián)的API 2000三重四極桿儀器上分析的1，4-二氨基丁烷(腐胺)的色譜圖1120、1，5-二氨基戊烷(尸胺)的色譜圖1110以及1，7-二氨基庚烷的色譜圖1105。
參照圖12A～C，獲得了在伯胺處利用同量異位標(biāo)簽標(biāo)記的腐胺、尸胺和1，7-二氨基庚烷的色譜圖。圖12A描繪了由圖11中所示LC/MS/MS運行中獲得的利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的114同量異位標(biāo)簽Q114標(biāo)記的腐胺的提取離子色譜圖。所觀察到的峰1205對應(yīng)于被標(biāo)記的腐胺(保留時間約8.9分鐘)。圖12B描繪了由圖11中所示LC/MS/MS運行中獲得的利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的115同量異位標(biāo)簽Q115標(biāo)記的尸胺的提取離子色譜圖。所觀察到的峰1215對應(yīng)于被標(biāo)記的尸胺(保留時間約8.8分鐘)。圖12C描繪了由圖11中所示LC/MS/MS運行中獲得的利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的116同量異位標(biāo)簽Q116標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷的提取離子色譜圖。所觀察到的峰1225對應(yīng)于被標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷(保留時間約8.4分鐘)。
圖13描繪了合并樣品的色譜圖，描繪了1，7-二氨基庚烷1305、尸胺1310和腐胺1320的色譜圖。
參照圖14A～C，獲得了95％乙腈和基質(zhì)氰基-4-羥基肉桂酸的背景O-MALDI質(zhì)譜圖。在同一質(zhì)譜圖中3個質(zhì)量范圍內(nèi)可見的大多數(shù)離子均由溶劑的化學(xué)背景和4-羥基肉桂酸的基質(zhì)離子所產(chǎn)生。
圖15描繪了在95％乙腈(ACN)和氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)中的在伯胺處用同量異位標(biāo)簽標(biāo)記的尸胺、腐胺和1，7-二氨基庚烷的混合物的O-MALDI-TOF質(zhì)譜。所觀察到的峰對應(yīng)于被標(biāo)記腐胺1512(m/z約379)、被標(biāo)記尸胺1520(m/z約391)、被標(biāo)記1，7-二氨基庚烷1525(m/z約419)和被標(biāo)記亞精胺1530(m/z約434)，雖然也觀察到了與標(biāo)準(zhǔn)物中化學(xué)雜質(zhì)相對應(yīng)的峰1502(m/z約359)、1504(m/z約361)、1508(m/z約377)和1515(m/z約380)。
參照圖16A和16B，獲得了未標(biāo)記腐胺1602和用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記的腐胺1604的質(zhì)譜圖。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的114同量異位標(biāo)簽Q114來標(biāo)記腐胺的伯胺。圖16B描繪了對基質(zhì)4-羥基肉桂酸中被標(biāo)記腐胺進(jìn)行CID的O-MALDI-TOF質(zhì)譜圖。所觀察到的主峰1608對應(yīng)于114同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記腐胺相對應(yīng)的峰1640(m/z約377)，與完整標(biāo)簽相對應(yīng)的峰1610(m/z約145)，與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰1615(m/z約172)、1620(m/z約233)、1630(m/z約331)和1635(m/z約359)。
參照圖17A和17B，獲得了未標(biāo)記尸胺1702和用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記的尸胺1704的質(zhì)譜圖。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的115同量異位標(biāo)簽Q115來標(biāo)記尸胺的伯胺。圖17B描繪了在基質(zhì)4-羥基肉桂酸中將利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q115標(biāo)記的尸胺的O-MALDI-TOF質(zhì)譜圖。所觀察到的主峰1708對應(yīng)于115同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記尸胺相對應(yīng)的峰1730(m/z約391)，與完整標(biāo)簽相對應(yīng)的峰1712(m/z約145)，與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰1720(m/z約247)。
參照圖18A和18B，獲得了未標(biāo)記1，7-二氨基庚烷1802和用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷1804的質(zhì)譜圖。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的116同量異位標(biāo)簽Q116來標(biāo)記尸胺的伯胺。圖18B描繪了在基質(zhì)4-羥基肉桂酸中將利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q116標(biāo)記的1，7-二氨基庚烷胺的O-MALDI-TOF質(zhì)譜圖。所觀察到的主峰1815對應(yīng)于116同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記1，7-二氨基庚烷相對應(yīng)的峰1845(m/z約419)、與iTRAQTM標(biāo)簽片段相對應(yīng)的峰1810(m/z約101)、與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰1825(m/z約275)和1835(m/z約381)。
參照圖19A和19B，獲得了未標(biāo)記亞精胺1902和用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記的亞精胺1904的質(zhì)譜圖。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的114同量異位標(biāo)簽Q114來標(biāo)記亞精胺的伯胺。圖19B描繪了在基質(zhì)4-羥基肉桂酸中將利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q114標(biāo)記的亞精胺的O-MALDI-TOF質(zhì)譜圖。所觀察到的主峰1908對應(yīng)于114同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記亞精胺相對應(yīng)的峰1965(m/z約434)，與完整的iTRAQTM標(biāo)簽相對應(yīng)的峰1912(m/z約145)，以及與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰1915(m/z約156)、1918(m/z約175)、1925(m/z約184)，1930(m/z約202)、1935(m/z約220)、1940(m/z約273)、1945(m/z約290)和1960(m/z約414)。
參照圖20A和20B，獲得了未標(biāo)記精胺2002和用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記的精胺2004的質(zhì)譜圖。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的117同量異位標(biāo)簽Q117來標(biāo)記精胺的伯胺。圖20B描繪了在95％乙腈和CHCA中將利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q117標(biāo)記的精胺的O-MALDI-TOF質(zhì)譜圖。所觀察到的主峰2015對應(yīng)于被標(biāo)記精胺(m/z約491)，雖然還觀察到了與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰2008(m/z約379)和2030(m/z約535)。
參照圖21A～C，獲得了未標(biāo)記精胺2102和用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記的精胺2104的質(zhì)譜圖。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的117同量異位標(biāo)簽Q117來標(biāo)記精胺的伯胺。圖21B描繪了在4-羥基肉桂酸基質(zhì)中將利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q117標(biāo)記的精胺的O-MALDI-TOF質(zhì)譜圖。所觀察到的峰2110對應(yīng)于117同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記精胺相對應(yīng)的峰2140(m/z約491)以及與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰2120(m/z約202)、2130(m/z約275)和2135(m/z約473)。
圖21C描繪了在4-羥基肉桂酸基質(zhì)中利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q117標(biāo)記的精胺的O-MALDI-TOF質(zhì)譜圖。所觀察到的峰2150對應(yīng)于117同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記精胺相對應(yīng)的峰2180(m/z約491)以及與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰2160(m/z約202)和2170(m/z約275)。
參照圖22A和22B，獲得了未標(biāo)記精胺2202和用同量異位標(biāo)簽在伯胺處標(biāo)記的精胺2204的質(zhì)譜圖。在本實施例中，利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的117同量異位標(biāo)簽Q117來標(biāo)記精胺的伯胺。圖22B描繪了在4-羥基肉桂酸基質(zhì)中將利用iTRAQTM品牌試劑同量異位標(biāo)簽組中的同量異位標(biāo)簽Q117標(biāo)記的精胺的O-MALDI-TOF質(zhì)譜圖。所觀察到的主峰2210對應(yīng)于117同量異位標(biāo)簽的報告物離子，雖然還觀察到了與被標(biāo)記精胺相對應(yīng)的峰2250(m/z約491)，與結(jié)構(gòu)特異性片段相對應(yīng)的峰2220(m/z約202)、2230(m/z約271)和2235(m/z約273)，以及與選用于裂解的母離子相關(guān)的峰2260(m/z約635)。
圖23描繪了iTRAQTM 115標(biāo)記的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的MRM分析的色譜圖，其包含在蛋白水解物中可見的不同氨基酸2310、2320、2330、2340、2350和2360。
實施例5牛血清蛋白(BSA)樣品 以下實施例舉例說明蛋白質(zhì)樣品中氨基酸濃度的測定，所述蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行水解而產(chǎn)生游離氨基酸。本實施例的教導(dǎo)不是窮舉性的，也并非旨在限定這些實驗或本教導(dǎo)的范圍。
材料和方法 通過標(biāo)準(zhǔn)水解方法制備蛋白質(zhì)或肽水解物。具體而言，利用6NHCl將含有1μg的牛血清樣品在110℃水解17小時。然后將水解后的樣品與緩沖液、異丙醇和iTRAQ品牌試劑混合并使之在室溫下反應(yīng)。然后將樣品干燥并再溶解或直接稀釋到所期望的供分析用濃度(通常每次分析需要0.2μg肽或蛋白質(zhì))?？稍谒夂?或標(biāo)記之前將標(biāo)準(zhǔn)品(即正亮氨酸、正纈氨酸)加入到樣品中以跟蹤實驗過程中樣品的回收率。還在表2中以操作方案的格式提供了有關(guān)樣品標(biāo)記的細(xì)節(jié)。
對于多種樣品而言(至多4種或者如果包括內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)則至多3種)，如上制備每一種樣品并利用不同的iTRAQ試劑(114、115、116或117)標(biāo)記。標(biāo)記反應(yīng)后將被標(biāo)記樣品與不同的試劑混合在一起。對于胺或氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品混合物而言在分開的瓶中進(jìn)行同樣的過程，但標(biāo)記試劑不同?？衫帽粯?biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生外部校正曲線。也可將被標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品與樣品混合，提供每種胺或氨基酸的內(nèi)標(biāo)物(參見圖1)。利用加熱至50℃的C18柱(利用15％碳負(fù)載進(jìn)行全末端封端)進(jìn)行HPLC分離，流速為1ml/分鐘，200μL/分鐘分流進(jìn)入檢測器。梯度、清洗和平衡總共需要20分鐘。
利用HPLC分離隨后在以MRM模式運行的三重四極桿或QTRAP MS/MS系統(tǒng)上進(jìn)行ESI MRM分析而進(jìn)行氨基酸濃度的定量。對于MRM分析而言，MRM躍遷由氨基酸的被標(biāo)記質(zhì)量和針對MS/MS中所用特定試劑而產(chǎn)生的報告物離子片段組成，例如對117試劑來說，利用220.1＞117.1的躍遷監(jiān)測甘氨酸。在本方法中輸入了對所有需監(jiān)測氨基酸而言的MRM躍遷。躍遷之一通常是針對樣品中所添加的內(nèi)標(biāo)物。每種氨基酸的內(nèi)標(biāo)物校正了檢測響應(yīng)和色譜分離方面的任何偏差。利用AnalystTM軟件和專門設(shè)計以支持氨基酸分析的工具進(jìn)行定量。
表2 有關(guān)用于產(chǎn)生本實施例數(shù)據(jù)的樣品處理和LC/MS/MS設(shè)定的進(jìn)一步詳情如下。在加載到LC柱上之前，利用25μL 3％甲酸(含有6皮摩爾/μL用iTRAQ試劑114標(biāo)記的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品)。然后用制造商推薦的方法將5μL的體積注入Applied Biosystems/MDS Sciex API 2000LC/MS/MS儀器中。有關(guān)儀器操作條件的詳情顯示在表3～11中。表3和表4提供了與所述儀器的LC部分相關(guān)的條件，表5～11提供了與所述儀器的MS/MS部分相關(guān)的條件。
表3 LC條件
表4 LC梯度 在本實施例中，在MS/MS數(shù)據(jù)采集中使用了多個時段(時段1-3)，使得并非所有的躍遷都在運行期間被連續(xù)掃描。僅該時段內(nèi)的躍遷才在該時段中被掃描。這能使每個峰有更多的數(shù)據(jù)點，導(dǎo)致了更好的定量。
表5 表6 時段1所傳輸質(zhì)量的參數(shù)表 表7 時段1參數(shù) 表8 時段2所傳輸質(zhì)量的參數(shù)表 表9 時段2參數(shù) 表10 時段3所傳輸質(zhì)量的參數(shù)表 表10 表11 時段3參數(shù) 譜圖和結(jié)果 在本實施例中，測定了20種氨基酸的濃度。表12歸納了針對每種氨基酸(列于第2列中)所得到的數(shù)據(jù)。第3列列出了氨基酸在LC柱上的保留時間，第4列列出了與未知濃度的樣品中氨基酸相關(guān)的峰面積，第5列列出了與氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣品相關(guān)的峰面積，第6列列出了標(biāo)準(zhǔn)樣品中氨基酸的濃度，第7列列出了利用本教導(dǎo)在本實施例中所測的氨基酸的濃度。未知樣品中氨基酸的濃度是通過以下方法測定的與所述未知樣品中氨基酸相關(guān)的峰面積除以與標(biāo)準(zhǔn)樣品相關(guān)的峰面積，并將此比值乘以已知樣品的濃度。
實例圖譜顯示在圖24和25A-25U中。
圖24描繪了iTRAQTM 114標(biāo)記的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和117標(biāo)記的樣品的MRM分析的色譜圖。與圖24中所示不同保留時間相對應(yīng)的氨基酸列于表12中。圖25A-25U示意性地描繪了所測多種氨基酸的MRM數(shù)據(jù)。圖25A-25U中每一幅圖的右側(cè)都描繪了內(nèi)標(biāo)物(IS)114標(biāo)記的氨基酸的離子信號，左側(cè)都描繪了117標(biāo)記的樣品的離子信號。所得出面積的峰被涂了陰影。應(yīng)當(dāng)指出，對于Cya而言，沒有檢測到樣品信號，因此在圖25A的左圖中沒有出現(xiàn)涂陰影的峰。
圖26A-B將所測氨基酸濃度與在Beckman上柱前和柱后衍生的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸分析方法/儀器設(shè)置進(jìn)行了比較。結(jié)果表明這些方法的一致性很好。
圖26A和26B將代表性蛋白質(zhì)水解物樣品與理論值和BeckmanGold系統(tǒng)的結(jié)果進(jìn)行了比較。圖26A比較了每種氨基酸的理論摩爾百分?jǐn)?shù)(最左邊的條柱，針對給定氨基酸)與在Beckman Gold系統(tǒng)上測定的摩爾百分?jǐn)?shù)(中間條柱，針對給定氨基酸)、以及在本實施例中利用LC/MS/MS測定的摩爾百分?jǐn)?shù)(最右邊的條柱，針對給定氨基酸)。圖26B比較了在Beckman Gold系統(tǒng)上運行的蛋白質(zhì)水解物樣品(左邊條柱，針對給定氨基酸)以及在本實施例中利用LC/MS/MS測定(右邊條柱，針對給定氨基酸)的測量值與理論值的偏差。本實施例(LC/MS/MS系統(tǒng))中酪氨酸值較低，是因為未用羥胺對樣品進(jìn)行處理(羥胺可從酪氨酸中除去不想要的第二iTRAQ試劑標(biāo)簽)。
表12 實施例6生物流體樣品 以下實施例舉例說明了生物樣品中游離氨基酸濃度的測定。雖然本實施例的數(shù)據(jù)是基于血漿樣品，但可將本實施例的教導(dǎo)用于其它生物流體，包括但不限于尿。本實施例的教導(dǎo)不是窮舉性的，并非旨在限定這些實驗或本教導(dǎo)的范圍。在本實施例中，監(jiān)測了血漿樣品中的48種游離氨基酸。所監(jiān)測的氨基酸列于表13中。
表13 監(jiān)測血漿中的一種或多種游離氨基酸具有幾種實際用途，包括例如新生兒疾病的檢測和/或監(jiān)測、生物標(biāo)志的檢測等。例如，新生兒中的某些游離氨基酸可以是新生兒代謝性疾病的指征，所述疾病例如甲基丙二酸血癥和丙酸血癥。還在表14中列出了與某些常見氨基酸代謝病相關(guān)的氨基酸升高的實例。
表14 雖然這些代謝性病癥是少見的遺傳病類型，但它們可以對受影響的嬰兒造成嚴(yán)重的后果。如果不加治療，這些病癥可引起不可逆的智力發(fā)育遲緩(從輕度到重度)、身體殘疾、神經(jīng)損傷甚至死亡。對于實現(xiàn)快速有利的治療而言，早期檢測(出生后不久)和準(zhǔn)確診斷非常重要。
材料和方法 對于生物流體(例如血漿、血清、尿)而言，將1份樣品與4份異丙醇或乙醇混合以沉淀樣品中大部分蛋白質(zhì)。向上清液中加入緩沖液以保持標(biāo)記反應(yīng)的堿性pH。然后加入iTRAQ品牌試劑并使之在室溫下反應(yīng)。然后使樣品干燥并再溶解或直接稀釋到所期望的供分析濃度(通常每次分析需要100nL生物流體)。還在表15中以操作方案的形式提供了關(guān)于樣品標(biāo)記的細(xì)節(jié)。
表15 有關(guān)用于產(chǎn)生本實施例數(shù)據(jù)的樣品處理和LC/MS/MS設(shè)置的更多細(xì)節(jié)如下。在加載到LC柱上之前，利用40μL 3％甲酸(含有用iTRAQ試劑117標(biāo)記的10皮摩爾/μL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品)重構(gòu)每種樣品。然后利用制造商推薦的方法，將2μL的體積注入到Applied Biosystems/MDSSciex API 3200 LC/MS/MS儀器中。有關(guān)儀器操作條件的細(xì)節(jié)列于表16-26中。表16和17提供了與儀器的LC部分有關(guān)的條件，表18-26提供了與儀器的MS/MS部分有關(guān)的條件。
表16 LC條件

表17 LC梯度 在本實施例中，在MS/MS數(shù)據(jù)采集中使用了多個時段(時段1-4)，使得并非所有的躍遷都在運行期間被連續(xù)掃描。僅那些在該時段內(nèi)的躍遷才在該階段中被掃描。這使得每個峰可獲得更多數(shù)據(jù)點，從而導(dǎo)致更好的定量。
表18 表19 時段1所傳輸質(zhì)量的參數(shù)表 表20 時段1參數(shù) 表21 時段2所傳輸質(zhì)量的參數(shù)表 表22 時段2參數(shù) 表23 時段3所傳輸質(zhì)量的參數(shù)表 表24 時段3參數(shù) 表25 時段4所傳輸質(zhì)量的參數(shù)表 表26 時段4參數(shù) 譜圖和結(jié)果 在本實施例中，監(jiān)測了48種氨基酸。表27歸納了針對每種所檢測氨基酸所獲得的數(shù)據(jù)。第二列列出了內(nèi)標(biāo)物中氨基酸的量，第三列中列出了添加外標(biāo)物(external standard spike)的量，第四列中列出了樣品中所測氨基酸的水平，第五列中列出了血漿對照范圍。
表27 外標(biāo)物 血漿對照 氨基酸 μM IS μM 樣品(μM)范圍μM VAL 62.1 52.3 59.0 49-69 TYR 22.3 18.7 17.0 13-22 TRP 21.0 0.0 THR 48.5 41.5 42.0 38-48 TAU 19.5 9.1 14.0 SER 31.9 30.7 26.0 23-30 SAR 0.70.6 PSER 0.00.1 PRO 118.9 98.4 44.0 34-52 PHE 19.3 18.1 15.0 12-25 PETN 0.50.6 ORN 33.3 17.8 27.0 MET 7.77.0 6.0 4-7 LYS 262.7 56.0 46.0 39-52 LEU 46.0 35.7 30.0 26-35 ILE 21.3 19.6 14.0 13-18 HYP 2.52.7 1.8 HYL 0.80.6 HIS 22.8 18.9 16.0 0-22 GLY 83.3 70.6 67.0 59-74 GLU 25.3 23.8 20.0 17-25 GLN 150.3 254.8 155.0 GABA 0.60.6 ETN 6.66.3 CYSTA0.50.4 CIT 9.07.1 5.0 CAR 1.21.0 BALA 11.7 15.4 BAIBA1.91.7 ASP 1.92.2 2.4 2-4 ASN 24.2 0.0 13.0 ARG 24.0 12.4 14.0 11-17 ANS 0.80.6 ALA 137.3 136.8 115.098-130 AANB 4.44.0 3.0 AAD 0.50.4 3-MHS2.42.4 1.0 1-MHS1.81.4 3.0 (HCY)2 0.70.7 (CYS)2 13.5 6.2 實施例7兒茶酚胺 本實施例討論了iTRAQ標(biāo)記的兒茶酚胺(CAT)的色譜分離。CAT常常是尿、血漿和CSF(腦脊液)樣品的臨床分析中所感興趣的。進(jìn)行血漿和尿的常規(guī)臨床分析例如以診斷腫瘤(神經(jīng)母細(xì)胞瘤、pheacytochroma等)及其齡期和位置。CAT還常常是神經(jīng)遞質(zhì)并在CSF中被監(jiān)測，例如在制藥工業(yè)中在降壓藥(hypretension drug)的藥物開發(fā)中。
兒茶酚胺及相關(guān)化合物是重要的心血管和代謝效應(yīng)器。測定這些化合物在各種生物流體中的濃度具有臨床和藥物開發(fā)研究上的意義。目前，標(biāo)準(zhǔn)分析方法易于受到各種化學(xué)和色譜干擾。在本發(fā)明中，我們提供了一種使用iTRAQ化學(xué)用于在單次分析中高靈敏度定量兒茶酚胺、其相關(guān)化合物和氨基酸的方法，所述iTRAQ化學(xué)為一組四種胺反應(yīng)活性的、同量異位的多重標(biāo)記試劑。利用LC-MS/MS以MRM(多重反應(yīng)監(jiān)測)模式分析并定量衍生物，這提供了極高的靈敏度和特異性。
在本實施例中，監(jiān)測了CAT組胺、去甲腎上腺素、腎上腺素、間甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺。此外，還監(jiān)測了氨基酸glu和tyr。
材料和方法 制備了兒茶酚胺、其相關(guān)化合物和幾種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)混合物并采用標(biāo)準(zhǔn)方案利用iTRAQ試劑將其標(biāo)記。在1mL/分鐘的流速下，在C18反相柱上利用含有揮發(fā)性離子對試劑的水-乙腈梯度分離衍生物。注入所述衍生化標(biāo)準(zhǔn)品的一系列稀釋液以測定LOD(檢測限)以及各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)公開方案，加入和不加入標(biāo)準(zhǔn)品，制備生物流體樣品(尿、CSF、血漿)、將其標(biāo)記和分析以測定基質(zhì)對方法的靈敏度和準(zhǔn)確度的影響。利用Applied Biosystems/MDS SCIEX API-4000三重四極桿質(zhì)譜在ESI+、MRM模式下分析樣品。
結(jié)果 結(jié)果證明了標(biāo)記和定量以下兒茶酚胺、相關(guān)化合物和氨基酸的可行性多巴(3，4-二羥基-DL-苯丙氨酸)、多巴胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、間甲腎上腺素、去甲變腎上腺素、甲基多巴、3-甲氧基酪胺、5-羥色胺、組胺、ABA(氨基丁酸)、酪氨酸和谷氨酸。提交摘要時的LOD為0.004皮摩爾/uL。各種樣品的線性度范圍為R＝0.9000至0.9998。滿足了準(zhǔn)確性和精密度。針對以下兒茶酚胺異構(gòu)體實現(xiàn)了基線分離多巴(342/117)和間甲腎上腺素(342/117)、以及腎上腺素(328/117)和去甲變腎上腺素(328/117)。
實施例8動態(tài)范圍 圖27A和27B顯示了有關(guān)本教導(dǎo)各實施方案中氨基酸濃度測定的動態(tài)范圍和響應(yīng)的數(shù)據(jù)。圖27A顯示了有關(guān)正纈氨酸的濃度響應(yīng)的數(shù)據(jù)(從約10至約990皮摩爾(pmole))。每次實驗(數(shù)據(jù)點)使用30皮摩爾的內(nèi)標(biāo)物，并重復(fù)注射三次。增加注入LC/MS/MS系統(tǒng)的氨基酸的量，并根據(jù)其響應(yīng)作圖。圖27A表明，響應(yīng)在約3個數(shù)量級的濃度范圍內(nèi)是線性的。
圖27B顯示了有關(guān)亮氨酸的濃度響應(yīng)的數(shù)據(jù)(從約10至約990皮摩爾)。每次實驗(數(shù)據(jù)點)使用30皮摩爾的內(nèi)標(biāo)物，并重復(fù)注射三次。增加注入LC/MS/MS系統(tǒng)的氨基酸的量，并根據(jù)其響應(yīng)作圖。圖29B表明，響應(yīng)在約3個數(shù)量級的濃度范圍內(nèi)是線性的。
實施例9生理流體中甲狀腺素和結(jié)構(gòu)相關(guān)甲狀腺激素的多重絕對和相對定量 以下實施例舉例說明了利用iTRAQ品牌試劑組中的同量異位標(biāo)簽進(jìn)行的甲狀腺素定量的方法。在本實施例的方法中，甲狀腺素可由通式IV表示
其中R1各自獨立地為碘或氫；以及 R2是羧基、羥基或甲基。
甲狀腺素化合物可以是甲狀腺激素，其在血液中的水平例如可以用作疾病診斷和預(yù)后的指征。例如，以下三種甲狀腺素化合物(式(IVa)-(IVc))常用于監(jiān)測疾病狀態(tài)
本實施例舉例說明了利用本教導(dǎo)的各種實施方案分析樣品中甲狀腺素的方法。例如，可提供的所述分析方法包括但不限于 1.利用外標(biāo)校正曲線進(jìn)行樣品中甲狀腺素的絕對定量。例如，可利用iTRAQ品牌試劑組中的114、115或116同量異位標(biāo)簽分別標(biāo)記甲狀腺素，并利用iTRAQ品牌試劑組中的117同量異位標(biāo)簽標(biāo)記的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生外部定標(biāo)。
2.利用如上面(1)中所述的外標(biāo)曲線和內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行樣品中甲狀腺素的絕對定量，所述內(nèi)標(biāo)物由利用iTRAQ品牌試劑組中的117同量異位標(biāo)簽標(biāo)記的甲狀腺素以及向所述待分析樣品中直接加入的被標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品組成。
3.利用外標(biāo)曲線進(jìn)行兩種不同樣品中甲狀腺素的絕對定量。每種甲狀腺素樣品例如可以分別被iTRAQ品牌試劑組中的114、115或116同量異位標(biāo)簽所標(biāo)記。可利用由iTRAQ品牌試劑組中的117同量異位標(biāo)簽標(biāo)記的甲狀腺素標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生所述外標(biāo)曲線。這兩種樣品例如可以相同并進(jìn)行一式兩份處理或者是不同的樣品。
4.利用外標(biāo)曲線和內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行兩種不同樣品中甲狀腺素的絕對定量。甲狀腺素標(biāo)準(zhǔn)品可以用iTRAQ品牌試劑組中的117同量異位標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記并作為內(nèi)標(biāo)物添加到樣品中。所述兩種樣品例如可以相同并進(jìn)行一式兩份處理或者是不同的樣品。
5.利用外部標(biāo)定進(jìn)行三種樣品中甲狀腺素的絕對定量。可利用iTRAQ品牌試劑組中的114、115或116同量異位標(biāo)簽分別標(biāo)記每種甲狀腺素樣品，并利用iTRAQ品牌試劑組中的117同量異位標(biāo)簽標(biāo)記甲狀腺素標(biāo)準(zhǔn)品。這三種樣品例如可以相同并一式三份進(jìn)行處理，這三種樣品中的兩種可以相同并且一式兩份進(jìn)行處理，這三種樣品還可以是兩種或更多種不同的樣品、或是以上的組合。
6.利用外部標(biāo)定和內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行三種樣品中甲狀腺素的絕對定量?？衫胕TRAQ品牌試劑組中的117同量異位標(biāo)簽標(biāo)記甲狀腺素標(biāo)準(zhǔn)品并將其直接加入至樣品中。這三種樣品例如可以相同并一式三份進(jìn)行處理，這三種樣品中的兩種可以相同并且一式兩份進(jìn)行處理，這三種樣品還可以是兩種或更多種不同的樣品、或其組合。
7.利用外標(biāo)曲線進(jìn)行四種樣品中甲狀腺素的絕對定量?？衫胕TRAQ品牌試劑組中的114、115、116或117同量異位標(biāo)簽分別標(biāo)記每種甲狀腺素樣品。這四種樣品例如可以相同并一式四份進(jìn)行處理，這四種樣品中的三種可以相同并且一式三份進(jìn)行處理，這三種樣品中的兩種可以相同并且一式兩份進(jìn)行處理，這四種樣品還可以是兩種或更多種不同的樣品、或其組合。
8.利用iTRAQ品牌試劑組中的114、115、116或117同量異位標(biāo)簽標(biāo)記的至多四種樣品中甲狀腺素的相對定量。這四種樣品例如可以相同并一式四份進(jìn)行處理，這四種樣品中的三種可以相同并且一式三份進(jìn)行處理，這三種樣品中的兩種可以相同并且一式兩份進(jìn)行處理，這四種樣品還可以是兩種或更多種不同的樣品、或其組合。
材料和方法 可使用以下材料測定生理流體中甲狀腺素(IVa)的絕對定量甲狀腺素標(biāo)準(zhǔn)品、iTRAQ品牌試劑組中的1～4種同量異位標(biāo)簽、配有自動進(jìn)樣器和柱加熱器的二元HPLC系統(tǒng)、150 x 2.1mm C18反相柱、基于三重四極桿或Q Trap技術(shù)的LC/MS/MS系統(tǒng)。
將甲狀腺素標(biāo)準(zhǔn)品樣品溶解在堿性緩沖液(0.5M碳酸氫三乙基銨或硼酸鈉，pH 8.5)中，向其中加入溶解在乙醇中的iTRAQ品牌試劑組中的同量異位標(biāo)簽中的一種(例如117同量異位標(biāo)簽)。將目的樣品加入到所述堿性緩沖液中并向樣品中加入iTRAQ品牌試劑組中的不同的同量異位標(biāo)簽(例如114、115或116同量異位標(biāo)簽)。根據(jù)樣品中總胺含量使用過量約3～5倍的iTRAQ品牌試劑。使兩種樣品均在室溫下與各自的iTRAQ試劑反應(yīng)30分鐘，然后稀釋到合適的溶劑(例如0.1％甲酸+10mM甲磺酸或10mM磺酸氫鈉)中并進(jìn)行PDITM(例如MRM分析)。
可提供樣品的絕對定量，例如通過利用外標(biāo)物產(chǎn)生校正曲線，例如使用117同量異位標(biāo)簽標(biāo)記過的標(biāo)準(zhǔn)品，用117同量異位標(biāo)簽標(biāo)記過的標(biāo)準(zhǔn)樣品加入到目的樣品中以產(chǎn)生內(nèi)標(biāo)物，或者二者同時使用。
LC-MRM分析 如本文中所述，可使用各種各樣的儀器。例如，在多個實施方案中，實驗裝備包括二元HPLC泵、自動進(jìn)樣器、柱加熱器和C18柱。在200ul/ml的流速下于梯度條件下操作HPLC以實現(xiàn)甲狀腺素及其衍生物的基線分離。使HPLC與MRM模式下的三重四極桿或線性離子阱質(zhì)譜儀連接，以提供樣品中甲狀腺素的PDTIM和定量。
本申請中所引用的全部文獻(xiàn)和類似材料(包括但不限于專利、專利申請、文章、書籍、文集和網(wǎng)頁)，不論這些文獻(xiàn)和類似材料的格式如何，均明確通過引用全文并入本文中。在所并入的文獻(xiàn)和類似材料中的一篇或多篇與本申請(包括但不限于所定義的術(shù)語、術(shù)語用法、所描述的技術(shù)等)不同或矛盾的情況下，以本申請為準(zhǔn)。
本文中使用的各部分標(biāo)題僅出于語言組織的目的，而不應(yīng)看作是以任何方式限制本申請的主題。
雖然已結(jié)合多個實施方案和實施例對本教導(dǎo)進(jìn)行了描述，但并不意味著將本教導(dǎo)限制在這些實施方案或?qū)嵤├?。相反，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，本教導(dǎo)包含了各種替代方案、修改和等同方案。
雖然已參考具體的示例性實施方案對本教導(dǎo)進(jìn)行了具體展示和描述，但應(yīng)當(dāng)理解，可做出形式和細(xì)節(jié)上的各種變化而不背離本教導(dǎo)的精神和范圍。例如，根據(jù)本發(fā)明的多個實施方案，可將任何所公開步驟與任何其它所公開步驟組合而提供一種分析含胺化合物的方法。因此，要求保護(hù)在本教導(dǎo)范圍和精神內(nèi)的所有實施方案及其等同方案。除非具體指出，本教導(dǎo)的方法、系統(tǒng)和測試的描述和圖表不應(yīng)視為是對所述要素次序的限定。
權(quán)利要求
1.一種用于分析一種或多種樣品中的一種或多種甲狀腺素化合物的方法，其中所述甲狀腺素化合物可由通式(IV)表示
其中每個R1獨立地為碘或氫；并且
R2是羧基、羥基或甲基；
所述方法包括以下步驟
提供包含甲狀腺素的標(biāo)準(zhǔn)化合物；
利用一組同量異位標(biāo)簽中的同量異位標(biāo)簽標(biāo)記所述標(biāo)準(zhǔn)化合物；
利用所述同量異位標(biāo)簽組中的不同同量異位標(biāo)簽各自標(biāo)記一種或多種甲狀腺素化合物；
合并所述被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的至少一部分與每種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的至少一部分以產(chǎn)生合并樣品；
將所述合并樣品的至少一部分加載到色譜柱上；
對所述色譜柱洗脫物的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測，其中，
第一所傳輸母離子的m/z范圍包括一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的m/z值，第一所傳輸子離子的m/z范圍包括與所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的至少一種同量異位標(biāo)簽相對應(yīng)的至少一種報告物離子的m/z值；以及
第二所傳輸母離子的m/z范圍包括一種或被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的m/z值，第二所傳輸子離子的m/z范圍包括與所述被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的同量異位標(biāo)簽相對應(yīng)的報告物離子的m/z值；
測量一種或多種所述所傳輸報告物離子的離子信號；以及
至少基于所述相應(yīng)的報告物離子的所測離子信號與和所述被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物相對應(yīng)的報告物離子的所測離子信號的比較，測定一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的濃度。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲狀腺素化合物中的一種或多種由通式(IVa)表示
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲狀腺素化合物中的一種或多種由通式(IVb)表示
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述甲狀腺素化合物中的一種或多種由通式(IVc)表示
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述樣品中的一種或多種包含生理流體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述一種或多種甲狀腺素化合物包含來自兩種或更多種樣品中的基本上相同的甲狀腺素化合物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述對所述色譜柱洗脫物的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測的步驟包括使用三重四極桿、四極桿/飛行時間質(zhì)譜儀、線性離子阱質(zhì)譜儀或串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀中的一種或多種。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述對所述色譜柱洗脫物的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測的步驟包括在基質(zhì)中混合所述合并樣品并利用基質(zhì)輔助激光解吸電離來產(chǎn)生用于所述母離子-子離子躍遷監(jiān)測的離子。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述測定一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的濃度之步驟包括測定一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的絕對濃度。
10.一種用于分析一種或多種樣品中的一種或多種甲狀腺素化合物的方法，其中所述甲狀腺素化合物可由通式(IV)表示
其中每個R1獨立地為碘或氫；并且
R2是羧基、羥基或甲基；
所述方法包括以下步驟
利用一組同量異位標(biāo)簽中的不同同量異位標(biāo)簽各自標(biāo)記一種或多種甲狀腺素化合物；
合并每種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的至少一部分以產(chǎn)生合并樣品；
將所述合并樣品的至少一部分加載到色譜柱上；
對所述色譜柱洗脫物的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測，其中，所傳輸母離子的m/z范圍包括一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的m/z值，所傳輸子離子的m/z范圍包括與所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的同量異位標(biāo)簽中的至少一種相對應(yīng)的至少一種報告物離子的m/z值；以及
測量一種或多種所述所傳輸報告物離子的離子信號；以及
至少基于所述相應(yīng)的報告物離子的所測離子信號與標(biāo)準(zhǔn)化合物的濃度曲線的比較，測定一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的濃度。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述標(biāo)準(zhǔn)化合物的濃度曲線通過以下步驟產(chǎn)生
(a)提供包含甲狀腺素化合物并具有第一濃度的標(biāo)準(zhǔn)化合物；
(b)利用來自一組同量異位標(biāo)簽中的同量異位標(biāo)簽來標(biāo)記所述標(biāo)準(zhǔn)化合物；
(c)將所述被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的至少一部分加載到色譜柱上；
(d)對所述色譜柱洗脫物的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測，其中所傳輸母離子的m/z范圍包括所述被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的m/z值，所傳輸子離子的m/z范圍包括與所述被同量異位標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)化合物的同量異位標(biāo)簽相對應(yīng)的報告物離子的m/z值；
(e)測量所傳輸報告物離子的離子信號；
(f)針對一個或多個不同的標(biāo)準(zhǔn)化合物濃度，重復(fù)步驟(a)～(e)；以及
(g)至少基于在兩個或更多個標(biāo)準(zhǔn)化合物濃度下所傳輸報告物離子的所測離子信號來產(chǎn)生所述標(biāo)準(zhǔn)化合物的濃度曲線。
12.權(quán)利要求10的方法，其中所述測定一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的濃度之步驟包括測定一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的絕對濃度。
13.權(quán)利要求10的方法，其中所述甲狀腺素化合物中的一種或多種由通式(IVa)表示
14.權(quán)利要求10的方法，其中所述甲狀腺素化合物中的一種或多種由通式(IVb)表示
15.權(quán)利要求10的方法，其中所述甲狀腺素化合物中的一種或多種由通式(IVc)表示
16.一種用于分析一種或多種樣品中的一種或多種甲狀腺素化合物的方法，其中所述甲狀腺素化合物可由通式(IV)表示
其中每個R1獨立地為碘或氫；并且
R2是羧基、羥基或甲基；
所述方法包括以下步驟
利用一組同量異位標(biāo)簽中的不同同量異位標(biāo)簽各自標(biāo)記一種或多種甲狀腺素化合物；
合并每種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的至少一部分以產(chǎn)生合并樣品；
利用基質(zhì)輔助激光解吸電離對所述合并樣品的至少一部分進(jìn)行母離子-子離子躍遷監(jiān)測，其中，第一所傳輸母離子的m/z范圍包括一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的m/z值，第一所傳輸子離子的m/z范圍包括與所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的同量異位標(biāo)簽中的至少一種相對應(yīng)的至少一種報告物離子的m/z值；以及
測量一種或多種所述所傳輸報告物離子的離子信號；以及
至少基于所述相應(yīng)報告物離子的所測離子信號與包含甲狀腺素化合物的標(biāo)準(zhǔn)化合物的所測離子信號的比較，測定一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的濃度。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述甲狀腺素化合物中的一種或多種由通式(IVa)表示
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述甲狀腺素化合物中的一種或多種由通式(IVb)表示
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述甲狀腺素化合物中的一種或多種由通式(IVc)表示
全文摘要
本教導(dǎo)提供了利用同量異位標(biāo)簽和母離子-子離子躍遷監(jiān)測(PDITM)來分析一種或多種樣品中的一種或多種甲狀腺素化合物的方法。在多種實施方案中，所述方法包括以下步驟(a)利用來自一組同量異位標(biāo)簽的不同同量異位標(biāo)簽來標(biāo)記一種或多種甲狀腺素化合物，每種同量異位標(biāo)簽包含報告物離子部分；(b)合并每種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的至少一部分以產(chǎn)生合并樣品；(c)使所述合并樣品的至少一部分經(jīng)受PDITM；(d)測量一種或多種所傳輸報告物離子的離子信號；以及(e)至少基于相應(yīng)的報告物離子的所測離子信號與標(biāo)準(zhǔn)化合物的一個或多個所測離子信號的比較，測定一種或多種所述被同量異位標(biāo)記的甲狀腺素化合物的濃度。
文檔編號G01N33/74GK101611321SQ200780037607
公開日2009年12月23日 申請日期2007年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年8月8日
發(fā)明者蘇巴西什·普爾卡亞斯塔 申請人:阿普里拉股份有限公司