專利名稱：：基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的新型毒性分析方法基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞的新型毒性分析方法
背景技術(shù)：
：人類胚泡來(lái)源的干(hBS)細(xì)胞具有分化成所有三種胚層的衍生物的獨(dú)特能力。這種特點(diǎn)使得它們?cè)诙纠韺W(xué)領(lǐng)域中成為特殊的工具，因?yàn)樗鼈兛梢宰鳛楣δ苄约?xì)胞的"細(xì)胞工廠"(MoonSY等，MolTher13(1):5-14,2006)。此外，在hBS細(xì)胞分化過(guò)程中相互作用的化合物的效應(yīng)可以被檢測(cè)，使得它們?cè)诎l(fā)育毒理學(xué)領(lǐng)域中特別具有價(jià)值。由于新的歐洲化學(xué)品政策(EuropeanChemicalsPolicy)(REACH)將在2007年生效，對(duì)于每年生產(chǎn)量或進(jìn)口量超過(guò)1噸的3萬(wàn)種以上的化學(xué)物質(zhì)來(lái)說(shuō)，需要它們的毒理學(xué)信息(Anon,2007)。因此，將可能額外使用大約390萬(wàn)只試驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)工業(yè)界來(lái)說(shuō)，花費(fèi)估計(jì)為大約15億歐元，其中僅用于發(fā)育毒性研究的就占32%(RPA,2002)。因此，對(duì)于體外發(fā)育毒性測(cè)試有緊迫的需求。此外，制藥工業(yè)面臨著高通量體外毒性測(cè)試的需求，因?yàn)樵陂_(kāi)發(fā)階段，新型藥物候選物的可靠毒理學(xué)數(shù)據(jù)必須盡可能早地產(chǎn)生。由于引入早期體外毒性篩選而使高的損耗率降低，將在經(jīng)濟(jì)方面減少相關(guān)的花費(fèi)。此外，已知有大量物質(zhì)表現(xiàn)出顯著的種間差異，在人類中導(dǎo)致嚴(yán)重的畸變，但是在大鼠或小鼠中不明顯，例如用于治療嚴(yán)重痤瘡的13-順式視黃酸(異維甲酸)(Accutane,Roche)以及鎮(zhèn)靜劑和抗炎性藥物沙利度胺(Contergan)(Gilbert,2003)。因此，需要人類相關(guān)的發(fā)育毒性測(cè)試。到目前為止，最有希望的體外胚胎毒性測(cè)試之一是被批準(zhǔn)的胚胎干細(xì)胞測(cè)試(EST)，它使用了鼠類胚胎干(mES)細(xì)胞來(lái)評(píng)估化學(xué)物質(zhì)的胚胎毒性潛力。EST考慮到了mES細(xì)胞和鼠類成纖維細(xì)胞對(duì)胚胎毒性物質(zhì)的不同敏感性。此外，mES細(xì)胞分化成功能性心肌細(xì)胞用作毒理學(xué)終點(diǎn)(Genschow,2004)。但是，EST的目的仍然在于在動(dòng)物系統(tǒng)中預(yù)測(cè)人類毒性。在發(fā)育毒性測(cè)試中使用人類胚胎干細(xì)胞可以提供可靠的，與人類相關(guān)的數(shù)據(jù)，增加了現(xiàn)有的毒性測(cè)試的價(jià)值，可用于藥物和化學(xué)物質(zhì)的安全性評(píng)估。但是，在毒性測(cè)試中使用hBS細(xì)胞是一種挑戰(zhàn)，因?yàn)檫@些細(xì)胞需要復(fù)雜的操作技術(shù)。例如，hBS細(xì)胞需要以細(xì)胞聚集物而不是單一種細(xì)胞的形式接種以確保生長(zhǎng)，并顯示出可變的與表面結(jié)合的能力，從而導(dǎo)致了高的差異。此外，hBS細(xì)胞的群體倍增時(shí)間是36小時(shí)，明顯長(zhǎng)于mES細(xì)胞的12小時(shí)。小鼠和人類BS細(xì)胞的另一個(gè)重要的差別是它們的培養(yǎng)條件。為了將mES細(xì)胞維持在未分化狀態(tài)，在培養(yǎng)基中加入白血病抑制因子(LIF)就足夠了。但是對(duì)于hBSC細(xì)胞株來(lái)說(shuō)，將它們培養(yǎng)在小鼠或人類飼養(yǎng)層上，顯示出是將細(xì)胞穩(wěn)定地維持在未分化狀態(tài)的最可靠的方法。正在進(jìn)行大量的工作以發(fā)現(xiàn)不需飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)，但這些研究都處于開(kāi)發(fā)的早期階段(Stacey等，2006)。本發(fā)明闡述了基于hBS細(xì)胞的毒性分析方法，用于預(yù)測(cè)人類毒性，例如發(fā)育毒性和細(xì)胞毒性。本發(fā)明顯示出了明顯超過(guò)mES的優(yōu)點(diǎn)，能夠提供與人類相關(guān)的數(shù)據(jù)，有助于鑒定人類致畸原，這些致畸原中的一些已知顯示出種間差異，例如13-順式視黃酸。這樣的毒性測(cè)試具有成為檢測(cè)與人類相關(guān)的發(fā)育毒性物質(zhì)的測(cè)試策略的一部分的潛力。發(fā)明描述定H終"分析方法"或"多個(gè)分析方法"用于描述所進(jìn)行的在基因，蛋白或功能水平上測(cè)量細(xì)胞毒性和/或發(fā)育毒性的體外測(cè)試。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"胚泡來(lái)源的干細(xì)胞"是指BS細(xì)胞，其人類形式被稱為"hBS細(xì)胞"或"hBSC"。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"祖細(xì)胞"或"祖細(xì)胞類型的細(xì)胞"是指任何源自于hBS細(xì)胞的，處于未分化的hBS細(xì)胞和完全分化的細(xì)胞之間任何分化階段的細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)"飼養(yǎng)細(xì)胞"或"詞養(yǎng)物"是指一種類型的細(xì)胞，它與另一種類型的細(xì)胞共培養(yǎng)，以提供使第二種類型的細(xì)胞能夠生長(zhǎng)的環(huán)境。詞養(yǎng)細(xì)胞任選地可以來(lái)自與它們支持的細(xì)胞不同的物種。典型情況下，飼養(yǎng)細(xì)胞在與其它細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可以通過(guò)輻照或用抗有絲分裂劑例如絲裂霉素C處理進(jìn)行失活，以防止它們長(zhǎng)得比它們所支持的細(xì)胞快。不受上面描述的限制，這樣的飼養(yǎng)細(xì)胞的一種具體類型可以是人類詞養(yǎng)細(xì)胞，例如人類皮膚成纖維細(xì)胞，在本文中稱為hFF。在本發(fā)明的上下中，hFF也是成體(adult)細(xì)胞類型的例子。另一種飼養(yǎng)細(xì)胞類型可以是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mEF)。對(duì)術(shù)語(yǔ)"物質(zhì)"的解釋不打算限于治療藥劑(或潛在的治療藥劑)，或被證明具有毒性效應(yīng)的試劑例如神經(jīng)毒素，肝臟毒素，造血細(xì)胞毒素，肌肉毒素，致癌物，致畸物或針對(duì)一種或多種生殖器官的毒素。術(shù)語(yǔ)物質(zhì)還可以是化學(xué)組合物，例如農(nóng)業(yè)化學(xué)物例如農(nóng)藥，殺真菌劑，肥料，或者也可以是在化妝品中使用的成分。本文文本中的術(shù)語(yǔ)"IC50"表示測(cè)試物質(zhì)在體外導(dǎo)致50%的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞死亡時(shí)的濃度。"效率"或"有效的"，如果沒(méi)有特別定義，在本文的分析方法的語(yǔ)境中是指與現(xiàn)有技術(shù)中描述的方法或分析方法，例如基于小鼠胚胎干細(xì)胞或小鼠癌細(xì)胞的分析方法相比，所述分析方法更可能檢測(cè)到在人類中有毒性的物質(zhì)，和/或毒性濃度，例如可用時(shí)，所分析的相應(yīng)的IC50值更接近已知人類體內(nèi)數(shù)據(jù)。發(fā)剪銜述本發(fā)明涉及用于在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)毒性的，基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠?qū)ξ镔|(zhì)的毒性進(jìn)行新型檢測(cè)，和/或與非人類分析方法或基于成體人類細(xì)胞類型的分析方法相比能夠更有效地檢測(cè)毒性。本發(fā)明還涉及用于在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)毒性的，基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的人類祖細(xì)胞的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠?qū)ξ镔|(zhì)的毒性進(jìn)行新型檢測(cè)，和/或與非人類分析方法或基于成體人類細(xì)胞類型的分析方法相比能夠更有效地檢測(cè)毒性。本發(fā)明的另一方面是用于在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)毒性的，包含了選自人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞，人類祖細(xì)胞和人類成體類細(xì)胞中的至少兩種人類細(xì)胞類型，例如至少三種，至少四種，至少五種人類細(xì)胞類型的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠?qū)ξ镔|(zhì)的毒性進(jìn)行新型檢測(cè)，和/或與非人類分析方法或基于成體人類細(xì)胞類型的分析方法相比，能夠更有效地檢測(cè)毒性。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的分析方法可以預(yù)測(cè)分化毒性例如，對(duì)胚胎細(xì)胞比對(duì)成體細(xì)胞更高程度的毒性。本發(fā)明的另一方面是用于在人種中檢測(cè)毒性的，基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的體外毒性分析方法，該分析方法與非人類分析方法相比，更有效地預(yù)測(cè)人類毒性，例如13-順式視黃酸(13CRA)的胚胎毒性。本發(fā)明的另一方面是用于在人種中檢測(cè)毒性的，基于從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的人類祖細(xì)胞，例如人類胚泡干細(xì)胞衍生的間充質(zhì)祖細(xì)胞(hBS-MPs)的體外毒性分析方法，該分析方法與成體人類細(xì)胞例如hEF相比，更有效地預(yù)測(cè)全反式視黃酸(ATRA)的人類毒性。本發(fā)明還涉及通過(guò)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法/分析方法，該方法包括下列步驟.-(i)將細(xì)胞接種在多孔板中(ii)將接種的細(xì)胞暴露于一種或多種濃度的一種/或多種物質(zhì)(iii)分析細(xì)胞毒性和/或胚胎毒性終點(diǎn)。(iv)任選地，與已知的體內(nèi)毒性數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還涉及通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)人類祖細(xì)胞群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的其它的方法，該方法包括下列步驟(i)將細(xì)胞接種在多孔板中(ii)將接種的細(xì)胞暴露于一種或多種濃度的一種/或多種物質(zhì)(iii)分析細(xì)胞毒性和/或胚胎毒性終點(diǎn)。(W)任選地，與己知的體內(nèi)毒性數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還涉及通過(guò)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法/分析方法，該方法包括下列步驟(i)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞接種到一個(gè)或多個(gè)多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔中(ii)將成熟的人類細(xì)胞類型接種到(i)中多孔板的不同的孔中或接種到一個(gè)或多個(gè)不同板的一個(gè)或多個(gè)孔中(iii)任選地，將一個(gè)或多個(gè)從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的祖細(xì)胞群接種到(i)和/或(ii)中的多孔板的不同的孔中，和/或接種到一個(gè)或多個(gè)不同的多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔中，條件是接種的密度使得細(xì)胞基本上維持其增殖能力，直到對(duì)暴露于細(xì)胞的一種或多種物質(zhì)的一種或多種效應(yīng)進(jìn)行測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)。本發(fā)明還涉及通過(guò)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法/分析方法，該方法包括下列步驟(i)將從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的一個(gè)或多個(gè)祖細(xì)胞群各接種到一個(gè)或多個(gè)多孔板中(ii)將成熟的人類細(xì)胞類型接種到(i)中多孔板的不同的孔中或接種到一個(gè)或多個(gè)不同的板中條件是接種的密度使得細(xì)胞能夠基本上維持其增殖能力，直到對(duì)暴露于細(xì)胞的一種或多種物質(zhì)的一種或多種效應(yīng)進(jìn)行測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)。本發(fā)明還涉及通過(guò)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法/分析方法，該方法包括下列步驟(i)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞接種到一個(gè)或多個(gè)多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔中(ii)將從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的一個(gè)或多個(gè)祖細(xì)胞群各接種到(i)中的一個(gè)或多個(gè)多孔板中，或接種到一個(gè)或多個(gè)不同的板中條件是接種的密度使得細(xì)胞基本上維持其增殖能力，直到對(duì)暴露于細(xì)胞的一種或多種物質(zhì)的一種或多種效應(yīng)進(jìn)行測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)。發(fā)窮拔述人類胚泡干細(xì)胞為發(fā)育毒性測(cè)試提供了獨(dú)一無(wú)二的工具，因此，按照本發(fā)明，我們開(kāi)發(fā)了基于hBS細(xì)胞的發(fā)育毒性測(cè)試，例如發(fā)育毒性分析方法和細(xì)胞毒性分析方法。作為概念的驗(yàn)證，使用了代表三種不同的發(fā)育成熟程度的多能hBS細(xì)胞，hBS細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)祖細(xì)胞(hBSMPs)和人類包皮成纖維細(xì)胞(hFFs)，開(kāi)發(fā)了帶有終點(diǎn)存活性的毒性分析方法。使用兩種不同的存活性分析方法，即ATP含量和刃天青(resazurin)(RES)還原，測(cè)試了一組具有眾所周知的體內(nèi)數(shù)據(jù)的發(fā)育毒性物質(zhì)，即全反式視黃酸(ATRA)和13-順式視黃酸(13CRA)。此夕卜，5-氟尿嘧啶(5-FU)被用作陽(yáng)性對(duì)照，鄰磺酰苯酰亞胺(Saccharin)(糖精)被用作陰性對(duì)照。類視色素例如ATRA和13CRA主要用于治療癌癥和皮膚病例如痤瘡或牛皮癬。類視色素誘導(dǎo)的畸形的特征性形式包括顱面結(jié)構(gòu)，包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)，肢體，胸腺和中軸骨骼的缺陷(Ross等，2000)。盡管ATRA和13CRA在人類中都是強(qiáng)致畸物，但它們?cè)谑箢愊到y(tǒng)中的致畸能力是不同的(Nau等，2001)。與ATRA相比，13CRA在小鼠體內(nèi)顯示出低得多的致畸能力，在鼠類畸胎癌(P19)細(xì)胞中顯示出較低的體外分化誘導(dǎo)能力(Adler等，2005;Soprano和Soprano1995)。因此，這些結(jié)構(gòu)相關(guān)的物質(zhì)被選擇用于挑戰(zhàn)我們的測(cè)試系統(tǒng)?？拱┌Y藥物5-FU在體內(nèi)和體外都是發(fā)育毒性物質(zhì)(Jacob等，1986)，關(guān)于人類中5-FU相關(guān)的出生缺陷也有獨(dú)立的報(bào)道(Stephens等，1980)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及基于hBS細(xì)胞，hBS細(xì)胞衍生的祖細(xì)胞和/或人類包皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)試，這些細(xì)胞代表了來(lái)自不同分化水平的細(xì)胞或其組合。該基于細(xì)胞毒性作為終點(diǎn)的測(cè)試有效檢測(cè)某些人類發(fā)育毒性物質(zhì)，包括全反式視黃酸(ATRA)和13-順式視黃酸(13CRA)。這些物質(zhì)在未分化的胚泡來(lái)源的干細(xì)胞和祖細(xì)胞中顯示出較低的IC50值，相比而言在成體人類細(xì)胞中該值較高。本發(fā)明還涉及用于在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)毒性的基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的體外毒性分析方法。該分析方法能夠?qū)ξ镔|(zhì)的毒性，特別是物質(zhì)對(duì)胚胎細(xì)胞或正在發(fā)育的細(xì)胞的毒性進(jìn)行新型檢測(cè)，和/或與非人類分析方法或基于成體人類細(xì)胞類型的分析方法相比，更有效地在人類中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)毒性。本發(fā)明還涉及用于在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)毒性的，基于從胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的人類祖細(xì)胞的體外毒性分析方法，其中該分析方法能夠?qū)ξ镔|(zhì)的毒性進(jìn)行新型檢測(cè)，和/或與非人類分析方法或基于成體人類細(xì)胞類型的分析方法相比，能夠更有效地檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)在人類中的毒性。本發(fā)明的祖細(xì)胞可以是介于hBS細(xì)胞和完全分化的細(xì)胞之間的任一祖細(xì)胞。本發(fā)明中的適合的祖細(xì)胞可以是中胚層，內(nèi)胚層或外胚層細(xì)胞類型。祖細(xì)胞還可以是間充質(zhì)祖細(xì)胞，成纖維細(xì)胞類祖細(xì)胞，心臟祖細(xì)胞，肝祖細(xì)胞，胰祖細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，祖細(xì)胞是人類胚泡干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)祖細(xì)胞(hBS-MPs)。IC50值的比較顯示出，hBS細(xì)胞和hBS來(lái)源的祖細(xì)胞與成體的成熟細(xì)胞類型例如hFF細(xì)胞相比，對(duì)毒性物質(zhì)例如5-FU，ATRA和13CRA更敏感(參見(jiàn)圖3和4)。祖細(xì)胞代表了容易被培養(yǎng)的hBS來(lái)源的細(xì)胞類型，能夠通過(guò)酶法傳代進(jìn)行較大規(guī)模的培養(yǎng)，同時(shí)仍然維持對(duì)有毒物質(zhì)的較高的敏感性。本發(fā)明還涉及含有至少兩種人類細(xì)胞類型，例如至少三種，至少四種，至少五種人類細(xì)胞類型的分析方法。這些人類細(xì)胞類型可以選自hBS細(xì)胞，祖細(xì)胞和成體類細(xì)胞。成體類細(xì)胞可以源自于不同的人類組織，例如皮膚和肌肉。成體類細(xì)胞也可以源自于不同的發(fā)育階段，例如新生兒或成人。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所用的成體類細(xì)胞是來(lái)自新生男嬰的人類包皮成纖維細(xì)胞。本發(fā)明還涉及體外毒性分析方法，其中非人種的分析可以是任何非人類哺乳動(dòng)物來(lái)源的分析，例如小鼠，大鼠或豬的分析。小鼠分析又可以舉例如基于小鼠胚胎千細(xì)胞的分析或基于小鼠畸胎瘤細(xì)胞的分析。作為本申請(qǐng)的參考系統(tǒng)的非人類分析方法，也可以是體內(nèi)分析方法。這樣的體內(nèi)分析方法可以是例如小鼠，大鼠，兔，豬或狗的動(dòng)物模型。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及用于在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)毒性的，基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的體外毒性分析方法，其中分析方法能夠?qū)ξ镔|(zhì)的毒性進(jìn)行新型檢測(cè)，和/或與非人類分析方法相比，能夠更有效地檢測(cè)毒性，例如效率高至少50%，至少75%以上，或至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少30倍，至少50倍，至少75倍，至少100倍。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，體外毒性分析方法與基于小鼠畸胎瘤細(xì)胞的非人類分析方法相比，檢測(cè)毒性的效率高123倍。同樣地，本發(fā)明涉及用于在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)毒性的，基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的體外毒性分析方法，其中分析方法能夠?qū)ξ镔|(zhì)的毒性進(jìn)行新型檢測(cè)，和/或更有效地檢測(cè)毒性，例如當(dāng)比較hBS細(xì)胞和祖細(xì)胞時(shí)，檢測(cè)毒性，特別是對(duì)胚胎細(xì)胞的毒性的效率高至少1.5倍，至少4倍，至少10倍，當(dāng)比較hBS細(xì)胞和成體類成纖維細(xì)胞時(shí)，檢測(cè)毒性的效率高至少2倍，例如至少4倍，至少10倍，當(dāng)比較祖細(xì)胞和成體類成纖維細(xì)胞時(shí)，檢測(cè)毒性的效率高至少1.5倍，至少2倍，至少5倍，至少10倍。此外，本發(fā)明的分析方法可以基于細(xì)胞毒性終點(diǎn)，例如測(cè)量存活率。用于這些終點(diǎn)的適合的檢測(cè)技術(shù)可以選自測(cè)量代謝活性包括ATP含量分析，MTT鹽分析和刃天青轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的其它適合的終點(diǎn)可以選自胚胎毒性終點(diǎn)?？梢栽诨蛩交虻鞍姿缴蠈?duì)生物分子的表達(dá)水平進(jìn)行分析，例如RNA的基因組和蛋白質(zhì)組測(cè)量，酶和抗體水平。也可以分析微型RNA水平。即測(cè)量細(xì)胞毒性又測(cè)量胚胎毒性的適合的方法可以是比色法(可見(jiàn)光顏色的可定量的變化)或熒光測(cè)定法(熒光的可定量的變化)。測(cè)量可以在多孔板讀出器中進(jìn)行，其中幾個(gè)孔的內(nèi)含物可以同時(shí)被分析。試驗(yàn)被設(shè)計(jì)成可以擴(kuò)大以用于中到高通量應(yīng)用。用于檢測(cè)和定量測(cè)定毒性效應(yīng)的另一種適合的方案可以在高含量讀出器(HighContentReader)中進(jìn)行。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用了有力的篩選技術(shù)高含量篩選(HCS)。HCS以一種允許對(duì)物質(zhì)進(jìn)行快速篩選的方式，擴(kuò)展了鑒定和定量化合物對(duì)多種細(xì)胞事件的效應(yīng)的能力。HCS允許在單一篩選平臺(tái)上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)測(cè)量。它可以多孔板樣品制備的通量自動(dòng)執(zhí)行與微觀研究有關(guān)的任務(wù)，例如數(shù)據(jù)捕獲和分析，同時(shí)能夠?qū)μ囟ǖ募?xì)胞事件進(jìn)行定量。根據(jù)本發(fā)明，在發(fā)育毒性測(cè)試中，HSC能夠平行檢測(cè)對(duì)分化成所有三種胚層的影響，同時(shí)在相關(guān)的生物學(xué)系統(tǒng)中檢測(cè)同一個(gè)測(cè)試板中的細(xì)胞毒性。也可以使用HCS為研究毒性動(dòng)力學(xué)和受影響的途徑提供有價(jià)值的工具，檢測(cè)物質(zhì)對(duì)活細(xì)胞的時(shí)間依賴性的影響。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在毒物學(xué)測(cè)試中使用hBSC時(shí)，細(xì)胞可能需要以小的聚集體形式接種，以便維持在增殖階段。這一般在毒性測(cè)試中將引起干擾，因?yàn)榭赡馨l(fā)生一個(gè)孔與另一個(gè)孔中細(xì)胞數(shù)量的高度變化。使用HCS技術(shù)，有可能將測(cè)量的信號(hào)歸一化(normalize)到每個(gè)測(cè)試孔的細(xì)胞數(shù)量。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性通過(guò)刃天青轉(zhuǎn)化來(lái)測(cè)量。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞毒性通過(guò)ATP含量分析來(lái)測(cè)里。本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案涉及用于在人種中檢測(cè)毒性的，基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的體外毒性分析方法，與非人類分析方法相比，能夠更有效地檢測(cè)13CRA的人類毒性。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用遺傳工程化的細(xì)胞株，例如未分化的hBS細(xì)胞株，hBS衍生的祖細(xì)胞類型或體細(xì)胞類hBS細(xì)胞，衍生的類型。這樣的工程化的細(xì)胞株可以是在發(fā)育相關(guān)啟動(dòng)子控制之下表達(dá)熒光或其它標(biāo)記物的報(bào)告物細(xì)胞株。此外，本發(fā)明涉及通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細(xì)胞接種在多孔板中(ii)將接種的細(xì)胞暴露于一種或多種濃度的一種/或多種物質(zhì)中(iii)分析細(xì)胞毒性和/或胚胎毒性終點(diǎn)。(iv)任選地，與已知的體內(nèi)毒性數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明還涉及通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法/分析方法，該方法包括下列步驟(i)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞接種到一個(gè)或多個(gè)多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔中(ii)將成熟的人類細(xì)胞類型接種到(i)中多孔板的不同的孔中或接種到一個(gè)或多個(gè)不同板的一個(gè)或多個(gè)孔中。(iii)任選地，將一個(gè)或多個(gè)從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的祖細(xì)胞群分別接種到(i)和/或(ii)中的多孔板的不同的孔中，或接種到一個(gè)或多個(gè)不同的多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔中，條件是接種的密度使得細(xì)胞能夠基本上維持其增殖能力，直到對(duì)暴露于細(xì)胞的一種或多種物質(zhì)的一種或多種效應(yīng)進(jìn)行測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)。此外，本發(fā)明涉及通過(guò)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的一個(gè)或多個(gè)祖細(xì)胞群各接種到一個(gè)或多個(gè)多孔板中(ii)將成熟的人類細(xì)胞類型接種到(i)中多孔板的不同的孔中或接種到一個(gè)或多個(gè)不同的板中條件是接種的密度使得細(xì)胞能夠基本上維持其增殖能力，直到對(duì)暴露于細(xì)胞的一種或多種物質(zhì)的一種或多種效應(yīng)進(jìn)行測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)。此外，本發(fā)明涉及通過(guò)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞接種到一個(gè)或多個(gè)多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔中(ii)將從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的一個(gè)或多個(gè)祖細(xì)胞群各接種到(i)中的一個(gè)或多個(gè)多孔板中，或接種到一個(gè)或多個(gè)不同的板中條件是接種的密度使得細(xì)胞能夠基本上維持其增殖能力，直到對(duì)暴露于細(xì)胞的一種或多種物質(zhì)的一種或多種效應(yīng)進(jìn)行測(cè)量的時(shí)間點(diǎn)。在該時(shí)間過(guò)程中，可以觀察到被接種的hBS來(lái)源的細(xì)胞分化成例如，來(lái)自所有胚層的祖細(xì)胞類型，例如心臟前體細(xì)胞，肝細(xì)胞類祖細(xì)胞和神經(jīng)元祖細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案還涉及通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)人類祖細(xì)胞群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細(xì)胞接種在多孔板中(ii)將接種的細(xì)胞暴露于一種或多種濃度的一種/或多種物質(zhì)中(iii)分析細(xì)胞毒性和/或胚胎毒性終點(diǎn)。(iv)任選地，與已知的體內(nèi)毒性數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。分析可以在1536，384，96，48，24，12，6孔的多孔板中進(jìn)行。在96孔板的情況下，在步驟(i)中接種的細(xì)胞的數(shù)量范圍為每個(gè)孔一個(gè)細(xì)胞到一百萬(wàn)(M)個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選為1，000-100，000個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選為10,000-30,000個(gè)細(xì)胞。任何步驟(i)中的板的孔還可以用蛋白，肽或細(xì)胞外基質(zhì)成分預(yù)先/在后包被。步驟(ii)中細(xì)胞的暴露可以進(jìn)行1分鐘到60天，優(yōu)選為5分鐘到30天，l天到20天，更優(yōu)選為5-15天。步驟(iii)中的毒性分析可以通過(guò)本文描述的任何適合的終點(diǎn)來(lái)進(jìn)行。在步驟(iv)中，獲得的體外數(shù)據(jù)可以進(jìn)一步與體內(nèi)數(shù)據(jù)通過(guò)數(shù)學(xué)預(yù)測(cè)模型或算法進(jìn)行比較。本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案涉及通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細(xì)胞接種在未包被的或包被的多孔組織培養(yǎng)皿中(ii)將接種的細(xì)胞暴露于幾種濃度的物質(zhì)中10天(iii)通過(guò)測(cè)量ATP含量或刃天青轉(zhuǎn)化進(jìn)行分析。另一方面，本發(fā)明涉及將本文描述的分析方法用于藥物開(kāi)發(fā)和/或用于安全性評(píng)估研究。另一方面，本發(fā)明涉及將本文描述的分析方法用于胚胎毒性，致畸性研究，和/或用于評(píng)估通過(guò)歐洲REACH法規(guī)鑒定的物質(zhì)。本發(fā)明還涉及用于如本文所述在人類中檢測(cè)毒性的試劑盒或使用本文描述的方法的試劑盒，該試劑盒包含(i)人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞(ii)(任選的)陽(yáng)性和陰性對(duì)照物質(zhì)(iii)用戶手冊(cè)。本發(fā)明的試劑盒還可以包含選自祖細(xì)胞和成體類成纖維細(xì)胞的至少一種其它類型的人類細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于如上所述在人類中檢測(cè)毒性的試劑盒或使用如上所述的方法的試劑盒，該試劑盒包含(i)從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的祖細(xì)胞(ii)(任選的)陽(yáng)性和陰性對(duì)照物質(zhì)(iii)用戶手冊(cè)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是試劑盒，其中含有hBS或hBS細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞類型，該細(xì)胞類型任選地被遺傳工程化或任選地與胚層特異性抗體組合，并連同算法，例如用于定量檢測(cè)一組發(fā)育毒性相關(guān)終點(diǎn)以及常見(jiàn)細(xì)胞毒性終點(diǎn)的高含量篩選算法。圖1.通過(guò)在第IO天測(cè)量直接與活細(xì)胞數(shù)量成比例的細(xì)胞內(nèi)ATP含量而確定的hBS細(xì)胞(A)，hBSMPs(B)和hFFs(C)的增殖曲線。對(duì)于hFFs和hBSMPs來(lái)說(shuō)，進(jìn)行了四個(gè)獨(dú)立的增殖試驗(yàn)(n=4)，對(duì)于hBS細(xì)胞來(lái)說(shuō)進(jìn)行了兩個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)(n=2)。誤差棒描述了平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖2.在(a)第1天，(b)第4天，(c)第7天和(d)第10天監(jiān)測(cè)到的96孔板中hBS細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的相差顯微鏡照片。在第0天時(shí)接種密度為60,000個(gè)細(xì)胞/孔。圖3.使用三種細(xì)胞類型hFFs，hBSMPs和hBS細(xì)胞獲得的陰性對(duì)照物質(zhì)糖精(A，B)和陽(yáng)性對(duì)照物質(zhì)5-FU(C，D)的濃度響應(yīng)曲線。數(shù)據(jù)通過(guò)測(cè)量每個(gè)孔的RES還原(A，C)和細(xì)胞內(nèi)ATP含量(B，D)，并按照未處理的/溶劑對(duì)照進(jìn)行歸一而獲得。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行三次(n=3)。誤差棒描述了平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。誤差棒描述了平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行三次。圖4.使用三種細(xì)胞類型hFFs，hBSMPs和hBS細(xì)胞獲得的物質(zhì)ATRA(A，B)和13-CRA(C，D)的濃度響應(yīng)曲線。數(shù)據(jù)通過(guò)測(cè)量每個(gè)孔的RES還原(A,C)和細(xì)胞內(nèi)ATP含量(B，D)，并按照未處理的/溶劑對(duì)照進(jìn)行歸一而獲得。所有實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立進(jìn)行三次(nX3)。誤差棒描述了平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。對(duì)于ATRA和13-CRA來(lái)說(shuō)，hBS細(xì)胞和祖細(xì)胞顯示出了比hEF更高的對(duì)毒性物質(zhì)的敏感性。hBS和祖細(xì)胞之間的IC50比率是10000:1(ATRA)和4000:1(13-CRA)。在hBS細(xì)胞和hFF之間，IC50值超過(guò)1:4(ATRA)和超過(guò)1:6(13-CRA)。圖5a)顯示了使用ATP分析獲得的在暴露10天后未分化的hBS細(xì)胞中ATRA禾B13CRA的濃度響應(yīng)曲線。ATRA和13CRA的IC50值分別為30.38pM和15.85pM。圖5b)顯示了使用ATP分析獲得的在暴露10天后hFFs中ATRA和13CRA(13-順式視黃酸)的劑量響應(yīng)曲線。ATRA禾卩13CRA的IC50值分別為244.3和301.6pM。實(shí)施例實(shí)應(yīng)激人A5S潘應(yīng)，巡潘應(yīng)浙W尸潘應(yīng)游潛蕎hBS細(xì)胞株SA002和SA002.5按照以前的描述確立和表征(Heins等，2004，WO03055992)，并在NIH(http:〃stemcells.nih.gov/research/registry/cellartis.asp)禾B英國(guó)干細(xì)胞庫(kù)Chttp:〃www.mrc.ac.uk/Utilities/Documentrecord/index.htmd=MRC003259)登記。細(xì)胞株被維持在絲裂霉素C失活的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mEF)上，在添加有4ng/ml人類重組堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(Invitrogen,Carlsbad，California)的VitroHESTM培養(yǎng)基中(Vitrolife，Kungsbacka,Sweden)。使用Swemed干細(xì)胞工具(SwemedLabInternationalAB,Billdal，Sweden)通過(guò)機(jī)械解離每4-5天對(duì)未分化的hBS細(xì)胞進(jìn)行傳代。通過(guò)將hBS細(xì)胞集落切成200x200)im的塊，并將塊放置在培養(yǎng)皿中，以在基于KO-DMEM，20%FCS，1%Glutamax，1%NEAA，1%PEST和0.1mM(3-巰基乙醇(都來(lái)自GibcoInitrogen)的培養(yǎng)基中聚集，來(lái)產(chǎn)生成纖維細(xì)胞類的祖細(xì)胞。經(jīng)過(guò)4天的時(shí)間，漂浮的聚集物形成，然后以每個(gè)孔大約IO個(gè)聚集體的高密度鋪于用明膠包被的組織培養(yǎng)皿中。觀察到細(xì)胞的生長(zhǎng)，并在第5-14天進(jìn)一步將細(xì)胞解離，并在第一次傳代時(shí)按l:l拆分進(jìn)行傳代。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到鋪滿時(shí)，一般將拆分比率設(shè)置為1:2。在聚集體鋪板后用于傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基包含不帶有丙酮酸鈉+glutamax的DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基，10%FCS，4ng/mlbFBF和1%PEST。人類胚泡干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)祖細(xì)胞(hBS-MPs)通過(guò)使用下列方法從hBS細(xì)胞株SA002.5衍生來(lái)獲得，該方法包括下列步驟i)將未分化的hBS細(xì)胞鋪在表面上；ii)溫育2到21天，例如3到10天，優(yōu)選7天，以允許分化；iii)酶法傳代到新型表面上；iv)重復(fù)步驟(iii)，直到獲得均勻的間充質(zhì)形態(tài)；v)培養(yǎng)獲得的hBS-MP細(xì)胞。在毒性測(cè)試前，將hBS-MPs培養(yǎng)在Dulbecco's修改的Eagle's培養(yǎng)基中，其中添加有io%FCS(二者都來(lái)自GibcoInvitrogenCorporation,Paisley,Scotland)禾卩4ng/mlbFGF，每4天以1:10的拆分比率傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)在T-25組織培養(yǎng)瓶上進(jìn)行，使用胰蛋白酶(Invitorgen)進(jìn)行傳代。具體來(lái)說(shuō)，可擴(kuò)增的hBSMPs從hBS細(xì)胞株SA002.5衍生而來(lái)。因此，使用TrypleSelectTM將hBS細(xì)胞酶法解離，并在含有添加了10%胎牛血清(FBS)和10ng/mlbFGF的DMEM培養(yǎng)基(都來(lái)自Invitrogen)中，以每平方厘米1.5x105個(gè)細(xì)胞的濃度鋪在用0.1%明膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿上(BDFalcon/BDBiosciences,Bedford,MA,USA)。分化7天后，將hBS細(xì)胞作為單個(gè)細(xì)胞酶法傳代培養(yǎng)到新的明膠包被的培養(yǎng)皿中。該過(guò)程每7天重復(fù)一次，直到細(xì)胞群在形態(tài)上變得均勻。該細(xì)胞群的全部表征作為另一項(xiàng)顯示出hBSMPs在形態(tài)學(xué)和標(biāo)記物表達(dá)方面類似胚胎間充質(zhì)(投送的稿件)細(xì)胞的研究的一部分進(jìn)行。將hBSMPs培養(yǎng)在未包被的組織培養(yǎng)瓶中(BDFalcon,BDBiosciences)添加有10%FBS，50U/ml青霉素/鏈霉素和4ng/mlbFGF的DMEM中(都來(lái)自Invitrogen)，每4天以1:10的拆分比率進(jìn)行傳代培養(yǎng)。人類包皮成纖維細(xì)胞(hFF)從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CRL-2429ATCC,Manassas，VA)獲得，培養(yǎng)在添加有10%FBS的Dulbecco's修改過(guò)的Eagle's培養(yǎng)基中，每4天以1:5的拆分比率進(jìn)行傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)在T-25組織培養(yǎng)瓶上進(jìn)行，使用胰蛋白酶(Invitorgen)進(jìn)行傳代。實(shí)雄2微為了確定在IO天的毒性試驗(yàn)中每個(gè)孔中接種的最適細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)行了一組增殖試驗(yàn)。接種的最適細(xì)胞數(shù)量必須在接種的細(xì)胞數(shù)量與在試驗(yàn)的讀數(shù)天時(shí)的信號(hào)成比例的范圍內(nèi)。將各三份hFFs，hBSMPs和hBS細(xì)胞以兩倍的連續(xù)稀釋率接種在明膠(Sigma)包被的96孔板中添加有10%FBS禾Q50U/ml青霉素/鏈霉素的DMEM中(都來(lái)自Invitrogen)，對(duì)于以單細(xì)胞懸浮液接種的hFF和hBSMPs來(lái)說(shuō)，最高細(xì)胞密度為16,000個(gè)細(xì)胞/L，對(duì)于以50到100個(gè)細(xì)胞的聚集體接種的hBS細(xì)胞來(lái)說(shuō)，最高細(xì)胞密度為60,000個(gè)細(xì)胞/L。在細(xì)胞接種后將帶有hBSC的板立即在400g離心5分鐘，以支持hBS細(xì)胞聚集體的可繁殖的附著。在第4天和第7天更換培養(yǎng)基。在第10天，使用CellTiterGlo試劑盒(Promega)按照制造商的說(shuō)明書(shū)測(cè)量每個(gè)孔中的細(xì)胞內(nèi)ATP含量。對(duì)于hFF和hBSMPs來(lái)說(shuō)進(jìn)行4次獨(dú)立的試驗(yàn)，對(duì)于hBS細(xì)胞來(lái)說(shuō)進(jìn)行兩次獨(dú)立的試驗(yàn)。此外，使用倒置顯微鏡(Nikon,Diisseldorf,Germany)每天監(jiān)測(cè)hBS細(xì)胞的生長(zhǎng)，直到第10天。在第1，4，7和10天使用數(shù)碼相機(jī)(Nikon)照相。hBS細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果(圖1A)顯示，在接種密度達(dá)到15,000個(gè)hBS細(xì)胞/孔的情況下，第10天時(shí)每個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)量與第0天時(shí)接種的細(xì)胞數(shù)量成正比。在更高的接種密度時(shí)，曲線變平。hBSMPs細(xì)胞增殖試驗(yàn)的結(jié)果(圖IB)表明，在接種密度達(dá)到500個(gè)hBSMPs/孔的情況下，第10天時(shí)每個(gè)孔的細(xì)胞數(shù)量與接種的細(xì)胞數(shù)量成正比。在更高的接種密度時(shí)，曲線變平，甚至從4000個(gè)細(xì)胞/孔向上，曲線開(kāi)始下降。hFFs的曲線(圖1C)也顯示出在接種密度達(dá)到500個(gè)hFFs/孔的情況下，第IO天時(shí)的細(xì)胞數(shù)量與接種的細(xì)胞數(shù)量之間成正比，在更高的接種密度下曲線變平。但是，當(dāng)接種密度從4000個(gè)細(xì)胞/孔向上時(shí)，曲線保持在平臺(tái)。在比較了這些結(jié)果之后，我們從圖的對(duì)數(shù)期中選擇了合適的接種細(xì)胞數(shù)，用于隨后的毒性測(cè)試，即hFFs為500個(gè)細(xì)胞/孔，hBSMPs為500個(gè)細(xì)胞/孔，hBS細(xì)胞為5000個(gè)細(xì)胞/孔。此外，使用相差顯微鏡對(duì)hBS細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行了IO天的監(jiān)測(cè)(圖2)。照片證實(shí)了接種的hBS細(xì)胞在IO天的時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)和分化成了各種不同的組織類結(jié)構(gòu)。寬潘辨3.瓶媳毒絲#/試將hBS細(xì)胞群落分解成大約50到100個(gè)細(xì)胞的小聚集體，并以5000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到明膠包被的96孔板(Nunc,Kamstrupvej,Denmark)中的lOOmL含有敲除DMEM培養(yǎng)基的測(cè)試培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中添加了20%FBS，1%青霉素-鏈霉素，l%Glutamax，0.5mmol/1N-巰基乙醇和1%非必需氨基酸(都來(lái)自Invitrog印)。hBSMPs禾卩hFF細(xì)胞被解離成單細(xì)胞，以500個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種到明膠包被的96孔板(Nunc)中的lOOmL測(cè)試培養(yǎng)基中。接種后直接將含有hBSC的板在400g離心5分鐘。祖細(xì)胞和hFF細(xì)胞被解離成單細(xì)胞，并接種到96孔板中的lOOpl測(cè)試培養(yǎng)基中。24小時(shí)后，通過(guò)在測(cè)試孔中加入lOOnl具有兩倍所需終濃度的濃度的毒性溶液，開(kāi)始細(xì)胞毒性測(cè)試(第O天)。在分析的第4天和第7天更換毒性培養(yǎng)基，并在第IO天對(duì)板進(jìn)行分析，測(cè)量不同的檢測(cè)方法的細(xì)胞毒性，艮P，使用P匪ega的CellTiterGlo試劑盒(P顧ega,Mannheim,Germany)按照制造商的說(shuō)明書(shū)測(cè)量ATP含量，以及按照以前的描述(Evans等，2001)測(cè)量刃天青(Sigma，Stockholm,Sweden,CAS62758-13-8)還原成發(fā)熒光的Resofurin。兩個(gè)終點(diǎn)都使用多重檢測(cè)讀出器(FluostarOptima,BMGLabtech,Offenburg,Germany)進(jìn)行分析，測(cè)量CellTiterGlo試劑盒的發(fā)光，以及對(duì)于刃天青分析來(lái)說(shuō)在波長(zhǎng)530nm(激發(fā))和590nm(發(fā)射)處測(cè)量熒光。眾學(xué)激廣游#/試浙統(tǒng)^學(xué)分#測(cè)試了下面的物質(zhì)5-FU(Invivogen，Toulouse,France,CAS51-21-8)作為陽(yáng)性對(duì)照，糖精鈉(Sigma,CAS128-44-9)作為陰性對(duì)照，ATRA(Sigma,CAS302-79-4)，13CRA(Sigma,CAS4759-48-2)。將糖精在PBS中稀釋到濃度為lg/ml，并分成等份試樣儲(chǔ)存在4°C。將ATRA和13CRA溶解在DMSO中，濃度為0.1M，分成等份試樣儲(chǔ)存在-20。C。將5-FU溶液(Invivogen)和DMSO直接稀釋在測(cè)試培養(yǎng)基中。所有化學(xué)物質(zhì)都以3倍的連續(xù)稀釋度進(jìn)行測(cè)試，最高濃度為5-FU為27MM，糖精為1mg/ml，ATRA和13CRA為100MM。對(duì)于ATRA和13CRA來(lái)說(shuō)，連續(xù)稀釋在DMSO中進(jìn)行，然后將稀釋液加入到測(cè)試培養(yǎng)基中以獲得最終測(cè)試濃度。這樣做是為了將所有被測(cè)試的ATRA和13CRA測(cè)試中的DMSO濃度維持在相等的0.1%。所有的實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立地進(jìn)行三次。IC50值通過(guò)將四參數(shù)的山丘函數(shù)(hillfunction)擬合于數(shù)據(jù)而獲得。所有細(xì)胞類型都與5-FU顯示出毒性反應(yīng)，與糖精不顯示毒性反應(yīng)(參見(jiàn)圖3)。IC50值的比較顯示出hBS細(xì)胞和祖細(xì)胞比hFF細(xì)胞對(duì)物質(zhì)5-FU，ATRA和13CRA要敏感得多。祖細(xì)胞代表了容易培養(yǎng)的hBS細(xì)胞類型，能夠使用酶法傳代進(jìn)行較大規(guī)模的培養(yǎng)，同時(shí)維持對(duì)毒性物質(zhì)的較高敏感性。更重要的是，在未分化的hBS細(xì)胞上，ATRA的IC50值高于13CRA的IC50值，在ATP分析中分別為25.76pM和15.85pM(參見(jiàn)圖4)，在刃天青分析中分別為17.31pM和14.51pM。對(duì)于祖細(xì)胞來(lái)說(shuō)，發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果，其中IC50值與hFF和hBS細(xì)胞相比急劇降低，ATRA為0.0027nM，13CRAS為0.0004pM，在刃天青分析中分別為0.0009nM和0.00002^M。以前報(bào)道的在基于多能畸胎瘤P19細(xì)胞的小鼠系統(tǒng)中相應(yīng)的IC50值(Adler等，2005,Thedetectionofdifferentiation-inducingchemicalsbyusinggreenfluorescentproteinexpressioningeneticallyengineeredteratocarcinomacells(使用在遺傳工程化的畸胎瘤細(xì)胞中表達(dá)的綠色熒光蛋白檢測(cè)誘導(dǎo)分化的化學(xué)物質(zhì))，JtemJw/m.2005Apr;33(2):91-103;Adler的論文(http:〃w3.ub.uni-konstanz.de/vl3/volltexte/2005/1619〃pdf7Adler.pdf)分別為0.005和0.38pM，即小鼠系統(tǒng)不能以123的倍率檢測(cè)13CRA，[(IC50小鼠(13CRA)/(IC50小鼠(ATRA))等于76，艮卩0.38/0.005，而(IC50人類(13CRA)/(IC50人類(ATRA))等于0.62，艮卩15.85/25.76)。分別比較人類和小鼠的比率，0.62:76等于123倍)。表l:使用存活率作為人類胚胎干(hBS)細(xì)胞，hBSMP和人類包皮成纖維細(xì)胞(hFFs)的終點(diǎn)獲得的測(cè)試化學(xué)物質(zhì)的平均IC50值。測(cè)量的參數(shù)是ATP含量和刃天青還原成resofurin。所有的實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立地進(jìn)行三次(n>3)。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>兩種類型的測(cè)試細(xì)胞(hBS細(xì)胞和hFF)的IC50值的比較，顯示出hBS細(xì)胞比hFF細(xì)胞對(duì)物質(zhì)5-FU，ATRA和13CRA敏感得多(對(duì)于ATRA和13CRA參見(jiàn)圖4-5)。多能hBS細(xì)胞比hFFs對(duì)ATRA和13CRA敏感得多。這些發(fā)現(xiàn)以前的結(jié)果相一致，這些結(jié)果通過(guò)測(cè)量存活性證實(shí)鼠類多能細(xì)胞比成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)已知的致畸物具有更高的敏感性(Laschinski等，1991)。此外，在我們的測(cè)試系統(tǒng)中，對(duì)于所有測(cè)試的細(xì)胞類型來(lái)說(shuō)，13-CRA的IC50值總是比ATRA的低。在以前的基于多能鼠類細(xì)胞的體外致畸性測(cè)試分析中，13CRA顯示出比ATRA明顯低的細(xì)胞毒性和致畸性能力(Adler等，2005)。盡管在鼠類系統(tǒng)中13CRA沒(méi)有被分類成致畸物，但它在人類中是強(qiáng)的致畸物。因此，我們的結(jié)果表明基于人類細(xì)胞的測(cè)試系統(tǒng)具有超過(guò)基于動(dòng)物細(xì)胞的分析方法的檢測(cè)人類發(fā)育毒性物質(zhì)的優(yōu)勢(shì)。對(duì)于兩種類型的細(xì)胞hBS細(xì)胞和hFF進(jìn)行的ATRA和13CRA的ATP測(cè)量之間的比較也可以參見(jiàn)圖4。表2和3顯示分別使用ATP分析和刃天青分析測(cè)量到的IC50值之間的比率。表2:使用ATP分析方法測(cè)量到的IC50值之間的比率<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表3:使用刃天青分析方法測(cè)量到的IC50值之間的比率<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>兩種不同的終點(diǎn)存活率檢測(cè)方法，ATP分析方法和刃天青分析方法的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較顯示在表4中。表4:兩種不同的終點(diǎn)存活率檢測(cè)方法的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。測(cè)量的參數(shù)是在人類包皮成纖維細(xì)胞(hFFs)，hBSMPs和人類胚胎干(hBS)細(xì)胞中用化學(xué)物質(zhì)處理后，每個(gè)孔中的細(xì)胞內(nèi)ATP含量和刃天青還原。使用雙向ANOVA檢驗(yàn)(***p<0.001;**p<0.01;*p<0.05)對(duì)濃度響應(yīng)曲線之間的差異進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立進(jìn)行三次(n23)。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在hBS細(xì)胞中使用兩種檢測(cè)方法獲得的結(jié)果的相似性可能是由于它們與hFFs和hBSMPs相比較低的增殖速度。此外，與其它類型的細(xì)胞相比，未分化的hBS細(xì)胞含有較少的線粒體，而在它們分化過(guò)程中線粒體的數(shù)量增加(Cho等，2006)。因此，較低的增殖速度以及較低的線粒體數(shù)量，為hBS細(xì)胞中ATP和RES分析之間差異不顯著，而這種差異在增殖速度高并含有更多線粒體的hFFs和hBSMPs中被擴(kuò)大，提供了解釋。但是，兩種檢測(cè)技術(shù)提供的IC50值在同樣的濃度范圍內(nèi)，因此都適合于測(cè)量存活率。實(shí)激賴4.嚴(yán)選一蘊(yùn)激廣以務(wù)定嚴(yán)游毒絲在多孔板形式的系統(tǒng)中使用hBS細(xì)胞或祖細(xì)胞或其組合對(duì)選定數(shù)量的測(cè)試化合物進(jìn)行了測(cè)試。作為參比系統(tǒng)，選擇并分析了一組具有不同胚胎潛在影響能力的物質(zhì)，例如6到10種物質(zhì)。該組中含有的化學(xué)物質(zhì)從無(wú)胚胎毒性，中等胚胎毒性到強(qiáng)胚胎毒性。此外，選擇了一種陰性(例如糖精)和一種陽(yáng)性對(duì)照化合物(例如5-氟尿啼啶)。使用測(cè)試方案對(duì)參比和測(cè)試物質(zhì)進(jìn)行了分析，該方案中包含針對(duì)參與早期分化和分化成中胚層，內(nèi)胚層和外胚層的蛋白的抗體，或在遺傳工程化的hBSC中由胚層特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白的表達(dá)。正確的時(shí)間點(diǎn)對(duì)于分析來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵的，因此建立了選定的發(fā)育毒性終點(diǎn)的時(shí)間依賴性的表達(dá)。為了定量測(cè)試板中的熒光信號(hào)，使用了高含量讀出器(HighContentReader)。對(duì)于細(xì)胞毒性終點(diǎn)來(lái)說(shuō)，評(píng)估描述了導(dǎo)致50%細(xì)胞死亡的化合物濃度的IC50值。從發(fā)育毒性終點(diǎn)計(jì)算出ID50值，它給出了導(dǎo)致所選標(biāo)記物被下調(diào)50%時(shí)的物質(zhì)的濃度。對(duì)這些值進(jìn)行比較和評(píng)估。通過(guò)評(píng)估每種物質(zhì)的IC50和ID50值之間的差異來(lái)評(píng)估化學(xué)物質(zhì)的體外胚胎毒性。對(duì)于胚胎毒性物質(zhì)來(lái)說(shuō)，IC50值明顯高于ID50值。使用這些結(jié)果，對(duì)參比物質(zhì)和測(cè)試物質(zhì)的排序可用于與已知的體內(nèi)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。參考文獻(xiàn)AdlerS,PaparellaM,PellizzerC等，Thedetectionofdifferentiation-inducingchemicalsbyusinggreenfluorescentproteinexpressioningeneticallyengineeredteratocarcinomacells.(使用在遺傳工程化的畸胎瘤細(xì)胞中表達(dá)的綠色熒光蛋白檢測(cè)誘導(dǎo)分化的化學(xué)物質(zhì))Alternativestolaboratoryanimals:ATLA，2005;33(2):91-103.Anon.Regulation(EC)No1907/2006oftheEuropeanparliamentandofthecouncil.(歐洲議會(huì)和委員會(huì)法規(guī)No1907/2006)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hù)量范圍為每孔1到l，OOO,OOO個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選為1,000-100,000個(gè)細(xì)胞，優(yōu)選為10,000-30,000個(gè)細(xì)胞，更優(yōu)選為10,000-20，000個(gè)細(xì)胞。12.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，其中細(xì)胞與物質(zhì)溫育的時(shí)間為1分鐘到60天，優(yōu)選為1分鐘到30天，更優(yōu)選為5-15天。13.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，其中細(xì)胞與物質(zhì)溫育的時(shí)間為10天。14.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，其中非人類分析方法是體外分析方法，諸如使用選自小鼠胚胎干細(xì)胞和小鼠畸胎瘤細(xì)胞的基于小鼠細(xì)胞的分析方法。15.權(quán)利要求1的體外分析方法，其中非人類分析方法是體內(nèi)分析方法，諸如小鼠，大鼠或豬的體內(nèi)分析方方。16.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，與非人類分析方法相比，檢測(cè)人類胚胎毒性的效率高至少兩倍。17.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，與非人類分析方法相比，檢測(cè)人類胚胎毒性的效率高至少ioo倍。18.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，與非人類分析方法相比，檢測(cè)人類胚胎毒性的效率高至少123倍。19.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，與人類成體類分析方法相比，檢測(cè)人類毒性的效率高至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少7倍，至少10倍。20.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，其中終點(diǎn)是細(xì)胞毒性。21.權(quán)利要求1-20的體外毒性分析方法，其中終點(diǎn)是胚胎毒性特異性的，諸如分析基因和/或蛋白表達(dá)。22.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，其中終點(diǎn)通過(guò)比色法或熒光測(cè)定法測(cè)量。23.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，其中毒性通過(guò)刃天青轉(zhuǎn)化目測(cè)。24.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，其中毒性通過(guò)ATP含量分析目測(cè)。25.用于在人種中檢測(cè)毒性的，基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的體外毒性分析方法，與非人類分析方法相比，更有效地檢測(cè)13CRA的人類毒性。26.通過(guò)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細(xì)胞接種在多孔板中(ii)將接種的細(xì)胞暴露于一種或多種濃度的物質(zhì)(iii)分析細(xì)胞毒性和/或胚胎毒性終點(diǎn)(iv)任選地，與已知的體內(nèi)毒性數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。27.通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)從胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的人類祖細(xì)胞的群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細(xì)胞接種在多孔板中(ii)將接種的細(xì)胞暴露于一種或多種濃度的物質(zhì)(iii)分析細(xì)胞毒性和/或胚胎毒性終點(diǎn)(iv)任選地，與已知的體內(nèi)毒性數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。28.通過(guò)將人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的一個(gè)或多個(gè)群暴露于物質(zhì)，在人種中檢測(cè)和/或預(yù)測(cè)該物質(zhì)的體外毒性的方法，該方法包括下列步驟(i)將細(xì)胞接種在多孔板中(ii)將接種的細(xì)胞暴露于幾種濃度的物質(zhì)(iii)通過(guò)測(cè)量ATP含量或刃天青轉(zhuǎn)化進(jìn)行分析。29.篩選物質(zhì)的方法，包括(a)獲得下列細(xì)胞的組合物(i)接種到一個(gè)或多個(gè)多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔中的人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞，和(ii)接種到(i)中的多孔板的不同的孔中，或接種到一個(gè)或多個(gè)不同的板的一個(gè)或多個(gè)孔中的成熟的人類細(xì)胞類型，以及任選的(iii)接種到(i)和/或(ii)中的多孔板的不同的孔中，或接種到一個(gè)或多個(gè)不同的多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔中的從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的祖細(xì)胞群；以及(b)任選地使或允許細(xì)胞進(jìn)行分化；(c)然后將細(xì)胞與一種和多種物質(zhì)合并；以及(d)任選地使或允許細(xì)胞進(jìn)行分化；(e)測(cè)定物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的任一效應(yīng)。30.篩選物質(zhì)的方法，包括i)獲得包含3,000-20,000個(gè)細(xì)胞/孔，更優(yōu)選10，000-15,000個(gè)細(xì)胞/孔的人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的組合物；ii)任選地使或允許細(xì)胞進(jìn)行分化；然后iii)將細(xì)胞與物質(zhì)合并；以及iv)測(cè)定物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的任一效應(yīng)。31.篩選物質(zhì)的方法，包括a)獲得100-5,000個(gè)細(xì)胞更優(yōu)選100-500個(gè)細(xì)胞/孔的從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的祖細(xì)胞的組合物；b)任選地使或允許細(xì)胞進(jìn)行分化；然后iii)將細(xì)胞與物質(zhì)合并；以及iv)測(cè)定物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的任一效應(yīng)。32.權(quán)利要求1-25中描述的分析方法在藥物發(fā)現(xiàn)和/或安全性評(píng)估研究中的應(yīng)用。33.權(quán)利要求1-25中描述的分析方法在胚胎毒性和/或致畸性研究中的應(yīng)用。34.權(quán)利要求1-25中描述的分析方法在評(píng)估由歐洲REACH法規(guī)鑒定的物質(zhì)中的應(yīng)用。35.用于按照權(quán)利要求1-25檢測(cè)人類毒性或用于權(quán)利要求26-31描述的方法的試劑盒，該試劑盒含有(i)人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞(ii)(任選的)陽(yáng)性和陰性對(duì)照物質(zhì)(iii)用戶手冊(cè)(iv)(任選的)培養(yǎng)基。36.權(quán)利要求35的試劑盒，該試劑盒還含有選自祖細(xì)胞和成體類細(xì)胞的至少一種其他的人類細(xì)胞類型。37.用于按照權(quán)利要求1-25檢測(cè)人類中的毒性或用于權(quán)利要求22-26描述的方法的試劑盒，該試劑盒含有(i)從人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞衍生的祖細(xì)胞(ii)(任選的)陽(yáng)性和陰性對(duì)照物質(zhì)(iii)用戶手冊(cè)(iv)(任選的)培養(yǎng)基。全文摘要本發(fā)明涉及用于在人種中檢測(cè)毒性的，基于人類胚泡來(lái)源的干細(xì)胞的體外毒性分析方法，該方法能夠在體外對(duì)物質(zhì)對(duì)人類的毒性進(jìn)行新型檢測(cè)，和/或與非人類分析方法相比能夠更有效地檢測(cè)對(duì)人類的毒性。本發(fā)明還可以對(duì)已知表現(xiàn)出種間差異，以及毒性效應(yīng)不能通過(guò)小鼠中的毒理學(xué)測(cè)試檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行毒性檢測(cè)。文檔編號(hào)G01N33/50GK101622537SQ200780043757公開(kāi)日2010年1月6日申請(qǐng)日期2007年10月2日優(yōu)先權(quán)日2006年10月2日發(fā)明者薩拉·阿德勒,雷蒙德·施特雷爾申請(qǐng)人:塞拉帝思股份公司