專利名稱：?jiǎn)蝹€(gè)藻細(xì)胞膜電位、膜電阻的非損傷性測(cè)定方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能同時(shí)測(cè)量單個(gè)藻細(xì)胞膜電位和膜電阻的非損傷性測(cè)定方法及裝置，屬 于細(xì)胞膜電信號(hào)分析技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景細(xì)胞質(zhì)膜是外源物質(zhì)諸如藥物、毒物、激素等接觸最早的靶位，并有多個(gè)受體，因此質(zhì) 膜對(duì)這些物質(zhì)的作用特別敏感。故而質(zhì)膜電生理信號(hào)的測(cè)定是醫(yī)學(xué)、藥理學(xué)、病理學(xué)、毒理 學(xué)以及營(yíng)養(yǎng)吸收和機(jī)體的抗逆性等研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的分析手段。目前，對(duì)活細(xì)胞膜電位的 直接測(cè)定與監(jiān)控，國(guó)內(nèi)外主要采用微電極插入法和膜片鉗技術(shù)。該類工作需要使用精密的儀 表，且操作復(fù)雜，須由非常熟練的專家進(jìn)行。此外，細(xì)胞中插入微電極必然降低作為試驗(yàn)對(duì) 象的細(xì)胞的壽命，而組建膜片鉗實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)費(fèi)用昂貴，試驗(yàn)成本高，普通實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)不起，因 而其普及受到很大阻力。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外涌現(xiàn)出多種細(xì)胞電位測(cè)定系統(tǒng)，如細(xì)胞電位測(cè)定裝置、細(xì)胞壓力和膜電 位測(cè)定探針、細(xì)胞電圖儀、親脂性陰離子熒光探針(DiBAC4)等。其中細(xì)胞電位測(cè)定裝置以 矩陣排列的微電極記錄細(xì)胞放置器中多個(gè)細(xì)胞的電活動(dòng)，該系統(tǒng)結(jié)構(gòu)繁雜、干擾因素多、人 為誤差大，且主要用于細(xì)胞團(tuán)膜電位的測(cè)定。細(xì)胞壓力和膜電位測(cè)定探針操作簡(jiǎn)單，但由于 探針尖端刺入被測(cè)細(xì)胞中，因而造成細(xì)胞損傷。細(xì)胞電圖儀對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷或損傷很小，且能 瞬時(shí)或持續(xù)記錄細(xì)胞電活動(dòng)和導(dǎo)電性，但該技術(shù)只能用于記錄貼壁、懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞的 電活動(dòng)。DiBAC4只能反映膜電位改變情況，卻無(wú)法得出確切的膜電位電壓值。因而，大型單 細(xì)胞膜電位的非損傷性測(cè)定存在很大難度。膜同時(shí)兼有電阻和電容的符合特征，因此膜電阻 和膜電位密切相關(guān)，而且均是反映膜電導(dǎo)特性的標(biāo)志參數(shù)，能用一套裝置同時(shí)測(cè)定單細(xì)胞的 膜電位和膜電阻對(duì)研究細(xì)胞膜完整性、通透性等重要生理特性有極大意義，而以往的細(xì)胞電 位測(cè)定系統(tǒng)均無(wú)法完成無(wú)損傷細(xì)胞膜電位和膜電阻的同時(shí)測(cè)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問(wèn)題，就是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種單個(gè)藻細(xì)胞膜電位和 膜電阻的非損傷性測(cè)定方法和裝置，他通過(guò)細(xì)胞表面技術(shù)對(duì)輪藻、麗藻等的單個(gè)藻細(xì)胞膜電 位和膜電阻實(shí)現(xiàn)連續(xù)測(cè)定，且不影響藻細(xì)胞壽命。本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題，采用的技術(shù)方案是， 一種藻細(xì)胞膜電位、膜電阻非損傷性測(cè)定 方法，包括細(xì)胞無(wú)損傷固定方法和無(wú)損傷采集膜電信號(hào)的細(xì)胞表面技術(shù)。采用凡士林無(wú)損傷固定細(xì)胞，并制成套管式藻細(xì)胞探頭；套管上部空隙(參比池)充灌0.1mol七"氯化鉀溶液， 作為參比液模擬藻細(xì)胞內(nèi)電環(huán)境，并導(dǎo)通參比的銀\氯化銀電極和藻細(xì)胞；套管內(nèi)壁附著鉑金 電極，與外部脈沖發(fā)生儀相連。細(xì)胞表面技術(shù)通過(guò)分別置于參比池和測(cè)定池的銀\氯化銀電極 采集藻細(xì)胞膜內(nèi)外電生理信號(hào)，外接電極信號(hào)儀顯示膜電位信號(hào)。一種藻細(xì)胞膜電位、膜電阻非損傷性測(cè)定裝置，包括藻細(xì)胞反應(yīng)裝置和電信號(hào)顯示裝置。在藻細(xì)胞反應(yīng)裝置中有5對(duì)電極固定環(huán)和5個(gè)可滑動(dòng)式細(xì)胞探頭固定架，分別用于固定成對(duì)的銀\氯化銀電極和套管式藻細(xì)胞反應(yīng)探頭；此外，還有含電極插孔和細(xì)胞探頭插孔的平行置于細(xì)胞反應(yīng)裝置底部的5個(gè)管狀測(cè)定池，內(nèi)充灌藻細(xì)胞緩沖液。藻細(xì)胞膜電信號(hào)顯示裝置為 電極信號(hào)儀和脈沖發(fā)生器集成的多通道電生理信號(hào)儀，顯示兩對(duì)應(yīng)銀\氯化銀間電勢(shì)差，即藻 細(xì)胞膜電位。脈沖發(fā)生器通過(guò)鉑金電極每10-15秒對(duì)藻細(xì)胞輸出脈沖電刺激，根據(jù)膜電位和 瞬時(shí)電流實(shí)現(xiàn)藻細(xì)胞膜電阻的測(cè)定。本發(fā)明有益效果是，同時(shí)測(cè)定藻細(xì)胞膜電位和膜電阻，并對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷，且一次能夠測(cè) 定五個(gè)平行值，效率高，測(cè)量準(zhǔn)確，可推廣應(yīng)用于以藻細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料的毒理、病理和環(huán)境 檢測(cè)等領(lǐng)域。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明； 圖1是本發(fā)明方法之一套管式藻細(xì)胞探頭 圖2是本發(fā)明方法之二細(xì)胞表面技術(shù)應(yīng)用原理3是本發(fā)明測(cè)定裝置前后剖面示意圖附圖標(biāo)記說(shuō)明1、參比池；2、硅膠管；3、有機(jī)玻璃管；4、凡士林；5、藻細(xì)胞；6 7、銀\氯化銀電 極；8 9、電極固定環(huán)；10、滑動(dòng)式細(xì)胞探頭固定架；11、測(cè)定池；12、多通道電生理信號(hào) 儀；13、藻細(xì)胞緩沖液；14、鉑金電極；15、電極信號(hào)儀；16、脈沖發(fā)生器具體實(shí)施方式
圖1是利用本發(fā)明方法之一制作套管式藻細(xì)胞探頭，在硅膠管2內(nèi)，套有機(jī)玻璃管3， 有機(jī)玻璃管內(nèi)充滿凡士林4用于包埋和封接藻細(xì)胞5，硅膠管上端形成的參比池1中充滿 O.lmol L'1氯化鉀溶液，藻細(xì)胞5頭部浸于氯化鉀溶液，另一端浸于藻細(xì)胞緩沖液13。圖2是本發(fā)明方法之二細(xì)胞表面技術(shù)應(yīng)用原理圖。如圖所示，銀\氯化銀電極6、 7分別 通過(guò)電極固定環(huán)8、 9固定，藻細(xì)胞探頭由可滑動(dòng)式固定架10固定。銀\氯化銀電極頭部6插 入?yún)⒈瘸?，銀\氯化銀電極7頭部插入測(cè)定池11。銀\氯化銀電極6、參比池1中氯化鉀溶 液、藻細(xì)胞5、藻細(xì)胞緩沖液13、銀\氯化銀電極7形成回路，其間電勢(shì)差值(藻細(xì)胞膜電位) 由多通道電生理信號(hào)儀12測(cè)量和顯示。本發(fā)明原理如下由于藻細(xì)胞5僅極小部分浸于參比池1氯化鉀溶液，形成一微小孤立的膜片，且該氯化 鉀溶液模擬細(xì)胞內(nèi)電環(huán)境，故該膜片段內(nèi)外離子濃度近相同，則銀\氯化銀電極6處電位El "0。假設(shè)E2為銀X氯化銀電極7測(cè)量的電位，兩電極間測(cè)得電位差A(yù)E^E1 — E2，而銀\氯化 銀電極6、 7之間固有電極電位理論值為0，且E1《0，則AE近似為藻細(xì)胞5膜內(nèi)外電位差， 即細(xì)胞膜電位，由多通道電生理信號(hào)儀12測(cè)知。膜電阻信號(hào)(AR)測(cè)量時(shí)，多通道電生理信號(hào)儀通過(guò)兩根鉑金電極14，對(duì)藻細(xì)胞5施 以持續(xù)時(shí)間為2 — 3s、大小為2 — 7nA的直流電脈沖(I)，激起的電位差不超過(guò)5 — 10mV。根 據(jù)多通道電生理信號(hào)儀12測(cè)量藻細(xì)胞5瞬時(shí)膜電位(AE')和系統(tǒng)瞬時(shí)擾動(dòng)電流(1)，從而確定藻細(xì)胞5膜電阻AR二AE' /1。圖3是本發(fā)明測(cè)定裝置前后剖示意圖。如圖所示，本發(fā)明裝置是一個(gè)可同時(shí)測(cè)定五個(gè)藻 細(xì)胞膜電位和膜電阻的多通道測(cè)定系統(tǒng)。該裝置五對(duì)銀\氯化銀電極、五個(gè)藻細(xì)胞探頭、多通 道電生理信號(hào)儀12的五套電極信號(hào)儀15和脈沖發(fā)生器16均同時(shí)工作，實(shí)現(xiàn)五個(gè)藻細(xì)胞膜電 位、膜電阻的同時(shí)測(cè)定，該測(cè)定方法和裝置效率高，測(cè)定成本低。具體實(shí)施方法如下將圖1所示藻細(xì)胞探頭、銀\氯化銀電極6和7、鉑金電極、多通道電生理信號(hào)儀依據(jù) 圖2進(jìn)行連接，同時(shí)按照?qǐng)D3所示連接其他同步測(cè)定需要的藻細(xì)胞探頭、銀\氯化銀電極、鈾 金電極等。裝置連接完畢后，打開(kāi)測(cè)定池11進(jìn)液口和出液口，使藻細(xì)胞緩沖液13連續(xù)的進(jìn) 入和流出測(cè)定池11，但其中始終充滿藻細(xì)胞緩沖液13。接通多通道電生理信號(hào)儀12的電源， 使電極信號(hào)儀15和脈沖發(fā)生器16同時(shí)工作。通過(guò)電極信號(hào)儀15讀取每個(gè)藻細(xì)胞5的膜電位 值。依據(jù)脈沖發(fā)生器16輸出的瞬時(shí)電脈沖(I)和藻細(xì)胞瞬時(shí)膜電位(AE')，計(jì)算出每個(gè)藻 細(xì)胞膜電阻值(AR)。與此同時(shí)，通過(guò)其他通道顯示結(jié)果，同時(shí)獲取五個(gè)藻細(xì)胞的膜電位、 膜電阻信息。
權(quán)利要求
1. “單個(gè)藻細(xì)胞膜電位、膜電阻的非損傷性測(cè)定方法及裝置”，其特征包括(1)套管式藻細(xì)胞探頭，凡士林無(wú)損傷固定藻細(xì)胞；(2)細(xì)胞表面技術(shù)測(cè)定方法，對(duì)細(xì)胞無(wú)實(shí)質(zhì)性損傷；(3)銀\氯化銀電極作為藻細(xì)胞電信號(hào)采集電極；(4)脈沖發(fā)生器和電極信號(hào)儀集成為多通道電生理信號(hào)儀，構(gòu)成五個(gè)藻細(xì)胞膜電信號(hào)同步記錄、顯示裝置。
2、 由權(quán)利要求l所述的單個(gè)藻細(xì)胞膜電位、膜電阻的非損傷性測(cè)定方法，其特征是套 管式藻細(xì)胞探頭裝置，內(nèi)充注凡士林無(wú)損傷固定藻細(xì)胞，制作藻細(xì)胞反應(yīng)探頭，凡士林對(duì)細(xì) 胞電信號(hào)無(wú)干擾或干擾極小。
3、 由權(quán)利要求1所述的單個(gè)藻細(xì)胞膜電位、膜電阻的非損傷性測(cè)定方法，其特征是細(xì) 胞表面技術(shù)通過(guò)設(shè)計(jì)參比池，充灌參比液模擬藻細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，細(xì)胞電信號(hào)采集電極無(wú)需插入 細(xì)胞，膜內(nèi)外電位差通過(guò)細(xì)胞表面進(jìn)行采集，對(duì)藻細(xì)胞無(wú)損傷。
4、 由權(quán)利要求l所述的單個(gè)藻細(xì)胞膜電位、膜電阻的非損傷性測(cè)定方法，其特征是銀 \氯化銀電極電極電位穩(wěn)定，作為藻細(xì)胞膜電位信號(hào)采集電極不影響測(cè)定系統(tǒng)穩(wěn)定性。
5、 由權(quán)利要求l所述的單個(gè)藻細(xì)胞膜電位、膜電阻的非損傷性測(cè)定方法，其特征是五 套脈沖發(fā)生器和電極信號(hào)儀集成制作五通道電生理信號(hào)儀，可對(duì)五個(gè)藻細(xì)胞膜電信號(hào)進(jìn)行同 步記錄和顯示，系統(tǒng)工作可同時(shí)獲取五個(gè)藻細(xì)胞膜電位、膜電阻值，測(cè)定效率高。
全文摘要
一種單個(gè)藻細(xì)胞膜電位、膜電阻的非損傷性測(cè)定方法及裝置，該方法通過(guò)細(xì)胞表面技術(shù)測(cè)定大型藻細(xì)胞膜電位和膜電阻。它是將套管式細(xì)胞探頭置于多通道細(xì)胞反應(yīng)裝置，每個(gè)通道均含有一對(duì)電極固定環(huán)、細(xì)胞探頭固定架，用于固定成對(duì)排列的銀\氯化銀電極及套管式藻細(xì)胞探頭。兩銀\氯化銀電極采集藻細(xì)胞膜電位信號(hào)，并經(jīng)電極信號(hào)儀記錄和顯示。脈沖發(fā)生器經(jīng)鉑金電極對(duì)藻細(xì)胞提供脈沖電刺激，依據(jù)藻細(xì)胞瞬時(shí)膜電位，實(shí)現(xiàn)膜電阻的同步測(cè)定。電極信號(hào)儀和脈沖發(fā)生器集成為多通道電生理信號(hào)儀，實(shí)現(xiàn)五個(gè)藻細(xì)胞膜電位、膜電阻的同時(shí)測(cè)定，測(cè)定效率高。本發(fā)明工藝和設(shè)備制作簡(jiǎn)單，操作方便，同時(shí)完成對(duì)五個(gè)藻細(xì)胞膜電位和膜電阻的無(wú)損傷測(cè)定，快速而準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)G01N33/48GK101285825SQ200810015570
公開(kāi)日2008年10月15日 申請(qǐng)日期2008年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月23日
發(fā)明者史建國(guó), 孟慶軍, 艷 楊, 楊俊慧, 王丙蓮, 馬耀宏 申請(qǐng)人:山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心