專利名稱：快速聯(lián)檢血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物和大便潛血試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是醫(yī)用診斷試劑，應(yīng)用免疫學(xué)原理，通過檢測人糞便中的血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白趙 合物和大便潛血，發(fā)現(xiàn)下消化道出血癥狀，早期診斷直腸癌或結(jié)腸癌等下消化道腫瘤。
背景技術(shù)：
糞便中的血紅蛋白(Hb， Hemoglobin)又叫大便潛血(Fecal Occult Blood， FOB),目前在 臨床被看作是直腸癌、結(jié)腸癌的腫瘤標(biāo)志物之一。血紅蛋白容易與結(jié)合珠蛋白(Hp, Haptoglobin,又譯為觸珠蛋白、珠球蛋白)結(jié)合形成穩(wěn)定不可逆的復(fù)合物——血紅蛋白-結(jié)合 珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp Complex)。檢驗大便潛血大致可分為化學(xué)檢測法(Guaiactest)及免疫檢測法?；瘜W(xué)法較煩瑣且糧 個過程患者很受罪，目前普遍采用免疫檢測法，即通過抗人血紅素球蛋白特異性抗體采用免 疫夾心來檢測人類血紅素球蛋白，此法因系針對人類血紅素球蛋白反應(yīng)，故特異性高。但潛 血反應(yīng)測的是有無潛血，而不是有無有腫瘤標(biāo)志，潛血反應(yīng)呈陽性必須用其它方法確認(rèn)，例 腸鏡等，這是因為可能由其它因素引起的偶爾出血陽性，同樣潛血反應(yīng)陰性也有可能是假陰 性，這是由于早期腫瘤少量出血和便中結(jié)合珠蛋白形成復(fù)合物，而這種復(fù)合物抗血紅蛋白抗 體不能對之識別，檢測結(jié)果呈陰性。閂本的目黑高志(TakashiMeguro,北海道醫(yī)誌69(4), 1994) 對48例結(jié)腸癌或直腸癌患者的糞便，用放射免疫法檢測其血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)及血紅蛋白(Hb)，結(jié)果陽性分別為44例及35例，這里至少有9例便潛血者為假陰 性，也就是說測定大便潛血診斷直腸癌或結(jié)腸癌的陽性符合率僅在70%左右，而測定血紅蛋 白-結(jié)合珠蛋白的復(fù)合物對直腸癌或結(jié)腸癌的陽性符合率在90o/。以上，造成測定大便潛血對力: 腸癌或結(jié)腸癌20%—30%假陰性主要原因由消化道少量出血，釋出的血紅蛋白(Hb)在經(jīng)過 較長的腸道時與糞便內(nèi)的Hp結(jié)合成復(fù)合物引起潛血假陰性，顯然檢糞便中的血紅蛋白來沴斷 是否患直腸癌或結(jié)腸癌的腫瘤標(biāo)志物有嚴(yán)重漏檢。本發(fā)明針對這些缺陷采用免疫層析膠體金技術(shù)，快速、簡便同時檢測大便中的血紅蛋f'l-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)和大便潛血的人血紅蛋白(Hb)可以消除上述弊端，準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn) 消化道癌變引起的少量出血，提高早期直腸癌或結(jié)腸癌診斷準(zhǔn)確率，也為早期診斷此病提供 快速、簡便的手段和及時治療。發(fā)明內(nèi)容大便中血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物和大便潛血診斷試劑，主要由二種形式。 一種形式是 由二根試條分別檢測血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)和血紅蛋白(Hb)組成的試劑稱 聯(lián)合型試劑，另一種形式由一根試條同時檢測血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)和血紅 蛋白(Hb)組成的試劑稱二合一型試劑。試劑的檢測原理是免疫學(xué)原理，即采用相應(yīng)的抗原抗體反應(yīng)，并通過膠體金免疫層析技 術(shù)實現(xiàn)此反應(yīng)過程，達(dá)到檢測目的。本發(fā)明的試劑結(jié)構(gòu)及工作原理聯(lián)合型的二根試條組成，其中一試條包含一對抗人血紅蛋 白抗體(anti-Hb)， anti-HM抗體標(biāo)記在膠體金上并包被在膠體金結(jié)合墊上，anti-Hb2抗體被 包被并固定在硝酸纖維素(NC)膜的檢測區(qū)的檢測線(T線)上，另一根試條含抗人血紅蛋 白抗體(atrti-Hb)和抗人結(jié)合珠蛋白抗體(anti-Hp)， anti-Hb抗體標(biāo)記在膠體金上并包被在 膠體金結(jié)合墊上，anti-Hp抗體被包被并固定在硝酸纖維素(NC)膜的檢測區(qū)的檢測線(T線) 上，二根試條分別組成在粘性底板上，始端有供加樣用的樣品處理墊，末端有^l助層析用的 吸水墊，并鑲嵌入塑卡中組成聯(lián)合型試劑；二合一型試條包含一對抗人血紅蛋白抗體(anti-Hb) 和抗人結(jié)合珠蛋白抗體(anti-Hp)，其中anti-Hbl抗體標(biāo)記在膠體金上并包被在膠體金結(jié)合墊 上，另一個anti-Hb2抗體和anti-Hp抗體分別被包被并固定在同一硝酸纖維素(NC)膜的檢 測區(qū)的檢測線(T線)不同位置上，試條組成在粘性底板上，始端有供加樣用的樣品處理墊， 末端有供助層析用的吸水墊，并鑲嵌入塑卡中組成二合一型試劑。當(dāng)被測樣品加樣到加樣樣 品處理墊上，通過層析使包被在膠體金結(jié)合墊上金標(biāo)記的Hbl抗體復(fù)溶，同時樣本中的血紅 蛋白(Hb)或血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)抗原就與金標(biāo)記的Hbl抗體結(jié)合形成相 應(yīng)的復(fù)合物(anti-Hbl…Hb或anti-Hb 1…Hb-Hp),這種復(fù)合物通過毛細(xì)作用沿NC膜向前移動， 再與固定在測試區(qū)的T線上的Hb2或Hp抗體結(jié)合形成夾心物(anti-Hbl…Hb…anti-Hb2或 anti-HM…Hb-Hp…肌ti-Hp),在測試區(qū)(T)內(nèi)會出現(xiàn)一條紫紅色條帶。顯而易見，色帶深淺 和樣品中相應(yīng)抗原濃度有關(guān)，抗原濃度越高，T線顯色越深。反之，如相應(yīng)的抗原濃度為0， 帶有金標(biāo)記抗體和T線抗體不可能結(jié)合，此時測試區(qū)(T)內(nèi)沒有任何線出現(xiàn)，這種由二種抗 體同時和相應(yīng)抗原結(jié)合的方法稱雙抗體夾心法。為了證明試劑有效性和易判讀，分別在質(zhì)控 區(qū)(C)包被羊抗鼠二抗IgG為質(zhì)控線，所以不管結(jié)果怎樣質(zhì)控線C始終出現(xiàn)。應(yīng)用發(fā)明試劑能快速檢測人糞便中的血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物和大便潛血，由于血紅 蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物及大便潛血和直腸癌或結(jié)腸癌等下消化道腫瘤相關(guān)性大于90%,所以本發(fā)明為診斷早期直腸癌或結(jié)腸癌等下消化道腫瘤提供新的方法。本診斷試劑的特點快速簡便、不需要任何儀器設(shè)備，又由于采用特異性抗體的免疫反應(yīng) 所以準(zhǔn)確性高。檢測結(jié)果大便潛血和血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)都是陽性或血紅 蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)陽性者，則高度懷疑是下消化道出血，很可能患直腸癌或 結(jié)腸癌等下消化道腫瘤，建議進(jìn)一步診斷加以確認(rèn)，例腸鏡；如果血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合 物(Hb-Hp)陰性而血紅蛋白(Hb)陽性可能由突發(fā)性炎癥引起的；大便潛血和血紅蛋白-結(jié) 合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)都是陰性者，說明下消化道沒有出血。試劑靈敏度可調(diào)在臨床意義范圍中。例血紅蛋白(Hb) 100ng/ml，血紅蛋白-結(jié)合珠蛋 白復(fù)合物(Hb-Hp) 25ng/ml是有臨床意義的值。


附圖1是本發(fā)明二合一型試劑的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中l(wèi).樣品處理墊，2.膠體金結(jié)合墊，3.硝酸纖維素膜，4.吸水墊，5.粘性底板，6.檢測 區(qū)(檢測線T), 7.控制區(qū)(控制線C)。附圖2是本發(fā)明聯(lián)合型試劑的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中l(wèi).樣品處理墊，2.膠體金結(jié)合墊，3.硝酸纖維素膜，4.吸水墊，5.粘性底板，6.檢領(lǐng)!1 區(qū)(檢測線T), 7.控制區(qū)(控制線C)。附圖3是本發(fā)明聯(lián)合型試劑增加塑料外殼的外部形態(tài)示意圖。圖中'T'是檢測線的位置和"C，，是控制線的位置，左邊是檢測大便潛血(Hb)的，右邊是 檢測血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)的。附圖4是本發(fā)明二合一試劑增加塑料外殼的外部形態(tài)示意圖。圖中"C"是控制線的位置，"Hb-Hp"是血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物檢測線的位置，"Hb" 是大便潛血檢測線的位置。附圖5是本發(fā)明的聯(lián)合型試劑的陽性結(jié)果示意圖。圖中1.血紅蛋白-結(jié)合^^蛋白復(fù)合物和大便潛血均是陽性，2.大便潛血是陰性、血紅蛋 白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物是陽性，3.大便潛血是陽性、血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物是陰性。附圖6是本發(fā)明的二合一型試劑的陽性結(jié)果示意圖。圖中1.血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物和大便潛血均是陽性，2.大便潛血是陽性、血紅蛋 白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物是陰性，3.大便潛血是陰性、血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物是陽性。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。1.樣品墊處理按下表配方(按百分比計算)配制，均勻鋪在樣品處理墊上并維持在37°C，相對濕度小于20%干燥。名稱含量膽酸鈉0.1%-0.7%S170.05%-1%硼酸鈉(pH9.0)緩沖液O.Olmmol/1 -0.03mmol/l2. 包被金標(biāo)記抗體膠體金結(jié)合墊100ml 0.01%氯金酸溶液，加熱煮沸加入3ml 1%檸 檬酸三鈉溶液煮沸5min，得膠體金液。取上述冷至室溫的膠體金液100 ml，力n 10ml (Umol/1硼酸緩沖液，滴加完畢后攪拌下加入l-2mg他l的抗體，繼續(xù)攪拌5min，再加 入2ml 10%的牛血清蛋白(BSA), 4"C離心，去上清，用1%BSA 0.0imol/l pH7.0的磷 酸鈉(PB)緩沖液稀釋懸浮物并均勻包被上膠體金結(jié)合墊，包被好的膠體金結(jié)合墊在37°C， 相對濕度小于20%干燥室干燥過夜。3. 聯(lián)合型試條T線和C線在硝酸纖維膜上檢測線處分別包被1.0mg/ml的Hp抗體或 包被1.0mg/ml的Hb2單克隆抗體，控制線處包被LOmg/ml的羊抗鼠IgG。 二合一型試 條同時在硝酸纖維膜上檢測線處包被1.0mg/ml的Hp抗體和包被l.Omg/ml的Hb2單克 隆抗體，以及控制線處包被l.Omg/ml的羊抗鼠IgG。包被好的膜在37'C，相對濕度小于 20%千燥室干燥過夜。4. 粘性底板依次粘貼包被好的硝酸纖維素膜、膠體金結(jié)合墊、樣品處理墊和吸水墊。5. 聯(lián)合型試劑將粘貼好相應(yīng)的試條鑲嵌入塑卡中，試條的樣品處理墊對著加樣孔， 塑料外殼則試劑的外部形態(tài)為有加樣孔方便加樣，反應(yīng)觀察窗標(biāo)有檢測線(T)和控制 線(C)位置，和相應(yīng)試條名稱。二合一試劑試條鑲嵌入要求和聯(lián)合型一樣，塑料外 殼有試劑的外部形態(tài)有加樣孔，反應(yīng)觀察窗標(biāo)有檢測血紅蛋白(Hb)和血紅蛋白-結(jié)合 珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)線以及控制線(C)的位置。6. 結(jié)果判斷6.1聯(lián)合型試劑6丄1大便潛血(Hb)試條窗口T和C處都出線，即出現(xiàn)二條線，說明樣本中血紅蛋白 (Hb)濃度100ng/ml以上；血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)試條窗口也出現(xiàn)二 條線，說明樣本中血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)濃度25ng/ml以上，此時兩者 都是陽性；6丄2大便潛血(Hb)試條窗口 T和C處出現(xiàn)二條線，說明樣本中血紅蛋白(Hb)濃度 100ng/ml以上；血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)試條窗口僅在C處出現(xiàn)一條線， 說明樣本中血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)濃度25ng/ml以下，此時樣本血紅蛋 白(Hb)為陽性，血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)為陰性；6丄3大便潛血(Hb)試條窗口僅在C處出現(xiàn)一條線，說明樣本中血紅蛋白(Hb)濃度 100ng/ml以下；血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)試條窗口 T和C處出現(xiàn)二條線， 說明樣本中血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)濃度25ng/ml以上，此時樣本血紅蛋 白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp)為陽性，血紅蛋白(Hb)為陰性；6丄4大便潛血(Hb)試條窗口僅在C處出現(xiàn)一條線，血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物(Hb-Hp) 試條窗口也僅在C處出現(xiàn)一條線，說明樣本中血紅蛋白(Hb)和血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白 復(fù)合物(Hb-Hp)濃度都低于規(guī)定值，此時樣本中血紅蛋白(Hb)和血紅蛋白-結(jié)合珠蛋 白復(fù)合物(Hb-Hp)都為陰性。6.2 二合一型試劑判斷和聯(lián)合型一樣，結(jié)果從名稱位置判讀得出。7.此試劑的特點快速準(zhǔn)確，操作方便，性能穩(wěn)定，不需任何專業(yè)儀器設(shè)備，適合醫(yī)院 的臨檢也適合家庭的自檢。由于此試劑在臨床上對直腸癌或結(jié)腸癌等下消化腫瘤的早期 診斷和鑒別有較大參考意義，加上它快速、簡便、準(zhǔn)確性高的特點為普査此類疾病和為 醫(yī)療條件落后地方診斷此類疾病提供手段。根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員無須過多實驗即可對本發(fā)明所要求保 護(hù)的進(jìn)行實施，并達(dá)到預(yù)期效果。本發(fā)明公開的實施例僅是對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但并 不是構(gòu)成對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員用相似替代物或改造，例用乳膠標(biāo)記抗 體代替膠體金標(biāo)記抗體，或用某些在理化上相似的試劑替代在此描述的試劑，對本發(fā)明的 有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行變動，但不超出本發(fā)明的精神、范圍和思想，均落入本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.快速聯(lián)檢大便中血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物和大便潛血診斷試劑，其特征是聯(lián)合型、二合一型或血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物單獨型試劑，應(yīng)用免疫學(xué)原理和膠體金或乳膠免疫層析技術(shù)，檢測人糞便中的血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物和大便潛血，從而早期診斷直腸癌或結(jié)腸癌等下消化道腫瘤。
2. 如權(quán)利要求1所述試劑，其特征是，使用高度特異性的抗人血紅蛋白單克隆抗體和抗人 結(jié)合珠蛋白抗體。
3. 如權(quán)利要求l所述試劑，其特征是，試劑由樣品處理墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、 吸水墊和粘性底板組成。
4. 如權(quán)利要求l所述試劑，其特征是，樣品處理墊緩沖液的組成。
5. 如權(quán)利要求1所述試劑，其特征是，膠體金結(jié)合墊附著有經(jīng)過血紅蛋白單克隆抗體標(biāo)記 的膠體金顆粒。
6. 如權(quán)利要求1所述試劑，其特征是，聯(lián)合型的硝酸纖維素膜的檢測線處分別包被有抗人 結(jié)合珠蛋白抗體和抗人血紅蛋白單克隆抗體，控制線處包被有羊抗鼠IgG; 二合一型的硝 酸纖維素膜的檢測線處同時包被有抗人結(jié)合珠蛋白抗體和抗人血紅蛋白單克隆抗體，控 制線處包被有羊抗鼠IgG。
7. 如權(quán)利要求1所述試劑，其特征是，吸水墊吸收通過硝酸纖維素膜的樣品，保證反應(yīng)持 續(xù)進(jìn)行。
8. 如權(quán)利要求l所述試劑，其特征是，粘性底板起支撐作用，樣品處理墊、膠體金結(jié)合墊、 硝酸纖維素膜和吸水墊依次粘貼在粘性底板上。
9. 如權(quán)利要求l所述試劑，其特征是，聯(lián)合型和血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物單獨型試劑， 增加塑料外殼則試劑的外部形態(tài)為有加樣孔方便加樣，反應(yīng)觀察窗標(biāo)有檢測線(T)和控 制線(C); 二合一試劑增加塑料外殼則試劑的外部形態(tài)為有加樣孔，反應(yīng)觀察窗標(biāo)有檢 測線Hb、 Hb-Hp和控制線(C)。
10. 如權(quán)利要求1所述試劑，其特征是，試劑不加塑料外殼則試劑的外部形態(tài)為試劑條，使 用時直接將樣品處理墊的一端插入有樣品液的容器中進(jìn)行測試。
全文摘要
一種快速、聯(lián)合檢測大便中血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物和大便潛血試劑，是應(yīng)用免疫學(xué)原理和膠體金免疫層析技術(shù)，主要由免疫試條和塑料件組成。本發(fā)明方法簡單，操作方便，性能穩(wěn)定，結(jié)果準(zhǔn)確，在臨床上對直腸癌或結(jié)腸癌等下消化道出血癥狀的腫瘤早期診斷和鑒別有較大參考意義，由于它快速、簡便、準(zhǔn)確性高的特點適合臨床醫(yī)檢和家庭的自檢，同時為普查此類疾病提供手段，也為醫(yī)療條件落后地方診斷此類疾病提供了手段。
文檔編號G01N33/53GK101236210SQ200810033198
公開日2008年8月6日 申請日期2008年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月29日
發(fā)明者吉 馮, 王學(xué)生 申請人:王學(xué)生;馮 吉