專利名稱：：通過測定二氧化碳濃度來計算草酸脫羧酶活力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于草酸脫羧酶活力的測定方法，特別是涉及一種通過測定酶反應(yīng)產(chǎn)物二氧化碳濃度來確定草酸脫羧酶活力的方法。技術(shù)背景目前草酸脫羧酶活力的測定方法主要有HPLC法、分光光度法、測壓法等。酶的活性可以通過測定底物草酸分解產(chǎn)生的甲酸的量、二氧化碳的量或者草酸分解減少的量得到。甲酸的測定可以用HPLC或甲酸脫氫酶法，二氧化碳的測定可以通過測壓計測定，草酸的測定可以通過HPLC或草酸氧化酶法測定。HPLC方法主要是對儀器和樣品的要求比較高，不利于推廣；酶法測定中的草酸氧化酶因為產(chǎn)率較低，售價昂貴，也不利于進(jìn)一步推廣。1980年Beutler等人以草酸為底物，加入氧化型輔酶I(NAD+)以及甲酸脫氫酶，用紫外分光光度法在340nm處測定其吸光值從而得到甲酸的量。經(jīng)過許多學(xué)者的改進(jìn)，現(xiàn)在的經(jīng)典方法如下具體所述(1)在0.3mL0.2M醋酸緩沖液(pH5.6)中加入0.1mL50mM的草酸溶液和0.1mL(v)的草酸脫羧酶液，反應(yīng)液最終pH為3.0，37'C條件下反應(yīng)30min(T);(2)然后加入2mL氧化型輔酶I和0.3mL的去離子水，繼續(xù)在3(TC下反應(yīng)2min，終止酶促反應(yīng)，用紫外-可見光分光光度計在340nm處測定反應(yīng)液的吸光值A(chǔ)1;(3)再加入0.2mL的甲酸脫氫酶(約5.27U/mL)，反應(yīng)液最終體積(V)為3mL，在同樣的溫度下，反應(yīng)30min，在340nm處測定反應(yīng)液的吸光值A(chǔ)2，得厶八=八2-八1;(4)按照公式(2)計算草酸脫羧酶的酶活，一個酶活單位定義為在30°CpH3.0，一個大氣壓下，每分鐘生成1pmol甲酸的量。體積酶活單位為U/mL。V乂AA體積酶活(U/mL)=VXAA340mn公式(2)e2xdxTxvV——最終體積(mL)T——反應(yīng)時間(min)v——待測粗酶液體積(mL)d——光路直徑(cm)s2——NADH在340nm處的吸收系數(shù)(6.3L'mmol"'cm")這種方法簡便、精確度高，是目前測定草酸脫羧酶的經(jīng)典方法。但這種方法存在耗時長、成本高的缺點(diǎn)，如第二步添加甲酸脫氫酶后的酶反應(yīng)時間需要半小時，較耗費(fèi)時間；所用的甲酸脫氫酶由于產(chǎn)量低等原因，價格昂貴，使測定草酸脫羧酶活力的成本大大增加。因此大家都在尋找一種能替代這種經(jīng)典方法，且耗時短、價格較便宜、精確度與該方法相近的測定草酸脫羧酶活力的方法。由草酸脫羧酶的催化反應(yīng)可以知道該酶活性也可以通過測定其反應(yīng)產(chǎn)物二氧化碳的量來得到。二氧化碳的測定可以利用測壓計法和酶法。測壓計法繁瑣，且對儀器要求高，而酶法是一發(fā)展方向。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種通過測定二氧化碳濃度來計算草酸脫羧酶活力的方法，該法通過測定酶反應(yīng)產(chǎn)物二氧化碳的濃度的變化得到草酸脫羧酶活力，這種測定方法與經(jīng)典方法相比，精確度相近，耗時短，價格相對便宜，有很好的實用性。本發(fā)明的一種通過測定二氧化碳濃度來計算草酸脫羧酶活力的方法，包括步驟(2)第一步酶催化反應(yīng)體系——草酸脫羧酶催化降解草酸生成甲酸和二氧化碳空白組混合0.3mL200mM醋酸緩沖液、0.1mL50mM草酸和0.1mL處理失活(沸水浴15min-20min)的草酸脫羧酶酶液待測樣品組混合0.3mL200mM醋酸緩沖液、0.1mL50mM草酸和O.lmL待測草酸脫羧酶酶液底物(v)第一步酶催化反應(yīng)體系總體積(V2)為0.5mL，反應(yīng)pH為3.0~3.7，反應(yīng)溫度為30~37°C，反應(yīng)時間(T)為30-60min;(2)第二反應(yīng)體系空白組和待測樣品組都為1.0mLCO2試劑，其CO2試劑的組成為8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mM還原型輔酶I(NADH)、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和200-300U/L的蘋果酸脫氫酶的Tris-HCl緩沖液(pH7.3~8.5);第二反應(yīng)體系在3037。C溫育5~10min，380nm條件下測定A1;(3)第三反應(yīng)體系空白組混合1.0mLCO2試劑和0.010.1mL上述第一步酶反應(yīng)空白組液(V3)待測樣品組混合1.0mLC02試劑和0.01~0.1mL上述第一步酶反應(yīng)待測樣品組液(V3)第三反應(yīng)體系總體積(Vi)為lmL+V3，30~37°C，510min，pH7.3~8.5，380nm下測定A2，計算AA:A廣A2;(4)計算草酸脫羧酶活力(U/mL)一個酶活單位定義為在3037'C，pH3.0-3.7，一個大氣壓下，每分鐘生成1pmol二氧化碳的量。體積酶活定義為每mL草酸脫羧酶酶液中的酶活力單位數(shù)，體積酶活單位為U/mL。體積酶活(U/mL)=VlXAA380nmXV2公式(1)qxdxTxvxVs其中，AA380nm=AA樣品—△A空白——最后的反應(yīng)液總體積(mL)T——第一步草酸脫羧酶反應(yīng)時間(min)v——待測酶液樣品體積(mL)V2——第一步酶反應(yīng)液總體積(mL)V3——參加第三步反應(yīng)的酶反應(yīng)液體積(mL)d——比色皿光路直徑(cm)fi——NADH在380nm處的吸收系數(shù)(1.33L'mmorLcm-1)本方法通過分光光度在380nm波長下檢測NADH濃度的變化計算二氧化碳的濃度，從而計算草酸脫羧酶的酶活力，第三步反應(yīng)中加入的第一步酶反應(yīng)液的體積可以隨待測樣品酶活力的變化而改變。本發(fā)明的測定原理是采用磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)催化碳酸氫鹽和烯醇式丙酮酸反應(yīng)，生成草酰乙酸和磷酸；草酰乙酸在蘋果酸脫氫酶(MDH)的催化下還原成蘋果酸，同時還原型輔酶I(NADH)被氧化成NAD,通過在380nm波長出測定吸光度的變化值，即可測得樣品中二氧化碳的濃度，進(jìn)而計算草酸脫羧酶活力(見圖l)。本發(fā)明的有益效果(1)利用烯醇式丙酮酸和蘋果酸脫氫酶系測定二氧化碳濃度，較簡便，相對縮短了第二步的反應(yīng)時間(5min，甲酸脫氫酶方法需要30min);(2)價格相對經(jīng)典方法便宜幾十倍，精確度與經(jīng)典方法相近。圖1是測定草酸脫羧酶活力的原理和步驟簡圖；圖2是本方法與經(jīng)典方法測定結(jié)果的比較，圖中顯示本方法結(jié)果與經(jīng)典方法結(jié)果相近，精確度較高，每組結(jié)果均為三次測量值的平均值。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實施例1按照下表l，進(jìn)行實驗。表1反應(yīng)試劑空白待測樣品反應(yīng)條件200mM醋酸0.30.3緩沖液(mL)50mM草酸(mL)0.10.1第一步酶催化反應(yīng)體系總體積(V2)為0.5待測草酸脫羧酶酶液(mL)(v)0.1mL，反應(yīng)pH為3.0，反應(yīng)溫度為3(TC，反應(yīng)時間(T)為30min草酸脫羧酶酶液(處理失0.1活)(mL)C02試劑[1]1.01.037。C溫育5min，pH8.0，380nm條件下(mL)測定Ai上述第一步酶反應(yīng)體系3總體積(V。為1.05mL，37反應(yīng)液(mL)，0.050.05。C，5min,pH8.0，380腿條件下測定v3A2，計算AA-ArA2△A380nm△A空白AA樣品△A380nm=AA樣品-AA空白計算草酸脫羧酶活力(U/mL)體積酶活(U/mL)=VlXAA38()nmxV2[2]qxdxTxvxV3[l]、C02試劑的組成8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mMNADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和200-300U/L的蘋果酸脫氫酶，Tris-HCl緩沖液，pH8.0。[2]、參見公式(1)。計算體積酶活(U/mL)=VlX-xV2=l嵐103x0.5=027嵐AxdxTxv/xV31.33x1x30x0.1x0.05按照下表2，進(jìn)行實驗'實施例2表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>[1]和[2]見實施例1,計算體積酶活(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>實施例3按照下表3，進(jìn)行實驗-表3<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>[1]和[2]見實施例1,<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>權(quán)利要求1.一種通過測定二氧化碳濃度來計算草酸脫羧酶活力的方法，包括步驟(1)第一步酶催化反應(yīng)體系空白組混合0.3mL200mM醋酸緩沖液、0.1mL50mM草酸和0.1mL處理失活的草酸脫羧酶酶液待測樣品組混合0.3mL200mM醋酸緩沖液、0.1mL50mM草酸和0.1mL待測草酸脫羧酶酶液v第一步酶催化反應(yīng)體系總體積V2為0.5mL，反應(yīng)pH為3.0～3.7，反應(yīng)溫度為30～37℃，反應(yīng)時間T為30～60min；(2)第二反應(yīng)體系空白組和待測樣品組都為1.0mLCO2試劑其CO2試劑的組成為8.0mM磷酸烯醇式丙酮酸、1.6mMNADH、1000-1200U/L磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和200-300U/L的蘋果酸脫氫酶的pH7.3～8.5Tris-HCl緩沖液；第二反應(yīng)體系在30～37℃溫育5～10min，380nm條件下測定A1；(3)第三反應(yīng)體系空白組混合1.0mLCO2試劑和0.01～0.1mL上述第一步酶反應(yīng)空白組液V3待測樣品組混合1.0mLCO2試劑和0.01～0.1mL上述第一步酶反應(yīng)待測樣品組液V3第三反應(yīng)體系總體積V1為1mL+V3，30～37℃，5～10min，pH7.3～8.5，380nm下測定A2，計算ΔA＝A1-A2；(4)計算草酸脫羧酶活力U/mL一個酶活單位定義為在30～37℃，pH3.0～3.7，一個大氣壓下，每分鐘生成1μmol二氧化碳的量，體積酶活定義為每mL草酸脫羧酶酶液中的酶活力單位數(shù)，體積酶活單位為U/mL；id="icf0001"file="S2008100346790C00011.gif"wi="62"he="9"top="211"left="39"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>公式(1)其中，ΔA380nm＝ΔA樣品-ΔA空白V1——最后的反應(yīng)液總體積(mL)T——第一步草酸脫羧酶反應(yīng)時間(min)v——待測酶液樣品體積(mL)V2——第一步酶反應(yīng)液總體積(mL)V3——參加第三步反應(yīng)的酶反應(yīng)液體積(mL)d——比色皿光路直徑(cm)ε1——NADH在380nm處的吸收系數(shù)(1.33L·mmol-1·cm-1)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過測定二氧化碳濃度來計算草酸脫羧酶活力的方法，其特征在于步驟(1)中處理失活的草酸脫羧酶酶液是通過沸水浴15min-20min處理失活。全文摘要本發(fā)明涉及一種通過測定二氧化碳濃度來計算草酸脫羧酶活力的方法，包括1)底物+草酸脫羧酶+醋酸緩沖溶液，30-37℃，反應(yīng)0.5-1h；2)配制pH7.3～8.5的含磷酸烯醇式丙酮酸、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、NADH、蘋果酸脫氫酶的Tris-HCl緩沖液，30-37℃，溫育，380nm處測A₁；3)在步驟2)中添加步驟1)反應(yīng)液，30-37℃反應(yīng)，380nm處測A₂；4)根據(jù)ΔA_380nm＝A₁-A₂計算NADH減少量，再根據(jù)反應(yīng)原理計算生成二氧化碳的濃度，從而計算草酸脫羧酶的活力。本方法可靠，靈敏度高，與測定草酸脫羧酶的經(jīng)典方法所測值相近，是一種很好的測定草酸脫羧酶酶活的方法。文檔編號G01N21/31GK101241073SQ200810034679公開日2008年8月13日申請日期2008年3月14日優(yōu)先權(quán)日2008年3月14日發(fā)明者朱翠俠,楓洪申請人:東華大學(xué)