專利名稱：：降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入高極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了一種降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入高極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法，屬于藥物質(zhì)量檢測(cè)體系。
背景技術(shù)：
：糖尿病已成為當(dāng)前世界性衛(wèi)生問(wèn)題，我國(guó)糖尿病患病率也逐年增加，新增的患者主要為2型糖尿病，口服降糖藥在這類患者的治療中占有重要的地位。近年來(lái)，臨床常用的降糖藥物有雙胍類和a-葡萄糖苷酶抑制劑等，民間也出現(xiàn)一些中藥降糖制劑，其中有些中藥制劑擅自添加西藥成分，隨意夸大療效，有的病人誤認(rèn)為這些民間中藥制劑是純中藥制劑，副作用小，可以大量服用，臨床出現(xiàn)服用這些中藥降糖藥中毒的病人。因此，有必要建立靈敏、可靠的分析方法對(duì)中藥降糖制劑中非法摻入的降糖藥進(jìn)行鑒定。降糖化學(xué)藥物一般可以分為磺酰脲類藥物、雙胍類藥物、a-糖苷酶抑制劑、噻唑烷二酮類藥物、非磺酰脲類的胰島素促進(jìn)分泌劑等幾大類，其中雙胍類藥物、a-糖苷酶抑制劑類降糖化學(xué)藥物具有較高的水溶性，極性較高，為高極性降糖化學(xué)藥物，與其它幾大類的極性有朋顯差異。雙胍類藥物的典型代表為鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍；a-糖苷酶抑制劑類藥物的典型代表為阿卡波糖、伏格列波糖。目前，已有采用高效液相色譜技術(shù)檢測(cè)降糖中藥類產(chǎn)品中摻雜的降糖化學(xué)藥物，如申請(qǐng)?zhí)枮?00610016419.l的中國(guó)專利，用高效液相色譜方法測(cè)定鹽酸甲基丙炔芐胺的含量，色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)為用十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑；甲醇-0.05mol/L磷酸二氫鉀(10。/。磷酸調(diào)pl^3)15:85為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為217nm;柱溫4(TC，理論塔板數(shù)按鹽酸甲基丙炔芐胺鋒計(jì)算，應(yīng)不低于5000。但是該專利方法適用范圍狹窄，僅能檢測(cè)鹽酸甲基丙炔芐胺一種降糖化學(xué)藥物?！?種口服降糖藥的液相色譜一質(zhì)譜分析》(分析測(cè)試學(xué)報(bào)，第19巻第6期，2000年11月，Page5—8)—文中采用以下高效液相色譜條件對(duì)二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍進(jìn)行檢測(cè)流動(dòng)相為體積比為65:35的甲醇一5mmol/L醋酸銨緩沖液(pH3.5),流速0.5ml/min;柱溫為室溫；進(jìn)樣量為20yL;《RP—HPLC檢測(cè)中藥保健品中的西藥降糖成分》(中國(guó)藥學(xué)雜志第40巻第4期，Page316—317)—文中采用RP—HPLC法對(duì)雙胍類藥物進(jìn)行檢測(cè)；色譜條件為C18色譜柱(伊立特4.6mraX250mm，5um;流動(dòng)相甲醇一離子對(duì)試液(庚烷磺酸鈉O.5056g，加三乙胺1.4mL，加水至1000mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.5±0.05)(30:70);流速1.0mLmirf1;進(jìn)樣量為10yL,40ugmL—、二極管陣列檢測(cè)器及UV檢測(cè)波長(zhǎng)233nm;柱溫為室溫;理論板數(shù)按兩個(gè)對(duì)照品峰計(jì)算應(yīng)均不低于2000;《反相液相色譜法同時(shí)測(cè)定六種降糖藥西藥成分》(現(xiàn)代科學(xué)儀器2006，6，Page89_91)—文中采用反相液相色譜法同時(shí)測(cè)定降糖樣品中的鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、格列吡嗪、格列齊特、格列本脲、格列美脲等六種降血糖西藥成分。色譜柱為AgilentC18柱，流動(dòng)相為乙腈-0.02%磷酸溶液，梯度洗脫，波長(zhǎng)229nm,流速1.0mL/min。17分鐘可實(shí)現(xiàn)六組分的完全分離，各組分在一定范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系；《液相色譜一串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定中藥降糖制劑中非法摻入苯乙雙胍和格列齊特的研究》(藥物分析雜志200525，Page1453—1455)提供了一種檢測(cè)非法慘入的苯乙雙胍和格列奇特的專屬性方法，HPLC條件為色譜柱ODSC18(250mmX4.6mm，5um);流動(dòng)相甲醇一醋酸鹽緩沖液(pH4.2)(50:50);流速l.OmLmin—、柱溫30。C;進(jìn)樣量20nL;檢測(cè)波長(zhǎng)240nm;《液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定中藥制劑中雙胍類化學(xué)藥物》(藥物鑒定第16巻第17期，Page15_16)用液相色譜-電噴霧離子阱質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定純中藥降糖制劑中非法摻入的雙胍類化學(xué)藥物，色譜條件為色譜柱AgelentC18柱(150mraX4.6mm，5ym);流動(dòng)相0.02mol/L醋酸銨溶液(將醋酸pH調(diào)至3.5)—甲醇(70:30);流速0.3ml/min;柱溫3(TC;進(jìn)樣量10uL;檢測(cè)波長(zhǎng)235nm;但是上述文獻(xiàn)中都未涉及到a-糖苷酶抑制劑類藥物阿卡波糖、伏格列波糖的檢測(cè)；《反相高效液相色譜法一二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定降糖中藥制劑中的化學(xué)藥品》(中國(guó)藥師，2005年第8巻第10期，Page827—829)應(yīng)用反相高效液相色譜法一二極管陣列檢測(cè)(RP—HPLC—_MD)測(cè)定中藥降糖制劑中可能存在的3種化學(xué)藥品一苯乙雙胍、阿卡波糖、格列本脲，色譜條件為AgilentZORB—AXODSC18(250mmX4.6腿，5um);流動(dòng)相醋酸鹽緩沖液(10mmol/L醋酸銨，20mmol/L三乙胺，用醋酸調(diào)節(jié)pH5.5)與乙腈，梯度洗脫，流速0.6mLmirT';檢測(cè)波長(zhǎng)230nm;但是該工藝需要梯度洗脫，略顯復(fù)雜，而且分離時(shí)間較長(zhǎng)，不利于快速鑒定。有鑒于此，本發(fā)明從降糖化學(xué)藥物的極性高低著手，提出了一種降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入高極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法，鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、阿卡波糖、伏格列波糖可實(shí)現(xiàn)完全分離，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入高極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法。簡(jiǎn)單的說(shuō)，本發(fā)明提供的降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入高極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法，包括(1)方法高效液相色譜法；(2)流動(dòng)相磷酸鹽一乙腈流動(dòng)相體系，由A和B組成，A為0.06X磷酸二氫鉀和0.0279%磷酸氫二鈉的混合溶液，B為乙腈，體積比A:B為30:70，流速為0.8—1.2ml/min;(3)色譜柱Hypersil氨基色譜柱，柱溫20—45。C;(4)紫外檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)波長(zhǎng)為195nm;(5)將一種或多種高極性降糖化學(xué)藥物混合，制成對(duì)照品溶液，然后進(jìn)行色譜分析，得到各種高極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間；(6)將待分析的降糖中藥類產(chǎn)品制成供試品溶液，然后進(jìn)行色譜分析；當(dāng)降糖中藥類產(chǎn)品色譜峰的保留時(shí)間和高極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間一致時(shí)，而且有明顯的吸收，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有該種降糖化藥；否則則無(wú)。其中，所述的流動(dòng)相流速優(yōu)選為1.0ml/min，所述的色譜柱柱溫優(yōu)選為3(TC。所述的Hypersil氨基色譜柱規(guī)格優(yōu)選為粒徑5um，4.6mraX250mm。所述的高極性降糖化學(xué)藥物為鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、阿卡波糖和伏格列波糖。所述的對(duì)照品溶液和供試品溶液溶劑為甲醇。所述的對(duì)照品溶液中，含濃度為10ug/ml的鹽酸二甲雙胍，濃度為5wg/ml的鹽酸苯乙雙胍，濃度為1000ug/ml的阿卡波糖，濃度為500yg/ml的伏格列波糖中的一種或多種，溶劑均為甲醇。所述供試品溶液制備過(guò)程為膠囊和片劑均取5?；?片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過(guò)濾，濾液過(guò)0.45陶濾膜，即得供試品溶液。色譜分析時(shí)進(jìn)樣量為20W。本發(fā)明的詳細(xì)描述如下鑒于目前檢測(cè)降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入降糖化學(xué)藥物的方法復(fù)雜，分離時(shí)間較長(zhǎng)，不利于快速檢測(cè)等缺點(diǎn)，申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐，從降糖化學(xué)藥物的極性高低著手，對(duì)色譜柱和流動(dòng)相等條件進(jìn)行了改進(jìn)，提供了一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高的檢測(cè)降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入高極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法。本發(fā)明采用高效液相色譜法作為檢測(cè)降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入高極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法，流動(dòng)相為磷酸鹽一乙腈流動(dòng)相體系；流動(dòng)相體系由A和B組成，A為0.06%磷酸二氫鉀和0.0279%磷酸氫二鈉的混合溶液，B為乙腈，體積比A:B為30:70，流動(dòng)相的流速為0.8_1.2ml/min;優(yōu)選1.0ml/min。色譜柱采用Hypersil氨基色譜柱，柱溫20—3(TC,優(yōu)選3(TC?？筛鶕?jù)實(shí)際需要選擇色譜柱的規(guī)格，如粒徑5um，4.6mmX250mm。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為195nm。進(jìn)樣量為2(M。操作時(shí)，首先需要將各種高極性降糖化學(xué)藥物混合，以得到對(duì)照品溶液，然后進(jìn)行色譜分析，得到各種高極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間；所謂的高極性降糖化學(xué)藥物，這里是指鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、阿卡波糖和伏格列波糖。為了方便一次性的檢測(cè)出降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入的所有高極性降糖化學(xué)藥物，也為了保持實(shí)驗(yàn)條件的一致性，避免其它因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，通常將所有高極性降糖化學(xué)藥物混合，以得到對(duì)照品溶液，對(duì)照品溶液溶劑為甲醇。如將鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、阿卡波糖和伏格列波糖溶解在甲醇中，鹽酸二甲雙胍濃度為10yg/ml，鹽酸苯乙雙胍濃度為5ug/ml，阿卡波糖濃度為1000ug/ml，伏格列波糖濃度為500yg/ml，即可得到對(duì)照品溶液。當(dāng)然也可根據(jù)實(shí)際情況選擇高極性降糖化學(xué)藥物中的一種或多種。將對(duì)照品溶液進(jìn)行色譜分析，得到色譜圖，得到各種高極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間。保留時(shí)間視所用儀器不同會(huì)略有差異，如表1所示，但只要對(duì)照品溶液和供試品溶液色譜條件完全一致，并不會(huì)影響最終結(jié)果的靈敏度。表1高極性混合樣品由不同高效液相色譜儀分析的保留時(shí)間<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>然后將待分析的降糖中藥類產(chǎn)品制成供試品溶液，以供色譜分析。供試品溶液的溶劑同樣為甲醇，其制備過(guò)程為囊和片劑均取5粒或5片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過(guò)濾，濾液過(guò)0.45Mra濾膜，即得供試品溶液。比對(duì)對(duì)照品溶液和供試品溶液的色譜圖，當(dāng)降糖中藥類產(chǎn)品色譜峰的保留時(shí)間和高極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間一致時(shí)，而且有明顯的吸收，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有該種降糖化藥；否則則無(wú)。本發(fā)明降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法，可檢測(cè)出降糖中藥類產(chǎn)品中非法慘入的高極性降糖化學(xué)藥物，鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、阿卡波糖、伏格列波糖可實(shí)現(xiàn)完全分離，具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)。圖1高極性降糖化藥對(duì)照品溶液分析色譜圖1、鹽酸苯乙雙胍2、鹽酸二甲雙胍3、伏格列波糖4、阿卡波糖圖2高極性降糖化學(xué)藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2_1鹽酸苯乙雙胍溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2—2鹽酸二甲雙胍溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2—3阿卡波糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2_4伏格列波糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施例方式實(shí)施例11、高效液相色譜條件流動(dòng)相為磷酸鹽一乙腈流動(dòng)相體系；流動(dòng)相體系由A和B組成，A為600mg磷酸二氫鉀，279mg磷酸氫二鈉溶于l升純水中，B為乙腈，體積比A:B為30:70，流動(dòng)相的流速為1.0ml/min。色譜柱為Hypersil氨基色譜柱，柱溫3(TC，規(guī)格為粒徑5pm，4.6mmX250mm。檢測(cè)波長(zhǎng)為195nm。進(jìn)樣量為20Ml。2、對(duì)照品溶液的分析將高極性降糖藥物混合在一起，配成甲醇溶液，其中阿卡波糖濃度為1000yg/ml，鹽酸苯乙雙胍濃度為5ug/ml，鹽酸二甲雙胍濃度為IOug/ml、伏格列波糖濃度為500ug/ml，分析對(duì)照品溶液的分析圖譜見圖l。3、待分析的降糖中藥類產(chǎn)品分析將待分析的降糖中藥類產(chǎn)品制成供試品甲醇溶液，制備過(guò)程為囊和片劑均取5粒或5片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過(guò)濾，濾液過(guò)0.45Mm濾膜，即得供試品溶液。然后將供試品溶液進(jìn)行色譜分析。4、比對(duì)比對(duì)供試品溶液和對(duì)照品溶液的色譜圖，當(dāng)降糖中藥類產(chǎn)品色譜峰的保留時(shí)間和高極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間一致時(shí)，而且有明顯的吸收，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有該種降糖化藥；否則則無(wú)。實(shí)施例2高效液相色譜條件中流動(dòng)相流速為0.8ml/min，柱溫2(TC，其余同實(shí)施例l。實(shí)施例3高效液相色譜條件中流動(dòng)相流速為1.2ml/min，柱溫45'C，其余同實(shí)施例l。實(shí)施例4高效液相色譜條件中流動(dòng)相流速為0.9ml/min，柱溫25'C，其余同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)例1本實(shí)驗(yàn)例是對(duì)本發(fā)明方法靈敏度、線性范圍、精密度、回收率等的考察。1、溶液的配制對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)照品，置于一定刻度的容量瓶中，用甲醇溶解后，用甲醇定容至刻度，配成指定濃度的貯備液。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液使用微量取樣器，分別向容量瓶中加入所需體積的貯備液，用甲醇稀釋至刻度，配成所需的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。供試品溶液的制備膠囊和片劑均取5?；?片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過(guò)濾，將濾液過(guò)0.45Wn濾膜后，轉(zhuǎn)入高效液相樣品瓶中，由高效液相色譜儀進(jìn)行分析。流動(dòng)相的制備稱取所需藥品的質(zhì)量，溶于一定量的純水中，用指定的酸或堿調(diào)節(jié)pH(需要時(shí)),定容，過(guò)0.45tai濾膜抽濾，超聲脫氣。2、積分條件色譜圖譜分析軟件為Class-VPversion6.1。積分參數(shù)width為5，slope為200，drift為1000。3、檢測(cè)限測(cè)定使用微量取樣器，按1的操作將精確制備的對(duì)照品溶液進(jìn)行稀釋，配成濃度不同的系列溶液，由高效液相色譜儀分別按實(shí)施例1的色譜測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，確定不同樣品的檢測(cè)限。檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果見表2。表2降糖藥物的檢測(cè)限測(cè)定結(jié)果藥品名稱進(jìn)樣體積檢出濃度(信躁比3:1)檢測(cè)限(信躁比3:1)化l)_(—I)__(ng)鹽酸苯乙雙胍200.12鹽酸二甲雙胍200.24阿卡波糖20360伏格列波糖203604、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按1的操作精確制備對(duì)照品溶液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，制備的樣品溶液由高效液相色譜儀在色譜測(cè)定條件下進(jìn)行，測(cè)定結(jié)果按2積分。以測(cè)試物濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。不同降糖藥物的線性范圍、標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)(r2)見表3。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。表3降糖化藥溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>鹽酸二甲雙胍5300Y=83949.0550X+5321.75660.9999阿卡波糖1005000Y=9700.9505X+811145.07480.9981伏格列波糖30010000Y=2835.0297X+179764.62600.99995、精密度測(cè)定按1的操作精確制備對(duì)照品低、中、高三個(gè)濃度的溶液，制備的對(duì)照品溶液由高效液相色譜儀色譜測(cè)定條件下進(jìn)行，測(cè)定結(jié)果按2項(xiàng)積分。以各樣品測(cè)定的峰面積代入相應(yīng)線性回歸方程，計(jì)算濃度。5.1日內(nèi)精密度在1日內(nèi)分別進(jìn)樣5次，計(jì)算日內(nèi)精密度。處理結(jié)果見表4。表4日內(nèi)精密度(n=5)加入量測(cè)定量RSD藥品名稱((xg/ml)((ig/ml)(%)1010.12±0.121,23鹽酸苯乙雙胍100104.58±0.300.285200193.45±0.890.4591010.08±0.262.60鹽酸二甲雙胍100100.98±0.400.402300302.49±0.300.10110059.69±3.075.07阿卡波糖10001073.31±5.370.50050004958.38±18.580.375300268.13±7.452.78伏格列波糖10001016.52±5.920.58380008084.81±10.180.1265.2日間精密度在1日內(nèi)每一樣品分析1次，連續(xù)測(cè)定5天，計(jì)算日間精密度。處理結(jié)果見表5。表5日間精密度(n=5)加入量側(cè)疋里RSD藥品名稱((ig/ml)(Hg/ml)(%)鹽酸苯乙雙胍1011.19±0.541.87<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>6、回收率測(cè)定將降糖中成藥及其它中成藥分別按供試品溶液的制備進(jìn)行處理，在降糖藥物高效液相色譜條件下進(jìn)行分析，選擇對(duì)測(cè)定降糖藥物沒(méi)有干擾的中成藥作為供試品樣品，供試品膠囊和片劑均取5粒或5片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，供試品被研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入一定量的甲醇，精確加入降糖對(duì)照品貯備液或?qū)φ掌?，配成終濃度和精密度測(cè)定濃度一致的低、中、高三個(gè)濃度的加樣樣品，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過(guò)濾，將濾液過(guò)0.45Wn濾膜后，轉(zhuǎn)入高效液相樣品瓶中，由高效液相色譜儀進(jìn)行分析。每份樣品測(cè)定l次，測(cè)定結(jié)果按2積分條件積分，將所測(cè)定的峰面積代入線性回歸方程，通過(guò)計(jì)算濃度，考察回收率。測(cè)定結(jié)果見表6。除個(gè)別化藥在低濃度時(shí)加樣回收率偏低和相對(duì)偏差較大外，不同的降糖化藥在不同的樣品中加樣回收率均保持了一個(gè)較高的水平，而且在不同中成藥中的回收率的相對(duì)偏差也較小。表6(—)鹽酸苯乙雙胍回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表6(二)鹽酸二甲雙胍回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表6(三)阿卡波糖回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表6(四)伏格列波糖回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>7、實(shí)際樣品的分析將市場(chǎng)上購(gòu)買到的降糖中成藥和保健品及部分非降糖中成藥按供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，將對(duì)照品溶液按對(duì)照品溶液的制備方法制成混合溶液，高極性降糖化藥混合溶液的濃度為阿卡波糖濃度1000Pg/ml，鹽酸苯乙雙胍濃度5ug/ml，鹽酸二甲雙胍濃度10yg/ml、伏格列波糖濃度500ug/ml，將供試品溶液在高極性降糖藥物分析條件下進(jìn)行分析，每分析3個(gè)高極性供試品溶液分析一次高極性對(duì)照品混合溶液，分析結(jié)束后，比較供試品溶液和對(duì)照品溶液的色譜峰的保留時(shí)間，色譜峰保留時(shí)間一致，而且有明顯的吸收，就可以判定該供試品中含有相應(yīng)的對(duì)照品化學(xué)添加物。分析結(jié)果見表7。表7實(shí)際樣品分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>8實(shí)際樣品的比對(duì)分析8.1不同儀器的比對(duì)分析使用不同的高效液相色譜儀，按7的處理?xiàng)l件處理后按高極性分析條件分析實(shí)際樣品，分析結(jié)果見表8。表8不同儀器對(duì)實(shí)際樣品的分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>8.2不同藥檢所對(duì)實(shí)際樣品的比對(duì)分析將樣品標(biāo)號(hào)以盲樣的形式分發(fā)給不同的藥檢所，不同的藥檢所使用高效液相色譜儀，按7的處理?xiàng)l件處理后按高極性分析條件分析實(shí)際樣品，分析結(jié)果見表9。表9不同藥檢所對(duì)實(shí)際樣品的分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>酸溶液，氨水調(diào)pH至3.5，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫表見表IO。表10液一質(zhì)聯(lián)用液相梯度洗脫表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，流速0.2ml/min。質(zhì)譜條件ESI源，源電壓4.5KV，毛細(xì)管溫度27(TC，毛細(xì)管電壓20V，鞘氣流速50arb，正離子檢測(cè)，掃描方式采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜、全掃描二級(jí)質(zhì)譜(MS2)，質(zhì)量數(shù)范圍1001000。對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)照品10mg，置于100ml的容量瓶中，加甲醇適量溶解后，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置于50ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(每lml中含對(duì)照品10ug)。供試品溶液的制備丸劑和片劑均取5?；?片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液5ml，置50ml的容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測(cè)定法分別精密吸取上述兩種溶液各10ixl注入液相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀，進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用分析，記錄液相色譜圖及一級(jí)質(zhì)譜與二級(jí)質(zhì)譜圖，通過(guò)與對(duì)照品液相色譜圖保留時(shí)間、一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜圖的對(duì)比，確定供試品中是否含有對(duì)照品物質(zhì)。分析結(jié)果見表ll。10、高效液相色譜分析結(jié)果的判定將不同儀器、不同藥檢所的分析結(jié)果和液一質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)論使用何種型號(hào)的高效液相色譜儀，也不管由那個(gè)藥檢所進(jìn)行分析，凡是液一質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢出有慘入化學(xué)降糖藥的樣品，其它的液相分析結(jié)果都顯示有該物質(zhì)明顯的吸收。由于液一質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在檢測(cè)摻雜使假方面是公認(rèn)的最有說(shuō)服力的技術(shù)，也是國(guó)家承認(rèn)的分析檢測(cè)結(jié)果，通過(guò)和液一質(zhì)聯(lián)用技術(shù)比較，可驗(yàn)證所建立的方法的準(zhǔn)確性。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，如果降糖中成藥或降糖保健品樣品中，有和化學(xué)降糖對(duì)照品保留時(shí)間一致的吸收峰，而且吸收峰明顯，就可以確定該樣品中含有摻入的降糖化藥。表ll液一質(zhì)聯(lián)用法對(duì)實(shí)際樣品的分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>11.結(jié)論使用所建立的高效液相法可用于降糖中成藥中的降糖化藥的定性分析。用于定性分析可很好的確定中成藥中摻入的降糖化藥的種類。特別是對(duì)高極性降糖化藥的分析，由于高極性降糖化藥在液相色譜保留時(shí)間非常短，高極性降糖化藥由于和溶劑峰混在一起，沒(méi)有辦法進(jìn)行分析。不法廠商也正是利用了這一點(diǎn)在降糖中成藥及保健品中摻入這些化藥，以增強(qiáng)其療效，實(shí)際樣品也確實(shí)在一些降糖中成藥及降糖保健品中檢出了鹽酸苯乙雙胍、阿卡波糖、鹽酸二甲雙胍和伏格列波糖，而且含量很高，使用這些藥物將極大的損害糖尿病患者的身體健康。本項(xiàng)目所建立的方法考察了所建立的方法靈敏度、線性范圍、精密度、回收率，結(jié)果顯示該方法有良好的重現(xiàn)性，靈敏度、回收率能夠滿足分析檢測(cè)的要求，這些因素可使該類方法很好地用于研究降糖中成藥及降糖保健品中摻入的高極性降糖化藥。權(quán)利要求1、降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入高極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法，其特征在于，包括(1)方法高效液相色譜法；(2)流動(dòng)相磷酸鹽-乙腈流動(dòng)相體系，由A和B組成，A為質(zhì)量百分比0.06％磷酸二氫鉀和0.0279％磷酸氫二鈉的混合溶液，B為乙腈，體積比A∶B為30∶70，流速為0.8-1.2ml/min；(3)色譜柱Hypersil氨基色譜柱，柱溫20-45℃；(4)紫外檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)波長(zhǎng)為195nm；(5)將高極性降糖化學(xué)藥物混合，制成對(duì)照品溶液，然后進(jìn)行色譜分析，得到各種高極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間；(6)將待分析的降糖中藥類產(chǎn)品制成供試品溶液，然后進(jìn)行色譜分析；當(dāng)降糖中藥類產(chǎn)品色譜峰的保留時(shí)間和高極性降糖化學(xué)藥物的保留時(shí)間一致時(shí)，而且有明顯的吸收，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有該種降糖化學(xué)藥物；否則則無(wú)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的定性分析檢測(cè)方法，其特征在于，所述的流動(dòng)相流速為L(zhǎng)0ml/min，所述的色譜柱柱溫為30°C。3、根據(jù)權(quán)利要求l所述的定性分析檢測(cè)方法，其特征在于，所述的Hypersil氨基色譜柱規(guī)格為粒徑5ym,4.6mmX250mm。4、根據(jù)權(quán)利要求l所述的定性分析檢測(cè)方法，其特征在于，所述的高極性降糖化學(xué)藥物為鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、阿卡波糖和伏格列波糖。5、根據(jù)權(quán)利要求l所述的定性分析檢測(cè)方法，其特征在于，所述的對(duì)照品溶液和供試品溶液溶劑為甲醇。6、根據(jù)權(quán)利要求l所述的定性分析檢測(cè)方法，其特征在于，所述的對(duì)照品溶液中，含濃度為10ug/ml的鹽酸二甲雙胍，濃度為5yg/ml的鹽酸苯乙雙胍，濃度為1000ug/ml的阿卡波糖，濃度為500ug/ml的伏格列波糖中的一種或多種，溶劑均為甲醇。7、根據(jù)權(quán)利要求l所述的定性分析檢測(cè)方法，其特征在于，所述供試品溶液制備過(guò)程為膠囊和片劑均取5?；?片，膠囊去掉膠囊殼，大蜜丸取半粒，研細(xì)或切成小塊，將藥品粉末或小塊轉(zhuǎn)入25ml容量瓶中，加入20ml甲醇，超聲處理15分鐘，冷至室溫，加甲醇定容，搖勻，過(guò)濾，濾液過(guò)0.45Mm濾膜，即得供試品溶液。8、權(quán)利要求1所述的定性分析檢測(cè)方法，其特征在于，色譜分析時(shí)進(jìn)樣量為20ri。全文摘要本發(fā)明公開了檢測(cè)降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入高極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法。本發(fā)明所提供的檢測(cè)降糖中藥類產(chǎn)品中非法摻入高極性降糖化學(xué)藥物的定性分析檢測(cè)方法，流動(dòng)相為磷酸鹽-乙腈流動(dòng)相體系；流速為0.8-1.2ml/min；色譜柱采用Hypersil氨基色譜柱，柱溫20-45℃，鹽酸二甲雙胍、鹽酸苯乙雙胍、阿卡波糖、伏格列波糖可實(shí)現(xiàn)完全分離。當(dāng)降糖中藥類產(chǎn)品中色譜峰的保留時(shí)間和降糖化藥的保留時(shí)間一致時(shí)，而且有明顯的吸收，說(shuō)明待測(cè)樣品中含有該種降糖化藥。本發(fā)明具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)。文檔編號(hào)G01N33/15GK101285802SQ20081008506公開日2008年10月15日申請(qǐng)日期2008年3月17日優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日發(fā)明者仵淑紅,劉小輝,孫建慧,朝克圖,楊秉呼,王江華,然聶,趙秀梅,棟郭,馬家華申請(qǐng)人:北京市東城區(qū)藥品檢驗(yàn)所