專利名稱：皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床血液免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種皮質(zhì)醇 化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。該試劑盒靈敏度高，特異性強，操 作簡便，穩(wěn)定可靠。
背景技術(shù)：
皮質(zhì)醇(Cortisol, Cor)是腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的糖皮質(zhì)激素，對體內(nèi)糖、 蛋白質(zhì)、脂肪的代謝以及維持機(jī)體水、電解質(zhì)平衡等一系列生命活動起重要調(diào)節(jié) 作用。同時皮質(zhì)醇也是主要的應(yīng)激性激素，在創(chuàng)傷、感染、運動、情緒激動等情 況下均有明顯的升高，各種原因的腎上腺分泌皮質(zhì)醇機(jī)能亢進(jìn)或低下，均可明顯 干擾機(jī)體的正常生理功能，產(chǎn)生特征性臨床表現(xiàn)，因此測定皮質(zhì)醇有廣泛的臨床 和科研價值。
化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)是把高靈敏的化學(xué)發(fā)光分析方法和特異性強的免疫 分析方法相結(jié)合發(fā)展起來的一項具有化學(xué)發(fā)光分析的高靈敏度和免疫分析法的 高選擇性的新的免疫分析技術(shù)。生物素-親和素系統(tǒng)(biotin-avidin system, BAS) 具有多級的信號放大作用，并且不增加非特異性干擾，且具有靈敏度高、特異性 好、穩(wěn)定性高、適用性強和實驗成本低等特點。
單純利用物理吸附把單克隆抗體包被到固相上會存在單克隆抗體用量大，活 性損失大等缺點，而且工藝優(yōu)化較為繁瑣，而將鏈親和素包被于固相載體上，將 捕獲抗體生物素化，以上問題即可迎刃而解。本發(fā)明將捕獲單克隆抗體生物素化， 用堿性磷酸酶(ALP)標(biāo)記待測皮質(zhì)醇抗原，生物素化單克隆抗體和酶標(biāo)記抗原 用稀釋液以一定比例稀釋成工作溶液。檢測操作時將血清樣品、生物素化單克隆 抗體溶液和酶標(biāo)記抗原溶液依次加入包被有鏈親和素的固相，經(jīng)過免疫反應(yīng)后， 在固相上形成的鏈親和素-生物素化抗體-待測抗原或鏈親和素-生物素化抗體-酶 標(biāo)記抗原的免疫復(fù)合物，然后加入化學(xué)發(fā)光底物，利用化學(xué)發(fā)光儀檢測相對發(fā)光 強度，就可以定量分析血清中皮質(zhì)醇的含量。
本發(fā)明通過檢測高靈敏特點的化學(xué)發(fā)光光信號，而不是傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫分析的 顯色反應(yīng)的顏色信號，其靈敏度得到大大提高，可以達(dá)到10—18mOl/mL。而繼承
了傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫分析方法的簡便操作，可實現(xiàn)大批量快檢測，適用性更廣，更易
在臨床診斷和科研工作應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒以及該試劑 盒的制備方法。
根據(jù)本發(fā)明的皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒包括皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品；鏈 親和素包被的固相；生物素化皮質(zhì)醇單克隆抗體；堿性磷酸標(biāo)記的皮質(zhì)醇抗原； 化學(xué)發(fā)光底物；以及洗滌液。
皮質(zhì)醇系列校準(zhǔn)品以小牛血清為基質(zhì)，加入皮質(zhì)醇純品配制而成。
鏈親和素溶于碳酸緩沖液，然后包被在固相栽體上，固相載體可以為包被 有微孔板、塑料珠、塑料管。
生物素化皮質(zhì)醇單克隆抗體，通過純化的皮質(zhì)醇單克隆抗體和生物素偶聯(lián)形 成，工作濃度0.02 pg/mL。
標(biāo)記抗原所用標(biāo)記酶為堿性磷酸酶，堿性磷酸酶標(biāo)記采用改良的戊二醛交聯(lián) 法，所得酶標(biāo)記抗原工作濃度為1: 1000-4000。
根據(jù)本發(fā)明的皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒制備方法，包括以下步 驟配制皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品；以鏈親和素包被固相載體，皮質(zhì)醇單克隆抗體生物素化； 以堿性磷酸酶標(biāo)記抗皮質(zhì)醇抗原；濃縮洗漆液；化學(xué)發(fā)光底物；上述半成品組分 的分裝以及組裝為成品。
l校準(zhǔn)品的配制
皮質(zhì)醇純品，加入校準(zhǔn)品基質(zhì)溶液，配制一中間濃度校準(zhǔn)品濃溶液，然后采 用逐點稀釋的方法，配制成0、 10、 40、 100、 200、 500 ng/mL的系列校準(zhǔn)品， 校準(zhǔn)品用國家標(biāo)準(zhǔn)校正。所述基質(zhì)溶液為100%小牛血清滅活、離心、過濾，加 0.1% Proclin-300。經(jīng)濃度校準(zhǔn)后的皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品，用3mL透明玻璃瓶，0.5m1/ 瓶分裝，貼上標(biāo)簽，冷凍或者2 8'C保存。
2固相載體的制備
1)包被
采用0.05mol/L， pH值為7.2的PBS與適當(dāng)濃度的皮質(zhì)醇單克隆抗體混合制 成包被液，并將其負(fù)載于固相載體上，固相載體為微孔板、塑料珠、或塑料管。
2) 封閉
配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2g NaH2P04 2H20、 2.9g NaH2P04 12H20、 100ml小牛血清和lmLProclin-300，所述封閉液的pH值為 7.0 7.4，然后將所得封閉液負(fù)載于上述洗滌后的固相載體上。
3) 分裝、保存
去除固相抗體表面的封閉溶液，放置在干燥間自然干燥，用鋁箔袋，放入干 燥劑，密封，貼上標(biāo)簽，2~8°C保存。 3酶標(biāo)記抗體的制備
酶標(biāo)記的皮質(zhì)醇抗原采用改良的戊二醛交聯(lián)法標(biāo)記堿性磷酸酶(ALP)，將 濃的酶標(biāo)記抗體，用酶稀釋液稀釋到工作濃度，所述酶用酶稀釋液稀釋成工作酶 溶液，酶標(biāo)記抗體稀釋比例為1: 1000-1: 4000。用15mL白色塑料瓶按需要分 裝，貼上標(biāo)簽，2~8°C保存。
4生物素化抗體的制備
皮質(zhì)純單克隆抗體和生物素通過偶聯(lián)反應(yīng)形成生物素化抗體，將濃的生物素 化抗體，用酶稀釋液稀釋到工作濃度，所述抗體工作溶液濃度約0.02 pg/mL。用 15mL白色塑料瓶按需要分裝，貼上標(biāo)簽，2~8°C保存
5洗滌液和發(fā)光底物分裝
洗滌液和化學(xué)發(fā)光底物，按照需要分裝，貼上標(biāo)簽，2~8'C保存。 根據(jù)本發(fā)明的方法，所述成品組裝的成品包括皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品一套，固相抗 體一包，生物素化抗體溶液一瓶，酶標(biāo)記抗原工作溶液一瓶，洗滌液一瓶，化學(xué) 發(fā)光底物一瓶，試劑盒使用說明書一張以及其它附件組裝而成。
本發(fā)明建立了人血清皮質(zhì)醇的檢測方法，可以定量檢測出病人血清內(nèi)的皮質(zhì) 醇含量，并且根據(jù)皮質(zhì)醇含量的多少輔助判斷疾病的治療效果及其病情變化。該 皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒的各項指標(biāo)均達(dá)到同類進(jìn)口試劑盒的分析 法水平，靈敏度高、特異性好，操作簡便，穩(wěn)定可靠。


圖1為實施例1所制備的試劑盒中的校準(zhǔn)品線性圖(附圖濃度單位ng/mL)。
具體實施例方式
實施例1制備本發(fā)明的皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒
一、皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品的制備 以小牛血清為基質(zhì)，將提純的人精液槳濃原料以國家標(biāo)準(zhǔn)品為準(zhǔn)系列稀釋而 成。小牛血清使用前需要56。C滅活30分鐘，加入O. l%Proclin-300。分裝濃度 范圍為0、 10、 40、 100、 200、 500 ng/mL的校準(zhǔn)品共6瓶。
二、 酶標(biāo)皮質(zhì)醇抗原的制備
(1)改良的戊二醛交聯(lián)法標(biāo)記堿性磷酸酶(ALP)
1) 取ALP 1. Omg和皮質(zhì)醇抗原2. Omg，分別溶于生理鹽水中，混合，最終 體積控制在0. 50ml;
2) 加入0.50ml 1%的戊二醛，室溫磁力攪拌15min后，避光反應(yīng)4h;
3) 加入1.Omol/L的乙醇胺O. 10ml，室溫溫育2h;
4) 4t:條件下用PBS加磁力攪拌過夜透析，更換透析液兩次；
5) 將透析產(chǎn)物移入試劑瓶加入等體積甘油，混勻，加入WBSA，密閉冷凍 保存?zhèn)溆谩?br> (2) 酶標(biāo)抗原稀釋液
lOOOmL酶稀釋液里含有磷酸二氫鈉0.2 g，磷酸氫二鈉2.9 g，氯化鈉8.8 g, BSA 5g， Proclin-300 lml。 pH調(diào)整到7. 0-7. 2。
(3) 酶標(biāo)記抗體工作溶液濃度選定
試驗證明，采用方陣法選擇酶標(biāo)抗原的工作濃度范圍為1:1000 4000。
(4) 酶標(biāo)記抗體工作溶液制備
用所述(2)稀釋液，按照(3)所述稀釋比例，將濃酶標(biāo)記抗原稀釋成工作 溶液。
三、 以鏈親和素包被固相載體 (1)包被
釆用0. 05 mol/L pH值為7. 2的PBS與適當(dāng)濃度的鏈親和素混合制成包被液， 并將其負(fù)載于固相載體上；
具體地，所述包被方法可以包括
可采用1000mL的0. 05mol/L pH值為7. 2的PBS包含2. 2g的磷酸二氫鈉，
12.9克的磷酸氫鈉和9克氯化鈉的去離子水溶液，與適當(dāng)濃度的鏈親和素混合 制成包被液，然后加入微孔板各孔中，每孔110yL， 4'C過夜，將其負(fù)載于固相 載體上；
(2)封閉
將稱量好的NaH2P04 2H20 0. 2g， Na2HP04 12H20 2 . 9g,小牛血清lOOmL放 入潔凈容器中，加雙蒸水定容至1000ml，溶解混勻，調(diào)整pH值為7.0-7.2。
每孔分別加入封閉液300pL，室溫放置3小時。甩掉封閉液，室溫除濕干燥 24小時，進(jìn)行真空封袋。貼簽后置2 8'C保存。
四、 生物素化皮質(zhì)醇單克隆抗體制備 (1)生物素化皮質(zhì)醇單克隆抗體制備
1) 將生物素(BNHS)溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)配成lmg/mL;
2) 用0.1mol/L pH值為9.0的NaHC03將純化的皮質(zhì)醇單克隆抗體稀釋為 2mg/mL;
3) 按BNHS與抗體容積比為1: 7或重量比1: 5混合，室溫攪拌下反應(yīng)2
4h;
4) 裝入透析袋，用0.05mol/LpH值為7.2的PBS4'C過夜透析，結(jié)合物加等 體積甘油，-20°。以下保存?zhèn)溆谩?br> (2)生物素化皮質(zhì)醇單克隆抗體工作溶液配制
將(1)所得濃生物素化抗體用稀釋液稀釋到0.2pg/mL，備用。
五、 化學(xué)發(fā)光底物液
本發(fā)明所使用的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法
在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0. lmol/L pH8. 5的Tris-HCl緩沖液。 在1000mL此緩沖液中加入NaCl 160g， KC1 4g， AMPPD 200ml ，加0. 1%的 Proclin-300，混合均勻，分裝后直接使用。
六、 20倍濃縮洗滌液
將稱量好的Na2HP04 12H20 58g， NaH2P04 2H20 2g， NaCl 160g，放入干凈 的容量瓶里，用去離子水定容至lOOOrnL，加入Tween-20和Proclin 300各1 mL 調(diào)整pH至7.2 7.4，分裝備用。
七、 半成品及成品組成
上述步驟所得半成品以及必需的產(chǎn)品說明書等附件經(jīng)分裝組裝成為成品試 劑盒。本發(fā)明試劑盒中的校準(zhǔn)品為液體；標(biāo)記物也是已經(jīng)稀釋到工作濃度的工作 溶液，固相抗體為提前包被好的，均可以直接使用。
實施例2 3制備本發(fā)明的皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒
除以分別以塑料珠、塑料管作為載體外，其余均以與實施例1相同的方法制 備皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒。
實施例4本發(fā)明的試劑盒的使用方法
使用本試劑盒進(jìn)行實驗前，需先取出固相抗體、校準(zhǔn)品/檢測樣品、標(biāo)記物 溶液在室溫放置15 30分鐘，使它們平衡到室溫；之后，準(zhǔn)備好合適的微量加
樣器及對應(yīng)吸頭并且檢査化學(xué)發(fā)光儀以及輔助儀器，如洗板機(jī)等，是否正常工作。
使用本試劑盒按照實施例1的方法進(jìn)行實驗的具體操作步驟如下
1) 將實驗需要的板條(己包被好鏈親和素，96/48孔可拆為12/6*8*1孔) 放置在板架上；
2) 反應(yīng)孔中分別加待測樣品和各濃度校準(zhǔn)品，校準(zhǔn)品每孔加0、 1.0、 4.0、 10.0、 20.0、 50.0 Pg/dL各25nl，每次試驗設(shè)空白1孔，然后除空白孔外各孔 加生物素化抗體和酶標(biāo)記抗原溶液50^11;
3) 微量振蕩器上振蕩30秒混勻；
4) 室溫(18-26。C)溫育45分鐘；
5) 棄去孔中溶液，用自動洗板機(jī)或者手工洗板5次，在吸水紙上拍干；
6) 每孔加發(fā)光底物50 jil，振蕩混勻，室溫(22 28°C)反應(yīng)30 90分鐘；
7) 用化學(xué)發(fā)光儀測相對發(fā)光值(RLU),測量時間O. 1-l秒/孔；
8) 分別對校準(zhǔn)品濃度和對應(yīng)RLU取對數(shù)，在建立的雙對數(shù)曲線上建立標(biāo)準(zhǔn)曲 線(見附圖1)，以各待測血清RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出該血清皮質(zhì)醇的濃度， 計算檢測結(jié)果；
9) 打印檢測結(jié)果報告。
實施例5本發(fā)明的試劑盒的方法學(xué)鑒定
按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的試劑盒進(jìn)行鑒定， 經(jīng)過大量的實驗證明，本發(fā)明的試劑盒在用于Cor濃度水平測定時，該方法學(xué)指 標(biāo)如下
項目
標(biāo)準(zhǔn)
實施例6本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對
本發(fā)明的試劑和國外權(quán)威試劑對873份臨床血清樣品檢測結(jié)果總符合率達(dá) 99.9%，數(shù)據(jù)如下
本發(fā)明試劑檢測結(jié)果 — 陰性(-)陽性(+ ) 合計 國外試劑陰性(-) 632 0 632
檢測結(jié)果陽性(+) 2 239 241
合計 634 239 873
從所列出兩種試劑檢測結(jié)果數(shù)據(jù)分析，本發(fā)明試劑檢測結(jié)果陰性中有2份陰 性和國外權(quán)威試劑檢測結(jié)果不符，這一差異可能由于試劑采用的免疫原料或檢測 體系靈敏度不同引起的。
本發(fā)明的試劑盒所用樣品量少， 一次檢測只要25^1，體外檢測對測試對象 沒有任何毒副作用。同時本發(fā)明釆用的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法，不產(chǎn)生放射性 污染，各指標(biāo)也優(yōu)于目前廣泛應(yīng)用的酶聯(lián)免疫吸附分析方法(ELISA)。和國外權(quán) 威診斷試劑分析結(jié)果相符合。本發(fā)明靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡 單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測實驗 室。 .
圍 0 50 Mg/dL
最小檢出限為0.5 Pg/dL
分析內(nèi)精密度(高、低兩個質(zhì)量控制范圍)均小于8% (n=10)， 分析間精密度(高、低兩個質(zhì)量控制范圍)均小于10% (n=10) 準(zhǔn)確性 加標(biāo)回收率在90 110%之間
范度度
測敏密
檢靈精
權(quán)利要求
1.一種皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品；鏈親和素包被固相載體；生物素化皮質(zhì)醇單克隆抗體；堿性磷酸標(biāo)記的皮質(zhì)醇抗原；化學(xué)發(fā)光底物；以及洗滌液。
2、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述鏈親和素包被的固相載 體為微孔板、塑料珠或塑料管。
3、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述堿性磷酸酶對應(yīng)化學(xué)發(fā) 光底物為1,2-二氧乙垸類衍生物。
4、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物1,2-二氧 乙垸類衍生物為(金剛烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧 基)苯基-l， 2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。
5、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光底物為溶液， 其包含24gTris、 160gNaCl、 4g KC1、 15mL HC1、 200mL 3-(2'-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯基-l， 2-二氧乙烷(AMPPD)、 lmLProclin300、 lOOOmL 雙蒸水。
6、 一種制備權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟 皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品的配制；在固相載體上包被鏈親和素，皮質(zhì)醇單克隆抗體生物素化； 皮質(zhì)醇抗原上標(biāo)記酶；濃縮洗滌液的配制；上述皮質(zhì)醇校準(zhǔn)品、鏈親和素包被固 相、生物素化抗體、酶標(biāo)記的皮質(zhì)醇抗原、化學(xué)發(fā)光底物和洗滌液的分裝；以及 組裝為成品。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述鏈親和素包被固相載體的 制備包括以下步驟(1)包被采用0.05 mol/L pH值為7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)與適當(dāng)濃度的鏈親和素混合制成包被液，并將其負(fù)載于固相載體上；(2) 封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2g NaH2P(V2H20、 2.9g NaH2P04'12H20、 lOOmL小牛血清和lmLProclin-300，所述封閉液的pH值為7.0 7.4，然后將所得封閉液負(fù)載于上述洗滌后的固相載體上。
8、 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述鏈親和素包被的固相載體 為微孔板，塑料珠或塑料管。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種皮質(zhì)醇化學(xué)發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法，用于血清中皮質(zhì)醇的定量分析。本發(fā)明的試劑盒即有效的采用生物素-親和素系統(tǒng)保證了免疫反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，也利用化學(xué)發(fā)光技術(shù)確保了檢測的靈敏度。
文檔編號G01N33/577GK101368972SQ200810103268
公開日2009年2月18日 申請日期2008年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月2日
發(fā)明者于尚永, 唐寶軍, 應(yīng)希堂, 根 石, 胡國茂, 鄭金來 申請人:北京科美東雅生物技術(shù)有限公司