用于測定酶活性的電化學(xué)發(fā)光(ecl)檢測試劑和相關(guān)方法
【專利說明】用于測定酶活性的電化學(xué)發(fā)光（ECL)檢測試劑和相關(guān)方法
[0001] 優(yōu)先權(quán)
[0002] 本申請要求2013年2月25日提交的美國臨時(shí)專利申請系列號(hào)61/769, 044和2013 年6月28日提交的美國臨時(shí)專利申請系列號(hào)61/840, 820的權(quán)益，通過參考將其每一個(gè)的 全部內(nèi)容并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開內(nèi)容大體上涉及開發(fā)用于檢測和定量測定生物樣品中的酶的檢測試劑和 基于電化學(xué)發(fā)光（ECL)的檢驗(yàn)以及試劑測試試劑盒。具體而言，本公開內(nèi)容涉及使用具有 電化學(xué)發(fā)光官能團(tuán)的含二硫基的檢測試劑（disulfide-containing detection reagent) 檢測和測定樣品中的酶活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0004] 血液或血漿中的酶活性的測定可以是顯示疾病狀況和風(fēng)險(xiǎn)因子的有用檢測和預(yù) 測工具?？梢栽谂R床環(huán)境中進(jìn)行的血液和血漿酶活性檢驗(yàn)可用于快速確定哪些患者會(huì)接受 例如抑制劑（在病理學(xué)酶過度活躍的情況下），或者它們可用作組織損傷、疾病病理的診斷 指標(biāo)，或者用于檢測毒性酶抑制劑的存在。
[0005] 存在標(biāo)準(zhǔn)臨床化學(xué)檢驗(yàn)以測定臨床相關(guān)酶活性或酶抑制劑的存在。這些檢驗(yàn)中 的一些可以通過改變反應(yīng)混合物中NADPH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的還原形式）或 NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的還原形式）的量而測定靶向酶活性，無論直接進(jìn)行還是通 過另外的反應(yīng)混合物酶和底物進(jìn)行，所述另外的反應(yīng)混合物酶和底物將靶向酶的活性測定 值與NADH或NADPH的變化關(guān)聯(lián)起來。目前，這些檢驗(yàn)使用顏色變化或其它已知的檢測方法 來獲得其定量檢測讀數(shù)。然而，需要能夠?qū)εR床化學(xué)酶活性進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光（ECL)測定的 檢測試劑和方法，通過將檢測試劑二硫鍵的切割與例如NADPH、NADH或游離巰基的變化關(guān) 聯(lián)起來，所述檢測試劑和方法能夠用于提供酶活性的所需定量檢測讀數(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本公開內(nèi)容大體上涉及一種檢測試劑，其包含具有可切割二硫鍵的分子，該分子 具有在所述二硫鍵的第一側(cè)的具電化學(xué)發(fā)光（ECL)活性的釕螯合物，和在所述二硫鍵的第 二側(cè)的固定性部分（immobilizing moiety)。
[0007] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容涉及一種檢測試劑，其中，所述檢測試劑的二硫鍵 能夠被游離巰基切割。
[0008] 本公開內(nèi)容大體上涉及檢測試劑的制備方法，所述方法包括：對具有可切割二硫 鍵的分子，在所述二硫鍵的第一側(cè)附接具電化學(xué)發(fā)光（ECL)活性的釕螯合物，在所述二硫 鍵的第二側(cè)附接固定性部分。
[0009] 本公開內(nèi)容大體上涉及檢測試劑的制備方法，所述方法包括：在第一分子和第二 分子之間形成可切割二硫鍵；對所述第一分子附接電化學(xué)發(fā)光官能團(tuán)；和對所述第二分子 附接固定性部分。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容涉及檢測試劑的制備方法，其中，所述檢測試劑的 二硫鍵能夠被游離巰基切割。
[0011] 本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中產(chǎn)生的NADPH的方法，所述方法包括：將具有 二硫鍵的檢測試劑、所述樣品和NADPH催化的二硫化物還原酶組合來形成反應(yīng)混合物，其 中在NADPH的存在下所述檢測試劑的二硫鍵被所述還原酶切割，其中所述檢測試劑含有在 所述二硫鍵的第一側(cè)的具ECL活性的釕螯合物和在所述二硫鍵的第二側(cè)的固定性部分， 其中所述切割產(chǎn)生具有所述具ECL活性的釕螯合物的第一切割產(chǎn)物和具有所述固定性部 分的第二切割產(chǎn)物，且其中所述還原酶進(jìn)行的切割與在所述樣品中產(chǎn)生的NADPH的量成 比例；并且測定ECL信號(hào)的不存在、存在或振幅（amplitude)，其中，ECL信號(hào)的不存在或 量級減少表明在所述樣品中存在NADPH，并且其中最大ECL信號(hào)表明在所述樣品中不存在 NADPH0
[0012] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中產(chǎn)生的NADPH的方法，其 中，產(chǎn)NADPH酶是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中產(chǎn)生的NADPH的方法，其 中，切割二硫化物的還原酶選自谷胱甘肽還原酶和錐蟲胱甘肽還原酶。
[0014] 本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中產(chǎn)NADPH酶的活性的方法，所述方法包括：(a) 將所述樣品、NADP+、和對所述樣品內(nèi)的待測定酶特異的底物組合，以在從產(chǎn)生NADPH的條 件下形成反應(yīng)混合物；(b)將步驟（a)的所述反應(yīng)混合物與谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽二 硫化物在將谷胱甘肽二硫化物還原成還原形谷胱甘肽的條件下組合；（c)將步驟（b)的所 述反應(yīng)混合物與含二硫基的檢測試劑組合，所述檢測試劑具有在所述二硫鍵的第一側(cè)的具 ECL活性的釕螯合物和在所述二硫鍵的第二側(cè)的固定性部分，其中所述含二硫基的檢測試 劑由還原型谷胱甘肽非酶促地切割，其中由還原型谷胱甘肽進(jìn)行的切割與在所述樣品中產(chǎn) 生的NADPH的量成比例；和（d)測定ECL信號(hào)的不存在、存在或振幅，其中ECL信號(hào)的不存 在或量級減少表明在所述樣品中存在產(chǎn)NADPH酶，并且其中最大ECL信號(hào)表明在所述樣品 中不存在產(chǎn)NADPH酶。
[0015] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中產(chǎn)NADPH酶的活性的方 法，其中，步驟（a)在適于特定反應(yīng)的規(guī)定溫度下以規(guī)定時(shí)間進(jìn)行。
[0016] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中產(chǎn)NADPH酶的活性的方 法，其中，所述二硫化物可切割還原酶選自谷胱甘肽還原酶和錐蟲胱甘肽還原酶。
[0017] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中產(chǎn)NADPH酶的活性的方 法，其中，產(chǎn)NADPH酶是葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。
[0018] 本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中酯酶活性的方法，所述方法包括：在下述條件 下將反應(yīng)混合物組合，其包括含有酯酶的所述樣品、酯酶底物的硫酯類似物和含二硫基的 檢測試劑，所述含二硫基的檢測試劑具有在所述二硫鍵的第一側(cè)的具ECL活性的釕螯合物 和在所述二硫鍵的第二側(cè)的固定性部分，所述條件是使得所述底物的硫酯類似物被所述反 應(yīng)混合物中的酯酶脫?；?，從而產(chǎn)生激活的底物類似物，所述激活的底物類似物具有暴 露的脫?；坞x巰基，所述脫酰基化游離巰基切割所述含二硫基的檢測試劑的二硫鍵， 產(chǎn)生的可檢測ECL信號(hào)的變化與所述反應(yīng)混合物中的酯酶活性成比例；和測定ECL信號(hào)。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中酯酶活性的方法，其中，所 述酯酶是Lp-PLA2 (血小板激活因子乙酰水解酶）。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中酯酶活性的方法，其中，底 物的硫酯類似物選自硫代-血小板激活因子（PAF)、溶血-硫代-PAF(lys〇-thi〇-PAF)、硫 代乙酰膽堿、硫代丙酰膽堿和硫代丁酰膽堿。
[0021] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中酯酶活性的方法，其中，所 述固定性部分是生物素。
[0022] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中酯酶活性的方法，其中，所 述組合步驟進(jìn)一步包括組合洗滌劑。
[0023] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中酯酶活性的方法， 其中，所述洗滌劑選自CHAPS((膽酰胺丙基）二甲氨基]-1-丙磺酸鹽）和Triton? X-100 (4-(1，1，3, 3-四甲基丁基）苯基-聚乙二醇、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇 叔辛基苯基醚）。
[0024] 在一些實(shí)施方式中，本公開內(nèi)容大體上涉及測定樣品中酯酶活性的方法，其中，所 述方法還包括在組合步驟之后且在測定步驟之前調(diào)整pH的步驟。
[0025] 本公開內(nèi)容大體上涉及用于執(zhí)行本文所述方法的試劑盒。在一些實(shí)施方式中，所 述試劑盒可以包括：含二硫基的檢測試劑；酯酶底物的硫酯類似物；和用于執(zhí)行酯酶活性 測定檢驗(yàn)的說明書，所述酯酶活性測定檢驗(yàn)包括下述步驟：以在下述條件下將反應(yīng)混合物 組合，所述反應(yīng)混合物包括含有酯酶的所述樣品、酯酶底物的硫酯類似物和含二硫基的檢 測試劑，所述含二硫基的檢測試劑具有在所述二硫鍵的第一側(cè)的具ECL活性的釕螯合物和 在所述二硫鍵的第二側(cè)的固定性部分，所述條件是使得所述底物的硫酯類似物被所述反應(yīng) 混合物中的酯酶脫?；?，從而產(chǎn)生激活的底物類似物，所述激活的底物類似物具有暴露 的脫醜基化游尚疏基，所述脫醜基化游尚疏基切割所述含^硫基的檢測試劑的^硫鍵，廣 生的可檢測ECL信號(hào)的變化與所述反應(yīng)混合物中的酯酶活性成比例；和測定ECL信號(hào)。
【附圖說明】
[0026] 本說明書中包含所附表和圖，其構(gòu)成本說明書的一部分。
[0027] 圖IA是使用二硫硝基苯甲酸（DTNB)作為底物的比色檢驗(yàn)的示意性圖示。
[0028] 圖IB是使用谷胱甘肽二硫化物（GssG)作為檢測試劑的ECL檢驗(yàn)的示意性圖示。
[0029] 圖2是從實(shí)施例7描述的二硫化物反應(yīng)收集的數(shù)據(jù)的圖形圖示，其顯示GssG切割 (% )v. s.酶濃度（ng/mL)。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 檢測試劑
[0031] 本公開內(nèi)容提供一種檢測試劑，其用于檢測和測定酶活性的檢驗(yàn)和方法。該檢測 試劑允許在標(biāo)準(zhǔn)的基于電化學(xué)發(fā)光（ECL)的檢驗(yàn)中測定酶活性，并且可用于檢驗(yàn)組（assay panel)和用于即時(shí)儀器上。所述檢測試劑可以是具有可切割二硫鍵或一S- S-的二硫化 學(xué)基團(tuán)的分子或化合物。在一些實(shí)施方式中，檢測試劑可以具有在二硫鍵的第一側(cè)上的至 少一種電化學(xué)發(fā)光官能團(tuán)，例如具電化學(xué)發(fā)光（ECL)活性的釕螯合物。在一些實(shí)施方式中， 檢測試劑可以具有在二硫鍵的第二側(cè)上的固定性部分。
[0032] 在一些實(shí)施方式中，檢測試劑的二硫鍵能夠被通過反應(yīng)混合物中的組分的反應(yīng)而 暴露出的游離巰基切割。反應(yīng)混合物中的組分可以包括諸如酶、底物或代謝物等至少一種 未知被分析物、檢測試劑、緩沖液和檢驗(yàn)試劑，以及諸如血液、血漿、血清、紅細(xì)胞裂解物、唾 液、尿和組織提取物等生物樣品。當(dāng)將反應(yīng)混合物的組分混合時(shí)，在一些實(shí)施方式中可以創(chuàng) 建條件，該條件使得酶獨(dú)立地或與反應(yīng)混合物中的其它組分聯(lián)合起作用，并最終暴露游離 巰基。然后游離巰基可以切割具有電化學(xué)發(fā)光官能團(tuán)的檢測試劑的二硫鍵。在一些實(shí)施方 式中，檢測試劑能夠與樣品和/或反應(yīng)混合物中存在的酶的量成比例地被切割。
[0033] 電化學(xué)發(fā)光官能團(tuán)可以充當(dāng)檢測標(biāo)記或標(biāo)簽，其可以在ECL反應(yīng)室（如在流式細(xì) 胞儀中的ECL反應(yīng)）內(nèi)或在一次性電極上被檢測或定量。固定性部分可以用于在檢測過程 中將檢測試劑保持在ECL反應(yīng)室中的ECL電極附近。因此，例如，當(dāng)檢測試劑的二硫鍵被 切割時(shí)，電化學(xué)發(fā)光官能團(tuán)可以從固定性部分脫離，并因此當(dāng)其可以在檢驗(yàn)洗滌步驟中被 沖洗掉時(shí)變?yōu)椴荒鼙粰z測。這于是可減少通過對ECL反應(yīng)室中的ECL激活電極施加電壓 而產(chǎn)生的ECL信號(hào)。電化學(xué)發(fā)光官能團(tuán)和固定性部分都可以直接連接在二硫鍵上或通過連 接中間體而間接