專利名稱：輔助確診老年性癡呆癥的試劑盒及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種輔助診斷老年性癡呆癥的試劑盒及其方法。
技術(shù)背景老年性癡呆癥，即阿爾茨海默氏病(簡稱AD),是危害性極大的疾病， 不僅造成患者記憶力減退直至完全喪失，還導(dǎo)致患者的生活自理能力喪失、 并發(fā)癥產(chǎn)生以致死亡。它嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，給社會和家庭帶來沉重 的負(fù)擔(dān)。AD不僅危害性大，而且發(fā)病率高。據(jù)估計全世界AD患者接近2000 萬，在美國已成為僅次于心血管疾病、癌癥和卒中的第4大死因；加拿大 60歲以上的老年人中有25%患不同程度的癡呆；我國AD的發(fā)病率也與西 方國家接近。但是目前國際范圍內(nèi)針對這一危害性大、發(fā)病率高的疾病仍無 有效診斷與治療的方法。長期以來AD的診斷一直是依靠排除法，雖然老年性癡呆患者腦組織有 其病理特征，但生前尚無可靠的診斷標(biāo)志，缺乏有效的實驗室診斷指標(biāo)。目 前對其診斷不僅要符合癡呆緩慢進(jìn)行性發(fā)展的臨床表現(xiàn)，在結(jié)合CT、 MRI 等輔助證據(jù)綜合分析的基礎(chǔ)上，還要必需根據(jù)病史、病程、體檢和輔助檢查 的資料進(jìn)行綜合分析，排除可引起癡呆的其他軀體和腦的疾病，如血管性癡 呆、腦炎后遺癥性癡呆、腦外傷后遺癥性癡呆等之后才能得出AD的臨床診 斷，因此其診斷和治療存在很大的主觀性和盲目性。而對AD的確診除了根 據(jù)臨床表現(xiàn)做出癡呆的診斷之外，尚有賴于患者死亡后對腦組織的病理檢查 來幫助判斷。但是AD和正常衰老的神經(jīng)病理變化目前尚無精確的區(qū)分界線， AD的神經(jīng)病理變化都可見于正常老人，只是病變的量和范圍不同，所以目 前的病理學(xué)檢測難以有效輔助AD的確診。因此，需要尋找能夠有效的用于病理;險查的方法以輔助AD的確-珍的AD相關(guān)的分子標(biāo)志。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種有效的老年性癡呆癥的病理學(xué)分子標(biāo)志，以便 在結(jié)合各種臨床診斷的基礎(chǔ)上，利用該分子標(biāo)志輔助確診老年性癡呆癥。本 發(fā)明的另一個目的是提供一種利用該分子標(biāo)志輔助診斷老年性癡呆癥的方 法及其試劑盒。本發(fā)明提供了一種提示老年性癡呆癥的可能性的分子標(biāo)志物，即抗氧化修復(fù)基因mutT同源基因2 (mutT homologue 2， MTH2 )及其所表達(dá)的蛋白 (MTH2蛋白)，其中MTH2蛋白表達(dá)水平的顯著降低提示老年性癡呆癥的 存在。本發(fā)明提供了 一種輔助確診老年性癡呆癥的試劑盒，其中包括mutT同源基 因2所表達(dá)的MTH2蛋白的特異性抗體作為第一抗體。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方 式中，該試劑盒中進(jìn)一步包含用于免疫組化反應(yīng)^^測所必需的試劑或用于免疫 印跡法檢測所必需的試劑。其中所述免疫組化反應(yīng)檢測所必需的試劑或免疫印 跡法檢測所必需的試劑包括用標(biāo)記物標(biāo)記的能與所述第一抗體結(jié)合的第二抗 體和;險測所述標(biāo)記物所必需的試劑。其中所述標(biāo)記可為熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、方文 射性同位素標(biāo)記或膠體金標(biāo)記。其中所述酶標(biāo)記可為辣根過氧化物酶標(biāo)記。本發(fā)明還提供了 一種輔助確診老年性癡呆癥的方法，包括用免疫學(xué)方法4全 測樣品中mutT同源基因2所表達(dá)的MTH2蛋白的水平，其中所述樣品取自已 經(jīng)死亡的人或哺乳動物的腦組織，特別是海馬區(qū)，最好是海馬的CA1和CA3要包括如下步驟制備抗MTH2蛋白的特異性抗體作為第一抗體；使所述第一抗體與樣品中 的MTH2蛋白結(jié)合；和檢測與MTH2蛋白結(jié)合的第一抗體的水平。其中所述檢測第 一抗體水平的步驟包括使用標(biāo)記的能與所述第 一抗體結(jié) 合的第二抗體與第一抗體結(jié)合，和檢測與第一抗體結(jié)合的第二抗體的標(biāo)記。其中所述標(biāo)記的第二抗體采用熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、》文射性同位素標(biāo)記或膠體金標(biāo) 記。其中所述酶標(biāo)記為辣根過氧化物酶標(biāo)記。其中所述哺乳動物為SAMP8小鼠。上述免疫印跡法具體包括如下主要步驟提取樣品總蛋白；取所述總蛋白 做蛋白質(zhì)電泳；將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到膜上；將帶有樣品中所述蛋白的膜與抗 MTH2的特異性抗體一起孵育雜交；和檢測結(jié)合到所述MTH2蛋白的所述抗 MTH2的特異性抗體；其優(yōu)選的實驗條件分別為電泳200嗎總蛋白上樣， 80 V濃縮，150 V分離；轉(zhuǎn)膜20 mA恒流2h;雜交室溫封閉6h， 1:800稀 釋抗MTH2抗體。所述免疫組化法的步驟主要包括封閉非特異性結(jié)合位點；加入抗 MTH2蛋白的特異性抗體，使該抗體與樣品中的MTH2蛋白結(jié)合；檢測結(jié)合 到樣品中MTH2蛋白上的抗MTH2蛋白的抗體，從而測得樣品中MTH2蛋白的存在情況。其中所述抗MTH2抗體可為標(biāo)記過的抗體，通過4全測其標(biāo)記物來測得樣品 中MTH2的存在情況。所述檢測結(jié)合到樣品中MTH2蛋白上的抗MTH2抗體的方法還可為用標(biāo) 記好的第二抗體與所述第 一抗體結(jié)合，然后檢測與第一抗體結(jié)合的第二抗體上 的標(biāo)記物，乂人而測得樣品中MTH2的存在情況。所述免疫組化法的步驟還可包括在封閉步驟之前對樣品的初步處理，使 樣品中的MTH2蛋白暴露并盡可能去除可能影響檢測的各種雜質(zhì)。上述標(biāo)記物為焚光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記或膠體金標(biāo)記等免疫 組化中常用的標(biāo)記方法。所述酶標(biāo)記可為辣根過氧化物酶標(biāo)記。采用本發(fā)明的方法或試劑盒檢測待測樣本中的MTH-2蛋白水平并與正常 樣本比較，如果待測樣本的MTH2蛋白水平顯著低于其對應(yīng)的正常的水平，即， 具有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著性差異，則提示待測樣本可能來自患有AD的人或動 物。本發(fā)明還提供了所述方法在檢測與確診老年性癡呆癥中的應(yīng)用，以及所述試劑盒在^r測與確診老年性癡呆癥中的應(yīng)用。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明的具有客觀、準(zhǔn)確、針對性強的優(yōu)點，彌補了現(xiàn)在沒有嚴(yán)格的AD與正常衰老的神經(jīng)病理區(qū)分界線的不足，可以作為輔助 診斷中的病理檢測中的分子標(biāo)志。并且其優(yōu)選的免疫學(xué)方法檢測靈敏、操作 簡單、迅速，特別適用于病理4企查。通過本發(fā)明的檢測方法，選用了在老年性癡呆病程中特異性蛋白分子 MTH2，通過操作簡單、4支術(shù)成熟的免疫印跡和免疫組化方法，可以在很短 的時間內(nèi)檢測到其特征性表達(dá)是否顯著下降，從而有針對性的提示了老年性 癡呆的發(fā)病。另外，本發(fā)明的測定是基于目的蛋白的表達(dá)量下降，而現(xiàn)有技 術(shù)中用到的作為分子標(biāo)志的相關(guān)蛋白的表達(dá)水平在AD患者中顯示為增加， 本發(fā)明這種下降的指標(biāo)更具顯著性，從而增加了檢測和輔助診斷的準(zhǔn)確性。


圖1為說明SAMR1、 SAMP8小鼠海馬中MTH2的表達(dá)情況的免疫組 化結(jié)果的顯微鏡照片，其中，Rl列指不同月齡SAMR1小鼠海馬25倍放大 圖，P8列指不同月齡SAMP8小鼠海馬25倍放大圖，對照組為未用MTH2 抗體孵育的空白對照，標(biāo)尺200(im(25x);圖2A為說明不同月齡SAMR1和SAMP8小鼠海馬CA1區(qū)MTH2蛋白 的表達(dá)的免疫組化結(jié)果的顯微鏡照片，其中對照組未用MTH2抗體孵育； Rl列表示SAMR1小鼠表達(dá)的MTH2蛋白的免疫組化結(jié)果；P8列為SAMP8 小鼠表達(dá)的MTH2蛋白的免疫組化結(jié)果；標(biāo)尺為10 pm;圖2B為說明不同月齡SAMR1和SAMP8小鼠海馬CA1區(qū)MTH2蛋白 的表達(dá)的免疫組化結(jié)果的光密度值的統(tǒng)計分析圖，*表示P<0.05, SAMP8 小鼠與同月齡SAMR1鼠比較MTH2蛋白的表達(dá)具有顯著性差異；#表示 尸<0.05, SAMP8小鼠與同品系1月齡小鼠比較MTH2蛋白的表達(dá)有顯著性 差異；R1指SAMR1小鼠，P8指SAMP8小鼠；圖3A為說明不同月齡SAMR1和SAMP8小鼠海馬CA3區(qū)MTH2蛋白的表達(dá)的免疫組化結(jié)果的顯微鏡照片；其中對照組為未用MTH2抗體孵育的 空白對照；Rl列為SAMR1小鼠MTH2蛋白表達(dá)；P8列為SAMP8小鼠MTH2 蛋白表達(dá)；標(biāo)尺為10圖3B為不同月齡SAMR1和SAMP8小鼠海馬CA3區(qū)MTH2蛋白的表 達(dá)的免疫組化結(jié)果的光密度值的統(tǒng)計分析圖，*表示尸<0.05: SAMP8小鼠與 同月齡SAMR1小鼠比較MTH2蛋白表達(dá)有顯著性差異；#表示戶〈0.05: SAMP8小鼠與同品系1月齡小鼠比較MTH2蛋白表達(dá)有顯著性差異；Rl指 SAMR1小鼠，P8指SAMP8小鼠；圖4為說明人海馬組織CA1區(qū)MTH2蛋白的免疫組化學(xué)結(jié)果的顯微鏡 照片，其中顯示了已經(jīng)死亡的AD患者和年齡相匹配的未患AD的正常人對 照組海馬CA1區(qū)MTH2蛋白表達(dá)的100倍放大圖和400倍放大圖，對照組 用抗體稀釋液代替抗MTH2蛋白抗體孵育；圖5A為MTH2在SAMR1和SAMP8小鼠海馬中表達(dá)的免疫印跡結(jié)果； 結(jié)果顯示MTH2蛋白在分子量約20kD處可見單一條帶，作為內(nèi)對照的a-微管蛋白的表達(dá)在兩系小鼠各月齡組均一致；圖5B為MTH2在SAMR1和SAMP8小鼠海馬中表達(dá)的免疫印跡結(jié)果 的光密度值的統(tǒng)計分析圖，R1指SAMR1小鼠，P8指SAMP8小鼠；*尸<0.05: SAMP8小鼠與同齡SAMR1小鼠比較有顯著性差異；#P<0.05: SAMP8小鼠 與同品系1月齡小鼠比較有顯著性差異。具7本實施方式研究表明，衰老伴隨有人腦組織的萎縮和認(rèn)知功能的下降，而AD患者的腦 萎縮比正常人更為迅速，其功能損害程度也更加嚴(yán)重。雖然AD發(fā)病的分子機制 目前仍不清楚，但是AD的氧化應(yīng)激學(xué)說已為越來越多的研究者所認(rèn)可，活性氧、自由基作為細(xì)胞代謝過程中的正常中間產(chǎn)物，不僅可以氧化脂質(zhì) 和蛋白質(zhì)，還可造成DNA["的氧化損傷。在DNA的氧化損傷中8-oxo-G是最重要 的致突變物質(zhì)[4]，它與胞嘧啶核苷和腺噪呤核苷配對的效率幾乎是相等的[5],從而導(dǎo)致了DNA突變及其轉(zhuǎn)錄的錯誤W。由于占體重2 - 3%的腦組織的耗氧量占 人體總耗氧量的20%[7],因此神經(jīng)元對氧化應(yīng)激尤為敏感。研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦 組織中8-oxo-G的含量顯著高于正常對照組問，這不但證明了DNA氧化損傷與 AD致病的相關(guān)性，也提示DNA氧化修復(fù)機制缺陷可能在AD致病過程中可能起重要作用。生物體具有完善的機制以對抗活性氧、自由基對DNA的氧化損傷。大腸桿 菌MutM的表達(dá)產(chǎn)物DNA糖香酶可識別并切除DNA鏈上錯誤的8-oxo-G; MutY 基因編碼的腺噤呤DNA糖香酶則通過清除與8-oxo-G錯誤配對的A來修復(fù)氧化 損傷；核苷酸代謝池中的8-oxo-dGTP可被MutT降解為8-oxo-dGMP,使其在DNA 復(fù)制時不能被利用。人類也有類似的機制，人體內(nèi)與大腸桿菌MutM、 MutY和 MutT相對應(yīng)的蛋白分別為hOGG 1 、 MYH和hMTH 1 。目前的研究結(jié)果顯示AD患者腦組織各區(qū)域hOGGl的表達(dá)均明顯降低，海 馬CA1、 CA3區(qū)hMTHl的表達(dá)量也顯著減少,。最近我們克隆成功了新的抗氧 化修復(fù)基因MTH2，其表達(dá)產(chǎn)物具有與MTH1相同的、將變異源性物質(zhì) 8-oxo-dGTP水解為8 -oxo-dGMP的活性,乂人而可4中制8-oxo-dGTP在DNA復(fù)制時 的錯誤摻入，起到了預(yù)防DNA突變發(fā)生的作用。本研究的免疫印跡實驗結(jié)果顯示MTH2在對照組(SAMR1 )小鼠海馬內(nèi)持 續(xù)高表達(dá)，而在快速老化小鼠(SAMP8小鼠)海馬內(nèi)隨月齡增加而顯著下降， 自8月齡開始顯著低于同品系1、 4月齡的表達(dá)及同齡對照鼠的表達(dá)，而且MTH2 蛋白表達(dá)量下降的結(jié)果同步于SAMP8'J、鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降的結(jié)果。對SAMP8 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力增齡性變化的研究結(jié)果顯示，SAMP8小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力隨 月齡增長而顯著減退；與同齡對照組相比，8、 12月齡的SAMP8小鼠出現(xiàn)明顯 衰老特征，表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退["]。以上結(jié)果提示海馬神經(jīng)元細(xì)胞中MTH2蛋白表達(dá)量的下降可能是促進(jìn) SAMP8小鼠快速老化的一個重要原因。為證實這一結(jié)論，進(jìn)一步用免疫組化的 方法，對快速老化動物模型SAMP8海馬CA1和CA3區(qū)MTH2的表達(dá)分別進(jìn)行了 研究，并用臨床病理已確診的AD病例進(jìn)行了驗證。研究結(jié)果表明，MTH2蛋白水平與老年性癡呆癥呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，即老年性癡呆癥患者的MTH2蛋白表達(dá)水平 明顯下降。MTH2蛋白的表達(dá)水平可以作為檢測和輔助診斷老年性癡呆癥的一 種有效指標(biāo)。本說明書中術(shù)語"免疫學(xué)方法"是指基于抗原抗體反應(yīng)的檢測方法，包 括免疫組化、免疫印跡等方法。術(shù)語"免疫組化相關(guān)試劑"是指常規(guī)免疫組化檢測所需的各種試劑，例 如各種緩沖液、顯色液、酶反應(yīng)底物等。例如對于辣4艮過氧化物酶標(biāo)記來說， 其底物溶液可為二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液。術(shù)語"免疫印跡相關(guān)試劑"是指常規(guī)免疫印跡檢測所需的各種常規(guī)試劑， 例如各種緩沖液等，如電泳緩沖液、洗滌用的TBS-T緩沖液等。術(shù)語"標(biāo)記"指免疫學(xué)方法中常用的各種標(biāo)記方法，例如熒光標(biāo)記， 即將抗體上標(biāo)記例如FITC等熒光素，通過檢測熒光的強度來確定目的蛋白 的量；酶標(biāo)記，即將抗體用如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶等酶標(biāo)記，再加存在下氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾(氨基苯二酰一肼)，用于免疫印跡，用照 相底片來感光來檢測；或更優(yōu)選使用ECL溶液作為底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 并檢測曝光)；放射標(biāo)記，例如1125標(biāo)記的二抗、I125標(biāo)記的金黃色葡萄球 菌蛋白A (可以與IgG的Fc區(qū)特異性結(jié)合，代替二抗)等；膠體金標(biāo)記； 以及利用生物素等的其他改進(jìn)的使;險測更加靈壽文的標(biāo)記方法，例如生物素-鏈霉菌抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶法、卯白素-生物素-辣根過氧化物酶法 等等。在本發(fā)明的一個實施方式中，采用免疫學(xué)方法來檢測樣品中MTH2蛋白的 水平。首先制備抗MTH2的特異性抗體，在本發(fā)明的一個實施方式中，設(shè)計特 定引物，克隆并表達(dá)純化MTH2蛋白。然后用該MTH2蛋白免疫動物制備其特異 性抗體。然后利用該抗體檢測樣品中MTH2蛋白水平與對照比較是否有顯著性 下降，從而輔助確診AD。所述免疫組化的方法可以包括已知的各種常規(guī)免疫組化方法，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員早已掌握的。如可以采用標(biāo)記好的抗MTH2特異性抗體與樣品中的 MTH2蛋白相結(jié)合，該標(biāo)記可以用例如熒光標(biāo)記，然后在紫外光下檢測焚光強 度，；^而推測樣品中MTH2蛋白的水平。在一個優(yōu)選的實施方式中，在抗MTH2特異性抗體(第一抗體)與樣品中 的MTH2蛋白相結(jié)合之后，用標(biāo)記好的針對該抗MTH2抗體的二抗再與之結(jié)合， 進(jìn)而檢測該二抗上的標(biāo)記物以獲得樣品中MTH2蛋白的水平。其中所述二抗的 標(biāo)記方法可為熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、反射標(biāo)記和月交體金標(biāo)記，優(yōu)選采用酶標(biāo)記， 更優(yōu)選采用辣根過氧化物酶標(biāo)記。最優(yōu)選，先用生物素標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合， 再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素與二抗結(jié)合，底物溶液采用DAB溶液。 另一優(yōu)選的實施方式中，可采用卯白素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物(ABC) 法進(jìn)^"所述免疫組化^f企測。在本發(fā)明的另 一 個實施方式中，采用免疫印跡的方法來檢測AD相關(guān)蛋白一 —MTH2蛋白的水平。其中已知的免疫印跡技術(shù)均可用于本發(fā)明所述的方法中。 在一個優(yōu)選的實施方式中，免疫印跡法中采用標(biāo)記好的金黃色葡萄球菌蛋白A 與已經(jīng)結(jié)合到樣品中的MTH2蛋白上的特異性一抗相結(jié)合，優(yōu)選所述蛋白A用 1125標(biāo)記，然后通過放射自顯影方式檢測。在更優(yōu)選的實施方式中，所述免疫印跡法中采用堿性磷酸酶或者更優(yōu)選釆 用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗。當(dāng)為辣根過氧化物酶標(biāo)記時，其檢測方法為在 &02存在下，氧化化學(xué)發(fā)光物質(zhì)魯米諾，然后在化學(xué)增強劑的存在下，將膜放 在照相底片上進(jìn)行顯影檢測。更優(yōu)選使用ECL溶液作為底物進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 并斗企測曝光。應(yīng)說明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員可明確地了解到各種常規(guī)的免疫組化技術(shù)和 免疫印跡技術(shù)均可用于本發(fā)明中，在此不再對各種常規(guī)的免疫組化技術(shù)和免疫 印跡技術(shù)——描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解其中所做的各種變通也落在本發(fā) 明的保護(hù)范圍之內(nèi)。下面結(jié)合具體實施例來說明本發(fā)明。實施例1 MTH2基因的克隆含有全長小鼠MTH2基因cDNA的I.M.A.G,E.克隆(克隆號1432009 )購于 KURABO公司。根據(jù)GenBank EST數(shù)據(jù)庫(No. AA987002 )用PCR方法擴增獲 得小鼠MTH2全長cDNA。引物T2P: (5'-TGCTCTAGATGGCCGCTAACG-3'); T2R ( 5'-CCCAAGCTTCAAGGAGTCTTCG-3')。用工具酶Xbal和HindIII切割后插入載體pTT100中，從而構(gòu)建 pTT00::mMTH2質(zhì)粒。用引物T2Pxa ( 5'-ATAGAAGGTAGAATGGCCG CTAACGCAGAG-3')和T2R擴增pTT100::mMTH2質(zhì)粒，將His-tags標(biāo)簽的編碼 序列引入mMTH2基因的末端5'產(chǎn)生融合基因。擴增產(chǎn)物克隆入pQE30UA載體。實施例2 MTH2蛋白的表達(dá)、純化和兔抗鼠MTH2抗體的制備與鑒定用實施例1中制備的pQE30-mMTH2轉(zhuǎn)化五.Co// Ml5細(xì)胞，制備His-tag小鼠 MTH2融合蛋白。用親和柱層析法分離獲得該融合蛋白。用約200 pg MTH2融 合蛋白免疫家兔制備抗MTH2的抗血清，4周后加強1次(100 (ig)，此后每隔l 周加強1次共3次。經(jīng)硫酸銨沉淀法獲得免疫球蛋白后，用親和色語法純化洗脫， 并經(jīng)Tris緩沖溶液透析獲得特異性兔抗鼠MTH2抗體，即一抗。取純化融合蛋白 經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用制備的兔抗鼠MTH2抗體按常規(guī) 免疫印跡步驟鑒定抗體的特異性，可在約20kDa處見單一條帶。實施例3免疫組化法檢測模型小鼠MTH2蛋白表達(dá)水平 1.試劑0.2MPB溶液，pH值7.2 7.4，高壓滅菌，另根據(jù)需要稀釋該PB溶液至所 需濃度；0.1MPBS: 0.1 M PB中加入氯化鈉，使氯化鈉濃度為0.8。/。 ( g/ml), 高壓滅菌，另根據(jù)需要稀釋該PBS溶液；4。Z。多聚曱醛(PFA)溶液，pH7.2~7.4， 4。C保存；PB蔗糖溶液取一定量蔗糖溶于O.l M PB中制備所需濃度的PB蔗糖 溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；標(biāo)本保護(hù)液量取25ml乙二醇和25ml甘油，加0.1MPB定容至100ml， -20。C保存；0.3 % 1202溶液1 m13 % &02加去離子水至IO ml, 4°C 避光保存。其余免疫組化用試劑購自中杉金橋生物技術(shù)有限公司。2. 動物處理1、 4、 8、 12月齡的SAMR1和SAMP8品系小鼠每組各8只，其中SAMR1小 鼠為老化速度正常的對照小鼠，SAMP8小鼠為老年癡呆癥模型小鼠(即快速老 化模型小鼠)。用1 %戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射小鼠麻醉。剪開小鼠胸腔暴露心臟 后迅速經(jīng)左心室插入針頭并固定，迅速剪開右心耳后快速灌注4。C 0.1 M PB約 50 ml。繼續(xù)灌注4。C預(yù)冷的4 %PFA溶液約100 ml。水上快速剝離腦組織，置于4 y。PFA溶液4。C繼續(xù)固定過夜。將腦組織置于15。/。PB蔗糖溶液，待其沉落底部后 轉(zhuǎn)移至20 % PB蔗糖溶液，再次沉落底部后轉(zhuǎn)移至30 % PB蔗糖溶液并保存其中。 用水包埋組織塊，水凍切片機40 iam連續(xù)冠狀切片。將切片置于標(biāo)本保護(hù)液中 -2(TC保存。3. 免疫組化挑選兩側(cè)海馬形狀對稱，能夠完整顯示海馬各區(qū)的切片進(jìn)行實驗，挑選的 切片轉(zhuǎn)移至24孔培養(yǎng)板內(nèi)。用O.Ol MPBS(如非特別注明，下述用于洗滌的PBS 均為0.01M)洗切片3遍，每次3 min，以洗掉殘留在切片上的標(biāo)本保護(hù)液。0.3 %&02避光蜉育切片30 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶。用0.01MPBS洗滌，每 次3min,共洗3次，以去除殘留的11202。封閉用正常山羊血清室溫孵育l h,以封閉非特異性位點。吸棄封閉液后滴 加實施例2中制備的兔抗鼠MTH2抗體(1:200稀釋)，之后置4。C水箱內(nèi)孵育過夜 (空白對照組僅用抗體稀釋液代替抗體孵育)。用O.Ol M PBS充分洗滌，每次3 min,共洗3次，以去掉未結(jié)合的一抗。用生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG (第二抗體) 室溫孵育l h。 0.01 MPBS洗去二抗后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫 孵育l h。PBS充分洗滌后用DAB顯色，嚴(yán)格控制顯色時間MTH2檢測顯色l分35sec 后PBS中止顯色。PBS洗去DAB后小心將切片裱到載玻片上，室溫晾干30min。常規(guī)梯度脫水二甲苯透明75 % 、 85 % 、 95 % 、 100 %和l00 %乙醇各5 sec 梯度脫水；二甲苯透明三次，每次10min,每次換用新鮮的二甲苯。中性樹膠封 片后室溫晾干長期保存。4.小鼠海馬組織中MTH2表達(dá)的結(jié)果1)海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)MTH2表達(dá)的定位參見圖l, MTH2在胞漿和胞核均有表達(dá)，但主要在胞漿表達(dá)；海馬不同區(qū) 域均有表達(dá)，尤以CA1和CA3區(qū)表達(dá)明顯，而僅用抗體稀釋液孵育的空白對照 組則未見陽性著色(見圖l對照組)。2 )海馬CA1區(qū)MTH2表達(dá)的免疫組化結(jié)果的平均光密度分析參見圖2A,可見1月齡、4月齡SAMP8小鼠與同月齡SAMR1小鼠相比 MTH2表達(dá)的差異不是很明顯，而8月齡以后的SAMP8小鼠的MTH2蛋白表 達(dá)水平明顯低于同月齡的SAMR1小鼠的MTH2蛋白表達(dá)水平。從定量的平均光密度分析結(jié)果來看，見圖2B，其中*指SAMP8小鼠與同月 齡SAMR1小鼠比較，MTH2的表達(dá)具有顯著性差異(P<0.05 ); #指SAMP8小 鼠與同品系1月齡小鼠比較MTH2的表達(dá)有顯著性差異(尸<0.05 )。統(tǒng)計學(xué)分析表明，SAMR1系不同月齡組間MTH2表達(dá)量沒有顯著性差異 (尸>0.05 )(見圖2A )，而SAMP8系MTH2表達(dá)從8月齡開始隨月齡增加而顯 著降低(P0.05)(見圖2A: 8月齡；圖2B ),持續(xù)下降至12月齡(P<0.05)，(見 圖2A: 12月齡；圖2 B ),即8月齡顯著低于4月齡，12月齡顯著低于8月齡 (P<0.05 )。與月齡匹配對照組相比，1月齡、4月齡SAMR1與SAMP8間MTH2 的表達(dá)量沒有顯著差異(P>0.05 )，當(dāng)達(dá)到8月齡時MTH2在兩系之間表達(dá)量的 差異達(dá)到顯著性水平(P<0.05)， 8月和12月齡SAMP8鼠分別顯著低于同齡 SAMR1鼠。3 )海馬CA3區(qū)MTH2表達(dá)的免疫組化結(jié)果的平均光密度分析 統(tǒng)計學(xué)分析表明，SAMR1系不同月齡組間MTH2表達(dá)量無顯著性差異()(見圖3A和B: R1歹'J )， SAMP8鼠MTH2表達(dá)也從8月齡開始顯著下降 CPO.05)(見圖3A:8月齡；圖3:B),但之后下降緩慢，穩(wěn)定在8月齡的低水平表達(dá)，即12月齡和8月齡相比表達(dá)無顯著性差異(尸>0.05)(見圖3 A: 12月齡；圖3 B )。 l月齡、4月齡的SAMR1與SAMP8間MTH2的表達(dá)量沒有顯著差異(尸>0.05 )， 當(dāng)達(dá)到8月齡時MTH2在兩系表達(dá)量差異顯著(PO.05), 8月和12月齡SAMP8 鼠分別顯著低于同月齡的SAMR1鼠。對SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力增齡性變化的研究結(jié)果顯示，SAMP8小鼠的學(xué) 習(xí)記憶能力隨月齡增長而顯著減退；與同齡對照組相比，8、 12月齡的SAMP8 小鼠出現(xiàn)明顯衰老特征，表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力明顯減退[11],即表現(xiàn)為老年性癡 呆的癥狀。而上述對MTH2蛋白表達(dá)的結(jié)果表明，在其表現(xiàn)為老年性癡呆癥狀 的同時，(8月齡、12月齡)，MTH2蛋白的表達(dá)水平明顯降低，從而證明了MTH2 蛋白與老年性癡呆癥的相關(guān)性。實施例4 免疫組化檢測AD病人海馬中MTH2表達(dá)情況1. 試劑各免疫組化所用試劑購于中杉金橋生物技術(shù)有限公司。2. 海馬標(biāo)本準(zhǔn)備從北京醫(yī)院病理尸體解剖標(biāo)本中取臨床病理確診AD病例和年齡匹配的正 常死亡人的石蠟包埋海馬組織，6 pm石蠟切片。37°C烤片2 h后室溫保存。3. 免疫組化步驟將石蠟切片脫蠟至水，0.3 % 11202室溫15 min清除細(xì)胞內(nèi)的過氧化物酶。PBS 洗3次，洗去殘留的11202。正常山羊血清室溫封閉2h。兔抗小鼠MTH2抗體1:50 稀釋，4。C過夜將育。PBS洗3次，洗棄殘留的抗體。生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG室 溫孵育l h。 PBS洗3次。用HRP標(biāo)記的鏈酶卵白素室溫孵育1 h。 PBS洗3次。DAB 顯色，PBS洗3次終止顯色。常規(guī)梯度脫水二曱苯透明。中性樹脂封片。4. AD海馬組織中MTH2表達(dá)的結(jié)果參見圖4的100倍放大圖，可見正常組海馬組織中MTH2的表達(dá)明顯高于 AD組。進(jìn)一步經(jīng)400倍放大可見MTH2主要在胞漿表達(dá)，且正常組中表達(dá)量 明顯高于AD病例組。而未經(jīng)抗MTH2抗體孵育的空白對照組無任何陽性染色，結(jié)果見圖4。該結(jié)果進(jìn)一步驗證了 MTH2蛋白的表達(dá)情況與AD的相關(guān)性，即AD病人 中的MTH2蛋白表達(dá)水平明顯降低。實施例5 SAM小鼠海馬中MTH2蛋白的免疫印跡檢測1. 動物處理SAMR1和SAMP8品系1 、 4、 8、 12月齡組動物每組8只，1%戊巴比妥 鈉(30 mg/kg, i.p.)麻醉后斷頭。水上迅速分離海馬放入預(yù)先標(biāo)記好的凍存管中， 液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?. 組織勻漿從液氮中取出組織，將適量組織塊(200 ~ 300 mg )放在一平皿中并加入適 量裂解液，用剪刀剪^^卒組織塊。用4。C預(yù)冷的PBS洗滌組織，4°C, 3,000 g離 心5min。棄上清，紙巾上輕扣，如有需要，多次重復(fù)洗滌至上清基本無血紅蛋 白的紅色，以清除血紅蛋白，減少其對組織總蛋白的影響。按5倍組織體積加入預(yù)冷的裂解液，玻璃勻漿器中進(jìn)行組織勻漿(以上步 驟均需水上操作)。10,000 g， 4°C離心15min,取上清。留取少量(10iil)做 蛋白濃度測定。其余蛋白溶液立即加入1/4總蛋白體積的5xSDS上樣緩沖液。沸水中煮蛋 白5min。 -20。C保存。3. 蛋白濃度測定使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度，按其說明書操作。4. 蛋白質(zhì)電泳取總蛋白溶液根據(jù)測得的蛋白濃度稀釋，后做SDS-PAGE電泳。根據(jù)目的 蛋白分子量選擇12%的分離膠，5%的積層膠。5. 轉(zhuǎn)膜根據(jù)凝膠大小，切6張Whatman 3 MM濾紙和1張硝酸纖維素濾膜(NC 膜)。將預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液倒入小盒。依次放入3張3MM濾紙，NC膜，3張3MM濾紙。浸泡5min。然后取3張3 MM濾紙放在石墨板上，玻璃棒趕盡氣 泡；將凝膠從電泳槽中取出，放到一盤純水中。用小鑷子撬開玻璃板，凝膠在 水中漂洗后沿溴酚藍(lán)上沿切去凝膠下方?jīng)]有蛋白的多余凝膠。之后在轉(zhuǎn)移緩沖 液中略微漂洗后放在濾紙上，對齊后趕盡氣泡。將NC膜放到膠上，趕盡氣泡， 將最后3張3 MM濾紙放到NC膜上，趕氣泡。接通電源，按照0.65 mA/cm2穩(wěn) 流電轉(zhuǎn)2h。轉(zhuǎn)膜完成之后切斷電源，去掉濾紙，NC膜在去離子水中漂洗。6. 雜交NC膜轉(zhuǎn)移到雜交袋中，根據(jù)濾膜面積以0.1 ml/cm"每張膜約10 ml左右) 的量加入封閉液，盡可能排除氣泡后封口，搖床上搖動2h。用封閉液稀釋第一 抗體至合適的濃度，封閉結(jié)束后，將硝酸纖維素濾膜轉(zhuǎn)移至另一雜交袋中，按 0.1 ml/ciT^加第一抗體溶液，盡量去除袋內(nèi)所有氣泡，用封膜機封上開口后4。C 搖床孵育過夜。剪開塑料袋，棄去反應(yīng)液，TBS-T洗5次，每次10min。用封 閉液稀釋HRP標(biāo)記二抗，濃度為1:2000。室溫溫育2h后TBS-T洗膜5次，每 次10min。7. 啄光按每平方厘米NC膜0.125 ml反應(yīng)液等量混合ECL反應(yīng)液A和B ，將NC 膜取出后在濾紙上稍沾以吸棄多余的水，蛋白面向上放置在保鮮膜上，將ECL 反應(yīng)液均勻加到膜上，靜置5min。棄反應(yīng)液后將NC膜轉(zhuǎn)移到暗匣中壓片，所 有X光片曝光均5min。顯影5min后水漂洗一次，定影5min，最后室溫晾干保存。8. 蛋白質(zhì)電泳及免疫印跡法檢測的條件優(yōu)化1) 轉(zhuǎn)膜條件優(yōu)化MTH2:分別20 mA恒流1 h, 2 h， 3 h，過夜。最后選得最優(yōu)為2h。2) 裂解液優(yōu)化選才奪因不同的組織裂解液的裂解能力有強有弱，對抗蛋白酶降解的能力也不同， 可能需要針對組織作適當(dāng)調(diào)整，故優(yōu)化裂解液條件。 配方0.25MNaCl0.05 M Tris-CI (pH 7.6)0.005 MEDTA(pH 8.0)l%NP-400.05 M NaF1 ng/ml Aprotinin100 |ag/ml PMSF此外，也可以使用華特生蛋白提取試劑盒RIPA和華特生蛋白提取試劑盒 全細(xì)胞裂解液。優(yōu)選使用本發(fā)明的配方，因為自己配制的裂解液的效果與上述 商購試劑盒無明顯差異，但成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于試劑盒。3)上樣量條件選擇目前關(guān)于MTH2蛋白在小鼠及其他動物體內(nèi)的表達(dá)情況尚未見文獻(xiàn)報道， 本研究中通過對上樣量進(jìn)行細(xì)致的優(yōu)化，最終選擇200 |ig總蛋白上樣以檢測 MTH2的表達(dá)。優(yōu)化后的條件為200(ig總蛋白上樣，80V濃縮，150V分離，20 mA恒 流轉(zhuǎn)膜2h。室溫封閉6 h后兔抗小鼠MTH2 1:800稀釋，山羊抗兔IgG-HRP 二 抗1:2000稀釋。9.結(jié)果分析根據(jù)以上條件，對各月齡組SAMR1和SAMP8小鼠海馬中MTH2的表達(dá) 進(jìn)行研究，免疫印跡的結(jié)果照片請見圖5A。用Scion Image軟件，對SAMR1和SAMP8小鼠海馬MTH2表達(dá)的條帶進(jìn) 行灰度分析定量。統(tǒng)計學(xué)分析表明，SAMR1對照組內(nèi)比較方差分析PX).05,提 示各月齡組之間無顯著性差異；SAMP8實驗組組內(nèi)比較方差分析尸<0.05，提 示SAMP8小鼠海馬中MTH2的表達(dá)隨月齡增加而顯著降低，其中4月齡表達(dá) 量顯著低于l月齡，8月齡顯著低于4月齡，而12月齡又顯著低于8月齡，至 12月齡海馬總蛋白中MTH2的表達(dá)量已極少。參見圖5B。對同月齡SAMR1與SAMP8組間t檢驗統(tǒng)計表明，兩品系之間的差異從4 月齡即開始表現(xiàn)出顯著性，此后差異迅速擴大?；叶确治鼋Y(jié)果顯示，8月齡SAMP8海馬中MTH2的量下降為1月齡鼠的43%,而12月齡鼠僅為1月齡鼠 的4.3%。該結(jié)果與免疫組化的結(jié)果一致。在實施例3和5中，通過對AD動物模型的研究可以看出，MTH2在對照 組小鼠海馬CA1和CA3區(qū)神經(jīng)元胞漿內(nèi)持續(xù)高表達(dá)，而在快速老化小鼠海馬 內(nèi)隨月齡增加而顯著下降，且MTH2蛋白表達(dá)量下降SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能 力的下降同步。免疫組化結(jié)果與免疫印跡研究的結(jié)果相符合，進(jìn)一步提示海馬 神經(jīng)元細(xì)胞中MTH2蛋白表達(dá)量的下降與SAMP8小鼠的快速老化及學(xué)習(xí)記憶 能力的減退的相關(guān)性。而在實施例4中，通過對AD患者海馬標(biāo)本的研究，可以看出相似的變化 趨勢，即AD組中MTH2的表達(dá)明顯低于正常對照組，進(jìn)一步證實了對動物模 型研究的結(jié)論，即MTH2表達(dá)量下降與癡呆的發(fā)生有明顯的相關(guān)性。綜上所述，免疫組化檢測結(jié)果和免疫印跡結(jié)果均顯示，海馬中MTH2表達(dá) 量下降是老年性癡呆有用的診斷標(biāo)志。所以，本發(fā)明所述的免疫學(xué)方法檢測可 以用來確診AD。應(yīng)理解的是，雖然在本說明書中結(jié)合具體實施方式
和具體實驗條件解釋了 本發(fā)明，但是這些具體實施方式
和條件僅僅為說明的目的，而非用于限制本發(fā) 明的范圍，在本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的范圍內(nèi)對實驗條件所作的各種改變也落在 本發(fā)明所保護(hù)的范圍內(nèi)。參考文獻(xiàn)[1] Cai JP， Ishibashi T, Takagi Y, et al. Mouse MTH2 protein which prevents mutations caused by 8-oxoguanine nucleotides. Biochem Biophys Res Commun， 2003,305:1073-1077,[2] 黃艷，董志.氧化應(yīng)激和阿爾茨海默病.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2005， 10 (5):485-488.[3] Wang S， Xiong J, Xie C， et al. Increased oxidative damage in nuclear and mitochondrial DNA in Alzheimer's disease. Journal of Neurochemistry， 2005， 93， 953—962.[4] Demple B， Harrison L. Repair of oxidative damage to DNA: enzymology and biology. A纖Rev Biochem, 1994， 63:915-948.[5] Maki H, Sekiguchi M. MutT protein specifically hydrolyses a potent mutagenic substratefor DNA synthesis. Nature, 1992, 355(6357):273-275.問 Shibutani S, Takeshita M, Grollman AP. Insertion of specific bases during DNA synthesispast the oxidation-damaged base 8-oxodG. Nature, 1991, 349(6308):431-434.[7] Zhu X, Raina AK， Lee HG, et al. Oxidative stress signalling in Alzheimer's disease. Brain Res, 2004, 1000:32-39.[8] Mecocci P， MacGarvey U, Beal MF. Oxidative damage to mitochondrial DNA is increasedin Alzheimer's disease. Ann Neurol, 1994, 36:747—751. [9] Lovell MA, Xie C， Markesbery WR. Decreased base excision repair and increased helicaseactivity in Alzheimer's disease brain. Brain Res, 2000, 855(1):116-123. [10] Furuta A, Iida T, Nakabeppu Y, et al. Expression of hMTHl in the hippocampi of controland Alzheimer's disease. Neuroreport， 2001, 12(13):2895-2899. [11] 蔡劍平，黑愛蓮.快速老化癡呆模型小鼠SAMP8學(xué)習(xí)記憶能力的增齡性變化.中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2005， 12(4):219-222.
權(quán)利要求
1. 一種輔助確診老年性癡呆癥的試劑盒，其中包括mutT同源基因2所表達(dá)的MTH2蛋白的特異性抗體作為第一抗體。
2、 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，進(jìn)一步包括用于免疫組化反應(yīng)檢測所必需 的試劑或用于免疫印跡法檢測所必需的試劑。
3、 如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其中所述免疫組化反應(yīng)檢測所必需的試劑 或免疫印跡法檢測所必需的試劑包括用標(biāo)記物標(biāo)記的能與所述第一抗體結(jié)合 的第二抗體和檢測所述標(biāo)記物所必需的試劑。
4、 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述標(biāo)記物為熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、放 射性同位素標(biāo)記或膠體金標(biāo)記。
5、 如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中所述酶標(biāo)記為辣根過氧化物酶標(biāo)記。
6、 一種輔助確診老年性癡呆癥的方法，包括用免疫學(xué)方法^r測樣品中mutT 同源基因2所表達(dá)的MTH2蛋白的水平，其中所述樣品取自已經(jīng)死亡的人或哺 乳動物的腦組織。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述免疫學(xué)方法為免疫組化法或免疫印 跡法。
8、 如權(quán)利要求7所述的方法，其中包括步驟 制備抗MTH2蛋白的特異性抗體作為第一抗體； 使所述第一抗體與樣品中的MTH2蛋白結(jié)合；和 檢測與MTH2蛋白結(jié)合的第一抗體的水平。
9、 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述檢測第一抗體水平的步驟包括 使用標(biāo)記的能與所述第一抗體結(jié)合的第二抗體與第一抗體結(jié)合；和 檢測與第 一抗體結(jié)合的第二抗體的標(biāo)記。
10、 如權(quán)利要求9所述的方法，其中所述標(biāo)記的第二抗體采用熒光標(biāo)記、 酶標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記或膠體金標(biāo)記。
11、 如權(quán)利要求IO所述的方法，其中所述酶標(biāo)記為辣根過氧化物酶標(biāo)記。
12、 如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述哺乳動物為SAMP8小鼠。
13、 如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述免疫印跡法進(jìn)一步包括 提取樣品總蛋白；取所述總蛋白做蛋白質(zhì)電泳；和 將電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移到膜上；并且，其中所述使所述第一抗體與樣品中的MTH2蛋白結(jié)合的步驟是將帶 有樣品中的所述蛋白的膜與第 一抗體一起孵育雜交，其中，所述電泳條件為200嗎總蛋白上樣，80V濃縮，150V分離；所述 轉(zhuǎn)膜條件為20 mA恒流2h;所述雜交條件為室溫封閉6h, 1:800稀釋抗 MTH2抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種輔助確診老年性癡呆癥的試劑盒及其方法。本發(fā)明基于抗氧化修復(fù)蛋白MTH2與老年性癡呆癥，即阿爾茨海默病的相關(guān)性，在制備抗MTH2蛋白的抗體后，通過免疫學(xué)方法檢測樣本中MTH2蛋白的表達(dá)水平來輔助確診老年性癡呆癥。本發(fā)明提供的方法和試劑盒使得老年性癡呆癥的檢測和輔助確診更加準(zhǔn)確，具有十分積極的意義。
文檔編號G01N33/68GK101275955SQ20081010595
公開日2008年10月1日 申請日期2008年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日
發(fā)明者戴大鵬, 蔡劍平, 鄭君德, 黑愛蓮 申請人:蔡劍平