專利名稱：一種用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫熒光顯微觀察方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞化學(xué)及細(xì)胞免疫學(xué)，具體是一種用于海水雙殼類減數(shù) 分裂器的免疫熒光顯微觀察方法。
背景技術(shù)：
海洋貝類是我國海水養(yǎng)殖的主導(dǎo)種類，在我國的海水養(yǎng)殖業(yè)中占有舉足 輕重的地位。利用生物技術(shù)培育優(yōu)良的養(yǎng)殖品種，是當(dāng)前乃至未來發(fā)展海 水貝類養(yǎng)殖亟待解決的關(guān)鍵問題之一。受精是個(gè)體發(fā)育的前提和基礎(chǔ)，是 苗種培育的第一步。在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，受精的質(zhì)量關(guān)系苗種培育的成敗。
20世紀(jì)80年代以來，海水經(jīng)濟(jì)貝類的染色體操作和細(xì)胞工程育種技術(shù) 得到廣泛研究，多倍體和非整倍體形成的受精生物學(xué)機(jī)制研究取得了許多 進(jìn)展。此外在廣泛開展的貝類雜交育種研究中，其受精過程的觀察和受精 機(jī)制的研究是必要的組成部份。
國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對(duì)牡蠣、珠母貝、貽貝、扇貝等主要經(jīng)濟(jì)雙殼類的受精 過程進(jìn)行了深入細(xì)致的觀察與研究，研究手段從普通光學(xué)顯微鏡發(fā)展到熒 光顯微鏡、電子顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡，研究內(nèi)容涉及海水雙殼類受 精相關(guān)事件。近年來，利用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合熒光顯微觀察，對(duì)海水 雙殼類受精過程中相關(guān)細(xì)胞成分(如微管)的定位和動(dòng)態(tài)變化的研究取得 了 一定進(jìn)展。
在海水雙殼類中開展的大量受精生物學(xué)研究表明絕大部分的海水雙殼 類為卵生型，雌雄配子被排放到海水中完成受精過程。排放的卵子處于第 一次減數(shù)分裂前期(生發(fā)泡期)或中期。精子入卵后，受精卵恢復(fù)減數(shù)分 裂，形成減數(shù)分裂器(包括減數(shù)分裂紡錘體和染色體)，伴隨減數(shù)分裂過程， 紡錘體和染色體發(fā)生一系列動(dòng)態(tài)變化，形成雌雄原核并最終啟動(dòng)卵裂。
目前，對(duì)受精過程的染色體動(dòng)態(tài)研究采用了各種染色方法，包括采用常 規(guī)堿性染料(地衣紅、蘇木精等)在普通光學(xué)顯微鏡下觀察了長牡蠣、櫛 孔扇貝的染色體行為，釆用熒光染料DAPI在熒光顯微鏡下觀察榨孔扇貝和 泥蚶受精過程的染色體行為，但限于熒光強(qiáng)度有限，對(duì)比度較低，無法定 量研究染色體。前者雖然清晰度高，但其樣品處理決定了只能適用于可見 光顯微觀察，無法開展熒光顯微觀察。上述技術(shù)方法均無法揭示紡錘體的 動(dòng)態(tài)。
迄今國內(nèi)外僅有一個(gè)關(guān)于利用熒光染色的方法觀察長牡蠣Crasm^ea g^^減數(shù)分裂紡錘體形態(tài)的報(bào)道。該研究釆用免疫熒光間接法，第一步用 鼠抗卩微管蛋白抗體標(biāo)記樣品的微管，第二步用熒光素(F1TC)標(biāo)記的羊 抗鼠抗體與第一抗體結(jié)合反應(yīng)。免疫熒光間接法步驟較多，容易引起非特
3異性染色。由于其局限性，該方法未能得到推廣應(yīng)用。
綜上所述，已報(bào)道的海水雙殼類受精生物學(xué)研究所應(yīng)用的熒光染色方法 多是對(duì)減數(shù)分裂器的一部分(紡錘體或染色體)進(jìn)行觀察，割裂了減數(shù)分 裂的生物學(xué)過程，無法揭示紡錘體和染色體的相互作用，妨礙了對(duì)受精機(jī) 理研究的進(jìn)一步深入。在廣泛借鑒動(dòng)物細(xì)胞骨架免疫熒光顯微研究技術(shù)的 基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供了一種用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫熒光顯微觀 察方法，實(shí)現(xiàn)了同步觀察減數(shù)分裂過程中的紡錘體和染色體動(dòng)態(tài)，特異性 強(qiáng)，清晰度高，突破了海水雙殼類受精生物學(xué)研究的技術(shù)瓶頸，顯著提高 了研究效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫熒光顯 微觀察方法。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫熒光顯微觀察方法，將樣品經(jīng)固定 等預(yù)處理、染色、制片后即可觀察，將樣品釆用質(zhì)量百分比濃度2-6%多聚 甲醛的磷酸緩沖液(PBS)固定，再依次進(jìn)行透化和封閉處理，而后對(duì)樣品 紡錘體進(jìn)行免疫熒光染色而后用含5-20 mg/L碘化丙錠的磷酸緩沖液對(duì)染 色體進(jìn)行熒光染色；染色后將樣品制片即可在熒光顯微下觀察。
將樣品經(jīng)固定液固定30-60 min,轉(zhuǎn)入孵育液中透化30-60 min,采用封 閉液處理30-60 min;所述孵育液為體積百分比濃度0.5-1%的聚乙二醇辛基 苯基醚(TritonX-l00 )的PBS;所述封閉液為1-5%小牛血清白蛋白(BSA) 的PBS。樣品的染色依次采用免疫熒光染色劑對(duì)紡錘體處理40-60 min和熒 光染色劑對(duì)染色體處理10min,釆用PBS處理5-20 min,所述免疫熒光染 色劑是由異硫氰酸熒光素(FITC )偶聯(lián)的抗a微管蛋白抗體 (FITC國anti-a-tubulin)與PBS按體積比1:1000-5000配制。所述PBS緩沖 溶液濃度為0.2 mol/L, pH7.4。染色后樣品轉(zhuǎn)移到載玻片，加入防熒光淬 滅劑，封片，制成觀察制片，在-2(TC避光條件下可保存2周；所述防熒 光淬滅劑為體積百分比濃度1-4% DABCO的甘油溶液。制片置于熒光 顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡下，以高壓汞燈產(chǎn)生的紫外光為激發(fā)光， 采用FITC對(duì)應(yīng)的濾光片，觀察分辨紡錘體和染色體的形態(tài)、位置和數(shù) 量。所述樣品包括各種海水雙殼類的未受精卵及受精卵。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
1. 操作簡捷。本發(fā)明方法為直接免疫熒光法，較之已報(bào)道的兩步免疫 熒光標(biāo)記法，具有操作簡單、省時(shí)的特點(diǎn)。
2. 清晰度高。本發(fā)明方法中樣品的制備方法有效降低了非特異性熒光， 采用的熒光染料特異性強(qiáng)，利用熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡觀察, 可滿足定位和定量研究紡錘體和染色體的要求。
3. 研究效率高。本發(fā)明方法可以批量制備海水雙殼類樣品，批量觀察受精卵發(fā)育過程中減數(shù)分裂器動(dòng)態(tài)，顯著提高海水雙殼類受精生物學(xué)研究 效率。
綜上，本發(fā)明方法是一種適用于海水雙殼類減數(shù)分裂器，綜合定性、 定位和定量，形態(tài)和功能密切結(jié)合的細(xì)胞學(xué)免疫熒光觀察方法。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例并不局限在本發(fā)明中。 實(shí)施例1
利用本發(fā)明方法，進(jìn)行長牡蠣受精卵減數(shù)分裂器免疫熒光顯微觀察，
具體操作為
1) 采用孔徑為25pm的篩絹過濾，去除大部分的海水，獲取牡蠣特定 發(fā)育階段的受精卵10000個(gè)左右，盛于1.5mL離心管，以2000rpm離心4 min,去除上清的海水；加入約1 mL固定液10 min后，以2000rpm離心4 min,去上清，收集受精卵，而后加入lmL固定液中固定30min,待用。 所述固定液為2%多聚甲醛的磷酸緩沖液。
2) 取60粒左右受精卵轉(zhuǎn)入孵育液中透化處理30min;所述孵育液為體 積百分比濃度0.5。/。的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-lOO)的PBS溶液。
3) 棄掉孵育液，將受精卵轉(zhuǎn)入封閉液中處理40min;所述封閉液為PBS 中加入質(zhì)量比1%的小牛血清白蛋白。
4) 將受精卵轉(zhuǎn)入微管熒光染色劑中，處理40min;再以PBS清洗受精 卵5min;所述微管熒光染色劑是由異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗a微 管蛋白抗體(FITC-anti-a-tubulin )與PBS按體積比1:3000配制。
5 )將受精卵轉(zhuǎn)入所述染色體熒光染色劑處理10 min;以PBS清洗受精 卵2次，每次5min;所述染色體熒光染色劑為PBS配制的5 mg/L碘化丙 錠(PI)。
6) 載玻片上滴一滴防熒光淬滅劑，將卵子轉(zhuǎn)移到防熒光淬滅劑中，加 蓋玻片，蓋玻片四周以樹脂封片；所述防熒光淬滅劑為體積百分比濃度 1%DABC0的甘油。
7) 將制片置于熒光顯微鏡下，釆用紫外光作為熒光的激發(fā)光，觀察構(gòu) 成減數(shù)分裂器的紡錘體和染色體；-2(TC下保存的制片，2周內(nèi)可進(jìn)行減數(shù) 分裂器的觀察；熒光染色、洗卵、顯微觀察、保存制片應(yīng)在黑暗環(huán)境下進(jìn) 行，避免熒光淬滅。
所述PBS緩沖溶液濃度為0.2 mol/L, pH 7.4。 實(shí)施例2
與實(shí)施例1不同之處在于進(jìn)行櫛孔扇貝受精卵有絲分裂器免疫熒光 顯微觀察，具體操作為
1)釆用孔徑為30pm的篩絹過濾，去除大部分的海水，獲取櫛孔扇貝 特定發(fā)育階段的受精卵8000個(gè)左右，盛于1.5mL離心管，以1000 rpm離 心5min，去除上清的海水；加入約]mL固定液10 min后,以1000 rpm離心5min,去上清收集受精卵，而后加入lmL固定液中固定60min,待用。 所述固定液為4%多聚甲醛的磷酸緩沖液。
2)取30粒左右受精卵，轉(zhuǎn)入孵育液中透化處理40 min;所述孵育液 為體積百分比濃度1%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)的PBS溶液。
3 )棄掉孵育液，將受精卵轉(zhuǎn)入封閉液中處理60 min,所述封閉液為PBS 中加入質(zhì)量比3%的小牛血清白蛋白。
4) 將受精卵轉(zhuǎn)入微管熒光染色劑中，處理60min;再以PBS清洗受精 卵10min;所述微管熒光染色劑是由異硫氰酸熒光素(FITC )偶聯(lián)的抗a 微管蛋白抗體(FITC-anti-a-tubulin)與PBS按體積比1:5000配制。
5) 將受精卵轉(zhuǎn)入所述染色體熒光染色劑處理10 min;以PBS清洗受精 卵3次，每次5 min;所述染色體熒光染色劑為PBS酉已制的10mg/L缺化丙 錠(PI)。
6) 載玻片上滴一滴封片劑將卵子轉(zhuǎn)移到防熒光淬滅劑中，加蓋玻片， 蓋玻片四周以樹脂封片；所述防熒光淬滅劑為體積百分比濃度4% DABCO的甘油。
7) 將制片置于激光掃描共聚焦顯微鏡下，釆用紫外光作為熒光的激發(fā) 光，觀察構(gòu)成減數(shù)分裂器的紡錘體和染色體；-2(TC下保存的制片，2周內(nèi)
可進(jìn)行減數(shù)分裂器的觀察；熒光染色、洗卵、顯微觀察、保存制片應(yīng)在黑
暗環(huán)境下進(jìn)行，避免熒光淬滅。
實(shí)施例3
與實(shí)施例1不同之處在于進(jìn)行菲律賓蛤仔受精卵有絲分裂器免疫熒 光顯微觀察，具體操作為
1) 釆用孔徑為30]im的篩絹過濾，去除大部分的海水，獲取特定發(fā)育 階段的菲律賓蛤仔受精卵5000個(gè)左右，盛于1.5mL離心管，以1000 rpm 離心5min,去除上清的海水；加入約1 mL固定液10 min后，以1000rpm 離心5min,去上清收集受精卵，而后加入1 mL固定液中固定50min,待 用。所述固定液為6%多聚甲醛的磷酸緩沖液。
2) 取40粒左右受精卵，孵育液透化處理60 min,所述孵育液為體積 百分比濃度0.8。/。的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-lOO)的PBS溶液。
3) 棄掉孵育液，受精卵轉(zhuǎn)入封閉液中處理60 min;所述封閉液為每 10mLPBS中加入500mg小牛血清白蛋白。
4) 將受精卵轉(zhuǎn)入微管熒光染色劑中，處理50min;再以PBS清洗受精 卵8min;所述微管熒光染色劑是由異硫氰酸熒光素(FITC )偶聯(lián)的抗a微 管蛋白抗體(FITC-anti-a-tubulin)與PBS按體積比1:2000配制。
5) 將受精卵轉(zhuǎn)入所述染色體熒光染色劑處理10min;以PBS清洗受精 卵2次，每次5min;所述染色體熒光染色劑為PBS配制的10mg/L碘化丙 錠(PI)。
6) 載玻片上滴一滴封片劑將卵子轉(zhuǎn)移到防熒光淬滅劑中，加蓋玻片，蓋玻片四周以樹脂封片；所述防熒光淬滅劑按體積百分比為含3%
DABCO的甘油。
7)將制片置于熒光顯微鏡下，釆用紫外光作為熒光的激發(fā)光，觀察構(gòu) 成減數(shù)分裂器的紡錘體和染色體；-20°。下保存的制片，2周內(nèi)可進(jìn)行減數(shù) 分裂器的觀察；熒光染色、洗卵、顯微觀察、保存制片應(yīng)在黑暗環(huán)境下進(jìn) 行，避免熒光淬滅。
實(shí)施例4
與實(shí)施例1不同之處在于進(jìn)行硬殼蛤受精卵有絲分裂器免疫熒光顯 微觀察，具體搡作為
1) 采用孔徑為30pm的篩絹過濾，去除大部分的海水，獲取特定發(fā)育 階段的硬殼蛤受精卵5000個(gè)左右，盛于1.5mL離心管，以1000 rpm離心 4min,去除上清的海水；加入約1 mL固定液10 min后，以1000rpm離心 4min,去上清收集受精卵，而后加入lmL固定液中固定45min,待用。所 述固定液為5%多聚甲醛的磷酸緩沖液。
2) 取30粒左右受精卵，孵育液透化處理45min,所述孵育液為體積百 分比濃度0.6%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-lOO)的PBS溶液。
3) 棄掉孵育液受精卵轉(zhuǎn)入封閉液中處理50min;所述封閉液為每10mL PBS中加入400mg小牛血清白蛋白。
4) 將受精卵轉(zhuǎn)入微管熒光染色劑中，處理45min;再以PBS清洗受精 卵6min;所述微管熒光染色劑是由異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗ct微 管蛋白抗體(FITC-anti-a-tubulin)與PBS按體積比1:4000配制。
5 )將受精卵轉(zhuǎn)入所述染色體熒光染色劑處理10 min;以PBS清洗受精 卵2次，每次5 min;所述染色體焚光染色劑為PBS酉已制的20mg/L碟化丙 錠(PI)。
6) 載玻片上滴一滴封片劑將卵子轉(zhuǎn)移到防熒光淬滅劑中，加蓋玻片，
蓋玻片四周以樹脂封片；所述防熒光淬滅劑按體積百分比為含4%
DABCO的甘油。
7) 將制片置于熒光顯微鏡下，采用紫外光作為熒光的激發(fā)光，觀察構(gòu) 成減數(shù)分裂器的紡錘體和染色體；-20°。下保存的制片，2周內(nèi)可進(jìn)行減數(shù) 分裂器的觀察；熒光染色、洗卵、顯微觀察、保存制片應(yīng)在黑暗環(huán)境下進(jìn) 行，避免熒光淬滅。
實(shí)施例5
與實(shí)施例1不同之處在于，進(jìn)行海灣扇貝受精卵有絲分裂器免疫熒光 顯微觀察，具體操作為
1)釆用孔徑為30pm的篩絹過濾，去除大部分的海水，獲取海灣扇貝 特定發(fā)育階段的受精卵8000個(gè)左右，盛于1.5mL離心管，以1000 rpm離 心4 min,去除上清的海水；加入約1 mL固定液10 min后，以1000 rpm離 心4min，去上清收集受精卵，而后加入lmL固定液中固定55min,待用；所述固定液為3%多聚甲醛的磷酸緩沖液。。
2) 取40粒左右受精卵，孵育液透化處理55min;所述孵育液為體積百 分比濃度0.7%的聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-lOO)的PBS溶液。
3) 棄掉孵育液，將受精卵轉(zhuǎn)入封閉液中處理55min，所述封閉液為每 10mLPBS中加入500mg小牛血清白蛋白。
4) 將受精卵轉(zhuǎn)入微管熒光染色劑中，處理55min;再以PBS清洗受精 卵7min;所述微管熒光染色劑是由異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗a微 管蛋白抗體(FITC-anti-a-tubulin)與PBS按體積比1:1000配制。
5 )將受精卵轉(zhuǎn)入所述染色體熒光染色劑處理10 min;以PBS清洗受精 卵2次，每次5 min;所述染色體熒光染色齊lj為PBS酉己制的15mg/L碌化丙 錠(PI)。
6) 載玻片上滴一滴封片劑將卵子轉(zhuǎn)移到防熒光淬滅劑中，加蓋玻片， 蓋玻片四周以樹脂封片；所述防熒光淬滅劑按體積百分比為含4% DABCO的甘油。
7) 將制片置于激光掃描共聚焦顯微鏡下，釆用紫外光作為熒光的激發(fā) 光，觀察構(gòu)成減數(shù)分裂器的紡錘體和染色體；-20匸下保存的制片，2周內(nèi)
可進(jìn)行減數(shù)分裂器的觀察；熒光染色、洗卵、顯微觀察、保存制片應(yīng)在黑
暗環(huán)境下進(jìn)行，避免熒光淬滅。
權(quán)利要求
1.一種用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫熒光顯微觀察方法，將樣品經(jīng)固定等預(yù)處理、染色、制片后即可觀察，其特征在于將樣品采用質(zhì)量百分比濃度2-6％多聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS)固定，再依次進(jìn)行透化和封閉處理，而后對(duì)樣品紡錘體進(jìn)行免疫熒光染色而后用含5-20mg/L碘化丙錠的磷酸緩沖液對(duì)染色體進(jìn)行熒光染色；染色后將樣品制片即可在熒光顯微下觀察。
2. 按權(quán)利要求1所述的用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫熒光顯微觀 察方法，其特征在于將樣品經(jīng)固定液固定30-60 min,轉(zhuǎn)入孵育液中透化 30-60 min,采用封閉液處理30-60 min;所述孵育液為體積百分比濃度 0.5-1%的聚乙二醇辛基苯基醚的PBS;所述封閉液為1-5%小牛血清白蛋白 的PBS。
3. 按權(quán)利要求1所述的用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫熒光顯微觀 察方法，其特征在于樣品的染色依次采用免疫熒光染色劑對(duì)紡錘體處理 40-60 min和熒光染色劑對(duì)染色體處理10 min,釆用PBS處理5-20 min，所 述免疫熒光染色劑是由異硫氰酸熒光素偶聯(lián)的抗a微管蛋白抗體與PBS按 體積比1:1000-5000配制。
4. 按權(quán)利要求1、 2或3所述的用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫 熒光顯微觀察方法，其特征在于所述PBS緩沖溶液濃度為0.2mol/L， pH 7.4。
5. 按權(quán)利要求1所述的用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫熒光顯微觀 察方法，其特征在于染色后樣品轉(zhuǎn)移到載玻片，加入防熒光淬滅劑，封 片，制成觀察制片，在-2(TC避光條件下可保存2周；所述防熒光淬滅劑 為體積百分比濃度1-4%DABC0的甘油溶液。
6. 按權(quán)利要求1所述的用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫熒光顯微觀 察方法，其特征在于制片置于熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡下， 以高壓汞燈產(chǎn)生的紫外光為激發(fā)光，釆用FITC對(duì)應(yīng)的濾光片，觀察分辨 紡錘體和染色體的形態(tài)、位置和數(shù)量。
7. 按權(quán)利要求1所述的用于海水雙殼類減數(shù)分裂器的免疫熒光顯 微觀察方法，其特征在于所述樣品包括各種海水雙殼類的未受精卵 及受精卵。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞化學(xué)及細(xì)胞免疫學(xué)，具體應(yīng)用于免疫熒光顯微觀察海水雙殼類減數(shù)分裂器。本發(fā)明將樣品經(jīng)固定等預(yù)處理、染色、制片后即可觀察，將樣品采用質(zhì)量百分比濃度2-6％多聚甲醛的磷酸緩沖液(PBS)固定，再依次進(jìn)行透化和封閉處理，而后對(duì)樣品紡錘體進(jìn)行免疫熒光染色而后用含5-20mg/L碘化丙錠的磷酸緩沖液對(duì)染色體進(jìn)行熒光染色；染色后將樣品制片即可在熒光顯微下觀察。本發(fā)明適用于同步觀測(cè)海水雙殼類減數(shù)分裂器的紡錘體和染色體，具有操作簡捷、清晰度高、研究效率高的優(yōu)點(diǎn)，是一種綜合定性、定位和定量，形態(tài)和功能密切結(jié)合的細(xì)胞學(xué)免疫熒光觀察方法。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101639441SQ200810138849
公開日2010年2月3日 申請(qǐng)日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者張國范, 闕華勇 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所