專利名稱：：利用NT-proET-1的診斷和風(fēng)險分層的制作方法利用NT-proET-l的診斷和風(fēng)險分層0001本發(fā)明涉及用于心臟病以及呼吸道和肺部疾病診斷和/或風(fēng)險分層的方法，其中進(jìn)行游離片段N-末端內(nèi)皮素原(NT-proET-l;根據(jù)圖1的前內(nèi)皮素原(preproET)的AS18-52)或其片段和肽段的測定。0002為了采用合適的治療，心臟病和/或呼吸道和肺部疾病的早期診斷以及鑒別在急診室中已是必要的，其與臨床決策的需要相結(jié)合。在現(xiàn)有技術(shù)中，已描述成熟ET-1(21AS)用于診斷目的，其包括前體蛋白Big-ETl(38AS,參見圖1)(RossiGP，SecciaTM，AlbertinG，PessinaAC.Measurementofendothelin:clinicalandresearchuse.AnnClinBiochem2000;37(Pt5):608-26.2;AubinP，LeBrunG，MoldovanF，VilletteJM,CreminonC，DumasJ等人,Sandwich—typeenzymeimmunoassayforbigendothelin-Iinplasma:concentrationsinhealthyhumansubjectsunaffectedbysexorposture.ClinChem1997;43:64-70)。此外，已知的是內(nèi)皮素激素原用于膿毒癥診斷由申請人在WO00/22439和EP1121600Bl中公開。0003另外，在EP1564558Bl中描述了具有前內(nèi)皮素原的氨基酸序列93-212或168-212(圖1,SEQIDNo.1)的C-末端內(nèi)皮素原片段(CT-proET-1)用于對內(nèi)皮素-1或大-內(nèi)皮素-l含量的間接測定的心血管疾病診斷。0004但是，在利用迄今為止已知的標(biāo)記的情況下，已知診斷方法的缺點(diǎn)仍舊是風(fēng)險患者的早期和全面檢測總是不能充分地成功，并且因此，風(fēng)險分層是不充分的。因此，本發(fā)明的一個目的是開發(fā)用于心臟病以及呼吸道和肺部疾病風(fēng)險分層的方法，所述方法能夠改進(jìn)風(fēng)險患者的檢測。0005此外，缺點(diǎn)是，在現(xiàn)有技術(shù)中，通常標(biāo)記的靈敏性和/或特異性是不足的。0006因此，另一個目的是提供用于心臟病以及呼吸道和肺部疾病風(fēng)險分層的方法，其中至少一種標(biāo)記或標(biāo)記的組合在體外診斷中具有足夠的靈敏性和特異性。0007因此，本發(fā)明的目的提供用于心臟病和/或呼吸道和肺部疾病診斷和/或風(fēng)險分層的方法。0008所述目的是通過用于心臟病以及呼吸道和肺部疾病診斷和風(fēng)險分層的方法來實(shí)現(xiàn)，其中進(jìn)行N-末端內(nèi)皮素原(縮寫為"NT-proET-l")或其片段和肽段的測定(見下文，根據(jù)本發(fā)明的方法)。0009令人驚訝的是，NT-proET-l或其片段和肽段對于心臟病以及呼吸道和肺部疾病的診斷具有高靈敏性和特異性(參見實(shí)施例和附圖)。0010根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"心臟病"特別是包括"急性冠脈綜合征"及其冠心病的不同階段，其是直接危及生命的。這特別是涉及急診醫(yī)學(xué)，即急性心肌梗塞和/或心絞痛，以及還有心源性猝死。除急性心肌梗塞外，其根據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)(WHO(1979):Nomenclatureandcriteriafordiagnosisofischemicheartdisease.ReportoftheJointInternationalSocietyandFederationofCardiology/WorldHealthOrganizationtaskforceonstandardizationofclinicalnomenclature,Circulation59(3):607-609)凈皮定義為急性的持續(xù)大于20分鐘的胸痛事件，與ST段抬高，和/或心肌酶的增加相關(guān)，還涉及術(shù)語不穩(wěn)定型心絞痛(AP)，其根據(jù)本發(fā)明被認(rèn)為是"心臟病"(HammCW:Leitlinien:AkutesKoronarsyndrom(ACS)-Teil1:ACSohnepersistierendeST-Hebung[Guidelines:AcuteCoronarySyndrome(ACS)Part1:ACSwithoutpersistentSTsegmentelevation].ZKardiol(2004)93:72-90)。0011在本發(fā)明的內(nèi)容中，"心肌梗塞"(心臟病發(fā)作，AMI(急性心肌梗塞))指急性和危及生命的心臟病，其中由于血液供給的限制(局部缺血)發(fā)生部分心肌(心肌)的壞死或組織死亡(梗塞)原因在于，其通常存在大于20分鐘。心臟病發(fā)作的主要癥狀是突然發(fā)生的持續(xù)大于20分鐘并且通常是嚴(yán)重的胸部疼痛("胸痛")，其可以放射傳播至肩部、手臂、下頜和上腹，并且可伴有出汗、惡心以及可能的嘔吐。心肌梗塞的后果，可能是心力衰竭。0012術(shù)語"心肌梗塞后"意思是這樣的患者，其在過去已經(jīng)遭遇例如，大于1小時，特別是20小時，特別是1至5天，或3至5天的心肌梗塞并且目前處于后期，并且未遭遇直接的致命后果，但可以間接地和直接地預(yù)計到進(jìn)一步不利的事件，例如患者又一次(后發(fā)的)心肌梗塞、心力衰竭或死亡發(fā)生，或另外的惡化。0013在本發(fā)明的內(nèi)容中，"心功能不全"還應(yīng)包括在"心臟病，，中。"心功能不全，，是心臟急性或慢性無力向組織提供足夠血液從而提供足夠的氧以確保在靜息或負(fù)荷情況下組織的物質(zhì)代謝。臨床上，當(dāng)?shù)湫桶Y狀(呼吸困難、疲勞、液體潴留)存在時，存在心功能不全，其根本原因是在收縮或舒張功能障礙意義上的心臟功能紊亂。根據(jù)本發(fā)明還包4舌'隄性心功能不全(CHF)(Kardiologiecompact,publishedbyChrisianMewis，ReimerRiessenundIoakimSpyridopoulos，第2未修訂版，Thieme2006)。下列可能是心功能不全的原因除了高血壓(高血壓(hypertension))和/或冠狀血管的動脈硬化(釣化)(冠心病)以外，還有瓣膜性心臟病(例如風(fēng)濕熱的遲發(fā)后果)、心肌炎(心肌的炎癥)、心率失常、心肌梗塞。根據(jù)本發(fā)明還包括具有(充血性)心功能不全的高血壓心臟病、具有(充血性)心功能不全的高血壓性心臟病和腎臟疾病、原發(fā)性右心功能不全、次發(fā)性右心功能不全、無癥狀的左心功能不全(NYHAI期)、在較重的體力活動過程中有癥狀的左心功能不全(NYHAII期)、在較輕的體力活動過程中有癥狀的左心功能不全(NYHAIII期)、在休息時有癥狀的左心功能不全(NYHAIV期)和心源性休克。0014在本發(fā)明的內(nèi)容中，"呼吸道和肺部疾病"的意思特別是"肺部和呼吸道感染，，，具體而言，由細(xì)菌、病毒、真菌，或寄生蟲引起的這些感染，例如適應(yīng)癥如下呼吸道感染(LRTI)、支氣管炎、肺炎、結(jié)節(jié)病、支氣管擴(kuò)張或非心源性肺水腫。另外，根據(jù)本發(fā)明，下呼吸道感染(LRTI)，支氣管炎，腐敗性支氣管炎和肺炎是優(yōu)選的。完全特別優(yōu)選的是肺炎，特別是社區(qū)獲得性肺炎(CAP)以及下呼吸道感染(LRTI)。0015在本發(fā)明的內(nèi)容中，肺炎應(yīng)解釋為肺部組織的急性或慢性疾病，其感染是由細(xì)菌、病毒或真菌、寄生蟲引起的，很少情況還由有毒物質(zhì)的吸入中毒引起或免疫引起。對于臨床醫(yī)生而言，肺炎是不同癥狀的組合(發(fā)燒或體溫過低、寒戰(zhàn)、咳嗽、胸膜炎性胸部疼痛、痰產(chǎn)生增加、呼吸頻率增加、叩音濁(Klopfschalldampfung)、支氣管呼吸、近耳高音羅音、胸膜摩擦音)，與至少一種胸部X射線圖像上可識另'J的浸潤結(jié)合(HarrisonsInnereMedizin[Harrison'sInternalMedicine]，publishedbyManfredDietel，NorbertSuttorp和MartinZeitz，ABWWissenschaftsverlag2005)。0016在本發(fā)明的內(nèi)容中，"呼吸道和肺部疾病"特別是指"慢性肺部和呼吸道疾病"，具體而言這樣的適應(yīng)癥如肺間質(zhì)疾病和肺纖維化、慢性阻塞性肺部疾病(C0PD)，特別是C0PD感染惡化、支氣管哮喘，特別是支氣管哮喘的感染惡化以及支氣管癌。完全特別優(yōu)選的是C0PD，特別是COPD感染惡化。0017根據(jù)本發(fā)明，C0PD是指一組慢性疾病，其特征為在體力活動過程中咳嗽、痰增加以及呼吸困難。主要地，應(yīng)當(dāng)提及慢性阻塞性支氣管炎和肺氣腫。這兩種疾病模式的特征在于特別是呼氣吃力。C0PD主要癥狀還通俗地稱為"吸煙者的咳嗽"。本發(fā)明對急性惡化是特別有利的。0018上述所有適應(yīng)癥還在例如，Pschyrembel，DeGruyter，9thedition,Berlin2004中描述。0019根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"風(fēng)險分層"，包括患者特別是急癥患者和風(fēng)險患者，其具有較差的預(yù)后的鑒定，目的是為了更深入診斷和治療/處理心臟病，特別是急性冠脈綜合征和心肌梗塞、心絞痛和/或心肌梗塞后、心功能不全或呼吸道和肺部疾病，特別是感染和慢性炎癥，以使該疾病達(dá)到盡可能有利的進(jìn)程的目的。因此根據(jù)本發(fā)明的風(fēng)險分層允許有效的治療方法，它可例如在急性冠脈綜合征的情況下，以經(jīng)皮冠狀動脈介入和更新的藥物的形式存在，或用于處理或治療心功能能不全，例如，利用ACE抑制劑、AT1拮抗劑血管緊張素II受體阻滯劑(亞型1)、P阻滯劑比索洛爾、卡維地洛、美托洛爾和奈必洛爾、加壓素受體拮抗劑、起始于NYHAIII期的醛固酮拮抗劑、鈣致敏劑(左西孟旦)，或利用抗生素用于處理或治療感染或慢性呼吸道和肺部疾病。0020因此，本發(fā)明同樣涉及患者的鑒定，所述患者處于心臟病以及呼吸道和肺部疾病的增加的風(fēng)險和/或具有心臟病以及呼吸道和肺部疾病不良預(yù)后，具體而言在有癥狀和/或無癥狀患者中，特別是急癥患者。0021特別是，在急癥和/或重癥護(hù)理的情況下，通過利用根據(jù)本發(fā)明的方法，可以特別有利地進(jìn)行可靠的分層。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法使導(dǎo)致治療的迅速成功以及防止死亡的臨床決策成為可能。這些臨床決策還包括使用藥物的進(jìn)一步處理，用于心臟病以及呼吸道和肺部疾病的處理或治療。0022因此，本發(fā)明還涉及用于患有心臟病和/或呼吸道和肺部疾病的患者的診斷和/或風(fēng)險分層方法，以用于臨床決策的執(zhí)行，例如利用藥物進(jìn)一步處理和治療，優(yōu)選在時間緊迫的重癥或急癥護(hù)理，包括使患者入院的決策。0023因此，在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法涉及了對心臟病和/或呼吸道疾病的治療控制。0024在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的用于診斷和/或風(fēng)險分層的方法以用于預(yù)后、鑒別診斷性早期識別和識別、嚴(yán)重程度評估、以及伴隨治療的疾病進(jìn)程的評估。0025在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用于心臟病和/或呼吸道和肺部疾病的早期診斷或鑒別診斷或預(yù)后的體外診斷方法，其中在待檢查的患者中進(jìn)行NT-proET-l標(biāo)記，或其片段和肽段的測定。0026在根據(jù)本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方式中，從待測患者中采集體液，優(yōu)選血液，任選地為全血或血清或可用血漿，并且在體外/離體(就是說在人類或動物機(jī)體以外)進(jìn)行診斷。由于NT-proET-l標(biāo)記或其片段和肽段的測定，實(shí)現(xiàn)了高靈敏性和特異性(參見實(shí)施例和附圖)，并且基于在至少一個患者樣品中的存在量可以進(jìn)行診斷或風(fēng)險分層。0027在本發(fā)明的內(nèi)容中，"NT-proET-l"理解為人蛋白或多肽(其可獲自前內(nèi)皮素原，并且在前內(nèi)皮素原的構(gòu)架中(SEQIDNo.1和圖1),包括具有氨基酸18-52的游離片段)以及可從其獲得的片段或肽段，特別是APETAVLGAELSAV(SEQIDNo.2)，preproET-1(SEQIDNo.1和圖1)的位點(diǎn)18-31以及GENGGEKPTPSPPWRLRRSKR(SEQIDNo.3)，preproET-1(SEQIDNo.1和圖l)的位點(diǎn)32-52。此外，根據(jù)本發(fā)明的這些多肽可具有翻譯后修飾，例如乙二醇化(Glykolisierung),脂質(zhì)體化或衍生化。0028在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，NT-proET-l或其片段和肽段的測定可附加地用另外的標(biāo)記進(jìn)行，特別優(yōu)選地是已經(jīng)指示心臟病，特別是冠心病和/或呼吸道和肺部疾病的那些標(biāo)記。0029因此，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明方法的這樣一個實(shí)施方式，其中測定是利用至少一種另外的選自炎癥標(biāo)記、心血管標(biāo)記、神經(jīng)激素標(biāo)記或局部缺血標(biāo)記的標(biāo)記，在待測的患者中附加地進(jìn)行。0030根據(jù)本發(fā)明，炎癥標(biāo)記可選自C-反應(yīng)蛋白(CRP)、細(xì)胞因子例如TNF-a、白細(xì)胞介素例如IL-6、降鈣素原(1-116，3-116)和粘附分子例如VCAM或ICAM中的至少一種標(biāo)記，而心血管標(biāo)記特別是指示心肌組織壞死的標(biāo)記，并且影響血壓的標(biāo)記可選自下述中的至少一種標(biāo)記肌酸激酶、肌紅蛋白、髓過氧化物酶、利尿鈉蛋白，特別是ANP(或ANF)、proANP、NT-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP10或其各自的序列段，心肌肌鉀蛋白、CRP。此外，就此而言還應(yīng)包括循環(huán)調(diào)節(jié)激素(原)，特別是如原胃泌素釋放肽(proGRP)、內(nèi)皮素原-2、內(nèi)皮素原-3、原-瘦蛋白、原-神經(jīng)肽Y、原-促生長素抑制素、原-神經(jīng)肽YY、原-阿黑皮素、原-腎上腺髓質(zhì)素(proADM)、原-加壓素(proAVP)或其各自的序列段-:局部缺血標(biāo)記可選自肌鈣蛋白I和T、CK-MI3中的至少一種標(biāo)記。另外，神經(jīng)激素標(biāo)記可以是至少一種另外的利尿鈉蛋白，特別是ANP(或ANF)、proANP、NT-proANP、BNP、proBNP或其各自的序列段。在本發(fā)明的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法可根據(jù)體外診斷，利用標(biāo)記的平行或同時測定(例如具有96和更多孔的多孔板)來進(jìn)行，其中對至少一個患者樣品進(jìn)行測定。0031此外，根據(jù)本發(fā)明的方法及其測定可在基于自動分析系統(tǒng)的診斷設(shè)備中進(jìn)行，特別是利用Kryptor(http://www,kryptor.net/)0032在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法及其測定可利用快速測試(例如側(cè)向流動測試或床邊體外診斷(PointofCare))進(jìn)行，其可以單個或多個參數(shù)測定。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，它是自我測試或適用于急癥診斷的設(shè)備。0033本發(fā)明進(jìn)一步涉及NT-proET-l或其片段和肽段的用途，用于心臟病和/或呼吸道和肺部疾病的風(fēng)險分層和/或早期診斷或鑒別診斷或心臟病和/或呼吸道和肺部疾病預(yù)后的體外診斷。0034另一個目的是提供相應(yīng)的診斷設(shè)備或其用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法的用途。0035在本發(fā)明的內(nèi)容中，這種診斷設(shè)備理解為最廣義上的陣列或分析(例如免疫分析、ELISA等等)的設(shè)備，用于進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法。0036本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于心臟病和/或呼吸道和肺部疾病診斷和/或風(fēng)險分層的試劑盒，其包括用于測定NT-proET-l、或其片段和肽段，任選地以上提及的另外的標(biāo)記的檢測試劑。這些檢測試劑包ii括例如抗體等等。0037提供下列實(shí)施例和附圖用于更詳細(xì)地描述本發(fā)明，但是本發(fā)明將不限于這些實(shí)施例和附圖。實(shí)施例和附圖免疫分析0038利用夾心免疫分析測定NT-proET-1，如Struck等所述(StruckJ，MorgenthalerNG，BergmannA.Proteolyticprocessingpatternoftheendothelin-lprecursorinvivo.Peptides2005;26;2482-6)。肽合成0039源自preproET-1的已知氨基酸序列(圖1)，選擇兩個區(qū)域(位點(diǎn)18-31，32-52)。所述區(qū)域在一種情況下，添加N-末端半胱氨酸殘基，利用標(biāo)準(zhǔn)方法化學(xué)合成為可溶性肽，并純化，利用質(zhì)譜和反相HPLC控制其質(zhì)量，并且等份凍干它們(JPTcompany,Berlin,Germany)。所述肽的氨基酸序列是PAV15CAPETAVLGAELSAVpreproET-1的位點(diǎn)18-31(圖1)，MPGC22GENGGEKPTPSPPWRLRRSKRCpreproET-l的位點(diǎn)32-52(圖1)。此外，合成包括preproET-1的位點(diǎn)18-52區(qū)域的肽(PAR35APETAVLGAELSAVGENGGEKPTPSPPWRLRRSKR)。綴合與免疫0040通過MBS(間-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯，)的方法，將肽PAV15和MPGC22綴合至KLH(匙孔血藍(lán)蛋白)載體蛋白(參見操作說明書"NHS-Esters-MaleimideCrosslinkers"PIERCE公司，Rockford，IL,USA)。根據(jù)以下方案，將這些綴合物用于免疫綿羊每只綿羊起始接受100綴合物(相對于綴合物的肽部分的數(shù)量信息)并且隨后每只50yg綴合物(相對于綴合物的肽部分的數(shù)量信息)每四周一次。免疫起始后第四個月開始，每四周從每只綿羊收集700ml血液，并通過離心從所述血液獲得抗血清。由MicroPharm公司，Carmarthenshire,UK進(jìn)行結(jié)合、免疫和抗血清的獲得?？贵w純化0041在l-步法中，從抗血清制備肽-特異性抗體，所述抗血清在免疫后的第四個月開始產(chǎn)生。為了該目的，首先將肽PAV15和MPGC22偶合至SulfoLink凝膠(參見操作說明書"SulfoLinkKit"PIERCE公司，Rockford，IL，USA)。為了偶合，每5ml凝膠提供5mg肽。來自抗所述肽的綿羊抗血清的肽-特異性抗體的親合純化如下進(jìn)行首先將肽柱洗滌三次，每次交替利用10ml洗脫緩沖液(50mM檸檬酸，pH2.2)和結(jié)合緩沖液(100mN磷酸鈉，0.1%Tween，pH6.8)。經(jīng)0.2nm過濾100ml抗血清并且與可用的柱材料混合。此外，用10ml結(jié)合緩沖液定量將凝膠從柱上沖洗掉。溫育在振蕩下于室溫過夜進(jìn)行。將這些批次定量轉(zhuǎn)移至空柱(NAP25,Pharmacia,空的)。去除流過物。然后，用不含蛋白質(zhì)的250ml結(jié)合緩沖液(洗脫液蛋白含量<0.02A280nm)進(jìn)行洗滌步驟。將洗脫緩沖液添加至洗滌柱，并且每個級分收集1ml。對于每個級分，利用BCA方法測定蛋白含量(參見PIERCE公司，Rockford，IL，USA的操作說明書)。將具有蛋白濃度>0.8mg/ml的級分集中。利用BCA方法對收集物進(jìn)行蛋白測定后，抗-PAV15抗體獲得27mg產(chǎn)量以及抗-MPGC22抗體獲得35mg產(chǎn)量。標(biāo)記0042經(jīng)過NAP-5凝膠過濾柱(Pharmacia)，根據(jù)操作說明書，將500iul純化的抗-MPGC22抗體(參見上文)在1ml100mM磷酸鉀緩沖液(pH8.O)中進(jìn)行緩沖液更換。利用100mM磷酸鉀緩沖液(pH8.0)，將抗體溶液的蛋白濃度調(diào)節(jié)至1.5mg/ml。對于化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，對抗體進(jìn)一步進(jìn)行如下處理將67jul抗體溶液與10m1MA70-吖咬(Akridinium)-NHS-酯(1mg/ml;HOECHSTBehring)混合并在室溫溫育15分鐘。然后，添加423jul的1M甘氨酸并另外溫育IO分鐘。然后，根據(jù)操作說明書，經(jīng)過NAP-5凝膠過濾柱(Pharmacia)在1ml洗脫液A(50mM磷酸鉀，100mMNaCl，pH7.4)中將標(biāo)記批次進(jìn)行緩沖液更換，并且就此去除低-分子量成分。為了分離未結(jié)合至抗體的最后剩余的標(biāo)記，進(jìn)行凝膠過濾HPLC(柱WatersProteinPakSW300)。加載樣品并利用洗脫液A，以流速lml/分鐘層析樣品。利用光度計，測定波長280nm和368nm。368nm/280nm的吸收比(作為抗體標(biāo)記程度的測量標(biāo)準(zhǔn))峰值為0.10+/-0.01。收集含有單體抗體的級分(停留時間8-10min)并收集在3ml100mM磷酸鈉、150mMNaCl、5%牛血清白蛋白、0.1%疊氮化鈉pH7.4中。偶合0043如下用純化的抗-PAV15抗體包^皮經(jīng)照射的5ml聚苯乙烯小管(Greiner):在50mMTris，100mMNaCl，pH7.8中將抗體稀釋至6.6|ig/ml的濃度。將300u1該溶液吸移至每個小管中。將小管在22。C溫育20小時。吸出溶液。然后，將每個小管填充4.2ml10mM磷酸鈉、2°yUarionFP、0.3°/。牛血清白蛋白，pH6.5。20小時后，吸出溶液。最后，將小管在真空干燥儀中干燥。免疫分析的進(jìn)行和評估0044使用的標(biāo)準(zhǔn)材料為肽PAR35，其在正常馬血清(SIGMA公司)中進(jìn)行連續(xù)稀釋。如此產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)物根據(jù)原始肽重量配置濃度。夾心免疫分析如下起始50|il標(biāo)準(zhǔn)或樣本和200jal分析緩沖液(100mM磷酸鈉、150mMNaCl、5%牛血清白蛋白、0.1%非特異性綿羊IgG、0.1%疊氮化鈉pH7.4)，其包括MA70-標(biāo)記抗體的1百萬RLU(相對光單位)被吸移至分別用抗體包被的測試小管。在22'C下進(jìn)行溫育2小時，同時振蕩。然后，每次利用lml洗滌溶液(O.l%Tween20)對每個小管進(jìn)行四次洗滌步驟，滴干，并利用光度計(BERTHOLD，LB952T;basereagentsBRAHMSAG)測量結(jié)合至管的化學(xué)發(fā)光。利用MultiCalc(SplineFit)軟件，從標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取樣本的NT-proET-1濃度。可以利用所述的分析法測定的分析物被稱為N-末端內(nèi)皮素原-1(NT-proET-l)。臨床評價正常范圍0045在健康對照者樣本(n-200)中測定NT-proET-l濃度。中值為30.5pmol/L，測定的最小值為2.0，最高值為53pmol/L，95%在16.3和47.2pmol/L之間。心功能不全/嚴(yán)重程度0046測定患有慢性或急性失代償性心功能不全患者中NT-proET-l濃度。NT-proET-l濃度與心功能不全嚴(yán)重程度相關(guān)，具體地是與增加的嚴(yán)重性相關(guān)四類嚴(yán)重程度NYHAI-IV的NT-proET-l濃度中值為35.4、37.3、45.5和83.9pmol/L(參見圖2)。慢性心功能不全/診斷0047測定患有慢性心功能不全的316名患者的集合和200名健康對照患者的NT-proET-l值。接受者-工作特征分析顯示AUC為0.72。對于臨界值49.7pmo1/1,該分析產(chǎn)生34.3%靈敏性，98%特異性。對于臨界值47.2pmo1/1，該分析產(chǎn)生38.5%靈敏性，95%特異性。慢性心功能不全/預(yù)后0048測定了患有慢性心功能不全的316名患者的集合的NT-proET-l值。監(jiān)測患者的平均時間為360天。在該時間段，42名患者死亡，274名存活。利用接受者-工作特征分析，測定預(yù)后死亡率的最佳臨界值(定義為靈敏性和特異性的最大產(chǎn)生)51.3pmo1/1。在該臨界值，預(yù)后的靈敏性為71.4%，特異性為74.5%。在臨界值51.3pmo1/1死亡的似然比為2.8。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>0049測定了125名患有急性呼吸困難的患者的集合的NT-proET-l值。125名患者中69名患有心功能不全。用于心功能不全鑒別診斷的接受者工作特征分析顯示AUC為0.72。對于臨界值111pmo1/1,該分析產(chǎn)生的靈敏性為10.2%,特異性為98%。對于臨界值90.5pmo1/1，該分析產(chǎn)生的靈敏性為17.5%，特異性為95%。急性心功能不全/預(yù)后0050測定了69名患有急性失代償性心功能不全的患者的集合的NT-proET-l值。監(jiān)測患者360天的時間。在這個時期中，21名患者死亡，48名存活。利用接受者-工作特征分析，測定預(yù)后死亡率的最佳臨界值(定義為靈敏性和特異性的最大產(chǎn)生)64pmo1/1。在該臨界值，預(yù)后的靈敏性為66.6%，特異性為68.7%。在臨界值64pmo1/1，死亡似然比為2.0。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>心肌梗塞/預(yù)后0051從246名患有急性心肌梗塞的患者中在心肌梗塞發(fā)作發(fā)生三天后獲得樣品，并且測定NT-proET-l。監(jiān)測患者60天的時期。在這個時期中，220名患者沒有不良事件，26名死亡或由于心功能不全再入院治療。利用接受者-工作特征分析(AUC=0.70)，測定死亡率或由于心功能不全再入院治療的預(yù)后的最佳臨界值(定義為靈敏性和特異性的最大產(chǎn)生)63.9pmo1/1。在該臨界值，預(yù)后靈敏性為65.4%,特異性為73.6%。在臨界值63.9pmo1/1，不良事件的似然比為2.5。<63.9pmo1/1>63.9pmo1/1沒有不良事件16258死亡/心功能不全917肺炎/嚴(yán)重程度和預(yù)后0052從患有社區(qū)獲得性肺炎的入院的142名患者獲得樣品，并且測定NT-proET-1。監(jiān)測患者70天的時期。在這個時期中，10名患者死亡。NT-proET-l濃度隨PSI(肺炎嚴(yán)重程度指數(shù)，其是一種疾病嚴(yán)重程度的評分)而上升(圖3)，并且平均為53pmo1/1，高于健康對照患者(30.5pmol/1)。對于死亡率預(yù)后，接受者-工作特征分析顯示AUC為0.89。利用接受者-工作特征分析，測定死亡率預(yù)后的最佳臨界值(定義為靈敏性和特異性的最大產(chǎn)生)77pmo1/1。在該臨界值，預(yù)后靈敏性為100%，特異性為81.2%。在臨界值77pmo1/1，死亡率的似然比為5.5。<77pmol/1>77pmol/1沒有不良事件10824死亡010惡化的COPD0053測定了患有慢性阻塞性肺部疾病并同時具有下呼吸道感染的53名患者的NT-proET-l。這些患者的平均值為47pmol/l，高于健康對照(30.5pmol/1)，但是低于肺炎患者(參見上文53pmol/1)。表紐約心臟學(xué)會(NYHA)分類NYHAI體力活動不受限。日常體力活動不會導(dǎo)致過度的疲勞、心律失常、呼吸困難或心絞痛。NYHAII體力活動輕度受限。休息時無癥狀，但日常體力活動導(dǎo)致疲勞、心律失常、呼吸困難或心絞痛。NYHAIII體力活動明顯受限。休息時無癥狀，但輕于日常的體力活動即導(dǎo)致疲勞、心律失常、呼吸困難或心絞痛。NYHAIV在任何體力活動后加重，并且在休息時亦有癥狀。臥床。附圖描述0054圖1顯示前內(nèi)皮素原-1的氨基酸序列(AS)，具有如下片段1-17信號肽、18-52NT-proET-l、53-73成熟ET-l、53-90大-ET-1(或74-90)。圖2:0055NT-proET-1濃度作為心功能不全嚴(yán)重程度的函數(shù)。圖顯示是健康對照(n=200)和基于NYHA嚴(yán)重程度評分(NYHAI:n=22、NYHAII:n=126、NYHAIII:n=132、NYHA4:n=17)分級的心功能不全患者的平均值(+SEM)。0056圖3:NT-proET-1作為心功能不全嚴(yán)重程度的函數(shù)。圖顯示的是健康對照(n=200)和基于肺炎嚴(yán)重程度指數(shù)(PSII:n=36、PSIII:n=44、PSIIII:n=25、PSIIV:n=19、PSIV:n=18)分級的肺炎患者的平均值(+SEM)。權(quán)利要求1.用于心臟病和/或肺部和呼吸道疾病體外診斷和/或風(fēng)險分層的方法，其特征在于游離片段NT-proET-1(18-52)或其片段和肽段的測定在待檢查的患者中進(jìn)行。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于心臟病診斷和/或風(fēng)險分層的方法，其特征在于所述心臟病選自急性冠脈綜合征、心肌梗塞后以及心功能不全。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于肺部和呼吸道疾病診斷和/或風(fēng)險分層的方法，其特征在于所述疾病選自由細(xì)菌、病毒、真菌或寄生蟲引起的感染，特別是下呼吸道感染(LRTI)、支氣管炎、肺炎、結(jié)節(jié)病、支氣管擴(kuò)張、非心源性肺水腫和/或慢性肺部和呼吸道疾病，特別是肺間質(zhì)疾病和肺纖維化、慢性阻塞性肺部疾病(C0PD)，特別是C0PD感染惡化、支氣管哞喘，特別是支氣管哮喘的感染惡化。4.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的用于診斷和/或風(fēng)險分層的方法，用于鑒定處于心臟病和/或肺部和呼吸道疾病的增加的風(fēng)險的患者和/或不良預(yù)后的患者。5.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的用于診斷和/或風(fēng)險分層的方法，其中所述患者是有癥狀和/或無癥狀的患者，特別是急癥患者。6.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的用于診斷和/或風(fēng)險分層的方法，用于心臟病和/或肺部和呼吸道疾病的治療控制，特別是在重癥護(hù)理或急癥護(hù)理中。7.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的用于心臟病和/或肺部和呼吸道疾病診斷和/或風(fēng)險分層的方法，用于臨床決策的執(zhí)行，特別是利用藥物進(jìn)一步的處理和治療，特別是在重癥護(hù)理或急癥護(hù)理中，包括使患者入院的決策。8.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的用于心臟病和/或肺部和呼吸道疾病診斷和/或風(fēng)險分層的方法，用于預(yù)后、鑒別診斷性早期識別和識別、嚴(yán)重程度評估和伴隨治療的疾病進(jìn)程評估。9.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，附加地進(jìn)行至少一種另外標(biāo)記的測定，所述標(biāo)記選自炎癥標(biāo)記、心血管標(biāo)記、神經(jīng)激素標(biāo)記或局部缺血標(biāo)記。10.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述炎癥標(biāo)記選自C-反應(yīng)蛋白(CRP)、細(xì)胞因子例如TNF-cx、白細(xì)胞介素例如IL-6、降鉀素原(1-116，3-116)和粘附分子例如VCAM或ICAM中的至少一種標(biāo)記。11.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述心血管標(biāo)記是選自下述的至少一種標(biāo)記肌酸激酶、肌紅蛋白、髓過氧化物酶、利尿鈉蛋白，特別是ANP(或ANF)、proANP、NT-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP或其各自的序列段，心臟肌鉀蛋白、CRP，以及循環(huán)調(diào)節(jié)激素(原)，例如原胃泌素釋放肽(proGRP)、原-內(nèi)皮素-2、原-內(nèi)皮素-3、原-瘦蛋白、原-神經(jīng)肽Y、原-促生長素抑制素、原-神經(jīng)肽YY、原-阿黑皮素、原-腎上腺髓質(zhì)素(proADM)、原-加壓素(proAVP)或其各自的序列段。12.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述局部缺血標(biāo)記選自肌鉤蛋白I和T、CK-Mp中的至少一種標(biāo)記。13.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述神經(jīng)激素標(biāo)記是至少一種利尿鈉蛋白，特別是ANP(或ANF)、proANP、NT-proANP、BNP、proBNP、NT-proBNP或其序列段。14.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，進(jìn)行所述標(biāo)記的平行或同時測定。15.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，對至少一個患者樣品進(jìn)行所述測定。16.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用自動分析系統(tǒng)進(jìn)行所述測定，特別是使用Kryptor。17.根據(jù)前述權(quán)利要求的任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，利用快速測試進(jìn)行所述測定，特別是以單個或多個參數(shù)測定進(jìn)行。18.游離片段NT-proET-l或其片段和肽段在心臟病和/或肺部和呼吸道疾病的診斷和/或風(fēng)險分層的用途，以及任選地根據(jù)權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)中的另外的標(biāo)記。19.用于心臟病和/或肺部和呼吸道疾病的診斷和/或風(fēng)險分層的試劑盒，其包括用于所述游離片段NT-proET-l或其片段和肽段以及任選地根據(jù)權(quán)利要求9至13任一項(xiàng)中的另外的標(biāo)記的測定的檢測試劑，以及助劑。20.診斷設(shè)備，用于進(jìn)行根據(jù)權(quán)利要求1至17中的任一項(xiàng)的方法。全文摘要本發(fā)明涉及用于心臟病以及呼吸道和肺部疾病的診斷和/或風(fēng)險分層的方法，根據(jù)所述方法測定了游離片段N-末端內(nèi)皮素原(N-terminalproendothelin)(NT-proET-1；根據(jù)圖1的前內(nèi)皮素原(preproET)的AS18-52)或其片段和肽段。文檔編號G01N33/74GK101688869SQ200880018171公開日2010年3月31日申請日期2008年5月8日優(yōu)先權(quán)日2007年5月8日發(fā)明者A·貝格曼,J·施特魯克申請人:布拉姆斯股份公司