專利名稱：Fto(2-氧化戊二酸依賴的加氧酶)活性的測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及監(jiān)測FT0蛋白活性的測定法，尤其是鑒定FT0蛋白的抑制劑、激活劑和 底物的測定法。本發(fā)明還涉及對重量增加、重量減輕以及與重量增加和重量減輕相關的病 癥的治療或預防。
背景技術：
肥胖癥與包括某些種類的癌癥、心臟病和II型糖尿病在內的一系列疾病的風險 增加有關。最近已有報導說位于人16號染色體的FT0基因的特定等位基因的存在與肥胖 癥和II型糖尿病有關。具體而言，發(fā)現(xiàn)II型糖尿病患者具有特定FT0變體(rs9939609A 等位基因)的可能性較高，所述變體與體重增加有關(Frayling等.Science (2007) 316 889-894)。涉及超過39，000名個體的后續(xù)分析揭示了 FT0等位基因與體重相關。攜帶一 個拷貝與II型糖尿病相關的FT0變體的個體與不具有該版本拷貝的個體相比肥胖風險增 加30%，并比不具有所述疾病相關變體拷貝的個體平均重超過1. 2kg。具有兩個該變體拷 貝的個體(占受分析人群的約16% )與不具有所述疾病相關變體拷貝的個體相比，肥胖風 險增加70%且比不具有所述疾病相關變體拷貝的個體平均重3kg。這項研究非常重要，因 為此前的工作從未鑒定如此普遍的有風險的肥胖癥等位基因。其它研究顯示了相似的結果 (Dina 等 Nat Genet(2007) 39 :724_726 ；Scott 等 Science(2007) 316 1341-1345)。小鼠的FT0直系同源物Fatso (Fto)是融合趾小鼠突變體中所缺失的基因 (Peters 等 Mann Genome (2002) 13 186-188 ；van der Hoeven 等 Development (1994) 120 1601-2607, Grotewold & Ruther，Dev Biol (2002) 251 129-141 ;Anselme 等 Dev Biol (2007) 304 =208-220)。為了清楚起見，后文提及FT0應包括人FT0、非人類同源物和/ 或其臨床上觀察到的任何變異。雖然FT0序列變異與肥胖癥關聯(lián)，但其蛋白質產(chǎn)物在生物化學、細胞學和生理學 水平的功能還未有報導。需要有關FT0結構及其生物化學、細胞學和生理學作用的知識才能夠對FT0和肥 胖癥之間的關系進行探究從而治療與重量增加相關的疾病，如糖尿病、心血管疾病、癌癥、 骨質疏松癥和高血壓。2-氧化戊二酸(2-0G)和亞鐵依賴的加氧酶是催化包括羥基化、去飽和和氧化閉 環(huán)在內的多種反應的酶的超家族(Hausinger (2004)，Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 39， 21-68 ；Ryle & Hausinger(2002)Curr. Opin. Chem. Biol. 6，193-201 ；和 Schofield 等 (1999) Journal of Inorganic Biochemistry 74，49_49)。底物氧化與 2-0G 向琥珀酸鹽和 二氧化碳的轉化相偶聯(lián)。至少在一些情況中，在氧的結合后，2-0G氧化脫羧得到琥珀酸鹽、 C02和鐵中心的鐵物種(ferryl species) [Fe(IV) =0]。這種高反應性的中間體隨后可氧 化主底物中的不活躍C-H鍵，例如氧化人類蛋白中的脯氨?；蛱於滨埢蜻M行其它 氧化反應如N-甲基化形式的蛋白或核酸的甲基的氧化。中間體的證據(jù)來自底物類似物研 究、模型化合物和光譜分析。
輔底物和主底物的依次結合是觸發(fā)氧結合所必須的，這對于在沒有主底物時限制 反應性氧化物種的生成可能十分重要。這種物種以主底物非偶聯(lián)方式生成可能使2-0G失 活并使有關加氧酶通過自身氧化失活，這種失活有時引起斷裂。通常，2-0G的非偶聯(lián)轉化以 當存在飽和濃度的主底物時其偶聯(lián)轉化率的約5%發(fā)生，不過其也可以以更低或更高速率 發(fā)生。包括前膠原脯氨酰羥化酶、缺氧誘導因子脯氨酰羥化酶和花色素合成酶在內的數(shù) 種2-0G依賴的加氧酶的完全催化活性需要抗壞血酸鹽。雖然抗壞血酸鹽可能通過將Fe3+ 或其它高價態(tài)形式的鐵還原為Fe2+(自由存在于溶液中或位于活性位點)來刺激活性，但抗 壞血酸鹽對加氧酶活性的刺激可能通過其它機制例如通過促進非偶聯(lián)循環(huán)的完成而發(fā)生。 對于在主底物不存在時由前膠原脯氨酰羥化酶催化的非偶聯(lián)反應循環(huán)，已表明2-0G被氧 化為琥珀酸鹽與抗壞血酸鹽在化學計量上偶聯(lián)。此外，已表明抗壞血酸鹽的活性可刺激細 胞中2-0G加氧酶的活性(例如在關于缺氧誘導因子(HIF)脯氨酰羥化酶的工作中)，并且 人類膳食中缺乏抗壞血酸鹽會由于前膠原脯氨酰羥化酶的活性受損而導致壞血病。以數(shù)種酶進行的研究已表明某些底物類似物和突變體也能夠刺激非偶聯(lián)的2-0G 轉化。從文獻中還可獲知，除抗壞血酸鹽自身之外的還原劑(包括抗壞血酸鹽的衍生物)在 非偶聯(lián)轉化反應中能夠發(fā)揮還原劑作用(Zhang等(1995)Biochem. J. 307 (Pt 1)，77_85和 Myllyla 等(1978)Biochem. Biophys. Res. Commun. 83，441-8)。多種2-0G加氧酶當下在治療上具有意義，包括轉錄因子羥化酶如缺氧誘導因子 脯氨酰和天冬氨酰羥化酶、甲基化核酸去甲基化酶、甲基化賴氨酰去甲基化酶、前膠原脯氨 酰和賴氨酰羥化酶、植烷酰CoA羥化酶、Mina53、N066和精氨酰羥化酶如磷脂酰絲氨酸受體 (Jmjd6)。甲基賴氨酰去甲基化酶可以將甲基化組蛋白用作優(yōu)選底物并可以任意使用所有 的三甲基化、二甲基化或單甲基化賴氨酸殘基作為優(yōu)選底物。核酸及包括組蛋白的核酸相關酸性蛋白的甲基化是表觀遺傳的已知機制。核酸的 甲基化還可以影響基因活性和表達。

發(fā)明內容
本發(fā)明人已將FT0鑒定為2-氧化戊二酸(2-0G)依賴的加氧酶并首次證明FT0是 2-0G依賴的加氧酶。本發(fā)明人已成功純化了重組FT0并證明所純化的重組FT0起到2-0G 依賴的加氧酶的功能并可被已知的2-0G加氧酶抑制劑抑制。因此，本發(fā)明提供了測定FT0活性的方法，該方法包括監(jiān)測FT0多肽的加氧酶活 性。在本發(fā)明的方法中可以將氧和/或2-氧化酸如2-0G用作輔底物和/或將鐵用作 輔因子。加氧酶活性的測定可以在諸如抗壞血酸鹽或其類似物、硫醇或膦等還原劑存在下 監(jiān)測。在一個實施方式中，在諸如肽或核酸底物等底物的存在下測定FT0加氧酶活性。用于本發(fā)明的方法的FT0多肽可以是重組多肽。在一個實施方式中，該FT0多肽 包含SEQ ID NO 1的氨基酸序列；或與SEQ ID NO :1的氨基酸序列在其全長有至少40% 同一性的氨基酸序列。所述與SEQ IDN0:1的氨基酸序列在其全長有至少40%同一性的氨 基酸可以是SEQ IDNo :2至11中任一個所示的氨基酸序列。作為選擇，所述與SEQ ID NO 1的氨基酸序列在其全長有至少40%同一性的氨基酸序列可以是人類FT0的天然存在的變體或除人之外其它物種的FT0同源物。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明提供了一種方法，所述方法包括使FT0多肽與 測試試劑接觸；在該測試試劑存在下監(jiān)測加氧酶活性；和確定該測試試劑是否是FT0活性 的抑制劑或激活劑。測試試劑可以是除FT0之外的2-0G加氧酶的已知抑制劑，或所述抑制劑的類似物
或變體。除FT0之外的2-0G加氧酶可以是例如脯氨酰、賴氨酰、精氨酰或天冬氨酰去甲基 化酶、前膠原脯氨?；蛸嚢滨Ａu化酶、缺氧誘導因子脯氨酰羥化酶、甲基化賴氨酰去甲基化 酶(包括組蛋白去甲基化酶)、天冬氨酰羥化酶、磷脂酰絲氨酸受體(Jmjd6)、AlkB或人類 AlkB同源物和/或赤霉素C-20氧化酶。已知的2-0G抑制劑可以是N-草酰氨基酸如N-草 酰甘氨酸或其衍生物、甘氨酸或丙氨酸衍生物、2-氧化酸類似物、類黃酮或類黃酮衍生物如 染料木黃酮。在本發(fā)明的用于鑒定FT0抑制劑或激活劑的方法中，測試試劑可以與2-0G或FT0 底物在FT0活性位點競爭和/或在FT0活性位點結合金屬。測試試劑可以例如包含金屬離 子。在一個實施方式中測試試劑是還原劑，所述還原劑可以是除FT0之外的2-0G加氧 酶的已報導激活劑。例如，測試試劑可以是抗壞血酸鹽或抗壞血酸鹽的類似物或硫醇還原 劑，例如二硫蘇糖醇或膦化學族的成員。本發(fā)明的方法中所用的FT0多肽的底物可以是核酸、核酸衍生物或類似物。例 如，該底物可以是甲基化核酸。甲基化核酸可以與參與重量調節(jié)的基因有關，例如野灰 (agouti)基因或神經(jīng)肽Y基因、瘦素基因、阿黑皮素原基因(proopiomelanocortin gene)、 食欲素基因、甘丙肽基因、PYY基因、膽囊收縮素基因、胰高血糖素相關肽1基因或胰島素基 因。在一個實施方式中，本發(fā)明提供了鑒定FT0底物的方法，該方法包括將FT0多肽 與測試底物接觸；監(jiān)測加氧酶活性；和確定測試底物是否是FT0的底物。測試底物可以是人 類核酸序列，例如包含3-甲基胸腺嘧啶堿基、1-甲基腺嘌呤堿基或3-甲基胞嘧啶堿基的核 酸序列。作為選擇，測試底物可以是甲基化的蛋白或肽?？梢允褂肍T0抑制劑使得能夠通 過在鑒定底物之前穩(wěn)定FT0和底物之間的相互作用來鑒定FT0底物。在一個方案中，本發(fā)明提供了鑒定可選擇性抑制或激活FT0、或者激活或抑制除 FT0之外的酶但不激活或抑制FT0的抑制劑或激活劑的方法，該方法包括在測試試劑的存 在下監(jiān)測FT0的活性，使用除FT0之外的酶重復該方法，并確定該測試試劑是否選擇性抑制 或激活FT0或其它酶。在本發(fā)明的一個實施方式中，除FT0之外的酶通常是2-0G加氧酶，例如缺氧誘導 因子羥化酶如脯氨酰、天冬氨?；蛸嚢滨Ａu化酶，膠原或前膠原脯氨酰羥化酶、核酸去甲基 化酶如AlkB同源物、或蛋白去甲基化酶如三甲基、二甲基或單甲基賴氨酸、精氨酸、天冬氨 酸或脯氨酸殘基去甲基化酶。蛋白去甲基化酶可以對甲基化組蛋白或其片段進行羥基化。在其它實施方式中，本發(fā)明提供了 -2-0G加氧酶活性的抑制劑或激活劑的調節(jié)FT0活性的應用；-在治療或預防重量增加或重量減輕或者治療或預防與重量增加或重量減輕相關疾病的方法中應用的FT0加氧酶活性的調節(jié)劑；-對有需要的個體進行的治療或預防重量增加或重量減輕的方法，所述方法包括 對所述個體施用治療有效量的FT0加氧酶活性的抑制劑或激活劑；和-對有需要的個體進行的治療或預防與重量增加或重量減輕相關疾病的方法，所 述方法包括對所述個體施用治療有效量的FT0加氧酶活性的抑制劑或激活劑。


圖1顯示了 FT0同源物序列的clustalW比對人類gi | 122937263，黑猩 猩 gi 1114662524(^99 % ),稱猴 gi 1109128525(^93 % )，狗 gi | 73950384 (*91 % )，奶 牛 gi 1119910109 (*88 % )，負鼠 gi 1126296336 (*65 % )，小鼠 gi 118490097 (*87 % )， 小鼠 2gi | 6753916 (*87 % )，大鼠 gi | 89337260 (*87 % )，魚 gi 1125821796 (*48 % )，蛙 gi| 62859671(^52% ) [* 表示與人 FT0 的同一性]。圖2是基于FT0序列和二級結構與ABH3 (圖5)比對的FT0的同源模型。圖3顯示了 FT0和ABH3的序列和二級結構比對(FT0的預測的二級結構)。羅馬 數(shù)字表示八個核心DSBH股。DSBH域之后有C-末端螺旋域。圖4顯示了確定FT0酶活性的2-0G轉化測試的結果。所進行的測試采用11. 5 y M FTO, 144uM 20G, 16 u M14C-20G, 80 u M (NH4) 2Fe (I I) (S04) 2，4 ii M 抗壞血酸鹽禾口 ImM DTT，或 者測試中不含(NH4)2Fe(II)(S04)2、抗壞血酸鹽和DTT中的一種。測試還在N-草酰甘氨酸 (NOG)的存在下進行。圖5顯示了以重組FT0對寡核苷酸去甲基化的質譜(MS)分析結果。所示數(shù)據(jù)對 于TTX TTT TTT TTT TTT (T =胸腺嘧啶，X-甲基化堿基)為4-電荷態(tài)。+FT0 =與FT0及 適當輔因子和輔底物溫育。3MeT = 3-甲基胸腺嘧啶；lMeA = 1-甲基腺嘌呤；3MeC = 3-甲 基胞嘧啶。圖6顯示了測試FT0的2-0G依賴的DNA去甲基化酶活性的實驗結果(a)在2_0G 脫羧測試中，1-meA的去甲基化依賴于FT0 ； (b) LC-MS表明FT0對3-meT底物的活性依賴于 輔因子/輔底物。所示數(shù)據(jù)表示ss-DNA中胸腺嘧啶對3-meT的比例。氧對照反應在<
02的氣氛中進行；(c)對FT0催化1-meA的抑制。圖7顯示了 FT0使單鏈DNA底物去甲基化的質譜分析結果。5’_TT(甲基化堿基) TTTTTTTTTTTT-3’形式的合成15聚寡核苷酸與FT0、輔因子和輔底物溫育的LC-MS數(shù)據(jù)；去 甲基化底物的預測峰的位置由虛線標示。比反應物峰質量更高的較小的峰可能是源于甲基 化寡核苷酸的Na+和K+加合物。m/z =質-荷比，以道爾頓為單位表示；(b)FTO反應的化學 計量；(c)甲醛從甲基化多聚(dA)和多聚(dT)的釋放。通過在37°C與[14C]_甲基化多聚 (dA)或[14C]-甲基化多聚(dT)(總c. p. m.分別為1000或800)溫育15分鐘測試FT0和 ABH3的去甲基化酶活性。監(jiān)測醇溶[14C]-甲醛的釋放。FT0-〇-，_ _ ； ABH3- A-,-A-. [14C]_甲基化多聚(dA)-〇-，-A-;[14C]_甲基化多聚(dT)- -，-▲-。當2-0G不存 在時，未檢測到明顯活性。圖8顯示了非偶聯(lián)2-0G轉化實驗結果(a)測試采用2_0G轉化法；未加入甲基化 DNA底物。實驗設備和方法如實施例所述。所示數(shù)值是兩次獨立實驗的平均值，100%對應 于130，000計數(shù)的[14C]-C02;(b)存在抑制劑時非偶聯(lián)2-0G轉化減少。DMS0= 二甲基亞砜。雖然N-草酰甘氨酸能夠螯合Fe (II)，但這不完全是其FT0抑制效果的原因，這是因為 2-0G依賴的天冬氨酸-羥化酶的抑制劑N-草酰-D-苯丙氨酸(10)具有與N-草酰甘氨酸 相似的Fe(II)螯合能力但不抑制FT0活性。所示數(shù)值是兩次獨立實驗的平均值，100%對 應于130，000計數(shù)的[14C]-C02 ； (c)所用抑制劑的結構?；衔?此前已被鑒定為有效的 2-0G加氧酶抑制劑(Franklin等，2001，Biochem J. 353:333)并采用標準合成方法學合成 (Banerji 等，2005，Chem Comm. 43 5438)。序列說明SEQ ID NO 1 是人 FT0 的氨基酸序列(gi 1122937263)。SEQ ID N0:2是與人FT0有99%序列同一性的黑猩猩FT0的氨基酸序列 (gi1114662524)。SEQ ID NO :3是與人FT0有93 %序列同一性的獼猴FT0的氨基酸序列 (gi1109128525)。SEQ ID NO :4是與人FT0有91 %序列同一性的狗FT0的氨基酸序列 (gi|73950384)。SEQ ID NO :5是與人FT0有88 %序列同一性的奶牛FT0的氨基酸序列 (gi1119910109)。SEQ ID NO :6是與人FT0有65 %序列同一性的負鼠FT0的氨基酸序列 (gi|126296336)。SEQ ID NO :7是與人FT0有87 %序列同一性的小鼠FT0的氨基酸序列 (gi|18490097)。SEQ ID NO :8是與人FT0有87 %序列同一性的小鼠FT0的氨基酸序列 (gi|6753916)。SEQ ID NO :9是與人FT0有87 %序列同一性的大鼠FT0的氨基酸序列 (gi|89337260)。SEQ ID NO :10是與人FT0有48 %序列同一性的魚FT0的氨基酸序列 (gi|125821796)。SEQ ID NO :11是與人FT0有52 %序列同一性的蛙FT0的氨基酸序列 (gi|62859671)。SEQ ID NO 12 是人 ABH3 的氨基酸序列(gi | 21040275)。
具體實施例方式本發(fā)明人已經(jīng)純化了重組FT0并鑒定FT0為2-氧化戊二酸(2-0G)依賴的加氧酶。 因此，本發(fā)明提供了測定FT0活性的方法，所述方法包括監(jiān)測FT0多肽的加氧酶活性。本發(fā) 明還提供了 FT0多肽在鑒定FT0加氧酶活性的調節(jié)劑和可被FT0氧化的底物的測試法中的應用。本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)FT0與Fe(II)和2_0G依賴的加氧酶同源，該酶與人DNA去甲基 化酶ABH3有特別強的序列相似性，ABH3對于1-甲基腺嘌呤和3-甲基胞嘧啶等核酸堿基 具有作為去甲基化酶的已知活性。本發(fā)明中所用的FT0多肽通常結合Fe2+。因此，在本發(fā) 明的一個方案中，在測定FT0活性的方法中鐵可被用作輔因子。
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本發(fā)明中使用的FT0多肽通常具有將2-0G和氧轉化為琥珀酸鹽和二氧化碳的能 力。因此，在本發(fā)明的一個方案中，測定FT0活性的方法使用氧和/或2-0G為輔底物。FT0多肽可以包含如SEQ ID NO 1所示的序列，或與雙鏈0螺旋(DSBH)域中的 SEQ ID NO :1具有至少40%序列同一性(例如至少45%序列同一性)，或與SEQ ID N0:1的 氨基酸序列在其全長有至少約40%例如至少約50%或約60%序列同一性、通常大于70% 或80%、更通常大于約90%或95%例如約99%序列同一性的氨基酸序列。序列同一性可以使用任何適合的算法來計算。例如，UWGCG包提供了 BESTFIT程 序，能夠用于推算同源性(例如按照其默認設置使用)(Devereux等(1984) Nucleic Acids Research 12，387頁-395頁)。PILEUP和BLAST等算法能夠用于推算同源性或排列序列 (通常按默認設置)，例如如 Latched (1993) J.Mol.Evol 36 :290_300 或 Latched 等(1990) J. Mol. Biol. 215 403-10 所述。FT0多肽可以是由任何天然存在的FT0基因編碼的多肽。天然存在的FT0基因可 以包含SEQ ID N0:1中所示序列，也可以是SEQ ID N0:1的變體。所述變體可以包括等位 基因變體和蛋白序列中單個氨基酸或氨基酸群的缺失、修飾或添加，只要多肽保留2-0G加 氧酶活性即可。多肽還優(yōu)選具有核定位信號，尤其是使用基于細胞的測試法監(jiān)測多肽活性 時。所述核定位信號可以是FT0核定位信號序列或來自其它肽的核定位信號序列。FT0多肽可以是來自非人類物種的FT0同源物，例如有黑猩猩(SEQID N0 2)、獼 猴(SEQ ID NO 3)、狗(SEQ IDN0 4)、奶牛(SEQ ID NO 5)、負鼠(SEQ ID NO 6)、小鼠(SEQ ID NO :7 或 8)、大鼠(SEQ ID NO :9)、魚(SEQ ID N0:10)、蛙(SEQ ID NO 11)等的 FT0 同 源物，或來自其它生物如綠藻的同源物。FT0同源物可以是天然存在的蛋白。FT0多肽具 有的氨基酸序列可以是非天然存在的但與天然存在的FT0序列相比包含單個氨基酸或氨 基酸群的缺失、修飾或添加。例如，F(xiàn)T0多肽可以與SEQ IDN0:1至11中任一個具有至少約 40%，例如至少約50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的序列同一性?？梢詫EQ ID NO 1至11中任一個進行氨基酸取代，例如從約1、2或3個至約 10、20或30個的取代?？梢愿鶕?jù)例如下表進行保守取代。第二列同一格中的氨基酸、優(yōu)選 第三列同一行中的氨基酸可以相互取代。 本發(fā)明范圍內的變體多肽可以通過任何適合方法例如基因改組技術產(chǎn)生。本發(fā)明還包括了本發(fā)明的多肽的活性部分、片段、衍生物和功能模擬物的應用。多 肽的“活性部分”是指比所述全長多肽短但保留2-0G加氧酶活性的肽。FT0的活性片段通 ?？梢酝ㄟ^監(jiān)測2-0G加氧酶活性來鑒定，下文對此有更詳細描述。這樣的活性片段可以作 為部分融合蛋白包括在內，該融合蛋白例如可包括不同(即異源)配體的結合部分。
所述片段可以具有至少約50個氨基酸或者至多約60、70、80、100、150、200、400或 500個氨基酸。具體而言，但不具限制性，本發(fā)明的這一方案可以包含這樣的情況蛋白是 完整FT0蛋白序列的片段并可以代表能夠將2-0G轉化為琥珀酸鹽和二氧化碳的催化區(qū)。 人、黑猩猩、獼猴、狗、奶牛、負鼠、小鼠、大鼠、魚和蛙FT0的催化核心如SEQ ID N0:1至11 所示。在一個實施方式中該片段可以包含催化核心和與催化核心N末端相鄰的核苷酸識別 巾冒(nucleotide-recognition lid)。該片段可以包含從SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列的約第1個氨基酸至約第505 個氨基酸的任何區(qū)域，例如從第2、3、4、5或10個氨基酸至第495、500、501、502、503或504 個氨基酸?？捎闷伟∟末端截短片段，即包含N末端缺失的片段，例如包含如SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的第30個殘基至第505個殘基或第60個殘基至第505個殘基的片 段；和同時包含N末端截短和C末端截短的片段，例如包含如SEQ ID NO :1所示氨基酸序列 的第30個殘基至第33個殘基或第60個殘基至第330個殘基的片段。其它適合片段可以 通過例如下述方式來容易地鑒定將FT0氨基酸序列與一種或多種已知2-0G依賴的加氧酶 的氨基酸序列比較并鑒別出哪個區(qū)域與具有催化活性的區(qū)域不同源。具有催化活性的區(qū)域 通常被包含在活性片段中。這種片段能夠被用于構建嵌合分子。與SEQ ID NO :1的氨基酸序列欄(sequence column)具有至少約60%例如至少 約70 %、80 %、90 %、95 %、99 %或100 %序列同一性的任何FT0多肽的片段(例如，包括SEQ ID N0 :2至11中任一序列的片段的任何上述天然存在或基因工程序列的片段)(所述片段 具有加氧酶活性)也可以用于本發(fā)明的測試并可被涵蓋在本文所用術語“FT0多肽”中?？梢院铣芍苽銯T0多肽。多肽可以被化學修飾或生物化學修飾，例如翻譯后修飾。 例如，它們可以被糖基化或包含經(jīng)修飾的氨基酸殘基。所述多肽還可以通過添加組氨酸殘 基(通常6個)、或其它序列標簽如麥芽糖結合蛋白標簽或內含肽(intein)標簽來修飾，以 輔助其純化，或通過添加核定位序列來修飾從而促進向核或線粒體的易位，或通過翻譯后 修飾(包括羥基化或磷酸化)來修飾。本發(fā)明的多肽可以是GST或其它適合的融合多肽。 還可以通過添加熒光標簽(例如綠色熒光蛋白)來修飾FT0多肽從而使其能在細胞或細胞 器中可視化，或有助于純化蛋白或表達FT0的細胞。這種經(jīng)修飾的多肽落入術語“FT0多肽” 的范圍內。本發(fā)明的多肽可以以部分純化的或基本上分離的形式存在。它們可以與不干擾其 預定用途的載體或稀釋劑混合并仍可被視為基本上分離。它們還可以處于基本已純化的形 式，在此情況下它們通常占制劑的蛋白、多核苷酸、細胞或干物質的至少約90%，例如至少 約 95%、98%或 99%?？梢詫⒈景l(fā)明的多肽用于2-0G依賴的加氧酶活性的測試，從而例如鑒定羥化酶 活性的調節(jié)劑如抑制劑或激活劑。抑制劑可以是選擇性抑制劑或激活劑?？蓪T0多肽用于主底物(即非2-0G底物)不存在的2-0G加氧酶活性測試。還 可以將FT0多肽用來在一種或多種適合底物存在時確定加氧酶活性。此外，本發(fā)明提供了 鑒定FT0的底物的方法。本發(fā)明的方法中所用的FT0可以是重組FT0或天然存在的FT0。優(yōu)選的是，在需 要將FT0用于需大量(> lmg)蛋白的用途例如生物物理學測試或高通量分析的情況下，尤 其應使用重組FT0?？梢圆捎冒幋aFT0的核苷酸序列的標準表達載體來生產(chǎn)重組FT0。這種表達載體可以按分子生物學技術常規(guī)構建，并且例如可能涉及使用質粒DNA和可能需 要的適宜起始子、啟動子、增強子和其它元件如多聚腺苷化信號(位于正確方位)從而使蛋 白質表達。其它適宜的載體對本領域技術人員顯而易見。關于這一方面進一步的實例可以 參考 Sambrook 等 1989。本發(fā)明的方法可利用經(jīng)修飾而表達本文所限定的FT0多肽的細胞。FT0還可以存 在于細胞提取物中，也可以以部分或基本純化的形式存在。獲得純化FT0的方法本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)利用經(jīng)修改的表達純化方法可以將重組FT0以可溶的活性形式 表達。本發(fā)明人還證明所純化的重組FT0是2-0G依賴的加氧酶。因此，本發(fā)明提供了獲得 純化FT0的方法和測定經(jīng)純化的FT0的加氧酶活性的方法。可以通過將包含編碼FT0多肽的多核苷酸的表達載體引入宿主細胞來獲得純化 FT0多肽。表達載體按本領域技術常規(guī)構建，并例如可能涉及使用質粒DNA和可能需要的適 宜起始子、啟動子、增強子和其它元件如多聚腺苷化信號(位于正確方位)從而允許完整蛋 白質表達。適宜的載體對本領域技術人員來說極其顯而易見。根據(jù)所選的測試方式，啟動 子序列可以是可誘導或組成型啟動子。啟動子可以具有組織特異性。因此將載體中的編碼 序列以可操控方式連接于所述元件，從而它們可使編碼序列表達(通常在細胞中)。術語 “以可操控方式連接”是指其中所述成分的關系使得它們能以其預定方式發(fā)揮功能的鄰接。載體可以是例如質粒、病毒或桿狀病毒載體。載體通常適于在細菌細胞如大腸桿 菌(E.coli)中使用。載體可具有復制起點。載體可包含一種或多種選擇性標記物基因，例 如在細菌質粒情況中可以是氨芐青霉素抗性基因，或對于真菌載體的抗性基因。載體可以 用于轉染或轉化宿主細胞，例如細菌宿主細胞、真菌宿主細胞、昆蟲宿主細胞、哺乳動物如 人宿主細胞、或桿狀病毒宿主細胞。細菌宿主細胞優(yōu)選為E. coli菌株BL21 (DE3)。本發(fā)明提供了純化FT0多肽的生產(chǎn)方法。所述方法通常包括培養(yǎng)包含編碼FT0多 肽的表達載體的宿主細胞和從該細胞中分離FT0多肽。通?？梢栽诶缂s15°C 約37°C 的溫度培養(yǎng)宿主細胞?？梢酝ㄟ^裂解細胞并從裂解緩沖液中提取蛋白來分離多肽。裂解緩 沖液通常含有約250mM 約700mM例如約400mM 約600mM (如500mM)的鹽如NaCl。本發(fā) 明的FT0多肽的生產(chǎn)方法還可以包括將本發(fā)明的多核苷酸或載體引入宿主細胞。FT0多肽 包含在裂解細胞培養(yǎng)物時獲得的可溶性部分中?？梢詫⒍嚯膹目扇苄圆糠种羞M一步純化， 例如通過親和純化，如經(jīng)由與截短的2-0G依賴的加氧酶融合的親和標簽進一步純化。將多肽和載體引入宿主細胞的方法為本領域中公知，包括但不限于電穿孔和熱休 克技術。之后可通過將宿主細胞在適宜溫度下培養(yǎng)來實現(xiàn)截短多肽的表達。優(yōu)選將表達重 組FT0的細胞置于約15°C至約30°C，例如約20°C或約28°C從而誘導重組FT0的表達。當 宿主細胞是細菌如E.coli時，可以將細胞在2TY培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在溫育期(或生長期)或 在溫育期的最后階段，可以向培養(yǎng)基中添加IPTG。在將細胞離心以去除細胞培養(yǎng)基后，通常使用含高鹽水平的裂解緩沖液來裂解 細胞。該緩沖液通常含有約250mmol 約700mmol的如NaCl等鹽，例如約400mmol 約 600mmol的NaCl (如500mmol的NaCl)。提取緩沖液可以含有去垢劑，例如Triton X-100和 /或SDS(通常為1%)和/或溶菌酶。裂解緩沖液中可以存在通常濃度為約5% 約20%(如約10% )的甘油。裂解緩沖液的pH通常大于約7. 5，例如約7. 6 約8. 1、約7. 8 約 8.0，更優(yōu)選為約7. 9。裂解緩沖液可以適于對細胞的超聲。裂解緩沖液中還可以存在濃度 為例如約lOmmol 約lOOmmol (如約20mmol)的Tris。裂解后，可對細胞離心。離心后上清液為可溶性部分?？扇苄圆糠种写嬖诘牡鞍?濃度取決于所用的提取緩沖液的量。可溶性部分中存在的FT0的量足以使其能被純化。這 可以通過SDS PAGE來確定。如果通過SDS PAGE可以檢測到截短的酶，則存在有足夠的酶 用以純化。可以通過本領域中已知的標準技術來純化本發(fā)明的FT0多肽。例如，當多肽包含 His標簽時，可以利用his-結合樹脂按照制造商(例如Novagen)的說明、或者通過諸如離 子交換色譜等其它方式來進行純化。純化方案可以包含以下步驟。將本發(fā)明的表達重組多 肽的細胞沉淀并重懸于適合的緩沖液中，隨后超聲以破碎細胞。通過離心將細胞碎片與可 溶性物質分離，將可溶性部分載樣于his-結合柱。以結合緩沖液和洗滌緩沖液洗滌所述 柱，隨后用洗脫緩沖液將所結合的蛋白從柱上洗脫。結合、洗滌和洗脫緩沖液通常均含有 0.5M NaCl。不必添加額外的鹽。隨后將所洗脫的蛋白濃縮并與凝血酶一起溫育(通常以 lUmg-1的濃度在4°C溫育16小時)。采用凝膠過濾柱分離經(jīng)消化的蛋白，從柱上洗脫的FT0 的純度通常為至少90%或至少95%?？梢詫τ糜诒疚乃龅母鞣N測試的純化蛋白進行脫
Trrt. o測試我們的數(shù)據(jù)表明FT0可催化2-0G轉化為琥珀酸鹽和二氧化碳。FT0的這種新發(fā) 現(xiàn)的活性首次表明可以進行FT0活性的抑制劑或刺激劑/激活劑的鑒定測試。阻斷或激活 FT0的2-0G加氧酶活性將導致重量調節(jié)?？梢赃M行任何適合的測試來鑒定FT0加氧酶活性 尤其是2-0G加氧酶活性的調節(jié)劑。下面將描述適合的測試的大量不同實施例。在一個實 施方式中，測試利用了本文所述的人FT0多肽。FT0多肽可以以純化形式或未純化形式提 供，例如作為細胞提取物或通過從所述提取物中純化相關多肽提供。作為選擇，可以將相關 成分使用重組表達技術表達并純化以用于所述測試。作為選擇，可以將所述成分在細胞中 重組表達以用于基于細胞的測試。測試方法FT0多肽可用于加氧酶活性例如2-0G加氧酶活性的測試。這些多肽還可用于鑒定 可調節(jié)(例如抑制或激活)FT0加氧酶活性的試劑的測試。所述方法包括在一種或多種輔底 物以及可選的主底物的存在下，使FT0多肽與測試物質如潛在的抑制劑接觸。測試物質和 FT0多肽通常在適于加氧酶活性的條件下接觸。適合的輔底物包括氧，例如雙氧和2-氧化 酸如2-0G。優(yōu)選的是，輔底物是2-0G。除了氧或2-氧化酸，還可以使用還原劑如抗壞血酸 鹽作為輔底物。在不存在測試物質的情況下使測試的成分在酶對輔底物起作用的條件下接 觸并確定輔底物修飾的程度。作為選擇，可以監(jiān)測主底物的氧化。不存在催化轉化時還可 以采用檢測對FT0結合的測試。所述測試可以利用諸如色譜、NMR、MS或熒光光譜等技術。 輔底物可以被FT0修飾，例如2-0G，也可以被FT0消耗，例如氧或抗壞血酸鹽?？梢酝ㄟ^測 定甲醛釋放來監(jiān)測去甲基化活性。測定甲醛釋放的適合方法為本領域中已知。所述方法例 如 Kleeberg 禾口 Klinger(1982)J.Pharmacol. Methods 8:19—31，Trewick 等(2002)Nature 419 :174-178和Tsukada等(2006)Nature 439 :811_816中所描述。通過對活性增加的測試，測試還可以用于檢測可增加2-0G依賴的加氧酶活性的物質。對其它2-0G依賴的加氧 酶，本領域中已經(jīng)描述了適合的測試。本發(fā)明的這些測試可用于鑒定加氧酶活性的抑制劑，因此優(yōu)選在包括不存在測試 物質時FT0具有加氧酶活性的條件下進行。將存在測試物質時的FT0加氧酶活性與不存在 測試物質時的FT0加氧酶活性比較從而確定測試物質是否是FT0加氧酶活性的抑制劑?；?者，可以利用測試來搜尋FT0加氧酶活性的促進劑，例如通過搜尋與不存在測試物質時進 行的測試相比輔底物轉化和/或底物羥基化的增加來搜尋FT0加氧酶活性的促進劑。測試 還可以在加氧酶活性降低或不存在的情況下例如在缺氧條件下進行，在這種條件下可以監(jiān) 測活性的存在或增加。還可以使用本發(fā)明的測試來鑒定對FT0特異的抑制劑或激活劑，所述特異的抑制 劑或激活劑對諸如前膠原羥化酶、人ABH(AlkB同源物)、甲基賴氨酸去甲基化酶、缺氧誘導 因子(HIF)天冬氨酰或脯氨酰羥化酶等其它2-0G加氧酶沒有活性或活性較低。反過來，可 以用本發(fā)明的測試來鑒定對一種或多種2-0G依賴的加氧酶例如HIF天冬氨?；蚋滨Ａu 化酶等特異、但不抑制FT0的抑制劑或激活劑。本發(fā)明的測試還可用于鑒定對特定底物或底物中的殘基的FT0活性特異的抑制 劑或激活劑。例如在醫(yī)藥應用中，通常有利的是調節(jié)單個酶或一組酶的加氧酶活性。因而可采 用本發(fā)明的測試來鑒定可選擇性調節(jié)FT0相對于另一種2-0G依賴的加氧酶的活性的試劑， 所述另一種2-0G依賴的加氧酶包括但不限于賴氨酰、脯氨酰、天冬氨酰和精氨酰去甲基化 酶、HIF羥化酶、包括FIH、PHD1、PHD2和PHD3、AlkB、ABH1、ABH2、ABH3、前膠原脯氨酰和賴 氨酰羥化酶、磷脂酰絲氨酸受體(Jmjd6)、Mina53和根據(jù)SMART數(shù)據(jù)庫已被定性為Jmj域蛋 白的2-0G加氧酶(包括但不限于賴氨酰去甲基化酶)。這種選擇性篩選可用于鑒定FT0的選擇性抑制劑或其它酶的選擇性抑制劑，即對 FT0活性的抑制比對其它酶活性的抑制更強的抑制劑，或對FT0活性的抑制比對其它酶活 性的抑制更弱的抑制劑。當該抑制劑是FT0活性的選擇性抑制劑時，它對其它酶的活性可 能沒有效果或僅顯示出低水平抑制，例如對其它酶活性低于約50%的抑制。當該抑制劑是 非FT0酶的活性的選擇性抑制劑時，它對FT0活性可能沒有效果或僅顯示出低水平抑制，例 如對FT0活性低于約50%的抑制。選擇性篩選可以以純化酶、部分純化酶(例如在細胞粗裂解物中)或在細胞中進 行。本發(fā)明提供了選擇性抑制劑在制造用以治療與2-0G依賴的加氧酶活性(例如FT0 加氧酶活性)改變(即增強或降低)相關的病況的藥物中的應用。當一種或多種受測試酶的主底物未知時，也可以使用本發(fā)明的方法鑒定選擇性抑 制劑。在這種實施方式中，通常一種或多種不希望被抑制的酶是具有未知底物的酶?？梢栽?不存在底物的情況下，通過確定測試試劑是否影響(例如抑制或刺激)加氧酶導致的2-0G 的轉化率來確定測試試劑對加氧酶活性的影響。本發(fā)明的測試可以使用可被FT0羥基化或氧化的底物。尤其是，這種底物可被用 于監(jiān)測FTO 2-0G加氧酶活性的調節(jié)劑活性的測試中。該底物可以是肽或核酸底物。核酸 底物可以是DNA或RNA?？梢允褂霉押塑账岬孜铩NA優(yōu)選是核DNA，但可以是線粒體DNA。優(yōu)選的是核酸底物在一個或多個殘基處被甲基化。可以將可被FT0羥基化或更常見為氧化的任何適合的底物與通常具有SEQ ID NO 1的氨基酸序列或變體的FT0—起使用。2-0G依賴的加氧酶的一些底物是本領域中已知的。 底物可以是天然存在的蛋白或者重組或合成的蛋白或核酸?？梢詫杀籉T0氧化的位 點的天然存在的底物蛋白或核酸的片段和變體用作本發(fā)明的測試中的底物。在鑒定FT0或其它加氧酶的選擇性抑制劑的測試中，可以對FT0和其它加氧酶使 用不同底物。本發(fā)明的方法可用于檢測FT0的2-0G依賴的加氧酶活性的新型底物。在這種測 試中，可使用測試底物，檢測到羥化酶活性表明已發(fā)生測試底物的羥基化，因此該測試底物 是FT0的底物。這種測試可以以經(jīng)分離成分、半純化提取物或在完整細胞中進行。測試底物可以是核酸、核酸衍生物或類似物，例如甲基化核酸，也可以是蛋白或 肽，例如甲基化的蛋白或肽。甲基化的核酸、蛋白或肽可能與參與重量調節(jié)的基因、蛋白或 肽相關。例如，該核酸可以是基因的一部分或從基因轉錄的mRNA，或者所述肽或蛋白可由基 因編碼。參與重量調節(jié)的基因或肽的實例包括野灰基因和野灰相關肽以及神經(jīng)肽Y基因和 神經(jīng)肽Y相關肽基因，以及以下肽和編碼它們的基因瘦素、阿黑皮素原、食欲素、甘丙肽、 PYY、膽囊收縮素、胰高血糖素相關肽1和胰島素。可以使用包括但不限于2-0G類似物如N-草酰甘氨酸的FT0活性抑制劑和諸如 鋅、鎂、錳、鈷和鎳等過渡金屬，通過穩(wěn)定FT0和底物之間的相互作用，隨后鑒定與FT0結合 的底物或結合伴侶來鑒定FT0底物?？梢允褂脴藴史椒▉龛b定底物或結合伴侶?？捎玫募?術的實例有涉及質譜或者抗體或其它標準試劑和蛋白質組學領域中所用的方法學的技術。 作為選擇，可以使用結合測試或基于細胞的測試。調節(jié)的監(jiān)測方法本領域的技術人員可以利用常規(guī)技術和知識來改變本發(fā)明的任何篩選或測試方 法的確切形式。技術人員明確知道需要額外采用適當?shù)膶φ諏嶒灐１景l(fā)明的測試可以涉及 監(jiān)測適宜底物的羥基化、監(jiān)測底物和輔底物的利用、監(jiān)測酶及其底物之間預期產(chǎn)物的產(chǎn)生。 本發(fā)明的測試方法還可以涉及對體系中成分之間的直接相互作用的篩選。作為選擇，可以 進行這樣的測試使用適宜的報告物構建體來監(jiān)測由底物介導的下游效應，例如底物介導 的轉錄，或者通過監(jiān)測已知直接或間接受底物調控的基因的上調或基因的表達方式的改變 進行。直接或間接確定加氧酶活性的各種方法是本領域中已知的。可以采用任何適宜的 方法來確定FT0的2-0G依賴的加氧酶活性，例如通過底物或輔底物利用、產(chǎn)物出現(xiàn)如肽/ 核酸羥基化/去甲基化，或由羥基化/去甲基化或非羥基化產(chǎn)物介導的下游效應來確定。在底物羥基化/去甲基化的抑制劑不存在的條件下，可以將底物、酶和潛在的抑 制劑化合物共同溫育，并可通過測定底物的羥基化/去甲基化來確定抑制劑的效果。這可 以通過任何適合的方式完成。小的多肽或多核苷酸底物可以回收并用于物理分析，如質譜、 放射照相術或色譜，或者進行功能性分析。這些方法是本領域中已知的，并可以采用常規(guī)技 術和知識來實施。例如，可以采用實施例中描述的LC-MS測試。測定可以是定量的或定性 的。在定量或定性測定中，尤其是在定性測定中，可以將定性測定與適合的對照(例如未與 潛在抑制劑溫育的底物)比較進行。
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在替代性實施方式中，可以提供其中由底物介導的啟動子與報告物基因可操縱連 接的報告物構建體?？梢允褂萌魏芜m合的報告物基因，例如隨后可用于比色、熒光、熒光共 振或光譜測試的酶。在本文所述的測試方法中，通常在輔底物如氧和/或2-氧化酸(如2-0G和/或 雙氧)的存在下使FT0和底物接觸?？梢酝ㄟ^測定一種或多種輔底物例如氧、2-0G和/或 抗壞血酸鹽的轉化來確定羥化酶/去甲基化酶活性。這可以通過確定反應產(chǎn)物如羥基化底 物或琥珀酸的存在和/或量來實現(xiàn)?？梢源_定相對于底物量的產(chǎn)物量。例如，在這種實施 方式中，底物可以是多肽，并且例如所測定的產(chǎn)物可以是羥基化/去甲基化的多肽或核酸。 例如，通過測定反應中生成的羥基化/去甲基化多肽/核酸、琥珀酸鹽、二氧化碳或甲醛的 量，或者通過測定2-0G或雙氧的消耗，可以確定羥基化/去甲基化的程度。這些之中任一 種的監(jiān)測方法可從科學文獻中獲知，例如Myllyharju等(1991)EMBO J. 16(6) :1173_1180 或 Cunliffe 等(1986)Biochem. J. 240 :617_619?？梢杂没瘜W試劑將未使用的2-0G衍生化，例如但不限于胼衍生物和鄰苯二胺衍 生物，從而得到能夠被定量并用于指示測試多肽的羥基化程度的指示性生色團或熒光團。 例如但不限于“Clarke型”電極的溶解氧電極或者利用熒光淬滅的電極可用于追蹤測試混 合物中氧的消耗，之后可以以與上述相類似的方式將其用來指示測試多肽的羥基化程度。鄰苯二胺(0PD)與2-0G的a -酮酸基序反應的熒光產(chǎn)物是3_(2_羧乙 基)-2(lH)_喹喔啉酮。這種熒光產(chǎn)物使用標準設備即可容易地檢測到，例如由Molecular Devices、Tecan、BMG Labtechnologies、asco 禾口 Perkin Elmer 制造的設備，并且有大量先 例證明熒光產(chǎn)物的生成可用于高通量篩選。熒光產(chǎn)物通常用設置為約300nm 約400nm、優(yōu)選為約335nm 約345nm、最優(yōu)選 為約340nm的激發(fā)濾光器檢測。發(fā)射濾光器通常為約400nm 約450nm、優(yōu)選為約415nm 約425nm、最優(yōu)選為約420nm。這種測試方法使其有利于高通量形式，例如多孔板形式如96孔、384孔或1536孔 板形式。此外，可以通過調節(jié)所用衍生化試劑的性質來調整熒光產(chǎn)物的性質。例如，可以使 用1，2- 二甲氧基-4，5- 二氨基苯或1，2-亞甲二氧基-4，5- 二氨基苯來增加該方法的靈敏度。本領域的技術人員可以使用常規(guī)技術和知識來改變本發(fā)明的任何篩選或測試方 法的確切形式。技術人員明確知道需要額外采用適當?shù)膶φ諏嶒?。通過以0PD或其它芳 香二胺將2-0G衍生化來測定活性，所述其它芳香二胺例如有1，2- 二甲氧基-4，5- 二氨基 苯或1，2-亞甲二氧基-4，5- 二氨基苯，從而使衍生物得到與使用0PD相比改善的靈敏度 (Miihling ^ Journal of Chromatography B (2003) 383-392, Nakamura ^ Chem. PharmBull. (1987)687-692)。可以在適合底物被氧化酶羥基化/氧化的條件下進行測試。因此，測試中存在 2-0G。測試混合物還可以含有鐵，優(yōu)選亞鐵?？梢韵驕y試混合物中添加其它成分。例如，可以向測試中加入還原劑如抗壞血酸 鹽、硫醇如二硫蘇糖醇(DDT)、巰基乙醇、N-乙酰半胱氨酸或酚以幫助保持酶結構和/ 或可以加入過氧化氫酶來破壞可能產(chǎn)生的任何H202。不過，在不存在還原劑或過氧化氫酶時測試也可進行。測試通常在約25°C 約40。C的溫度，例如約30。C 約39。C或約35°C 約38。C或 約37°C的溫度進行。測試混合物的pH通常為約pH 7 約pH 9，例如約pH 7. 5 約pH 8。 可使用諸如Tris或HEPES等合適的緩沖劑來保持測試混合物的pH。通常，測試在正常含氧量條件下進行。也可以在羥基化或氧化減少或者不存在羥 基化或氧化的條件(例如在缺氧條件下)下進行測試，從而檢測可增強羥基化/氧化的試 劑對加氧酶活性的調節(jié)。作為選擇，可以根據(jù)從衍生自多肽或核酸底物的底物或底物片段(包括合成的及 重組的肽或核酸)向可檢測產(chǎn)物的轉變來確定終點。可以修飾底物以便于使測試能夠快速 進行并適合于高通量篩選。例如，可以利用在本文中作為示例的反相HPLC(C_4十八烷基硅烷柱)將起 始合成肽底物與產(chǎn)物分離。對這一測試或加氧酶活性的替代性測試的改變可以利用 例如本領域中公知的質譜、光譜和/或熒光技術(Masimirembwa C.等Combinatorial Chemistry & High ThroughputScreening (2001)4 (3)245-263, Owicki J. (2000) J.Biomol. Screen. 5 (5) 297-305, Gershkovich A 等(1996)J.Biochem.& Biophys. Meths. 33 (3) 135-162, Kraaft G.等(1994)Meths. Enzymol. 24170-86)。熒光技術可以利用 按所述方式改性的底物的形式從而進行或者優(yōu)化光譜或熒光測試。可以采用本領域技術人員任何可用的技術來評定可對羥基化和非羥基化或去甲 基化形式的多肽或其它底物進行區(qū)分的分子的結合，這可能涉及確定適合標記的存在。本發(fā)明的測試方法還可以采取體內測試或對來自諸如哺乳動物(包括人)或昆蟲 等動物的離體細胞進行的測試等形式。測試可以在細胞系如酵母或細菌菌株或者昆蟲或哺 乳動物細胞系中進行，在所述細胞系中由引入細胞中的一種或多種載體表達相關的多肽或 肽。作為選擇，可以對表達內源性FT0或其中FT0過表達的哺乳動物細胞進行測試。本發(fā)明的基于細胞的測試中所用的FT0多肽優(yōu)選包含核定位信號。測試化合物可利用本文所述的測試方法來篩選的試劑可以是藥物篩選程序中所用的天然或 合成化合物。也可以使用包含數(shù)種已表征或未表征成分的植物、微生物或其它生物的提取 物。組合文庫技術(包括固相合成和平行合成方法學)能夠提供測試潛在大量的不 同物質調節(jié)相互作用的能力的有效方式。對所有形式的天然產(chǎn)物、小分子和肽(但不限于 此)，所述文庫及其應用是本領域中已知的。在某些情況下優(yōu)選應用肽文庫?；衔锏母鞣N 商業(yè)文庫也可獲得。存在著能夠確定用于抑制的先導結構的篩選這些文庫的計算方法(有 時稱為虛擬篩選的過程)。潛在的抑制劑化合物(即拮抗劑)可以是多肽或小分子如包括組合文庫在內的可 商購文庫的分子等?？墒褂玫男》肿踊衔锇?-0G類似物或可抑制酶的作用的底物類 似物?？墒褂玫男》肿踊衔锛捌渌愋偷幕衔锇ㄋ幸阎?-0G加氧酶抑制劑，例 如已知可抑制HIF羥化酶(例如見W002/074981和W003/080566)和前膠原脯氨酰羥化酶 的那些抑制劑。可以從種類廣泛的可商購來源尤其是小化合物文庫來篩選潛在的促進劑。用于篩選的候選化合物中可包括含氧化合物，例如2-0G類似物。現(xiàn)有可用于治療肥胖癥(Cooke 和Bloom，Nature Reviews DrugDiscovery 2006)和2型糖尿病的任何試劑都可影響FTO 的活性并可用作候選試劑。由于包括TCA循環(huán)中間體如富馬酸鹽在內的天然存在的化合物是2-0G加氧酶的 已知抑制劑，它們可能以生理學相關性方式抑制FT0，這包括在其中富馬酸鹽已知可作為瓦 博效應(Warburg effect)的結果而上調的一些癌癥?？梢允褂帽疚乃龅臏y試方法來鑒定和/或獲得增加、強化、刺激、破壞、降低、干 擾或者完全或部分消除底物的羥基化/氧化并可能由此調節(jié)活性的測試化合物。可以在陽性測試試劑不存在時羥基化/氧化受限制或阻止的條件下來鑒定和/或 獲得增加或強化羥基化/氧化例如脯氨?；蛱於滨Ａu基化的試劑(即激動劑)。這種試 劑可用于強化、增加、增強或刺激FT0的加氧酶活性。在各種方案中，本發(fā)明提供了由本發(fā)明的篩選方法鑒定為FT0加氧酶活性調節(jié)劑 的試劑或化合物，例如可抑制或降低、增加或強化FT0活性的物質。測試試劑可以在FT0活性位點與2-0G或FT0底物競爭和/或在FT0活性位點結 合金屬。測試試劑可以包含金屬離子，例如但不限于錳、鈷、鋅或鎳離子。作為選擇，抑制的 方式可以是通過變構相互作用。測試試劑可以是還原劑。還原劑通常發(fā)揮2-0G加氧酶活性(通常為體外)的激 活劑作用。加氧酶活性的激活劑可以是在體外或體內增加FT0多肽的加氧酶活性的任何物 種?？捎玫倪€原劑包括抗壞血酸鹽和抗壞血酸鹽的類似物以及硫醇化學族的還原劑，如二 硫蘇糖醇或者膦(例如三羧乙基膦)。鑒定了調節(jié)劑之后，可以將該物質純化和/或進一步研究(如改性)和/或制造。 可使用調節(jié)劑來獲得肽基或非肽基模擬物，例如可通過本領域技術人員已知的和本文所論 述的方法來獲得。如本文所描述，可以將調節(jié)劑改性從而例如增加選擇性。它可以在如下 文所述的治療情況中使用。對于治療，調節(jié)劑可單獨使用或與任何其它治療活性物質或治療組合使用。作為酸的化合物可以以鹽形式存在，例如鈉鹽?；衔镞€可以以衍生物形式存在， 例如二甲基酯、二乙基酯、單乙基酯或者二酰胺或單酰胺。在某些情況下，優(yōu)選這些衍生物， 例如在需要抑制生物細胞內的酶時?？烧{節(jié)2-0G加氧酶的化合物可被用作例如治療本文所述重量病癥的本發(fā)明的試 劑，或用作本發(fā)明的測試中的測試物質。測試化合物已知可以作為除FT0之外的2-0G加氧 酶的抑制劑。例如，測試試劑可以是前膠原脯氨酰羥化酶、缺氧誘導因子、脯氨酰和天冬氨 酰羥化酶、膠原脯氨酰羥化酶、赤霉素C-20氧化酶、核酸去甲基化酶如AlkB或人類AlkB同 源物、蛋白去甲基化酶如三、二、單甲基賴氨酸或精氨酸殘基去甲基化酶、參與代謝或調節(jié) 的其它人或動物20G加氧酶或者植物2-0G羥化酶的抑制劑。2-0G加氧酶的許多抑制劑是 已知的，尤其是人脯氨酰羥化酶。N-草酰甘氨酸及其衍生物是適合的實例。甘氨酸或丙氨 酸衍生物和2-氧化酸類似物也可以使用。調節(jié)2-0G加氧酶的化合物及這些化合物的家族是本領域中已知的，例如Aoyagi 等(2002)Hepatology Research 23(1) 1-6, Aoyagi 等(2003)Free Radical Biology and Medicine 35 :410Suppl.1，Philipp 等(2002)Circulation 106(19) :1344Suppl. S,
18Ivan 等(2002)PNAS USA 99(21) 13459-13464，Nwogu 等(2001)Circulation 104(18) 2216-2221，Myllyharju和Kivirikko(2001)Ann Med 33(1) :7_21，0hta等(1984)Chemical andPharm Bulletin 32(11) :4350_4359，F(xiàn)ranklin 等(2001)Biochem J. 353 :333_338， Franklin(1997) Int J. Biochem Cell Biol 29(1) :79_89，Dowell 等(1993)Eur J Med Chem 28(6) :513_516，Baader 等(1994)Biochem J. 300 :525_530，Baader 等(1994)Eur J Clin Chem and Clin Biol 32(7) :515_520，Bickel等(1998)H印atology 28(2) :404_411， Bickel 等(1991) J. H印atology 13 :S26_S34Suppl. 3，US 6，200，974，US 5，916，898，美國 專利申請 2003-0176317，2003-0153503 和 2004-0053977，W0 02/074981，W003/080566, W0 04/035812, Cunliffe 等(1992)J. Med. Chem. 35 :2652_2658，Higashide 等(1995) J. Antibiotics 38 :285_295，Cunliffe等(1986)Biochem. J. 239(2) :311_315，F(xiàn)ranklin等 (1989) Biochem. J.261 (1) : 127-130，F(xiàn)riedman等(2000)PNAS USA 97(9) :4736_4741，Wu等 (1999)J. Am. Chem. Soc. 121 (3) :587_588，DE-A-3818850, Wang 等(2001)BiochemistryUS 15676-15683 和 Lerner 等(2001)Angew Chem. Int. Edit 40 =4040-4041 W003/080566和W002/074981中公開了適合的測試化合物。其它適合的化合 物包括纖維蛋白原HIF羥化酶的抑制劑。纖維蛋白原HIF羥化酶抑制劑公開于美國專 利申請公報第 20070042937 號、第 20060276477 號、第 20060270699 號、第 20060258702 號、第 20060258660 號、第 20060251638 號、第 20060183695 號、第 20060178317 號和第 20060178316 號。其它適合的測試化合物包括式(I)的化合物 其中-Y2選自-0R'和-NR' R"，其中R'是氫或未經(jīng)取代的烷基并且R"是氫、羥 基或未經(jīng)取代的Ci_4烷基；-Y1 選自-C-、_S-和-S(0)_ ；-Z2選自-C(0)-和-NR" _，其中R"選自氫、羥基或未經(jīng)取代的烷基；-Z1選自氫和未經(jīng)取代的(V4烷基；和-R是天然存在的氨基酸的側鏈。優(yōu)選Y1是-C-并且Y2是-0H或_NH2。最優(yōu)選Y1是_C_并且Y2是-0H。優(yōu)選Z2是-C(0)_或-NR 〃 _，其中R 〃是氫、甲基或乙基。更優(yōu)選Z2 是-c(0)-或-NH-。Z1優(yōu)選是氫、甲基或乙基，更優(yōu)選是氫。最優(yōu)選Z2是-C(o)-并且Z1是 氫、甲基或乙基。優(yōu)選R是丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸或苯丙氨酸的側鏈。優(yōu)選R是纈氨酸、亮氨酸或 苯丙氨酸的側鏈。更優(yōu)選R是苯丙氨酸的側鏈，即_CH2Ph。可以使用這些化合物的L-立體異構體或D-立體異構體。用于獲得式(I)的測試化合物的示例性合成流程圖如下面的流程圖1所示。這里 氨基酸與草酰氯反應從而產(chǎn)生式(I)的化合物。該流程圖中所用的氨基酸是苯丙氨酸，不過顯而易見的是用其它氨基酸可發(fā)生相同的通用性反應。第一個反應生成了本發(fā)明的受保 護化合物(二甲基酯形式)。通過與氫氧化鈉水溶液的反應容易生成二酸形式。流程圖1 其中X是-0-或-S-或者Z不是-C0-C0-0H的化合物可以如Mole等(2003) Bioorg. Med. Chem. Lett. 13，2677-2680 和 Cunliffe 等 J. Med. Chem. (1992) 35 2652-2658 所述來合 成?？死撞妓寡h(huán)中間體如琥珀酸鹽和富馬酸鹽可發(fā)揮FT0去甲基化酶活性抑制劑 的作用。因此琥珀酸鹽和富馬酸鹽的類似物可用于抑制FT0活性。治療性應用所發(fā)現(xiàn)具有影響FT0的加氧酶活性的能力的化合物、物質或試劑在所論述的多種 情況中具有治療和其它潛力。尤其是FT0活性的調節(jié)劑可用于治療或預防與重量增加或重 量減輕相關的疾病。所述調節(jié)劑可預防或逆轉超重患者的重量增加。所述調節(jié)劑可以預防 重量減輕或促進過輕患者的重量增加。所述調節(jié)劑還可以施用于重量在正常健康范圍內的 個體(通常體重指數(shù)為約19 約25)從而預防重量增加，例如在這些個體帶有FT0基因的 等位基因變體且所述等位基因變體與肥胖癥相關的情況中，在此實施方式中，使用調節(jié)劑 預防重量增加和相關的疾病或病癥。可通過施用FT0活性調節(jié)劑來治療或預防的與重量增加相關的疾病和病癥包 括肥胖癥(體重指數(shù)超過30)、癌癥(尤其是結腸癌、前列腺癌、直腸癌、乳癌和子宮內膜 癌)、心血管疾病(包括心臟病和充血性心衰)、高血壓、高膽固醇水平、胰島素抵抗、II 型糖尿病、膽結石、睡眠窒息、骨關節(jié)炎、痛風、血脂異常、匹克威克綜合征(Pickwickian syndrome)禾口不育?？赏ㄟ^施用FT0活性調節(jié)劑來治療或預防的與重量減輕相關的病癥包括神經(jīng)性 厭食癥、貪食癥(bullemia)、營養(yǎng)不良、骨質疏松、不育、免疫功能受損、AIDS或抗癌治療患 者的重量減輕。FT0活性的調節(jié)劑還可以用于治療或預防癌癥。這是因為FT0的修復DNA的能力。對于治療，可以將FT0調節(jié)劑與例如用以治療重量控制、糖尿病和心血管疾病的 任何其它活性物質組合使用。對于使用一種或多種經(jīng)初級篩選(例如在無細胞體系中)鑒定為具有調節(jié)加氧酶 活性能力的試劑，可以使用一種或多種二次篩選來進一步評估。通常將作為本發(fā)明的調節(jié)劑的試劑、化合物或物質以分離的和/或純化(即基本
純)的形式來提供。這可以包括處于其中它代表至少約90%活性成分、更優(yōu)選至少約95%、
更優(yōu)選至少約98%組合物中。不過，任何這種組合物可以包含惰性載體材料或其它藥學和
生理學可接受的賦形劑，例如正確遞送、釋放和/或穩(wěn)定活性試劑所需的那些載體和賦形
劑。如下所述，除了所公開的調節(jié)劑化合物之外，本發(fā)明的組合物可以包含一種或多種有治
療用途的分子，所述治療用途例如有重量控制、糖尿病和心血管疾病的治療。
本發(fā)明的測試獲得的產(chǎn)物本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的測試方法獲得的化合物和包含所述化合物的組合 物，例如其中所述化合物與藥學可接受載體或稀釋劑混合的藥物組合物。例如“Harrison's Principles of Internal Medicine”中給出了適合的載體或稀釋劑的實例。載體可以是液 體，例如鹽水、乙醇、甘油和它們的混合物，也可以是固體，例如片劑形式，還可以是半固體 形式，例如配制為長效制劑的凝膠，也可以配置在透皮施用載質中，例如透皮藥貼。本發(fā)明還提供了治療方法，所述方法包括對患者施用可干擾FT0加氧酶活性的藥 劑。這種藥劑可以包括FT0加氧酶活性的抑制劑或激活劑。治療/預防目的可以涉及治療與FT0水平或活性降低或不理想或增加相關的病 況，或FT0水平正常但希望調節(jié)活性例如增加或降低FT0加氧酶活性的病況。例如，在治療 與非理想的重量減輕或增加相關的病癥中可以調節(jié)FT0活性。對有需要的受試者通常施用治療有效量的藥劑。治療有效量是改善病況的癥狀或 減輕病況給受試者帶來的痛苦的量。用以治療或預防重量增加或諸如肥胖癥等與重量增 加相關病癥的治療有效量通常是減少重量增加的量，例如保持患者重量或引起重量減輕的 量。作為選擇，治療有效量可以是引起重量減輕的量。用以治療或預防重量減輕或諸如厭 食癥等與重量減輕相關的病癥的治療有效量通常是減少重量減輕的量，例如保持患者的重 量或引起重量增加的量。藥物組合物在各種進一步的方案中，本發(fā)明因而提供了藥物組合物、藥物、藥品或用于所述 目的的其它組合物，所述組合物包含如本文所述的一種或多種試劑、化合物或物質(包括 2-0G依賴的加氧酶活性的抑制劑或激活劑)；所述組合物在醫(yī)學治療方法中的應用，所述 醫(yī)學治療方法是包括對患者施用所述組合物從而例如治療(可包括預防性治療)上述醫(yī)學 病況的方法；在制造出于任何所述目的而施用的組合物、藥物或藥品中所述試劑化合物或 物質的應用，所述目的例如為治療本文所述的病況；以及藥物組合物的制造方法，所述方法 包括將所述試劑、化合物或物質與藥學可接受賦形劑、載質或載體以及可選的其它成分混
口 o在一個實施方式中，提供藥物組合物的方法通?？梢园?a)通過本發(fā)明的測試方法鑒定出試劑；和(b)將由此鑒定的試劑與藥學可接受賦形劑配制。本發(fā)明的藥物組合物可以包含本發(fā)明的試劑、多肽、多核苷酸、載體或抗體以及藥 學可接受賦形劑。本發(fā)明的醫(yī)學治療方法中所用的試劑無論怎樣，均優(yōu)選以“預防有效量”或“治療 有效量”施用(視情況而定，不過預防也可被看做治療)，這足以顯示出對個體的益處。所 施用的實際量和施用的速率和時程將取決于待治療疾病的性質和嚴重性。治療的處方如劑 量的確定等屬于全科醫(yī)師和其它醫(yī)學醫(yī)生的職責。根據(jù)待治療的病況(例如上述病況)，試劑或組合物可以單獨施用，也可以與其它 治療同時地或依次地組合施用。除了活性成分之外，用于本發(fā)明的應用的本發(fā)明的藥物組合物可以包括藥學可接 受賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或其它本領域技術人員熟知的材料。尤其是它們可以包括藥學可接受賦形劑。所述材料應該無毒并且不會干擾活性成分的功效。載體或其它材料的 準確性質將取決于施用途徑，施用途徑可以為口服或注射，例如皮膚、皮下或靜脈內注射。用于口服施用的藥物組合物可以為片劑、膠囊劑、散劑或液體形式。片劑可以包括 固體載體如明膠或佐劑。液體藥物組合物通常包括液體載體如水、石油、動物油或植物油、 礦物油或合成油?？梢园睇}水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或者二醇類如乙二醇、丙二 醇或聚乙二醇。對于靜脈內、皮膚或皮下注射或在受累位點的注射，活性成分應該處于無熱源且 有適合PH、等滲性和穩(wěn)定性的胃腸外可接受水溶液的形式。利用例如等滲載質如Sodium Chloride Injection、Ringer‘ s Injection、LactatedRinger' s Injection，本令頁域技術 人員能夠很好地制備適合的溶液。如果需要，可以包含防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和 /或其它添加劑。在載體配制中可以使用脂質體，尤其是陽離子脂質體。上述技術和方案的實例可 見于 Remington’ s Pharmaceutical Sciences，第 16 片反，Osol，A.(編)，1980。可以將所述物質或組合物以局部方式施用于特定位點，也可以利用例如基于動脈 內支架的遞送將所述物質或組合物以其中它靶向特定細胞或組織的方式遞送。通過使用靶向系統(tǒng)如抗體或細胞特異性配體，可利用靶向性治療將活性物質更加 特異性地遞送至某些類型的細胞。需要靶向的原因可能有多種，例如試劑具有不可接受的 毒性，或者否則就需要過高劑量，或者否則其就不能進入靶標細胞。在另一實施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的試劑在用于治療與FT0加氧酶水平或 活性的增加或降低相關的病況的藥物的制造中的應用。所述病況可以包括例如與重量減輕 或增加相關的疾病。本文中所引用的所有文件以參考方式并入本文。下面的實施例將闡述本發(fā)明。實施例實施例1 選擇作為2-0G加氧酶用以分析的FT0利用二級結構預測(JPRED)和序列保守性的組合生成了 Fatso與ABH3的序列 比對，從而以M0DELLER8V2建立了基于已報導的ABH3晶體結構(Sundheim等(2006)EMB0 J. 25(14)3389-3397)的FT0的同源模型。然后將FT0模型與來自大腸桿菌的ABH3和AlkB DNA去甲基化酶(Yu等(2006)Nature，439，879-884)疊加以進行比較。序列比對、二級結構 預測和結構模型清楚地顯示出這三種蛋白之間的強相似性。FT0中清晰地存在DSBH構架并 且單個活性位點Fe (II)和20G結合殘基嚴格保守(例如，His231 FT0，Hisl91 ABH3，Hisl31 AlkB ；Asp233 FT0, Aspl93 ABH3, Aspl33AlkB ；His307FT0, His257ABH3, Hisl87AlkB ； Arg316FT0，Arg269ABH3，Arg204AlkB)。此外，存在著參與催化機制的殘基(即Arg322FT0， Arg275ABH3 和 Arg210AlkB ；Leu213FT0 和輕基化 Leu 177ABH3)以及經(jīng)預測參與 DNA 堿基 識別的芳香殘基(Tyrl08FT0和Tyrl43ABH3)。于是FT0序列經(jīng)檢測為AlkB同源物(ABH)和其它已知2_氧化戊二酸依賴的加氧 酶(其中一些催化甲基化核酸序列的去甲基化)的同源物，并發(fā)現(xiàn)FT0序列含有雙鏈3螺 旋(DSBH)基序和至少一個C末端螺旋域。DSBH基序是2-0G依賴的加氧酶的特征，但許多不是2_0G依賴的加氧酶的蛋白也含有DSBH基序。這些蛋白包括但不限于JmjC家族，其中一些但不是所有是2-0G依賴 的加氧酶(Clissold & Ponting(2001) Trends Biochem. Sci. 26 :7_9)。DSBH 基序也是功 能多樣的cupin超家族的特征(Dunwell等(2004)Phytochemistry 65:7-17)。人類蛋白 pirin(Pang 等(2004) J. Biol. Chem. 279 1491-1498)也含有 DSBH 基序，但不是 2-0G 依賴 的加氧酶。一種含有DSBH基序的2-0G依賴的加氧酶是FIH。此前將FT0的等位基因變體 與重量增加相關聯(lián)，但FT0此前并未被鑒定為2-0G依賴的加氧酶，也未鑒定其含有DSBH結 構基序。還不知道FT0的C末端螺旋域與20G加氧酶有關。序列分析還證明FT0展示了用于結合Fe(II)的保守2-His_l-羧酸酯面三聯(lián)體 (facial triad)和堿性殘基(此處為精氨酸)等2_0G鐵-依賴的加氧酶的特征，以及可將 其歸類為以AlkB為代表的2-0G加氧酶亞家族的其它特征。實施例2:FT0的克隆利用帶有限制位點突出端的商業(yè)合成的寡核苷酸引物(Sigma-Genosys) mftolf (序列5，-GCTAGCATGAAGCGCGTCCAGACC-3，)和 mftolr (序列5，-GAATTCCTAGGATC TTGCTTCCAGCAG-3，)在下述 PCR 反應中從 Image clone IMGCL04237261 擴增了編碼全長小 鼠fto的cDNA序列，條件模板 DNAmftolf (10 UM)mftolr (10 uM)MgCl2 (50mM)dNTP，s (各 lOmM)10 X聚合酶緩沖液PfuTurbo DNA 聚合酶H20 加至總體積為溫度循環(huán)儀設定95 V 2 分鐘
95 °C 1 分
50°C 1 1jY
72°C 2.5 72 °C 10 分鐘以QIAquick PCR純化試劑盒(QIAGEN)對完成的PCR反應進行凈化，并以TAE緩 沖液使樣品在瓊脂糖凝膠上泳動。將PCR產(chǎn)物以Nhel和EcoRI (均為New England Biolabs)于37°C在過夜反應中消化DNAlugNhel (10000 單位 /ml) 2 u 1EcoRI (20000 單位 /ml) 2 u 1IOXEcoRI 緩沖液5 ill
23
150ng 1 u 1 1 u 1 1 u 1 1 u 1 5u 1 1 u 1 50 u 1
(New England Biolabs)
(聚合酶緩沖液獲自Stratagene)
1'、
/
>
25個循環(huán)
分鐘
100XBSA0.5 illH20加至總體積為50 ill隨后將反應混合物在TAE緩沖液中在1 %瓊脂糖凝膠上泳動，切下對應于經(jīng)消化 的PCR產(chǎn)物的條帶，以QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN)從凝膠中提取DNA。使用T4DNA連接酶(New England Biolabs)在冰上過夜將所提取的DNA連接到相 似限制性切割的純化pET_28a載體(Novagen)中載體50ngPCR 產(chǎn)物42ng10XT4 緩沖液2 illT4DNA 連接酶(400000 單位 /ml) 0. 5 u 1H20加至總體積為20 ill根據(jù)制造商的說明將4 ill的這種反應混合物轉化到50iU E. coliXLlOGold cells (Stratagene)中。使細胞在含有25 y g/ml卡那霉素的LB平板上于37°C生長過夜。在其后一天，從平板挑取8個菌落，每個都重懸在含25 iig/ml卡那霉素的5ml 2YT 培養(yǎng)基中并在環(huán)境振蕩器中37°C溫育過夜。在其后一天，使用QIApr印Spin少量制備試劑盒(QIAGEN)從這些液體培養(yǎng)物中 分離質粒，并以EcoRI和Nhel在37°C對樣品進行檢驗性限制性消化3小時少量制備的DNA3 illNhel (10000 單位 /ml)1 u 1EcoRI (20000 單位 /ml)1 u 1lOx EcoRI 緩沖液2 u 1lOOx BSA0. 2 u 1H20加至總體積為20 ill以瓊脂糖凝膠分析樣品，發(fā)現(xiàn)樣品含有mfto插入。對一個樣品進行外部測序 (Geneservice)，表明其含有所需的插入。該質粒被稱為mfto-pET_28a。實施例3 :FT0的表達與純化按照制造商的說明將Mfto-pET_28a 轉化入 E. coli BL21_Gold(DE3) (Stratagene)中，并使其如上在含有卡那霉素的LB平板上生長。表達試驗表明在37°C、 28°C和21°C有中等的可溶性表達，且隨著溫度的降低不溶性材料的量減少。對于表達，從轉化平板上挑取單個菌落，重懸于100ml 2YT+卡那霉素培養(yǎng)基中并 在環(huán)境振蕩器中于37°C培養(yǎng)過夜。在其后一天，將12個600ml 2YT+卡那霉素每一個以6ml 過夜培養(yǎng)物接種，并在環(huán)境振蕩器中于37°C生長，直至培養(yǎng)物達到0D_為1.0。在此階段， 將培養(yǎng)物移至21°C 1小時，之后在每個中加入IPTG至終濃度為0. 25mM。繼續(xù)在21°C溫育 9小時，之后離心收集細胞(共60g)并儲存于-80°C。將細胞沉淀按每克細胞重懸浮于5ml含1刮勺頭DNAsel的lOmMHEPES pH 7. 5， 0. 5M NaCl，10mM咪唑，ImM MgCl2中。加入30mg苯甲基磺酰氟(PMSF，蛋白酶抑制劑)，在冰 上超聲裂解細胞。離心去除碎片(Beckman Avanti J-25離心機，JA25. 50轉子，22000rpm， 20分鐘，4°C )，之后慢慢傾出上清液，通過0.45um Omni pore過濾器(Millipore)過濾， 開以 0. 5ml/ 分鐘的流速載于 10ml His-Bind*柱(Novagen)。用 250ml 的 10mM HEPES pH7. 5,0. 5M NaCl,40mM咪唑以2ml/分鐘洗滌所述柱，之后用100ml的25mM HEPES pH 7. 5， 0. 5M NaCl,40mM咪唑，5mM ATP 二鉀鹽以2. 5ml/分鐘洗滌這一步驟將去除與His標簽和 Fto蛋白之間肽連接物結合的E. coli分子伴侶。以100ml初始洗滌緩沖液再次洗滌之后， 使用35ml 10mM HEPES pH 7. 5,0. 5M NaCl，500mM咪唑以2. 5ml/分鐘通過等度洗脫將結合 的蛋白洗脫。使用Amicon-15 5000分子量截留超濾裝置將含有FT0的流分(經(jīng)SDS PAGE分析 純度> 90% )濃縮至3ml終體積，并裝載到以lOmMHEPES pH 7. 5,0. 05M NaCl, ImM DTT平 衡的300ml Superdex S200凝膠過濾柱上。以3ml/分鐘進行凝膠過濾步驟，從70ml洗脫 體積處開始收集10ml的流分。實施例4 以純化FT0進行2_氧化戊二酸脫羧測試利用2-0G 轉化測試(Kivirikko 和MyllylS (1982)Methods inEnzymology 82: 4412-4421)來測試FT0的酶學活性。在不含特定試劑(Fe2+、抗壞血酸鹽或DTT)的各種緩 沖液中，在濃度為0.5mM的常用Fe2+-20G-雙加氧酶抑制劑N-草酰-甘氨酸(N0G)的存在 下，將FT0與所有必需的輔因子溫育。除了 Fe2+ (以(NH4) 2Fe (II) (S04) 2形式加入)和20G之 外，向反應混合物中加入二硫蘇糖醇(DTT)和抗壞血酸鈉DTT是幫助保持Fe2+的還原劑。測試成分11. 5uM FT0144 uM 20G16 u M14C-20G 80 uM(NH4) 2Fe (II) (S04) 2ImM DTT4mM抗壞血酸鹽將這些以50mM TRIS，pH 7. 5稀釋至100 yl的總體積。將所有試劑混合并移 液至5ml塑料螺旋蓋管中，向管中逐滴加入FT0。向各個管中加入含200 ill氫氧化海 胺(Fisher Scientific，C02捕提劑)的500 ill Eppendorf管，并以橡膠隔膜將管封 閉。在環(huán)境振蕩器中于37°C溫育半小時，之后向內容物中加入200 yl甲醇并將管置于冰 上30分鐘以結束反應。將含有氫氧化海胺的Eppendorf管轉移至閃爍計數(shù)瓶中，與5ml OptiPhase Li qui dScint illation Cocktail (Fisher Scientific)混合并使用 Beckman LS6500Multi-Purpose Scintillation Counter 對總 14C 計數(shù)進行定量。第一項測試的結果如下表1 (完全計數(shù)_總起始2-0G計數(shù))和圖所示4。結果顯 示FT0的2-0G轉化活性受輔因子Fe (II)刺激，并被N-草酰甘氨酸抑制，N-草酰甘氨酸是 許多2-0G加氧酶的抑制劑。加入抗壞血酸鹽也可以刺激活性，這與其它2-0G加氧酶相同， 抗壞血酸鹽可能作為天然底物的替代物而發(fā)揮作用。以FT0進行的20G非偶聯(lián)轉化測試監(jiān)測[1-14C]-20G轉化為[14C]-二氧化碳，該 測試表明FT0催化20G脫羧，該反應可被抗壞血酸鹽和FeS04刺激(圖8a)。已知的20G加 氧酶抑制劑(圖8b)和Fe(II)與抗壞血酸鹽的缺少抑制了 20G轉化。表1 :2_氧化戊二酸脫羧測試結果 實施例5 應用2-0G加氧酶測試檢測FT0抑制劑利用實施例4中描述的方法，篩選各種2-0G加氧酶抑制劑抑制活性FT0加氧酶活 性的能力。所測試的抑制劑有 NOG = N-草酰甘氨酸N0FD = N-草酰D-苯丙氨酸P-2-4-CD-吡啶 _2，4_ 二羧酸鹽P-2-4-CD-吡啶 _2，5_ 二羧酸鹽化合物41和化合物16的結構如下所示。 實施例6 去甲基化測試利用實施例2所述方法，但只使用未標記的20G，篩選出可被FT0去甲基化的各種 潛在底物。結果如圖5和圖6所示。該結果表明，在所用測試條件下，F(xiàn)T0在對3-甲基胸 腺嘧啶和3-甲基胞嘧啶殘基去甲基化的催化中偏好3甲基胸腺嘧啶殘基。對潛在FT0底物進行了篩選，其中包括合成單鏈1-甲基腺嘌呤(1-meA)甲基化寡 核苷酸、Lys-9甲基化組蛋白H3、缺氧誘導因子-la (HIF-1 a )亞基片段、Ik Ba和輔酶A 衍生物。只有1-meA甲基化寡核苷酸顯著刺激20G的轉化(圖6a)。這一活性被N-草酰甘 氨酸、富馬酸鹽和琥珀酸鹽抑制，它們也是20G非偶聯(lián)轉化測試的抑制劑(圖6c)。利用直接監(jiān)測DNA去甲基化的LC-MS測試(不需要放射性標記的(輔)底物或偶 聯(lián)測試)，我們證明FT0可催化依賴Fe (II)和20G的DNA去甲基化。這一活性可被抗壞血 酸鹽刺激，這與對其它20G加氧酶的觀察相同(圖6b)。當反應在氧減少的條件下進行時， 觀察到顯著減少的轉化。通過1H NMR(400MHz)分析證實了琥珀酸鹽的生成，通過以五氟苯胼的衍生化確認了甲醛的生成。為了檢驗已歸屬的Fe(II)結合和20G 5_羧酸酯結合殘基的所推測的作用，構建 了 His-304和Arg-313丙氨酸取代突變體。His-304突變體顯示了顯著減少的20G轉化，而 Arg-313突變體消除了活性(圖6b)。利用下述在單一位置甲基化的單鏈寡核苷酸(ss-DNA)進一步研究了 FT0活性 1-甲基腺嘌呤(l-meA)、l-甲基鳥嘌呤(l-meG)、3-甲基胞嘧啶(3_meC)和3-甲基胸腺嘧 啶(3-meT)(圖7b)。當pH 7. 5時，在測試條件下顯示出，相比于ss_DNA中1-meA或3_meC， FT0優(yōu)選3-meT ； 1-meG不是FT0的底物(圖7a)。與此前報導一致，我們利用ss_DNA底物 發(fā)現(xiàn)重組形式的ABH2和ABH3顯示出對3_meC和1-meA及3_meT的偏好，而在我們的條件 下觀察到只有極低水平的3-meT去甲基化。在測定甲醛從甲基化多聚(dA)和多聚(dT)釋 放的測試中，也觀察到FT0對3-meT底物的偏好(圖7c)。實施例7 :FT0的定位由于FT0催化DNA去甲基化，因此推測其應定位到核。確實，共聚焦成像表明黃色 熒光蛋白標記的FTO(YFP-FTO)在核中濃縮，而YFP自身僅存在于細胞質中。有趣的是，F(xiàn)T0 向核中的定位甚至比ABH3更有效。20G加氧酶催化的翻譯后羥基化是缺氧反應中轉錄調控的核心，并且20G加氧酶 可催化組蛋白去甲基化。FT0的催化活性通過核酸去甲基化可以相似地調控參與代謝的基 因的轉錄?；蛘?，可能FT0與對ABH2提出的一樣，能夠行使核酸修復酶的作用有證據(jù)表明 基因組修復過程的破壞將導致肥胖癥和代謝綜合征。在以上所用的測試條件下，在生理PH 下，所鑒定的FT0的優(yōu)選底物為DNA中的3-甲基胸腺嘧啶，這是在DNA接觸甲基化試劑時 生成的微小但穩(wěn)定的損傷。
權利要求
一種測試FTO活性的方法，所述方法包括監(jiān)測FTO多肽的加氧酶活性。
2.如權利要求1所述的方法，其中將氧用作輔底物。
3.如權利要求1或2所述的方法，其中將鐵用作輔因子。
4.如權利要求1 3中任一項所述的方法，其中將2-氧化酸用作輔底物。
5.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中將2-氧化戊二酸用作輔底物。
6.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中在還原劑的存在下監(jiān)測加氧酶活性。
7.如權利要求6所述的方法，其中所述還原劑是抗壞血酸鹽或其類似物、硫醇或膦。
8.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中在底物的存在下測定加氧酶活性。
9.如權利要求8所述的方法，其中所述底物是肽或核酸底物。
10.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述FT0多肽是重組多肽。
11.如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述FT0多肽包含(a)SEQ ID NO 1的氨基酸序列；或(b)與SEQID NO 1的氨基酸序列在其全長有至少40%同一性的氨基酸序列。
12.如權利要求11所述的方法，其中所述與SEQID NO :1的氨基酸序列在其全長有至 少40%同一性的氨基酸序列是人類FT0的天然存在的變體或來自除人之外其它物種的FT0 的同源物。
13.如權利要求11或12所述的方法，其中所述與SEQID NO :1的氨基酸序列在其全 長有至少40%同一性的氨基酸是SEQ ID N0:2至SEQID NO :11中任一項所示的氨基酸序 列。
14.前述權利要求中任一項所述的方法，所述方法還包括(i)使FT0多肽與測試試劑接觸；(ii)在測試試劑的存在下監(jiān)測加氧酶活性；和(iii)確定所述測試試劑是否是FT0活性的抑制劑或激活劑。
15.如權利要求14所述的方法，其中所述測試試劑是除FT0之外的2-0G加氧酶的已報 導的抑制劑，或所述抑制劑的類似物或變體。
16.如權利要求15所述的方法，其中所述2-0G加氧酶是前膠原脯氨酰或賴氨酰羥化 酶、缺氧誘導因子脯氨酰羥化酶、包括組蛋白去甲基化酶在內的甲基化賴氨酰去甲基化酶、 天冬氨酰羥化酶、磷脂酰絲氨酸受體(Jmjd6)、AlkB或人類AlkB同源物和/或赤霉素C-20 氧化酶。
17.如權利要求15或16所述的方法，其中所述抑制劑是N-草酰氨基酸如N-草酰甘氨 酸或其衍生物、甘氨酸或丙氨酸衍生物、2-氧化酸類似物、類黃酮或類黃酮衍生物如染料木黃酮。
18.如權利要求14 17中任一項所述的方法，其中所述測試試劑在FT0活性位點與 2-0G或FT0底物競爭，和/或在FT0活性位點結合金屬。
19.如權利要求14 18中任一項所述的方法，其中所述測試試劑包含金屬離子。
20.如權利要求14所述的方法，其中所述測試試劑是還原劑。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述還原劑是除FT0之外的2-0G加氧酶的已報導 的激活劑。
22.如權利要求20或21所述的方法，其中所述還原劑是抗壞血酸鹽或抗壞血酸鹽的類似物或者硫醇類還原劑，例如二硫蘇糖醇或膦化學族的成員。
23.如權利要求14 22中任一項所述的方法，所述方法還包括使用除FT0之外的酶 重復所述方法的步驟；和確定所述測試試劑是否選擇性抑制或激活FT0或其它酶。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述除FT0之外的酶是2-0G加氧酶。
25.如權利要求24所述的方法，其中所述2-0G加氧酶是缺氧誘導因子羥化酶，如脯氨 ?；蛱於滨Ａu化酶、膠原或前膠原脯氨酰羥化酶、核酸去甲基化酶如AlkB同源物、或者 蛋白去甲基化酶如三甲基、二甲基或單甲基賴氨酸或精氨酸殘基去甲基化酶。
26.如權利要求25所述的方法，其中所述蛋白去甲基化酶將甲基化組蛋白或其片段羥 基化。
27.如權利要求8 26中任一項所述的方法，其中所述底物是核酸、核酸衍生物或類似物。
28.如權利要求27所述的方法，其中所述底物是甲基化核酸、衍生物或類似物。
29.如權利要求28所述的方法，其中所述甲基化核酸序列與參與重量調節(jié)的基因相 關，例如野灰基因或神經(jīng)肽Y基因。
30.如權利要求1至13中任一項所述的方法，所述方法還包括(i)使FT0多肽與測試底物接觸；(ii)監(jiān)測加氧酶活性；和(iii)確定所述測試底物是否是FT0的底物。
31.如權利要求30所述的方法，其中所述測試底物是人類核酸序列。
32.如權利要求31所述的方法，其中所述核酸序列包含3-甲基胸腺嘧啶堿基、1-甲基 腺嘌呤堿基或3-甲基胞嘧啶堿基。
33.如權利要求32所述的方法，其中所述底物是甲基化蛋白或肽。
34.如權利要求30至33中任一項所述的方法，其中在鑒定所述底物之前使用FT0抑制 劑使得能夠通過穩(wěn)定FT0和所述底物之間的相互作用來鑒定FT0底物。
35.2-0G加氧酶活性抑制劑或激活劑的調節(jié)FT0活性的應用。
36.用以在治療或預防重量增加或重量減輕或者治療或預防與重量增加或重量減輕相 關病癥的方法中應用的FT0加氧酶活性的調節(jié)劑。
37.如權利要求36所述的調節(jié)劑，所述調節(jié)劑是如權利要求15 22中任一項所限定 的抑制劑或激活劑。
38.如權利要求36所述的調節(jié)劑，所述調節(jié)劑是可通過如權利要求23 26中任一項 所述的方法鑒定的FT0加氧酶活性的選擇性調節(jié)劑。
39.治療或預防有需要的個體的重量增加或重量減輕的方法，所述方法包括對所述個 體施用治療有效量的FT0加氧酶活性的抑制劑或激活劑。
40.治療或預防有需要的個體的與重量增加或重量減輕相關病癥的方法，所述方法包 括對所述個體施用治療有效量的FT0加氧酶活性的抑制劑或激活劑。
41.如權利要求40所述的方法或如權利要求36 38中任一項所述的調節(jié)劑，其中 所述與重量增加相關的病癥是肥胖癥、癌癥、心血管疾病、高血壓、高膽固醇水平、胰島素抵 抗、糖尿病、膽結石、睡眠窒息、骨關節(jié)炎、痛風、血脂異常、匹克威克綜合征和/或不育，或 者所述與重量減輕相關的病癥是神經(jīng)性厭食癥、貪食癥、營養(yǎng)不良、骨質疏松、不育和/或免疫功能受損。
42.如權利要求41所述的方法或調節(jié)劑，其中所述與重量增加相關的病癥是肥胖癥或 糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明提供了測試加氧酶活性的方法，所述方法包括監(jiān)測FTO的加氧酶活性。
文檔編號G01N33/50GK101855551SQ200880021055
公開日2010年10月6日 申請日期2008年6月20日 優(yōu)先權日2007年6月20日
發(fā)明者克里斯多佛·保羅·龐廷, 克里斯多佛·約瑟夫·斯高菲爾德, 弗朗西絲·瑪麗·阿什克羅夫特, 托馬斯·吉肯 申請人:Isis創(chuàng)新有限公司