專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑(盒)及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧
化酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
背景技術：
現有技術中，測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有熒光法、免疫抑制法和化 學分光光度法。熒光法是以e-苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化酶，其依據是e-苯乙胺 在10 100mg時反應速度最大，高于芐胺和5-羥色胺的反應速度。免疫學方法則利用單胺 氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應，測定反應后形成的單胺氧化酶同工酶，目前應用較多
的單克隆抗體有MA0-A3C9 、 MA0-A4F10 、 MA0-A7B10 、 MA0-A7氨甲酰磷酸合成酶0和MA0-B1C2等。 相對而言，化學分光光度法應有更為普遍?？梢杂脝伟费趸复呋奉愥尫?出的過氧化氫(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲?；?3，7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪 (MCDP)等發(fā)色劑進行測定，也可以應用芐胺(Benzylamine)、對苯甲胺-l3-偶氮萘酚、 丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine) 、 |3 -苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪 胺(tyr咖ine，又稱"3-對羥基苯乙胺，，，3-pa:rahdroxyphenylethyl咖ine) 、5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine)等作為反應底物來測定單胺氧化酶的活性。其中，應用苯甲胺類型 底物測得的單胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺作底物測 得的活性約為3-對羥基苯乙胺作底物的30%。目前，單胺氧化酶測定多用芐胺和對苯甲 胺-e-偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成芐醛，然后在 強堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應，生成醛苯腙，這在生化儀上測定較困難；對苯 甲胺-P _偶氮萘酚方法則需要用環(huán)乙烷提取，限制了該方法的實用性，且不能應用全自動 生化儀分析。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔 酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定單胺氧化酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還 將給出用以實現該方法的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑(盒)不僅可以在 紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行單胺氧化酶活性濃度測定，而且測定 速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測定方法如下 胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應醛類產物+氨+過氧化氫 氨+ 二氧化碳+2腺苷三磷酸+水氨甲酰磷酸合成酶 2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲酰磷酸
磷酸根+甘油醛_3-磷酸+輔酶甘油醛-3-磷酸脫氡酶 甘油酸-l，3-雙磷酸+還原型輔酶這種方法應用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase ;EC 1. 4. 3. 4 ;EC 1. 4. 3. 6)酶
(偶)聯氨甲酰磷酸合成酶(carbamyl phosphate synthetase ;EC 6. 3. 4. 16)、甘油
醛_3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ;EC 1.2.1.59)酶促反
應連續(xù)監(jiān)測法。單胺氧化酶酶解胺類化合物反應產生氨，再通過(偶)聯合氨甲酰磷酸合
成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原
型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，
通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算單胺氧化酶的活性濃度大小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷/測定試劑較為理想緩沖液100,1/L穩(wěn)定劑500,1/L輔酶3mmol/L氨甲酰磷酸合成酶6000U/L甘油醛_3-磷酸脫氫酶8000U/L胺類化合物4mmol/L碳酸氫鈉12mmol/L腺苷三磷酸6mmol/L甘油醛_3-磷酸7mmol/L本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以下物質之一 芐胺、對苯甲胺_ P _偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、P _苯乙基胺、酪胺、5_羥色胺
或者這七種物質的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。碳酸氫鈉(二氧化碳)可以
用其他碳酸氫鹽取代。本發(fā)明的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨甲酰磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、 胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛_3-磷酸。
試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油
醛-3-磷酸。 試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨甲酰磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。 輔酶、氨甲酰磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化 碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑l或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以 是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油
醛-3-磷酸。 試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、氨甲酰磷酸合成酶。 輔酶、氨甲酰磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化 碳)、腺苷三磷酸、甘油醛_3-磷酸在試劑1 、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑(盒) 可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定單胺氧化酶活性濃度的方法，其輔酶可以 是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。實施例一本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑500,1/L輔酶3mmol/L氨甲酰磷酸合成酶6000U/L甘油醛_3-磷酸脫氫酶8000U/L芐胺4mmol/L碳酸氫鈉12mmol/L腺苷三磷酸6mmol/L甘油醛_3-磷酸7mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. 1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反 應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值 4180。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實施例二 本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L










芐胺
腺苷三磷酸 甘油醛-3-試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
氨甲酰磷酸合成酶 甘油醛-3-
4mmol/L 12mmol/L 6mmol/L 7mmol/L
鹽酸緩沖液 100mmol/L 500,1/L 6000U/L 8000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測 試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為 2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右， 理論K值2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實施例三
本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 輔酶 芐胺

















腺苷三磷酸 甘油醛-3-試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
甘油醛_3-磷酸脫氫酶 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
氨甲酰磷酸合成酶
鹽酸緩沖液
100,1, 50mmol/L 3mmol/L 4mmol/L 12mmol/L 6mmol/L 7mmol/L
100,1, 500,1/L 8000U/L
鹽酸緩沖液
1
100,1/ 500,1/L 6000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定單胺氧化酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間 10分鐘，起始吸光度《0. l，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與 試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間 大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
申請人:經過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)0. 0001 ;吸光度時間反應曲線應呈直線 上升；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達500U/L ;試劑測試的不準確度，其相對偏差
不超過±5% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(CV)《3% ;試劑的靈敏度可達
0. 0002±0. 0001 AA/min/U/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏 度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權利要求
一種利用酶比色法及酶聯法技術的單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法如下胺類化合物+水+氧 單胺氧化酶 相應醛類產物+氨+過氧化氫氨+二氧化碳+2 腺苷三磷酸+水 氨甲酰磷酸合成酶2 腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲酰磷酸磷酸根+甘油醛-3-磷酸+輔酶 甘油醛-3-磷酸脫氫酶 甘油酸-1，3-雙磷酸+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出單胺氧化酶的活性濃度大小測定結果。
2. —種單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 20-500mmol/L穩(wěn)定劑 1-4000mmol/L輔酶 1-6mmol/L氨甲酰磷酸合成酶 1000——80000U/L甘油醛-3-磷酸脫氫酶 1000——80000U/L胺類化合物 1——50mmol/L碳酸氫鈉(二氧化碳) 1——50mmol/L腺苷三磷酸 1——50mmol/L甘油醛-3-磷酸 1——50mmol/L本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以下物 質之一芐胺、對苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、e-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者 這七種物質的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。碳酸氫鈉(二氧化碳)可以用其 他碳酸氫鹽取代。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨甲酰磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨甲酰磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛_3-磷酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定 齊U、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨甲酰磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成。輔酶、氨甲酰磷酸合成 酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷 酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、氨甲酰磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛_3-磷酸組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸組成；試劑2， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、氨甲酰磷酸合成酶組成。輔酶、氨甲酰磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化 碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、胺類化合物、碳酸氫鈉(二氧化碳)、腺苷三磷酸、甘油醛-3-磷酸、氨甲酰磷酸合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號G01N35/00GK101793716SQ200910028229
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優(yōu)先權日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司