專利名稱：：一種生物樣品中蛋白質(zhì)組的分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物樣品中蛋白質(zhì)組分析方法，特別是一種鑒定不同生物樣品中特異表達蛋白組的分析方法，更確切的說，涉及到鑒定腫瘤細胞產(chǎn)生的特異表達蛋白的方法，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：目前在大、中城市里，醫(yī)院門診部所見到的癌癥病人，一般說來，早期(I期)病人約占5%10%，屮期(n期)約占20%，較晚期的病人(m+iv期)約占70%75%。較晚期病人治療后的5年生存率只有10%30%。從60年代至今，我國一些醫(yī)務(wù)人員和科研人員在不同的癌癥高發(fā)區(qū)、高危人群中展開了癌癥的初篩、普査普治，發(fā)現(xiàn)了許多早期病人，早期癌癥病人約占普査發(fā)現(xiàn)癌癥總數(shù)的30%70%。早期癌癥病人正規(guī)治療后的5年生存率高達70%-95%。對癌癥控制的策略是預(yù)防為主，防治結(jié)合，重在三早，三早是指早期發(fā)現(xiàn)，早期診斷和早期治療。只有這樣，才能以較少的投入，獲得較好的控制癌癥的效果。早期得到診斷的癌癥病人住院治療，在腫瘤體積小、沒有發(fā)生轉(zhuǎn)移的情況下，患者的自身免疫功能良好，往往在手術(shù)切除即可治愈，住院治療時間短，花費的醫(yī)療費用少。但當(dāng)較晚期才確診的癌癥病人，需要應(yīng)用綜合治療，治療時間長，醫(yī)療費用高，而且治療效果差。所以，腫瘤治療的關(guān)鍵在于早期發(fā)現(xiàn)和早期治療。目前認為能在CT、MRI下觀察到的占位性病變己算不上最早期，當(dāng)然也不是治療的最佳時期。應(yīng)該從細胞生物學(xué)角度看癌變，并做到早期診斷，才能夠?qū)⒛[瘤扼殺在細胞萌芽期或腫瘤形態(tài)可見的最早期。由于不論是細胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細胞所表達的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定細胞內(nèi)表達的蛋白質(zhì)組的區(qū)別，可用于診斷疾病，并可用于藥物開發(fā)和疾病治療。而要進行蛋白質(zhì)組表達和功能的差異化分析，要求能夠達到分辨細胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進行定性鑒定和定量分析。目前，一種常用的蛋白質(zhì)分離的方法是凝膠電泳。通常是用凝膠內(nèi)等電點聚焦先分離蛋白質(zhì)組，再用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS—PAGE)進行第二次分離。結(jié)果得到一張根據(jù)等電點范圍(凈電荷)和大小(質(zhì)量)來區(qū)分蛋白質(zhì)的圖。但是該方法存在以下幾方面的局限。首先，該方法只能根據(jù)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量和等電點(pl)對蛋白質(zhì)分子進行區(qū)分；其次，各維度的分辨率受到凝膠分辨能力的限制，通常很難區(qū)分質(zhì)量差異小于5%或等電點相近的生物分子。第三，凝膠的容量和靈敏度都有限，可能無法檢測出少量和微量表達的生物分子。第四，無法觀察到分子量低于約1()20kDa的小肽。目前臨床診斷疾病的一般方法是要求特異性地檢測出疾病的己知標(biāo)記。但是，制備特異性結(jié)合標(biāo)記并且能在復(fù)雜的混合物中鑒別出標(biāo)記的試劑需要大量時間，因此阻礙了此類診斷方法的發(fā)展。用質(zhì)譜的方法測定蛋白質(zhì)組是較新的方法，如申請?zhí)枮?3148375.5、名稱為用于生物樣品分析的蛋白指紋法的專利，涉及用滯留層析法捕獲蛋白質(zhì)組進行分析的蛋白指紋法。采用質(zhì)譜法進行鑒別檢測蛋白質(zhì)組，分析所得數(shù)據(jù)的形式是可用計算機讀取的條碼格式(蛋白指紋)。該發(fā)明的方法可用于細胞和臨床疾病的診斷，如腫瘤的診斷。申請?zhí)枮?00610140288.8、名稱為"用磁珠支持基質(zhì)及質(zhì)譜判斷正常人與肝癌的試劑盒和方法"的專利申請，涉及一種用磁珠支持基質(zhì)的方法捕獲生物樣品中肝癌蛋白質(zhì)組，用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品，然后用質(zhì)譜法進行分析的蛋白指紋分析。5專利號為ZL0314S375.5、名稱為"用于生物樣品分析的蛋白指紋法"的專利，涉及用滯留層析法捕獲蛋白質(zhì)組進行分析的蛋白指紋法。但是以上專利由于其反應(yīng)條件的設(shè)計使其敏感性即早期檢出率仍然有待于提高。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種生物樣品中蛋白質(zhì)組的分析方法，該方法具有更高的敏感性即早期檢出率。本發(fā)明的又一發(fā)明目的在于提供一種鑒定生物樣品中特異表達蛋白的分析方法，特別是在腫瘤形態(tài)不可見或可見的情況下，檢測血液或體液中癌細胞產(chǎn)生的獨特的蛋白質(zhì)組的方法。本發(fā)明的再一發(fā)明目的在于提供一種根據(jù)上述方法的原理制備的試劑盒。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為本發(fā)明提供的一種生物樣品中蛋白質(zhì)組的分析方法，包括如下步驟本發(fā)明涉及一種生物樣品中蛋白質(zhì)組的分析方法，包括如下步驟(1)生物樣品預(yù)處理在生物樣品中加入12倍體積的U9尿素緩沖液，放置510分鐘后加入12倍體積的結(jié)合試劑，得到生物樣品預(yù)處理溶液；(2)納米磁珠處理在步驟(1)得到的生物樣品預(yù)處理溶液中加入納米磁珠，置于磁鐵上孵育1030min后棄去液體，加入12倍體積的結(jié)合試劑，置于磁鐵上孵育l5min使納米磁珠結(jié)合腫瘤標(biāo)記物，棄去液體；在納米磁珠中加入洗脫液，洗脫15min，得上清液；(3)芯片分析將步驟(2)得到的上清液進行蛋白質(zhì)譜分析，得到指紋圖譜；其中，所述結(jié)合試劑為pH3.553.95、3040mmol/L的醋酸鈉溶液，所述洗脫液為質(zhì)量百分比濃度為5%三氟醋酸溶液。其中，本發(fā)明中的納米磁珠優(yōu)選為弱陽離子交換型納米磁珠；本發(fā)明的又一優(yōu)選方案為結(jié)合試劑優(yōu)選為pH3.653.85、35~40mmol/L的醋酸鈉溶液，進一歩優(yōu)選為pH3.75的醋酸鈉溶液。其中，本發(fā)明中的生物樣品包括血清、血槳、唾液、精液、淋巴液、尿液以及其他體液；本發(fā)明中的U9尿素緩沖液中含有9mol/L的尿素、質(zhì)量百分比含量為2。/。的CHAPS、50mmoI/L的Tris鹽酸，1%二硫蘇糖醇，pH為9.0。本發(fā)明的再一優(yōu)選方案為在步驟(2)中，加入pH3.553.95的醋酸鈉溶液，置于磁鐵上孵育15min使納米磁珠結(jié)合腫瘤標(biāo)記物，棄去液體；重復(fù)l3次后加入質(zhì)量百分比濃度為5%三氟醋酸溶液進行洗脫。本發(fā)明還涉及一種鑒定生物樣品中特異表達蛋白的分析方法，包括以下步驟(1)按照本發(fā)明中的方法建立正常生物樣品的蛋白質(zhì)組指紋圖譜庫；(2)按照同步驟(1)相同的方法和條件建立待測生物樣品的蛋白質(zhì)組指紋圖譜庫；(3)將正常生物樣品的指紋圖譜庫與待測生物樣品的指紋圖譜庫比較，根據(jù)特異指紋確定特異指紋峰，特異指紋峰對應(yīng)的蛋白即為待測生物樣品的特異表達蛋白。本發(fā)明還涉及鑒定生物樣品中特異表達蛋白的分析方法在檢測癌變細胞或組織的蛋白質(zhì)特異表達中的應(yīng)用。其中，癌變細胞或組織選自肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、前列腺癌、食管癌、鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌，卵巢癌、宮頸癌、惡性淋巴瘤或皮膚癌的細胞或組織。本發(fā)明分析方法的孵育的目的是使納米磁珠與腫瘤標(biāo)記物結(jié)合，腫瘤標(biāo)記物為蛋白質(zhì)組、細胞中發(fā)生了突變的基因、蛋白質(zhì)、多肽或其他小分子物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)組是指一個基因組、一個細胞或組織或一種生物體所表達的全部蛋白質(zhì)，所述的其他小分子物質(zhì)為氨基酸或多糖、質(zhì)譜能夠檢測并具有識別意義的物質(zhì)。本發(fā)明的質(zhì)譜分析優(yōu)選飛行質(zhì)譜。選用飛行質(zhì)譜時，需要將步驟(2)最終7得到的上清液與SPA飽和溶液以1:11:2的比例混合，然后加樣到Au/Steel芯片上，晾干，然后質(zhì)譜測定。SPA為Sinapinicacid在50%乙腈(ACN)和0.5%三氟乙酸(TFA)的飽和溶液，其作用是作為介質(zhì)，使蛋白質(zhì)分子在介質(zhì)中分開，同時作為能量吸收分子，Au/Steel芯片上保留的蛋白在特異的激光照射后，發(fā)生解離作用，帶電分子在通過電場時加速，記錄儀記錄飛行時間的長短，質(zhì)量越輕，相對所帶的電荷越多(質(zhì)荷比m/z越小)，飛行時間越短。信號由高速的模擬數(shù)字轉(zhuǎn)化器傳化并記錄，被測定的蛋白質(zhì)以一系列峰的形式呈現(xiàn)，形成指紋圖譜。當(dāng)兩種生物樣品分別為正常血清或其它體液和各種癌癥的血清或其它休液時，特異指紋峰對應(yīng)的蛋白即為腫瘤細胞的特異表達蛋白。所述癌癥選自肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、前列腺癌、食管癌、鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌，卵巢癌、宮頸癌、惡性淋巴瘤或皮膚癌等。本發(fā)明中，結(jié)合試劑是本發(fā)明的主要改進之處，現(xiàn)有技術(shù)所用的結(jié)合試劑，通常為pH4.06.0的醋酸鈉溶液，更常用的是pH為4.0的醋酸鈉溶液，這是因為通常認為pH過高或過低都不利于吸附載體與蛋白質(zhì)組的結(jié)合。但本發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)試驗和硏究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)吸附載體為納米磁珠時，以pH為3.553.95的醋酸鈉溶液作為結(jié)合試劑，納米磁珠可捕捉更多的腫瘤早期尤其是小分子標(biāo)記物，從而大大提高了本發(fā)明方法對腫瘤的敏感性即早期檢出率。這是由于蛋白質(zhì)具有兩性電離的性質(zhì)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的pH大于等電點時，蛋白質(zhì)顆粒帶負電荷，反之則帶正電荷。在生物樣本中，能起診斷意義的小分子蛋白質(zhì)的等電點為5.0左右，因而在較低pH條件下帶更多的正電荷，從而可以大大提高檢測的靈敏度，檢測到低豐度的分子量較小的蛋白質(zhì)分子。由于腫瘤早期會出現(xiàn)一些低風(fēng)度小分子的標(biāo)記物，因而本發(fā)明的方法具有更高的靈敏度，為癌癥的早期診斷提供的一種有效的方法。實驗中發(fā)現(xiàn)，使用pH為3.553.95的醋酸鈉溶液作為結(jié)合試劑，較pH4.06.0的醋酸鈉溶液作為結(jié)合試劑，能更敏感的即更早的檢測到腫瘤早期低豐度的8腫瘤標(biāo)志物、較早的得到腫瘤特異指紋圖譜峰，另外，本發(fā)明方法可檢測出更多的低豐度尤其是腫瘤特異的堿性小肽標(biāo)志物，從而增大了正常指紋圖譜和癌癥指紋圖譜間的差異性，提高了早期癌癥的檢出率。同時，由于本發(fā)明方法更加靈敏，因此可以檢測出更加早期的癌癥?，F(xiàn)有技術(shù)的指紋圖譜一般只有當(dāng)腫瘤直徑達到0.5cm時才能檢測到，而本發(fā)明方法可檢測到直徑為0.3以下的腫瘤，可通過PET-CT觀察至0.3cm時而證實，因此，本發(fā)明方法無疑對癌癥的早期檢測和治療有重要的意義。此外，本發(fā)明還涉及一種用于檢測早期癌癥的試劑盒，包括納米磁珠，結(jié)合試劑、洗脫液和磁架，結(jié)合試劑為pH3.553.95的醋酸鈉溶液，洗脫液為5%三氟醋酸溶液；磁架為設(shè)置有小孔的磁鐵，小孔與PCR管相匹配；納米磁珠優(yōu)選帶羧基的納米磁珠。使用時，按照上述方法，將納米磁珠放入PCR管中，加入經(jīng)過步驟(1)處理的生物樣品，然后放入磁架上的小孔，由于磁架為磁鐵制成，因此帶有磁性，可進行孵育，1030分鐘后將PCR管從磁架的小孔中取出，孵育自然結(jié)束，除去上清液，然后加入結(jié)合試劑，仍放入磁架的小孔將育l5分鐘，使納米磁珠與腫瘤標(biāo)記物結(jié)合，除去液體；之后PCR管中加入洗脫液，反應(yīng)15分鐘；洗脫腫瘤標(biāo)記物至上清液；上清液即可直接用于質(zhì)譜分析。綜上所述，本發(fā)明提供了一種生物樣品中蛋白質(zhì)組分析方法，該方法可以在腫瘤形態(tài)不可見或可見的情況下，通過血液或體液檢測到非常早期癌細胞產(chǎn)生的獨特的蛋白質(zhì)組；采用該方法，可以更敏感、更早期的診斷癌癥，使癌癥早期診斷與治療成為可能。本發(fā)明的方法還可以監(jiān)測腫瘤，在腫瘤治療前、治療中和治療后檢測腫瘤特異性物質(zhì)的水平可幫助了解治療效果，監(jiān)測腫瘤有無早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。進一步，本發(fā)明的方法還可以用于腫瘤藥物的開發(fā)。圖1為靈敏度實驗的蛋白質(zhì)指紋圖譜。具體實施例方式以下實施例對本發(fā)明進行進一步的說明，并不對本發(fā)明作出任何限制。實施例l肝癌的診斷1.建立正常血清的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜庫，其方法如下連續(xù)體檢三年健康的志愿者1000名，男女各半，年齡2050，均無家族病史，至少兩代無癌癥患者，抽血數(shù)滴，分離出血清。將lpL血清加入2倍體積U9緩沖液稀釋(含有9mol/L尿素、2%CHAPS、50mmol/LTris鹽酸、1%DTT，pH9.0)后，冰浴振蕩30min，使蛋白質(zhì)組與尿素作用。然后在上述樣品中加入3|iLpH3.75的40mM醋酸鈉結(jié)合試劑；將MACS納米磁珠(德國美天旎生物技術(shù)公司產(chǎn)品)加入該血清，置于磁鐵上孵育1030min;除去上清液；然后加入結(jié)合試劑，置于磁鐵上孵育15min，使納米磁珠結(jié)合腫瘤標(biāo)記物，除去液體;加入5%TFA溶液，反應(yīng)15min;洗脫腫瘤標(biāo)記物至上清液用于用質(zhì)譜儀檢測。采用上述方法分別檢測其余志愿者，用統(tǒng)計學(xué)方法，采用計算機分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果。得到具有統(tǒng)計學(xué)意義的質(zhì)譜圖譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。2.建立肝癌的血清指紋圖譜庫CT、核磁共振等檢查診斷為肝癌的患者300例，男女各半，年齡4060，所有患者已經(jīng)手術(shù)切除腫瘤，病理結(jié)果證明為肝癌。術(shù)前抽檢全血采集后吸取血清，置于-8(TC保存。取血樣標(biāo)本分離出血清。按照同建立正常血清的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜庫相同的方法進行操作。采用上述方法分別檢測其余患者，用統(tǒng)計學(xué)方法，采用計算機分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果。得到具有統(tǒng)計學(xué)意義的質(zhì)譜圖譜標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。3.將乙肝患者的血清與上述相對應(yīng)的指紋圖譜比較，根據(jù)特異指紋圖譜確定該患者是否已患肝癌。抽取乙肝患者靜脈血5ml，分離出血清。照同建立正常血清的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜庫相同的方法進行操作。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>具體比較方法如下:在指紋圖譜中，2045Da、3460Da、3780Da、3935Da、4280Da、4469Da、4569Da、5627Da、5012Da、8687Da和8933Da等處的10個峰的同時變化對于診斷胃腺癌具有重要意義，該IO個種蛋白指紋可以用于區(qū)分正常人細胞和肝癌患者細胞。其中在4280Da、3780Da等兩處峰所有的病人均比正常人高，5627Da、4569Da峰出現(xiàn)在所有病人中，而正常人中則無此峰。通過這10個峰的鑒別，可以準(zhǔn)確地鑒定被診斷者，在受試的126例中，有2例被診斷為肺癌，術(shù)后病理學(xué)檢測證明診斷的正確，其它跟蹤5年未見異常。本發(fā)明釆用計算機分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)結(jié)果，通過操作者對比或用分析軟件自動分析對比質(zhì)譜圖中強弱沿著線性軸的暗度強度值信號，本發(fā)明中采用Ciphergenproteinchip3.0版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù)，然后用BiomarkerWizard軟件分析HepG2、HepG2.2.15細胞的蛋白質(zhì)譜差異，通過被診斷者與正常及癌癥患者譜圖三者之間的差異，判斷被診斷者罹患癌癥的可能，再經(jīng)過定期的血液檢查、CT、核磁共振等檢查，進行癌癥的監(jiān)測。實施例2胃癌的診斷1、建立正常血清的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜庫連續(xù)體檢三年健康的志愿者IOOO名，男女各半，年齡2050，均無家族病史，至少兩代無癌癥患者，抽血數(shù)滴，按照實施例2的方法處理。區(qū)別為結(jié)合試劑pH為3.95。2、建立胃癌的血清指紋圖譜庫；CT、核磁共振等檢査確診為胃癌的患者52名，男女各半，年齡4060，所有患者以經(jīng)手術(shù)切除腫瘤，病理結(jié)果證明為胃癌。術(shù)前抽檢全血采集后按照樣品收集項下的方法處理吸取血清，置于-80。C保存；按照實施例1的方法處理。不同之處在于結(jié)合試劑pH為3.95。3、將被診斷者的血清或其它體液與上述相對應(yīng)的指紋圖譜庫比較，根據(jù)特異指紋確定癌癥的類別。4、實驗結(jié)果1588Da、1725Da、1817Da、2046Da、3175Da、5084Da、5252Da、5910Da、6027Da、6956Da、75671Da和8691Da處的12個峰的同時變化對于診斷胃腺癌具有重要意義，其中在5910Da、6027Da峰處所有的病人均比正常人高，5084Da、6956Da峰處在病人中均在該峰旁邊出現(xiàn)二聯(lián)峰或三聯(lián)峰。在這三個峰中只有8691Da峰的值為腫瘤病人低于正常人。通過這五個峰的鑒別，本實驗中50例患胃腺癌的樣品中有48例被準(zhǔn)確的檢出為胃腺癌，1000例健康志愿者中有990例確定為非胃腺癌患者。此結(jié)果表明，該方法的靈敏度為98%(48/50)，特異性99%(990/1000)。實施例3通過體液進行直腸癌的診斷1、建立正常尿液的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜庫連續(xù)體檢三年健康的志愿者1000名，男女各半，年齡2050，均無家族病史，至少兩代無癌癥患者。采集尿液按照實施例2的步驟處理并進行質(zhì)譜分析，不同之處在于所用結(jié)合試劑的pH為3.55。2、建立直腸癌的尿液指紋圖譜庫；CT、核磁共振等檢査確診為直腸癌的患者278名，男女各半，年齡4060，所有患者以經(jīng)手術(shù)切除腫瘤，病理結(jié)果證明為直腸癌。采集尿液按照實施例1的步驟處理并進行質(zhì)譜分析，不同之處在于所用結(jié)合試劑的pH為3.55。3、將被診斷者的血清或其它體液與上述相對應(yīng)的指圖譜庫比較，根據(jù)特異指紋確定癌癥的類別。4、實驗結(jié)果通過分析幾千種尿液蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述12種蛋白指紋可以用于診斷正常與直腸癌(PO.01):2045Da、2812Da、2872Da、3372Da、3390Da、3935Da、4095Da、4469Da、5908Da、7910Da、8687Da、8933Da。將來自具有統(tǒng)計意義的患者群的樣品與正常樣品比較，這12種蛋白指紋，可以用于鑒別診斷。實施例4靈敏度實驗1.實驗過程1.1分組取實施例1中建立肝癌指紋圖譜的樣本300例，隨機分為2組；1.2實驗過程組l(150例)將肝癌患者的血清lpL加入2倍體積U9緩沖液稀釋(含有9mol/L尿素、2%CHAPS、50mmol/LTris鹽酸、1%DTT，pH9.0)后，冰浴振蕩30min，使蛋白質(zhì)組與尿素作用。然后在上述樣品中加入3pLpH3.75的40mM醋酸鈉結(jié)合試劑；將MACS納米磁珠(德國美天旎生物技術(shù)公司產(chǎn)品)加入該血清，置于磁鐵上孵育1030min;除去上清液；然后加入結(jié)合試劑，置于磁鐵上孵育l5min，使納米磁珠結(jié)合腫瘤標(biāo)記物，除去液體；加入5^TFA溶液，反應(yīng)15min;洗脫腫瘤標(biāo)記物至上清液用于用質(zhì)譜儀檢測；組2(150例)將肝癌患者的血清1^L加入2倍體積U9緩沖液稀釋(含有9mol/L尿素、2%CHAPS、50mmol/LTris鹽酸、1%DTT，pH9.0)后，冰浴振蕩30min，使蛋白質(zhì)組與尿素作用。然后在上述樣品中加入3pLpH4.0的50mM醋酸鈉結(jié)合試劑；將MACS納米磁珠(德國美天旎生物技術(shù)公司產(chǎn)品)加入該血清，置于磁鐵上孵育1030min;除去上清液；然后加入結(jié)合試劑，置于磁鐵上孵育l5min，使納米磁珠結(jié)合腫瘤標(biāo)記物，除去液體；加入5。"TFA溶液，反應(yīng)15min;洗脫腫瘤標(biāo)記物至上清液用于用質(zhì)譜儀檢測。2.實驗結(jié)果如圖1所示，下圖為組1得到的蛋白質(zhì)指紋圖譜，上圖為組2得到的蛋白指紋圖譜。從圖中可以看出，當(dāng)pH為3.75時，蛋白圖譜的峰值顯著提高，特征峰的數(shù)量也明顯增多，尤其在小于4000Da圖譜部分，特征峰數(shù)量顯著增多，提示在pH為3.75時，可以檢測出更多的分子量較小的肽，由于在腫瘤發(fā)展的早期特征的堿性小肽標(biāo)記物較多，因而選用較低的pH值，可以提高對腫瘤的敏感性即早期檢出率。同樣，按照上述實驗過程對胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、前列腺癌、食管癌、鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌，卵巢癌、宮頸癌、惡性淋巴瘤、皮膚癌的生物樣本分析，發(fā)現(xiàn)在pH為3.553.95時得到的蛋白圖譜峰值和特征峰數(shù)量要明顯好于pH為4.06.0的蛋白圖譜，其中，尤其以pH為3.75時的蛋白圖譜最好。1權(quán)利要求1、一種生物樣品中蛋白質(zhì)組的分析方法，其特征在于，包括如下步驟(1)生物樣品預(yù)處理在生物樣品中加入1～2倍體積的U9尿素緩沖液，放置5～10分鐘后加入1～2倍體積的pH3.55～3.95、30～40mmol/L的醋酸鈉溶液，得到生物樣品預(yù)處理溶液；(2)納米磁珠處理在步驟(1)得到的生物樣品預(yù)處理溶液中加入納米磁珠，置于磁鐵上孵育10～30min后棄去液體，加入1～2倍體積的pH3.55～3.95、30～40mmol/L的醋酸鈉溶液，置于磁鐵上孵育1～5min使納米磁珠結(jié)合腫瘤標(biāo)記物，棄去液體；在納米磁珠中加入質(zhì)量百分比濃度為5％三氟醋酸溶液，洗脫1～5min，得上清液；(3)質(zhì)譜分析將步驟(2)得到的上清液進行蛋白質(zhì)譜分析，得到指紋圖譜。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)組的分析方法，其特征在于，所述的納米磁珠為弱陽離子交換型納米磁珠。3.根據(jù)權(quán)利耍求1所述的蛋白質(zhì)組的分析方法，其特征在于，在步驟(1)和(2)中加入的醋酸鈉溶液的pH為3.653.85。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)組的分析方法，其特征在于，所述的醋酸鈉溶液的pH為3.75。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)組的分析方法，其特征在于，所述的生物樣品包括血清、血漿、唾液、精液、淋巴液和尿液。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的蛋白質(zhì)組的分析方法，其特征在于，在步驟(2)中，加入pH3.553.95的醋酸鈉溶液，置于磁鐵上孵育15min使納米磁珠結(jié)合腫瘤標(biāo)記物，棄去液體；重復(fù)13次后加入質(zhì)量百分比濃度為5%三氟醋酸溶液進行洗脫。7.—種鑒定生物樣品中特異表達蛋白的分析方法，其特征在于，包括以下歩驟:(1)按照權(quán)利要求16任意一項所述方法建立正常生物樣品的蛋白質(zhì)組指紋圖譜庫；(2)按照同步驟1相同的方法建立待測生物樣品的蛋白質(zhì)組指紋圖譜庫；(3)將正常生物樣品的指紋圖譜庫與待測生物樣品的指紋圖譜庫比較，根據(jù)特異指紋確定特異指紋峰，特異指紋峰對應(yīng)的蛋白即為待測生物樣品的特異表達蛋白。8.權(quán)利要求7所述的分析方法在檢測癌變細胞或組織的蛋白質(zhì)特異表達中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的鑒定不同生物樣品中特異表達蛋白的分析方法，其特征在于，所述的癌變細胞或組織選自肝癌、胃癌、肺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、前列腺癌、食管癌、鼻咽癌、胰腺癌、乳腺癌，卵巢癌、宮頸癌、惡性淋巴瘤或皮膚癌的細胞或組織。10.—種用于檢測早期癌癥的試劑盒，其特征在于，包括納米磁珠，結(jié)合試劑、洗脫液和磁架，所述的結(jié)合試劑為pH3.553.95的醋酸鈉溶液，所述的洗脫液為5%三氟醋酸溶液，所述磁架為設(shè)置有小孔的磁鐵，所述小孔與PCR管相匹配。全文摘要本發(fā)明的目的在于提供一種生物樣品中蛋白質(zhì)組分析方法，該方法可以在腫瘤早期通過血液或體液檢測到癌細胞產(chǎn)生的獨特的蛋白質(zhì)組；采用該方法，可以更敏感、更早期的診斷癌癥，使癌癥早期診斷與治療成為可能。文檔編號G01N1/28GK101685080SQ20091014688公開日2010年3月31日申請日期2009年6月11日優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日發(fā)明者高尚先申請人:高尚先