專利名稱：：一種牛奶中諾氟沙星抗生素殘留量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測牛奶中抗生素含量的方法，特別涉及一種牛奶中諾氟沙星抗生素殘留量的檢測方法。屬于分析
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：諾氟沙星是一種廣譜高效抗菌藥物，在臨床上的應(yīng)用相當(dāng)廣泛。諾氟沙星抗生素對大多數(shù)革蘭氏陽性菌、大腸桿菌、綠膿桿菌有非常好的抑制活性；對葡萄球菌、衣原體、分支桿菌、支原體和尿?qū)僦гw有中等強(qiáng)度的抑制活性；對鏈球菌(尤其是D族鏈球菌)、腸球菌及厭氧菌有很小或無抑制活性。隨著該類藥物的廣泛應(yīng)用及深入研究，有關(guān)諾氟沙星藥物的不良反應(yīng)和耐藥性報道越來越多，其潛在的嚴(yán)重不良反應(yīng)逐漸受到人們的重視，作為獸藥和飼料添加劑而大量的用于動物，因而其殘留在動物可食性產(chǎn)品中的可能性相對很大。這些殘留物可直接對人造成危害外，更嚴(yán)重的是低濃度的殘留藥物可能對諾氟沙星藥物敏感的致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而間接危害人類健康。為保護(hù)人類健康，控制諾氟沙星抗生素的殘留，美國FDA規(guī)定氟諾喹酮類在牛奶中的殘留量小于100pg/kg，我國規(guī)定的氟諾喹酮在牛奶中的殘留量應(yīng)小于100pg/kg。因此，需要尋求簡便、快速、準(zhǔn)確檢測乳與乳制品中諾氟沙星抗生素殘留量的檢測方法，才能滿足日趨嚴(yán)格的殘留限量要求，從而保證人們飲用牛奶的衛(wèi)生和安全。檢測諾氟沙星殘留量的方法有微生物法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、免疫分析法、高效毛細(xì)管區(qū)帶電泳法和化學(xué)發(fā)光分析法等。目前，牛奶中諾氟沙星抗生素常用的檢測方法主要是高效液相色譜法。但采用此法，檢測時間較長，而且高效液相色譜法檢測諾氟沙星抗生素的檢出限較高(一般高于20pg/kg)。超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀在定量分析中可以根據(jù)特征離子和由此特征離子斷裂產(chǎn)生的特征碎片作為某一目標(biāo)化合物的指紋，將它從復(fù)雜基質(zhì)的混合物樣品中選擇出來進(jìn)行定量，因此靈敏度高和選擇性強(qiáng)，是目標(biāo)化合物定量分析的金標(biāo)準(zhǔn)。它是食品安全，藥代動力學(xué)等各種國際法規(guī)所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)儀器。超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀能夠針對目標(biāo)化合物電離產(chǎn)生的母離子和子離子進(jìn)行定量，與傳統(tǒng)的高效液相色譜法相比，大大提高了對目標(biāo)化合物的選擇性和靈敏度，且極大的縮短了分析時間，檢測一個樣品僅需5min左右。超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的應(yīng)用前景非常廣泛，已被國際上普遍承認(rèn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是得到一種牛奶中諾氟沙星抗生素殘留量的檢測方法，其檢測時間短，靈敏度高，精密度好。本發(fā)明的牛奶中諾氟沙星抗生素殘留量的檢測方法，包括如下步驟1)制備多個(優(yōu)選5-10個溶液點，更優(yōu)選5個溶液點)不同濃度的諾氟沙星抗生素溶液，并對其分別檢測，根據(jù)所測得的數(shù)據(jù)，繪制諾氟沙星抗生素的含量與檢測結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線2)對樣品用同樣的方法進(jìn)行檢測，并得到檢測結(jié)果；3)將步驟2)中的檢測結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖比對，即得到樣品中諾氟沙星抗生素含量；4)檢測設(shè)備為超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀。上述步驟l)中制備溶液的溶劑優(yōu)選為甲醇。上述多個不同濃度的諾氟沙星抗生素溶液含量優(yōu)選為100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL和Ong/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。上述所述的步驟2)中所述樣品的處理方法如下a)牛奶樣品與pH4.0的Na2EDTA-Mellvaine緩沖溶液按照質(zhì)量與體積比(g/ml)為l:(4-10)的比例加入，在室溫條件下充分渦流l-5min，靜置10-20min，充分提取，加入l-5mL50。/。的三氯乙酸混勻后，在轉(zhuǎn)速為10,000rpm、溫度為4"的條件下離心5-15min，后得上清液待凈化；加入l-5ml50%的三氯乙酸，可以更好地沉淀蛋白，得到較對比文件澄清的上層提取液，在不影響檢測結(jié)果的同時，為以后的SPE凈化作比較好的準(zhǔn)備工作。b)用5.0mL甲醇以1.0-2.0mL/min的流速通過固相提取小柱，再用5.0mL超純水以1.0-2.0mL/min的流速過柱，將上述所得上清液在流速為1.0-2.0mL/min的條件下經(jīng)固相提取小柱凈化和富集，然后用3.0mL的5%的甲醇水溶液以1.0-2.0mL/min的流速過此柱，用真空泵將固相提取小柱抽干；c)向富集目標(biāo)物質(zhì)的固相提取小柱中加入6.0mL甲醇洗脫，洗脫流速1.0-2.0mL/min，收集洗脫液，用氮氣在40'C水浴下吹干，用l.OmL的50%甲醇溶解，渦旋，經(jīng)0.22(im微孔濾膜過濾。所述固相分離小柱優(yōu)選為艾爾杰(Agela)公司的CleanertPEP固相提取小柱。Agela公司的固相提取小柱的特點是加入甲醇或者水之后的流速較快，并且價格較為便宜，考慮到活化完全的小柱的吸附效果較好，所以加入的活化溶劑的體積均為5ml。上述超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的色譜分離方法如下色譜柱:沃特斯(Waters)公司的ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱(2.1mmx50mm，I.D.1.7nm)柱，柱溫40°C，流速0.3mL/min;進(jìn)樣體積5pL;流動相梯度如下時間/min流速/(ml/min)乙腈/%0.1%甲酸水/%變化曲線00.3012.088.0Initial1.000.3030.070.063.000.3070.030.063.500.3012.088.01其中，l為即時變化，6為線性變化。上述超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的質(zhì)譜條件如下電離方式ES(+)，電離電壓3.00KV，源溫度110°C，去溶劑氣溫度:350°C，去溶劑氣流量500L/hr，碰撞室壓力0.35Pa，電子倍增電壓650V，采集方式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM):化合物母離子子離子錐孔電壓/v碰撞能量/eV停留時間(S)諾氟沙星320.2-276.3*30190.05(Norfloxacin)302.330210.05其中，*表示定量離子。本發(fā)明的諾氟沙星抗生素檢測方法具有如下優(yōu)點:1)檢測時間短。一個樣品僅需5min左右。2)靈敏度高。檢出限僅為1.0-2都g/Kg，能夠滿足國際及國內(nèi)對諾氟沙星抗生素含量特別是痕量諾氟沙星抗生素的檢測要求。3)對目標(biāo)化合物的選擇性強(qiáng)，精確定量。超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀根據(jù)目標(biāo)化合物的母離子及經(jīng)碰撞產(chǎn)生的特征子離子進(jìn)行定量分析，只有同時滿足這兩個特征質(zhì)量選擇的目標(biāo)化合物才能被檢測，而且選定的特征裂片離子一定是從選定的母離子產(chǎn)生的，從而排除了樣品中可能存在的其它分子的干擾現(xiàn)象。本發(fā)明的方法采用三重四極桿的ESI(+)離子源，確定了諾氟沙星的母離子和兩個子離子，大大降低了利用高效液相色譜法測定諾氟沙星抗生素可能會出現(xiàn)假陽(陰)性檢測結(jié)果的機(jī)率，從而達(dá)對目標(biāo)化合物精確定量的目的。4)在本發(fā)明所色譜及質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定，在實驗濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r能夠達(dá)到0.999以上，回收率在80-105%之間，日內(nèi)和日間精密度實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.5Q/。和4.0。/。。此法能夠排除干擾組分而從復(fù)雜基質(zhì)中提取出目標(biāo)物質(zhì)，無論對于具有簡單基質(zhì)還是復(fù)雜基質(zhì)的樣品都同樣適用，具有適用范圍廣的優(yōu)點。圖l是本發(fā)明的一個實施例的諾氟沙星的總離子流譜圖，其橫坐標(biāo)表示時間(min)，縱坐標(biāo)表示離子流響應(yīng)信號強(qiáng)度的大小，折合為諾氟沙星目標(biāo)化合物的離子流強(qiáng)度占總離子流的百分比。圖2是本發(fā)明的一個實施例的諾氟沙星子離子257.9與302.0的色譜圖。其橫坐標(biāo)表示時間(min)，縱坐標(biāo)表示離子流響應(yīng)信號強(qiáng)度的大小，折合為諾氟沙星的離子流強(qiáng)度占總離子流的百分比。圖3是本發(fā)明的一個實施例的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。本圖中橫坐標(biāo)表示諾氟沙星的濃度，單位為納克/毫升(ng/mL);縱坐標(biāo)表示離子響應(yīng)信號強(qiáng)度，單位為mv。具體實施例方式下面將結(jié)合具體實施方案對本發(fā)明的方法做更詳細(xì)的說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下述實施例均用于對本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍進(jìn)行實例性的描述，以此概括本發(fā)明的各參數(shù)的相對范圍，因而不能將之理解為對本發(fā)明的一種具體限制。實施例l利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(WatersTQD)測定牛乳中諾氟沙星抗生素諾氟沙星的含量。1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用甲醇定容于100mL棕色容量瓶中，混勻，得到諾氟沙星濃度均為10(Vg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，放置于-18"C冷柜避光保存，至少可以保存4個星期。使用時，稀釋成100ng/mL、50ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。2)試劑的配制(a)提取液的配制0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液準(zhǔn)確稱取28.41g磷酸氫二鈉，用水溶解，定容至1000mL。0.1mol/L檸檬酸溶液準(zhǔn)確稱取21.01g檸檬酸，用水溶解，定容至1000mL。Mellvaine緩沖溶液將1000mL0.1mol/L檸檬酸溶液與0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液625mL混合，用NaOH調(diào)節(jié)pH:4.0。0.1mol/LNa2EDTA-Mellvaine緩沖溶液稱取60.5g乙二胺四乙酸二鈉放入1625mLMellvaine緩沖液中，使其完全溶解。(b)流動相的配制流動相A:乙腈流動相B:0.1%甲酸水溶液3)樣品的制備稱取5.0000g牛奶樣品，置于50mL聚丙烯離心管中，加入25mLNa2EDTA-Mellvaine緩沖溶液提取，在室溫條件下充分振搖2min，靜置15min，充分提取，再加入2mL50。/。三氯乙酸混勻，10,000rpm溫度為4。C的條件下離心10min，得到上清液待凈化。用5.0mL甲醇以1.0-2.0mL/min的流速通過艾爾杰(Agela)公司的CleanertPEP(親水親油平衡)固相提取小柱，再用10.0mL超純水以1.02.0mL/min的流速過柱，目的是活化固體小柱。將上述所得濾液在流速為1.02.0mL/min的條件下經(jīng)固相提取小柱凈化和富集，等快干時用用3.0mL5%的甲醇水溶液以1.0-2.0mL/min的流速過此柱除雜。用真空泵將固相提取小柱抽干。加入6mL甲醇洗脫，然后用氮氣4(TC吹干，用lmL的50%甲醇溶解，渦旋，經(jīng)0.22nm微孔濾膜過濾后用于高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀分析。4)色譜條件色譜柱沃特斯(Waters)公司的ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱(2.1mmx50mm,I.D,1.7(xm)柱，柱溫40。C，流速0.3mL/min;進(jìn)樣體積5|iL;流動相梯度如下時間/min流速/(ml/min)乙腈/%0.1%甲酸水/%變化曲線00.3012.088.0Initial1.0003030.070.063.000.3070.030.063.500.3012.088.01其中，l為即時變化，6為線性變化。5)質(zhì)譜條件電離方式ES(+)，電離電壓3.00KV，源溫度ll(TC，去溶劑氣溫度:350°C，去溶劑氣流量500L/hr，碰撞室壓力0.35Pa，電子倍增電壓650V，采集方式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM):化合物母離子子離子錐孔電壓/V碰撞能量/eV停留時間(S)諾氟沙星320.2-276.3*30190.05(Norfloxacin)302.330210.05其中，*表示定量離子。6)檢測步驟a)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀測定不同濃度的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液。提取總離子流如圖l所示，其橫坐標(biāo)為時間(min)，縱坐標(biāo)表示離子流響應(yīng)信號強(qiáng)度的大小，折合為諾氟沙星目標(biāo)化合物的離子流強(qiáng)度占總離子流的百分比。由圖l可以看出諾氟沙星的保留時間為1.98min。從圖l的總離子流圖中分別提取諾氟沙星定量離子與定性離子的離子對色譜圖，結(jié)果見圖2，其橫坐標(biāo)為時間(min)，縱坐標(biāo)表示離子響應(yīng)信號強(qiáng)度的大小，單位nw。其中，圖2諾氟沙星定量離子257.9與定性離子302.0的色譜圖。利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀測定不同濃度的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液(100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，lng/mL，Ong/mL)進(jìn)行檢觀[)，根據(jù)所得數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，結(jié)果見圖3。其中，圖3為諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，橫坐標(biāo)表示濃度，單位為納克/亳升(ng/mL)，縱坐標(biāo)表示響應(yīng)信號強(qiáng)度的大小，單位為mv。根據(jù)諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，確定線性方程及線性相關(guān)系數(shù)，以信噪比等于3時對應(yīng)的濃度為檢出限，具體結(jié)果見表l。表l諾氟沙星的線性方程及檢出限<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集方式，在實驗濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r=0.9992，回收率在80-105%之間，日內(nèi)和日間精密度實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.5。/。和4.00/0。b)樣品測定利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測制備好的待測樣品，得到諾氟沙星的圖譜，分別將諾氟沙星的相應(yīng)信號值的結(jié)果套入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即可分別得到樣品中諾氟沙星的濃度(ng/mL)，以一未知樣品按照本發(fā)明的樣品制備方法進(jìn)行處理后，在本發(fā)明的檢測條件下進(jìn)行測定，得到樣品中諾氟沙星的響應(yīng)值y為983，代入諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=47.1626x一184.586，則此樣品中諾氟沙星的濃度為2.3納克/毫升(ng/mL)。實施例2利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(WatersTQD)測定牛乳中諾氟沙星的含量。1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制同實施例l中標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。2)試劑的配制(a)提取液的配制同實施例l。(b)流動相的配制同實施例l。3)樣品的制備稱取5.0000g牛奶樣品，置于50mL聚丙烯離心管中，加入20mLNa2EDTA-Mellvaine緩沖溶液，在室溫條件下充分振搖2min，靜置15min，充分提取，再加入lmL50。/。三氯乙酸混勻，10,000rpm、4。C下離心10min，得到上清液待凈化。用5.0mL甲醇以1.0-2.0mL/min的流速通過固相提取小柱，再用10.0mL超純水以1.0-2.0mL/min的流速過柱，目的是活化固體小柱。將上述所得上清液在流速為1.0-2.0mL/min的條件下經(jīng)固相提取小柱凈化和富集，等快干時用3.0mL5%的甲醇水溶液以1.0-2.0mL/min的流速過此柱除雜。用真空泵將固相提取小柱抽干。加入6mL甲醇洗脫，然后用氮氣40。C吹干，用lmL50。/。甲醇溶解，渦旋，經(jīng)0,22^im微孔濾膜過濾后用于高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀分析。4)色譜條件同實施例l。5)質(zhì)譜條件同實施例l。6)檢測步驟a)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀測定不同濃度的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液。提取總離子流如圖l所示。由圖l可以看出諾氟沙星的保留時間為1.98min。從圖l的總離子流圖中分別提取諾氟沙星定性離子與定量離子的離子色譜圖，結(jié)果見圖2。其中，圖2諾氟沙星子離子302.0與275.9的色譜圖。禾,超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀測定不同濃度的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液(100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL)進(jìn)行檢測，根據(jù)所得數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，確定線性方程及線性相關(guān)系數(shù)，以信噪比等于3時對應(yīng)的濃度為檢出限，具體結(jié)果見表2。表2諾氟沙星線性方程及檢出限化合物線性方程線性相關(guān)系數(shù)檢出限(S/N^3)(y=ax+b)(r)(Kg)諾氟沙星Y=47.1626X—184.5860.99922.0用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集方式，在實驗濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r能夠達(dá)到0.9992以上，回收率為80%-105。/。之間，日內(nèi)和日間精密度實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.9。/。和5.1。/。。b)樣品測定利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測制備好的待測樣品，得到諾氟沙星的圖譜，將結(jié)果套入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到樣品中諾氟沙星的含量為0嗎/Kg。實施例3利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀(WatersTQD)測定牛乳中諾氟沙星的含量。1)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制同實施例l。2)試劑的配制(a)提取液的配制同實施例l(b)流動相的配制同實施例l3)樣品的制備稱取3.0000g牛奶樣品，置于50mL聚丙烯離心管中，加入30mLNa2EDTA-Mellvaine緩沖溶液，在室溫條件下充分振搖2min，靜置15min，充分提取，再加入5mL50。/。三氯乙酸混勻，10,000rpm、4。C下離心10min，得到上清液待凈化。用5.0mL甲醇以1.0-2.0mL/min的流速通過固相提取小柱，再用10.0mL超純水以1.0-2.0mL/min的流速過柱，目的是活化固體小柱。將上述所得上清液在流速為1.0-2.0mL/min的條件下經(jīng)固相提取小柱凈化和富集，等快干時用3.0mL5。/。的甲醇水溶液以1.0-2.0mL/min的流速過此柱除雜。用真空泵將固相提取小柱抽干。加入6mL甲醇洗脫，然后用氮氣4(TC吹干，用lmL50n/。甲醇溶解，渦旋，經(jīng)0.22pm微孔濾膜過濾后用于高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀分析。4)色譜條件同實施例l。5)質(zhì)譜條件同實施例l。6)檢測步驟a)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀測定不同濃度的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液。提取總離子流如圖l所示。由圖l可以看出諾氟沙星的保留時間為1.98min。從圖l的總離子流圖中分別提取諾氟沙星定性離子與定量離子的離子色譜圖，結(jié)果見圖2。其中，圖2諾氟沙星子離子302.0與275.9的色譜圖。利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀測定不同濃度的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液(100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL)進(jìn)行檢測，根據(jù)所得數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。根據(jù)諾氟沙星的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，確定線性方程及線性相關(guān)系數(shù)，以信噪比等于3時對應(yīng)的濃度為檢出限，具體結(jié)果見表3。表3諾氟沙星線性方程及檢出限<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)采集方式，在實驗濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r能夠達(dá)到0.9992以上，回收率為80%-105%之間，日內(nèi)和日間精密度實驗的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.9。/。和5.1。/。。b)樣品測定利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測制備好的待測樣品，得到諾氟沙星的圖譜，將結(jié)果套入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到樣品中諾氟沙星的含量為0嗎/Kg。權(quán)利要求1.一種牛奶中諾氟沙星抗生素殘留量的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟1)制備多個不同濃度的諾氟沙星抗生素溶液，并對其分別檢測，根據(jù)所測得的數(shù)據(jù)，繪制諾氟沙星抗生素的含量與檢測結(jié)果之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；2)對樣品用同樣的方法進(jìn)行檢測，并得到檢測結(jié)果；3)將步驟2)中的檢測結(jié)果與所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖比對，即得到樣品中諾氟沙星抗生素含量；4)所述檢測的設(shè)備為超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀。2.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟l)中制備溶液的溶劑為甲醇。3.如權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的步驟l)中制備的不同濃度的諾氟沙星抗生素溶液具有5—10個溶液點。4.如權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述多個不同濃度的諾氟沙星抗生素溶液含量為100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL，10ng/mL，5ng/mL和Ong/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。5.如權(quán)利要求1-4中任意一項所述的檢測方法，其特征在于所述的步驟2)中所述樣品的處理方法如下a)牛奶樣品與pH4.0的Na2EDTA-Mellvaine緩沖溶液按照質(zhì)量體積比(g/ml)為l:(4-10)的比例加入，在室溫條件下充分振搖l-5min，靜置10-20min，充分提取，加入l-5mL50%的三氯乙酸混勻，在轉(zhuǎn)速為10,000rpm、溫度為4°C的條件下離心5-15min，后得上清液待凈化；b)用5.0mL甲醇以1.0-2.0mL/min的流速通過PEP固相提取小柱，再用10.0mL超純水以1.0-2.0mL/min的流速過柱，將上述所得上清液在流速為1.0-2.0mL/min的條件下經(jīng)固相提取小柱凈化和富集，然后用3.0mL的5%的甲醇水溶液以1.0-2.0mL/min的流速過此柱，用真空泵將固相提取小柱抽干；c)向富集目標(biāo)物質(zhì)的固相提取小柱中加入6.0mL甲醇洗脫，洗脫流速1.0-2.0mL/min，收集洗脫液，用氮氣在4(TC水浴下吹干，用l.OmL的50%甲醇溶解，渦旋，經(jīng)0.22iam微孔濾膜過濾。6.7.如權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述固相分離小柱為艾爾杰(Agela)公司的CleanertPEP固相提取小柱。如權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于所述超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的色譜分離方法如下色譜柱沃特斯(Waters)公司的ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱(2.1mmx50mm,I.D.1.7fim)柱，柱溫40°C，流速0.3mL/min;進(jìn)樣體積5pL;流動相梯度如下<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>變化曲線Initial661其中，l為即時變化，6為線性變化。8.如權(quán)利要求7所述的檢測方法，其特征在于所述超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀的質(zhì)譜條件如下電離方式ES(+)，電離電壓3.00KV，源溫度ll(TC，去溶劑氣溫度350°C，去溶劑氣流量500L/hr，碰撞室壓力0.35Pa，電子倍增電壓,650V,采集方式多反應(yīng)監(jiān)測(MRM):<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>其中，*表示定量離子,全文摘要本發(fā)明涉及一種牛奶中諾氟沙星抗生素殘留量的檢測方法。本發(fā)明利用超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀測定諾氟沙星抗生素殘留量。樣品經(jīng)Na₂EDTA-Mellvaine緩沖液(pH4.0)提取，三氯乙酸除蛋白，經(jīng)PEP固相提取小柱凈化和富集，采用色譜柱分離，柱溫30℃，以含有0.1％甲酸的水溶液(v/v)和乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫，采用多反應(yīng)監(jiān)測方式進(jìn)行定量。儀器檢出限為1.0-2.0μg/Kg，在1-100μg/Kg的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r可達(dá)0.999以上，回收率為80％-105％(添加水平為10，50，100μg/Kg)。此法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、適用范圍廣的優(yōu)點。文檔編號G01N30/72GK101609073SQ20091016259公開日2009年12月23日申請日期2009年8月4日優(yōu)先權(quán)日2009年8月4日發(fā)明者劉衛(wèi)星,濤崔,常建軍,張雪峰申請人:內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司