專利名稱：一種依替米星的分析方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高效液相色譜(HPLC)檢測方法，具體涉及一種以聚苯乙烯-二乙烯基 苯色譜介質為分離載體的對依替米星及其有關物質進行含量測定的分析方法。
背景技術：
硫酸依替米星(etimicin)為國家一類新藥，是我國科技人員研究開發(fā)的具有自主知識產 權的新一代半合成氨基糖苷類抗生素。作為一種新藥，其質量控制和安全評價尤為重要。目 前，關于依替米星含量測定的方法主要有微生物法，旋光法，HPLC法。其中微生物法操作繁 瑣，誤差大，在2005版中國藥典依替米星含量測定中該法已被淘汰；而旋光法則精確性差， 重復性低；相對而言，HPLC法靈敏度高，精確性好，但依替米星只具有紫外末端吸收，難以 用紫外檢測器直接進行測定，通常要對樣品進行柱前衍生化處理，或換用其他通用型檢測器， 如蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)等[參見王明娟，胡昌勤，金少鴻，中華臨床醫(yī)學雜志，2004， 5(6) :4 6;國家藥典委員會，中華人民共和國藥典，2005年版，北京化學工業(yè)出版社，2005， 730]。其中柱前衍生化試劑法操作繁瑣、費時，影響因素較多，而且反應過程中可能會產生 一些副產物，干擾其有關物質檢查或純度分析[參見張玫，袁耀佐，范青峰，實驗與研 究，2004, 28 (7) :314 316]; 2005版中國藥典采用蒸發(fā)光散射法，其專屬性好、靈敏度高、 滿足藥品的檢測要求，但所用ELSD檢測器，對于依替米星的純化過程中的在線檢測而言，成 本較高且操作繁瑣，及純度虛高。
因此開發(fā)一種操作快速簡單、分析成本較低的檢測方法用于依替米星前期純化的在線 檢測，對純化工藝的開發(fā)具有積極意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是開發(fā)研究一種能對依替米星及其有關物質進行快速、準確檢測的分析 檢測方法。
本發(fā)明的技術方案如下， 一種依替米星及其有關物質高效液相色譜的快速分析檢測方法， 其特點在于采用一種多孔型聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為固定相的高聚物色譜柱，高效液
相色譜操作條件為
a. 高聚物色譜柱MKF-RP-ETI (南京麥科菲高效分離載體有限公司生產)，4~10pm， (100 300) x (8.0~4.6)薩(LD.);
b. 流動相0.1(M).50md/L的醋酸鹽緩沖液(pH=4~7)和乙腈的體積比為90 100: 10-0;
c. 流速0.8-1.2 mL/min,進樣量10~20nL,柱溫室溫
d. 采用示差檢測器檢測。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點和效果如下
1、選用高聚物色譜柱(MKF-RP-ETI)及常規(guī)的醋酸鹽緩沖液(pH=6. 0)，乙腈比例為10 0% 的范圍內，依替皿以及其^&關物質達到了有效的分離，該流動相的Dll倌以及有機相比例均在所用的MKF-RP-ETI柱的適用范圍內。
2、 本法與《中國藥典》25版所述方法相比，所用色譜柱具有更好的酸堿耐受性，更適合在 此流動相中長期使用，因而具有較好的耐用性。
3、 本發(fā)明操作簡單，分析成本低，為國產新藥依替米星純化過程的在線檢測提供技術支持。
(四)具體實施方案
實驗器材及試劑
(1) 實驗儀器
Summit高效液相色譜儀(戴安公司)，由P680HPLC泵、Shodex示差折光檢測器、8125型進 樣裝置組成；工作站(美國戴安Chromeleon系統(tǒng))。
(2) 實驗試劑
硫酸依替米星發(fā)酵液(廠家提供)；硫酸依替米星純品(中國藥品生物制品檢定所)；乙 腈(美國Merck公司)；醋酸，醋酸銨(均為國產分析純)。高效液相去離子水(自制)。
(3) 色譜條件
色譜柱填料為高度交聯(lián)的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(PS-DVB)微球，粒徑4 l(^m， (南京麥科菲高效分離載體有限公司，型號MKF-RP-ETI， ( 100-300) x (8.0-4.6)mm(I.D.))。 流動相0.10 0.50mol/L的醋酸鹽緩沖液-乙腈，流速0.8-1.2 mL/min，進樣量10~20|iL， 柱溫25°C。
(4) 樣品配制
供試品溶液的配制移液管精密量取硫酸依替米星發(fā)酵液2mL，置于10mL容量瓶中以 流動相定容至刻度，形成稀釋5倍的發(fā)酵液。
對照品溶液的配制精確稱量硫酸依替米星純品0.6g置于10mL容量瓶中以流動相定 容至刻度，制得60mg/ml的對照品溶液。
實施例l
色譜條件檢測機器戴安Summit型高效液相色譜系統(tǒng)；色譜柱MKF-RP-ETI (250mmx4.6mm， 5拜);流動相0.10mol七—'的醋酸鹽緩沖液(pH=4.0)-乙月青(90: 10);
流速lmL/min;進樣量20(JL;進樣物質供試品溶液與對照品溶液。結果依替米星及
其有關物質均達到了基線分離。
實施例2
色譜條件檢測儀器、色譜柱、進樣量、進樣物質同實施例l，流動相0.20mol/L的醋酸鹽 緩沖液(pH=5.0)-乙腈(95: 5);流速0.8mL/min。結果依替米星及其有關物質均達到
了基線分離。 .
實施例3
色譜條件檢測儀器、色譜柱、進樣量、進樣物質同實施例l，流動相0.22mol/L的醋酸鹽 緩沖液(pH=6.5)-乙腈(100:0);流速0.9mL/min。結果依替米星及其有關物質均達到了 基線分離。實施例4
色譜條件檢測儀器、流速、進樣物質同實施例l，色譜柱MKF-RP-ETI (200mmx7.8mm， 5pm),進樣量攀;流動相0.1Omol/L的醋酸鹽緩沖液(pH=4.0)-乙腈(90:10)。結果: 依替米星及其有關物質均達到了基線分離。
實施例5
色譜條件檢測儀器、進樣量、進樣物質同實施例l，色譜柱MKF-RP-ETI (200mmx7.8mm， 10,)，流動相0.3Omol/L的醋酸鹽緩沖液(pH=5.0)-乙腈(95:5)，流速0.9ml/min。結
果依替米星及其有關物質均達到了基線分離。
實施例6
色譜條件檢測儀器、流速、進樣量、進樣物質同實施例l,色譜柱MKF-RP-ETI
(250mmx4.6mm， 6pm)，流動相0.5Omol/L的醋酸鹽緩沖液(pH=5.5)-乙腈(90:10)。結 果依替米星及其有關物質均達到了基線分離。
實施例7
色譜條件檢測儀器、流速、進樣量、進樣物質同實施例l，色譜柱MKF-RP-ETI (300mmx7.8mm， 8pm)，流動相0.32mol/L的醋酸鹽緩沖液(pH=6.5)-乙腈(90:10)。結 果依替米星及其有關物質均達到了基線分離。
實施例8
色譜條件檢測儀器、進樣量、進樣物質同實施例l，色譜柱MKF-RP-ETI (250mmx4.6mm， 4pm)，流動相0.1Omol/L的醋酸鹽緩沖液(pH=4)-乙腈(95:5),流速1,lml/min。結果
依替米星及其有關物質均達到了基線分離。
實施例9
色譜條件檢測儀器、進樣量、進樣物質同實施例l，色譜柱MKF-RP-ETI (100mmx7.8mm， 6pm)，流動相0.40mol/L的醋酸鹽緩沖液(pH=5.0)-乙腈(90:10)，流速1.2ml/min。結 果依替米星及其有關物質均達到了基線分離。
權利要求
1、一種高效液相色譜法測定依替米星及其有關物質的方法，其特征在于選用聚苯乙烯型-高聚物色譜柱，以醋酸鹽緩沖液與乙腈為流動相，分離分析依替米星及其有關物質。
2、 根據(jù)權利要求1所述的測定依替米星及其有關物質的方法，其特征在于，所述高聚物色譜 柱為以苯乙烯-二乙烯基苯共聚物為基質。
3、 根據(jù)權利要求1和2所述的測定依替米星及其有關物質的方法，其特征在于，所述高聚物 色譜柱為MKF-RP型色譜柱。
4、 根據(jù)權利要求l、 2和3所述的測定依替米星及其有關物質的方法，其特征在于，所述高 聚物色譜柱規(guī)格為(100~300) x (8.0-4.6) mm (I.D.)或250x4.6 mm (I.D.)，粒徑4 10阿，。
5、 根據(jù)權利要求1所述的測定依替米星及其有關物質的方法，其特征在于，流動相中醋酸鹽 緩沖液的含量為0.10 0.50mol'L—1， pH為4~7。
6、 根據(jù)權利要求1所述的測定依替米星及其有關物質的方法，其特征在于，流動相中醋酸鹽 緩沖液與乙腈的體積比為9(M00: 10~0。
7、 根據(jù)權利要求1所述的測定依替米星及其有關物質的方法，其特征在于，選用流速為 0.8~1.2 mL/min;
8、 根據(jù)權利要求1所述的測定依替米星及其有關物質的方法，其特征在于，采用示差折光檢
全文摘要
本發(fā)明涉及一種對依替米星及其相關物質的檢測方法。本發(fā)明采用高效液相色譜法，色譜條件為聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物色譜柱MKF-RP-ETI，(粒徑4～10μm，柱規(guī)格(100～300)×(8.0～4.6)mm(I.D.))，流動相組成體積比為0.10～0.50mol/l的醋酸鹽緩沖液(pH＝4～7)和乙腈的體積比為90～100∶10～0，流速0.8～1.2ml/min，檢測器示差折光檢測器；進樣量10～20μl；本發(fā)明使用常規(guī)HPLC儀及示差折光檢測器即可完成對依替米星及其相關物質的在線檢測，方法簡單，快速，準確。
文檔編號G01N30/02GK101614712SQ20091018168
公開日2009年12月30日 申請日期2009年7月27日 優(yōu)先權日2009年7月27日
發(fā)明者劉曉寧, 尹亞萍, 魏榮卿 申請人:南京工業(yè)大學