專利名稱：一步法制備微流診斷芯片的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微流診斷芯片技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及的是一種在芯片內(nèi)表面定點固 定生物分子以制作微流診斷芯片的方法。
背景技術(shù)：
經(jīng)過十幾年的發(fā)展，微流診斷芯片已經(jīng)在生化分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，其中微 量多元診斷芯片已成為未來臨床診斷中的一個新的發(fā)展方向。制作微流診斷芯片材料主要 有PDMS (聚二甲基硅氧烷，Polydimethylsiloxane)等高分子材料，其具有加工成型方便、 價格便宜，可以廉價的大批量生產(chǎn)的優(yōu)點。
微流診斷芯片除了制作微管道結(jié)構(gòu)用于反應(yīng)，往往還需要將生物大分子固定 在管道內(nèi)部，以便后續(xù)的捕獲、分離及抗原抗體(核酸雜交)等生物反應(yīng)的進行。制作 過程通常分為兩個步驟，首先是高分子材料芯片的制作，然后是芯片表面的改性和生物 分子的固定。生物分子在高分子材料表面的有效固定是構(gòu)建診斷芯片的核心步驟，目 前常用的方法主要是對高分子材料表面進行改性，賦予高分子材料的疏水表面以親水 性，進而有效固定特異抗體分子，較少非特異性吸附。經(jīng)過對現(xiàn)有文獻進行檢索，2009 年 Peng Li 等在 Microfluid and Nanofluid 發(fā)表文章中(Peng Li, Assem AboImaaty, Christine D' Amore,etal,Development of an ultrafast quantitative heterogeneous immunoassay on pre—functionalized poly (dimethylsiloxane)microfluidic chips for the next-generation immunosensors) ^lJMS S A PDMS^t PDMS 流道內(nèi)表面固定牛IgG,制備免疫反應(yīng)芯片。而新加坡Ling Yu等人在文章中(Ling Yu, Chang Ming Li,Yingshuai Liu,etal,Flow-through functionalized PDMS microfluidic channels with dextran derivative for ELISAs. Lab Chip，2009，9，1243-1247)提出利 用葡聚糖修飾PDMS芯片表面，共價固定兔IgG抗體，制作檢測兔IgG的ELISA芯片。但上 述這些方法步驟多，成本高，制備速度慢，最大的問題是很難在芯片內(nèi)特定的位置進行生 物分子的固定，極大限制了微流診斷芯片的廉價大批量生產(chǎn)。法國學(xué)者Kevin A. Heyries 等發(fā)表文章提出新的方法(Kevin A. Heyries, Celine A. Mandon, Laura Ceriotti, etal, "Macromolecules to PDMS transfer" as a general route for PDMS biochips. Biosensors and Bioelectronics 24 U009) 1146-1152)，在 iTeflon 3D 模具上點樣 CRP 等 生物分子，然后澆鑄PDMS，利用直接轉(zhuǎn)印法將CRP等生物分子的固定與PDMS反應(yīng)池制作一 步法完成，大大簡化了生物分子在PDMS表面的固定困難。但上述方法中所得的固定有生物 分子的PDMS芯片為平面結(jié)構(gòu)，而反應(yīng)池是通過另外加工的基于SU-8的微管道芯片與其相 鍵合形成，這樣還需后續(xù)的管道結(jié)構(gòu)加工，工序復(fù)雜，如果能將微流診斷芯片制作和生物大 分子固定一步完成，將極大簡化目前工藝流程，加快微流診斷芯片的制作過程，促進診斷芯 片早日走向市場。
因此，有必要開發(fā)一種新的在芯片內(nèi)表面進行生物分子定點固化以便快速制作微 流診斷芯片的方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種微流診斷芯片結(jié)構(gòu)制作的方 法，尤其涉及一種一步法制備微流診斷芯片的方法。
本發(fā)明方法在保持高分子材料對模具圖形復(fù)制好、易脫模的優(yōu)點同時，使蛋白抗 體等生物分子的特異地固定與芯片制作同時完成，從而快速制作微流診斷芯片。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，首先制作微流診斷芯片的陽版模具，在模具 表面涂覆防粘涂層，例如Teflon層，再將蛋白抗體溶液噴點于芯片模具表面特定的位置， 隨后澆鑄PDMS，熱烘后脫模，與玻片鍵合，使微流診斷芯片制作與蛋白抗體固定同步完成， 大大縮短工藝流程所需時間。
本發(fā)明方法包括如下步驟
第一步，首先是制作陽版模具，可采用微機電加工中的硅深刻蝕技術(shù)制作硅模具， 或在基底片上旋涂光刻膠，通過光刻顯影后形成光刻膠模具；也可通過激光加工、精機械加 工的方法制作金屬模具等。
第二步，在陽版模具表面均勻滴加Teflon溶液，甩涂機適當(dāng)轉(zhuǎn)速進行甩涂。
第三步，表面甩涂Teflon的芯片模具進行熱烘，自然冷卻。
第四步，利用點樣儀在芯片特定位置噴點蛋白抗體溶液，形成陣列。
第五步，將PDMS的預(yù)聚體與固化劑混合，經(jīng)超聲、攪拌、真空脫氣等步驟后澆鑄在 陽版模具上，適當(dāng)溫度熱烘，自然冷卻。
第六步，PDMS芯片從模具上揭下來進行鍵合，經(jīng)過表面封閉處理后就得到了已固 定蛋白抗體的微流控診斷芯片。
本發(fā)明和傳統(tǒng)的兩步法制備相比，具有成本低(無需復(fù)雜昂貴的表面修飾試劑)、 制備時間短(一步法完成，完全省略了固定蛋白抗體之前繁復(fù)的表面改性步驟)、蛋白抗體 固定效果好、非特異性吸附小、可即做即用的優(yōu)點，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1本發(fā)明的工藝路線示意圖，其中顯示了根據(jù)本發(fā)明的方法制作的微流控芯片 在各個步驟中的剖面結(jié)構(gòu)。
圖2為實施例1中檢測人IgG的熒光顯微鏡圖片。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明方法的具體實施例作詳細說明。
圖1的示意圖顯示了根據(jù)本發(fā)明的方法制作的微流控芯片在各個步驟中的剖面 結(jié)構(gòu)。如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明的方法主要包括如下步驟
第一步，首先是制作陽版模具，可采用微機電加工中的硅深刻蝕技術(shù)制作硅模具， 或在基底片上旋涂光刻膠，通過光刻顯影后形成光刻膠模具；也可通過激光加工、精機械加 工的方法制作金屬模具等。
第二步，在陽版模具表面均勻滴加Teflon溶液，甩涂機適當(dāng)轉(zhuǎn)速進行甩涂。
第三步，表面甩涂Teflon的芯片模具進行熱烘，自然冷卻。
第四步，利用點樣儀在芯片特定位置噴點蛋白抗體溶液，形成陣列。
第五步，將PDMS的預(yù)聚體與固化劑混合，經(jīng)超聲、攪拌、真空脫氣等步驟后澆鑄在 陽版模具上，適當(dāng)溫度熱烘，自然冷卻。
第六步，PDMS芯片從模具上揭下來進行鍵合，經(jīng)過表面封閉處理后就得到了已固 定蛋白抗體的微流診斷芯片。
實施例1 一步法制備人IgG微流診斷芯片
(1)光刻膠模板的制備
首先采用SU-8-100型負性光刻膠(美國Micro Chem公司)，以2500r/min的轉(zhuǎn) 速在單面拋光的硅片上甩膠，獲得厚度為80 μ m的光刻膠。前烘條件為IOmin從室溫升至 65°C，保溫lOmin，然后30min升至95°C，并保溫35min，隨爐冷。曝光采用德國Karl Suss 公司MA6型光刻機，曝光時間為60s。后烘條件為30min從室溫升至90°C，并保溫lOmin，隨 爐冷。采用Micro Chem公司專用的SU-8顯影液，顯影時間為6min，顯影后用異丙醇清洗， 氮氣吹干，即獲得所需的光刻膠模板。
(2)模板表面Teflon處理
把光刻膠模板置于甩涂機上(美國Micro Chem公司)，均勻滴加Teflon溶液， 200rpm 預(yù)轉(zhuǎn) 10s, 500rpm 轉(zhuǎn) 30s。
(3) 1Tef Ion 處理后熱烘
把Teflon處理后的光刻膠模板置于烘箱內(nèi)，180°C熱烘2小時，自然冷卻。
(4)蛋白抗體的噴點
兔抗人IgG抗體用PBS(IX)稀釋成lmg/ml，利用Biodot AD1500工作站進行蛋白 噴點，噴點陣列為3*3，間距0. 75mm,噴點量20nl。37°C適當(dāng)干燥。
(5) PDMS 澆鑄
PDMS前體與固化劑(牌號Sygard 184，美國道康寧公司的產(chǎn)品)按10 :1質(zhì)量 比進行物理混合，充分攪拌，真空脫氣20min后澆鑄在陽版模具上，90°C熱烘20min，自然冷卻。
(6)PDMS芯片鍵合與封閉
將PDMS芯片從模具上揭下，與潔凈玻片加壓鍵合。在芯片內(nèi)注入封閉液(IX PBS 含BSA，0. 1% Tween-20)，37°C濕盒內(nèi)孵育20min，取出后用IX PBS適當(dāng)沖洗就得到了 人IgG微流診斷芯片。
(7)夾心法檢測人IgG
將各濃度人IgG與熒光標記的山羊抗人IgG注入芯片，37°C濕盒內(nèi)孵育20min， PBST (含Tween-200. 1% )沖洗15min，PBS沖洗5min后在熒光顯微鏡下進行定量檢測，結(jié) 果如圖2所示。
本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體 的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于上述的實施例。
權(quán)利要求
1.一種微流診斷芯片的制備方法，包含在芯片模具表面定點固定生物大分子的步驟， 其特征在于，在所述定點固定步驟中，首先利用防粘涂料涂覆在芯片模具表面；再將生物大 分子溶液點樣于特定區(qū)域；然后澆鑄PDMS ；待PDMS澆注層固化后進行脫模，同時揭下所固 定的生物分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中芯片模具采用微機電加工中的硅深 刻蝕技術(shù)制作硅模具，或在基底片上旋涂光刻膠，通過光刻顯影后形成光刻膠模具；或通過 激光加工、精機械加工的方法制作金屬模具。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述防粘涂料為Teflon材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物大分子選自蛋白質(zhì)、核酸、脂類、 糖類中的一種或多種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，其中經(jīng)過防粘處理的芯片模具表面點樣 生物分子采用手工點樣，或機械點樣；所述點樣類型為接觸式點樣，半接觸式點樣或非接觸 點樣。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微流診斷芯片的制作方法，包含在芯片模具表面定點固定生物大分子的步驟，其特征在于在所述定點固定步驟中，首先利用防粘涂料涂覆在芯片模具表面；再將生物大分子溶液點樣于特定區(qū)域；然后澆鑄PDMS；待PDMS澆注層固化后進行脫模，同時揭下所固定的生物分子。如此，通過一步法實現(xiàn)芯片制備與生物分子固定的同步完成，快速高效地縮短工藝流程所需時間，降低了制造微流診斷芯片的成本。
文檔編號G01N33/543GK102033126SQ20091019667
公開日2011年4月27日 申請日期2009年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月28日
發(fā)明者周崇治, 夏駿, 彭志海, 陳翔 申請人:上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院