專利名稱：一種基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方 法。
背景技術(shù)：
炭疽是由炭疽芽孢桿菌(Baxcillus anthracis)引起的一種人獸共患傳染病，是 牧區(qū)食草動物的一種常見疾病。炭疽芽孢桿菌屬于蠟樣芽胞桿菌屬，主要可通過消化道、呼 吸道及皮膚接觸感染人和動物，具有高度致病性，特定條件下炭疽芽孢桿菌可以形成芽孢， 抵抗力強，在外環(huán)境中可存活數(shù)十年，此外由于炭疽芽孢桿菌易大批量生產(chǎn)、易施放、易擴 散，在軍事上一直被列為頭號生物戰(zhàn)劑。因此開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，對于監(jiān)控炭 疽的發(fā)生和生物恐怖襲擊均有重大意義。炭疽芽孢桿菌診斷根據(jù)實驗室檢查進(jìn)行，主要是靠涂片顯微鏡檢查、培養(yǎng)性狀、噬 菌體試驗等。目前國內(nèi)外均在研究開發(fā)一些更加快速和靈敏的檢測方法，主要有直接免疫 熒光法(DFA)和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。但這些方法步驟比較繁瑣，都需要特殊的儀器和試 劑，且操作人員需要具備相應(yīng)的技術(shù)素質(zhì)。免疫標(biāo)記技術(shù)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的新方法之一，而熒光免疫技術(shù)是其中發(fā)展最早 的一種，隨著熒光抗體標(biāo)記方法及熒光材料的改進(jìn)，熒光免疫技術(shù)在生物物種的超靈敏檢 測等方面得到了廣泛的應(yīng)用。但是傳統(tǒng)的熒光染料如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明等，由 于其激發(fā)光譜和發(fā)射光譜常有部分重疊，互相干擾嚴(yán)重，且對光不穩(wěn)定等缺點，從而限制了 其應(yīng)用范圍。熒光量子點是近年來出現(xiàn)的新型熒光標(biāo)記材料，因其特有的量子尺寸效應(yīng)和 表面效應(yīng)，具有光穩(wěn)定、激發(fā)光譜范圍寬、發(fā)射光譜范圍窄而對稱、stokes位移大、背景噪聲 小等特性，靈敏度和分辯率顯著提高，成為生物標(biāo)記方面的研究熱點，在微生物檢測等方面 有著誘人的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法，以克服公知 技術(shù)中的缺陷。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法，是以 熒光量子點作為標(biāo)記物，通過抗原抗體特異性反應(yīng)及生物素與親和素之間的結(jié)合作用，形 成熒光免疫復(fù)合物，即炭疽芽孢桿菌-炭疽芽孢桿菌抗體-生物素化的抗抗體-親和素化 的熒光量子點，最后采用激發(fā)光激發(fā)待測樣品，通過檢測熒光信號建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實現(xiàn)炭疽 芽孢桿菌的定量檢測。其主要步驟為1)先將炭疽芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌抗體進(jìn)行抗原抗體特異性反應(yīng)；2)加入生物素化的抗抗體進(jìn)行反應(yīng)；3)加入親和素化的熒光量子點進(jìn)行反應(yīng)，形成熒光免疫復(fù)合物；3
4)對熒光免疫復(fù)合物進(jìn)行檢測。上述步驟1、2、3中的反應(yīng)時間均為10 30分鐘，且每步反應(yīng)之后離心洗滌2 3次。上述步驟1、2、3均采用冷凍離心機進(jìn)行離心，用緩沖液洗滌，主要是用在于去除 未參加反應(yīng)的炭疽芽孢桿菌抗體、生物素化的抗抗體或親和素化的熒光量子點。上述步驟1中的炭疽芽孢桿菌抗體是炭疽桿菌單克隆抗體或者多克隆抗體。上述步驟2中的抗抗體是能與炭疽芽孢桿菌單克隆抗體或多克隆抗體特異性結(jié) 合的抗體。本發(fā)明提供的檢測炭疽芽孢桿菌的方法，無需對活菌進(jìn)行培養(yǎng)，具有操作簡便，特 異性好等優(yōu)點，在公共安全，防化反恐等領(lǐng)域具有重要實際意義。本發(fā)明方法不僅僅局限于 炭疽芽孢桿菌的檢測，也可應(yīng)用于其他細(xì)菌的特異性定量檢測。


圖1為基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的原理示意圖；圖中1-炭疽芽孢桿菌，2-炭疽芽孢桿菌抗體，3-抗抗體，4-生物素，5-熒光量子點， 6-親和素圖2為炭疽芽孢桿菌經(jīng)熒光量子點標(biāo)記后的熒光顯微鏡觀察圖；圖中A-明場； B-熒光。圖3為結(jié)合F4500熒光光度計對不同濃度炭疽芽孢桿菌的檢測結(jié)果。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合熒光量子點光穩(wěn)定、激發(fā)光譜范圍寬、發(fā)射光譜范圍窄而對稱、stokes 位移大、背景噪聲小等特性，提供一種基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法(請參閱 圖1所示)，以熒光量子點作為標(biāo)記物，通過抗原抗體特異性反應(yīng)及生物素與親和素之間的 結(jié)合作用，形成熒光免疫復(fù)合物，即炭疽芽孢桿菌-炭疽芽孢桿菌抗體-生物素化的抗抗 體-親和素化的熒光量子點，最后采用激發(fā)光激發(fā)待測樣品，通過檢測熒光信號建立標(biāo)準(zhǔn) 曲線，實現(xiàn)炭疽芽孢桿菌的定量檢測。本發(fā)明檢測炭疽芽孢桿菌的方法是一、先將炭疽芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌抗抗體反應(yīng)一定時間；二、再加入生物素化的抗體反應(yīng)一定時間；三、最后加入親和素化的熒光量子點反應(yīng)一定時間，經(jīng)過上述三步反應(yīng)形成最終 的熒光免疫復(fù)合物。上述的三步反應(yīng)中，每步反應(yīng)時間為10 30分鐘，每步反應(yīng)之后離心洗滌2 3次。所述的離心洗滌，是通過冷凍離心機對樣品離心，然后使用緩沖液洗滌，作用在于 去除未參加反應(yīng)的炭疽芽孢桿菌抗體、生物素化的抗抗體或親和素化的熒光量子點。所述的炭疽芽孢桿菌抗體，是炭疽桿菌單克隆抗體或者多克隆抗體。所述的抗抗體，是能與炭疽芽孢桿菌單克隆抗體或多克隆抗體特異性結(jié)合的抗 體。
本發(fā)明提供的方法，是通過抗原抗體特異性反應(yīng)及生物素與親和素之間的結(jié)合作 用，形成熒光免疫復(fù)合物，將熒光量子點標(biāo)記在炭疽芽孢桿菌上，經(jīng)離心去除未連接的炭疽 芽孢桿菌抗體、生物素化的抗抗體或親和素化的熒光量子點，最后通過激發(fā)光激發(fā)熒光量 子點檢測熒光信號，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，便可定量檢測炭疽芽孢桿菌。下面以高壓滅活的炭疽芽孢桿菌為具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步描述。實施例1 熒光量子點標(biāo)記炭疽桿菌方法和熒光顯微觀察1)取高壓滅活的炭疽芽孢桿菌待測樣品100 μ L ；2)向待測樣品中加入5 μ L濃度為lmg/mL的炭疽芽孢桿菌抗體溶液，37°C下振蕩 孵育30min后，離心洗滌2次；3)向上述溶液中加入5μ L稀釋比例為1 50的生物素化的抗抗體，37°C下振蕩 孵育30min后，離心洗滌2次；4)向上述溶液中加入5 μ L濃度為20nmol/L的親和素化的熒光量子點，37°C下振 蕩孵育30min后，離心洗滌2次；5)在顯微鏡下使用紫外光激發(fā)樣品，觀察拍攝熒光圖像，進(jìn)行分析處理。圖2為拍 攝到的炭疽芽孢桿菌在顯微鏡下的明場和暗場對比圖。如圖2所示，熒光圖像清晰明亮，可以清晰地分辨經(jīng)熒光量子點標(biāo)記的炭疽芽孢 桿菌，從而實現(xiàn)對炭疽芽孢桿菌的檢測。實施例2 利用F4500熒光分光光度計對炭疽桿菌進(jìn)行定量檢測1)取高壓滅活的炭疽芽孢桿菌待測樣品100 μ L ；2)向待測樣品中加入5μ L濃度為0. lmg/mL的炭疽芽孢桿菌抗體溶液，37°C下振 蕩孵育30min后，離心洗滌2次；3)向上述溶液中加入5μ L稀釋比例為1 20的生物素化的抗抗體，37°C下振蕩 孵育30min后，離心洗滌2次；4)向上述溶液中加入5 μ L濃度為40nmol/L的親和素化的熒光量子點，37°C下振 蕩孵育30min后，離心洗滌2次；5)取100 μ L待測樣品加入熒光比色皿中，利用F4500熒光分光光度計對樣品進(jìn)行 激發(fā)，檢測熒光信號。圖3為利用F4500檢測結(jié)果建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以看出，F(xiàn)4500檢測 到的熒光信號與炭疽芽孢桿菌濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
權(quán)利要求
1.一種基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法，其主要步驟為1)先將炭疽芽孢桿菌和炭疽芽孢桿菌抗體進(jìn)行抗原抗體特異性反應(yīng)；2)在步驟1中加入生物素化的抗抗體進(jìn)行反應(yīng)；3)在步驟2中加入親和素化的熒光量子點進(jìn)行反應(yīng)，形成熒光免疫復(fù)合物；4)對熒光免疫復(fù)合物激發(fā)，檢測熒光強度。
2.如權(quán)利要求1所述基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法，其中，步驟1、2、3中的 反應(yīng)時間均為10 30分鐘，且每步反應(yīng)之后離心洗滌2 3次。
3.如權(quán)利要求2所述基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法，其中，步驟1、2、3均采 用冷凍離心機進(jìn)行離心，用緩沖液洗滌。
4.如權(quán)利要求1所述基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法，其中，步驟1中的炭疽 芽孢桿菌抗體是炭疽桿菌單克隆抗體或者多克隆抗體。
5.如權(quán)利要求1所述基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法，其中，步驟2中的抗抗 體是能與炭疽芽孢桿菌單克隆抗體或多克隆抗體特異性結(jié)合的抗體。
6.如權(quán)利要求1所述基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法，其中，步驟3中的熒光 量子點是由II-VI族元素組成的納米顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于熒光量子點檢測炭疽芽孢桿菌的方法，是先通過抗原抗體反應(yīng)來特異性捕獲樣品中的待測菌，再利用生物素與親和素之間的結(jié)合力，將熒光量子點標(biāo)記到待測菌上形成熒光免疫復(fù)合物，然后在激發(fā)光的作用下檢測熒光信號，通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，實現(xiàn)炭疽芽孢桿菌的定量檢測。該方法克服了傳統(tǒng)和現(xiàn)代方法中的不足，具有靈敏度高、特異性好、操作簡便的優(yōu)點，能在2小時內(nèi)完成對炭疽芽孢桿菌的快速檢測。
文檔編號G01N33/531GK102053156SQ20091023671
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月28日
發(fā)明者劉軍濤, 劉春秀, 劉曉紅, 田青, 羅金平, 蔡新霞 申請人:中國科學(xué)院電子學(xué)研究所