人源抗炭疽保護性抗原PA的抗體IgG及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于單克隆抗體藥物技術領域，涉及一種抗炭疽保護性抗原的全分子人源 單克隆抗體及其被編碼的DNA分子、包含該DNA分子的表達載體、含有該表達載體的宿主細 胞，以及該全分子人源單克隆抗體在制備炭疽治療或預防性藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 炭疽病是一種由炭疽芽孢桿菌引起的人畜共患的急性烈性傳染病，牛、羊等食草 動物的發(fā)病率最高，人可通過接觸患炭疽的動物及其畜產(chǎn)品或通過存在于空氣、土壤中的 炭疽桿菌芽胞而被感染。炭疽桿菌具有高度致病性、其芽胞在惡劣環(huán)境中有較強的生存能 力.可通過氣溶膠途徑感染，在世界范圍內(nèi)廣泛分布等特點，臨床上依據(jù)感染途徑不同將 炭疽分為3型，即皮膚炭疽、吸入性炭疽和消化道炭疽。吸入性炭疽，叉稱肺炭疽，其致死 率接近1〇〇%。炭疽芽孢桿菌在血液中可產(chǎn)生并釋放三種蛋白：保護性抗原（protective antigen，PA)、致死因子（lethal factor，LF)、水腫因子（edema factor，EF)。實驗證實， 炭疽毒素是一種AB (active-binding)的模式。PA是復合物中的"B"，與細胞膜上的炭疽毒 素受體（2型毛細血管形成蛋白CMG2或腫瘤肉皮細胞標志8TEM8)結合，由位于細胞膜上的 Furin蛋白酶切除其氨基端20kD片段PA20,余下的63kD片段（PA63)發(fā)生寡聚化，在膜上 形成七聚體（(PA63) 7)。LF和EF是"A"，能夠結合七聚體形成的復合物通過受體介導的內(nèi) 吞進入細胞。在內(nèi)吞小體酸性pH的環(huán)境下，PA七聚體發(fā)生構象改變，形成一個管道，使EF 和LF進入細胞液，分別發(fā)揮毒性作用。這三種蛋白本身是無毒的，但PA和LF的混合物稱為 致死毒素，PA和EF的混合物稱為水腫毒素。在體外實驗研宄中，單純使用高純度的致死毒 素或水腫毒素可以使動物死亡。通過阻斷PA與受體結合或是與LF及EF，以及影響其寡聚 化，都可以有效防止炭疽毒素的致病作用。而且PA能誘導機體的保護性免疫，是目前唯一 獲美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的人用炭疽吸附疫苗（anthrax vaccine absorbed，AVA) 的主要活性成分。因此，保護性抗原PA是炭疽病治療的理想靶點。
[0003] 炭疽的醫(yī)學防護措施主要有預防和治療二大方面。目前，有效的預防措施主要是 接種炭疽疫苗，接觸前1-2個月進行預防接種，能為人群提供免疫防護。有效的治療措施主 要有二大類：一類是根據(jù)炭疽病理模型設計的毒素抑制劑，主要包括炭疽毒素的中和抗體、 可溶性受體、毒素突變體和小分子拮抗劑；另一類是炭疽桿菌的抑菌劑和殺菌劑，其中包括 抗菌素和噬菌體的溶菌成分?？咕刂委熤饕柑烤腋腥緯r高劑量靜脈注射和口服抗生素 以對炭疽桿菌產(chǎn)生殺傷作用，例如青霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)霉素、紅霉素、和萬古霉素等，但 對于已釋放的毒素是沒有效果的，而且目前已發(fā)現(xiàn)具抗藥性的菌株。
[0004] 國內(nèi)外的研宄表明，在暴露于炭疽芽孢之前使用抗PA抗體，能夠起到預防炭疽感 染保護機體的作用。而且，在孢子攻毒后一定時間給藥（24_48h)仍能起到保護作用，即使 是在出現(xiàn)體征后給藥也可以起到一定的治療作用。因此，進行人源炭疽抗體的研宄顯得尤 為重要和迫切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 鑒于現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種抗炭疽保護性抗原的全分子人 源單克隆抗體及其被編碼的DNA分子、包含該DNA分子的表達載體、含有該表達載體的宿主 細胞，以及該全分子人源單克隆抗體在制備炭疽治療或預防性藥物中的應用。
[0006] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明人通過大量試驗研宄和不懈探索，最終采用 噬菌體抗體庫技術篩選到了對炭疽保護性抗原PA具有高度親和力的人源Fab抗體，并獲取 了賦予所述抗體優(yōu)異特性的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列和核苷酸序列，并將所述抗體 的重鏈和輕鏈可變區(qū)與含有抗體恒定區(qū)的表達載體連接，最終獲得了具有特異的抗原結合 性、優(yōu)異的毒素中和活性以及良好的動物保護功能的全分子人源抗體。
[0007] 具體地，本發(fā)明第一方面提供了如下全分子人源單克隆抗體的技術方案：
[0008] 一種抗炭疽保護性抗原的全分子人源單克隆抗體，包含重鏈可變區(qū)、恒定區(qū)，和輕 鏈可變區(qū)、恒定區(qū)，其中：
[0009] (1)所述的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，或者是該序列經(jīng)一個或 多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；
[0010] 且（2)所述的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示，或者是該序列經(jīng)一 個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0011] 需要說明的是，該抗體的重鏈可變區(qū)區(qū)和輕鏈可變區(qū)均為人源抗體，并將其與人 源抗體的恒定區(qū)連接，因此稱之為全分子人源抗體。
[0012] 進一步優(yōu)選地，如上所述的全分子人源單克隆抗體，其中：
[0013] (1)所述的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示，或者是該序列經(jīng)一個或 多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體；
[0014] 且⑵所述的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID NO. 8所示，或者是該序列經(jīng)一 個或多個氨基酸添加、刪除、替換、修飾的保守性突變而獲得的保守性變異體。
[0015] 本發(fā)明第二方面提供一種DNA分子，其編碼上述的全分子人源單克隆抗體的至少 如下一個區(qū)域：重鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)、輕鏈可變區(qū)、輕鏈恒定區(qū)。
[0016] 進一步優(yōu)選地，如上所述的DNA分子，其編碼重鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQID NO. 1所示，編碼輕鏈可變區(qū)的核酸序列為SEQIDNO. 3所示。
[0017] 再進一步優(yōu)選地，如上所述的DNA分子，其編碼重鏈恒定區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO. 5所示，編碼輕鏈恒定區(qū)的核酸序列為SEQ ID NO. 7所示。
[0018] 本發(fā)明第三方面提供一種表達載體，該表達載體中包含有上述的任意一種DNA分 子。所述載體優(yōu)選為抗體IgGl亞型分泌型真核表達載體。比如，在一個最優(yōu)選的實施例中， 本發(fā)明提供的IgG質(zhì)粒表達載體為pFUSE-CHIg-hGl和pFUSE-CLIg-hk，其包含人源IgGl亞 型的重鏈和輕鏈（Kappa)的恒定區(qū)核苷酸序列，編碼重鏈恒定區(qū)的具體核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，編碼輕鏈恒定區(qū)的具體核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0019] 本發(fā)明第四方面提供一種含有上述表達載體的宿主細胞，宿主細胞為 FreeStyle?293_F cells。
[0020] 由于本發(fā)明提供的全分子人源單克隆抗體可以作為藥物分子特異性識別和結合 炭疽保護性抗原PA，從而抑制PA裝配或與細胞結合來發(fā)揮作用，預防炭疽感染或者治療炭 疽感染性疾病。因此，本發(fā)明第五方面還提供了上述全分子人源單克隆抗體在制備預防或 治療炭疽病的藥物中的應用，以及提供了一種以該全分子人源單克隆抗體為活性成分的預 防或治療炭疽病的藥物組合物。
[0021] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供了一種具有高保護性、高特異性、良好親和力的抗PA 的全分子人源單克隆抗體（IgG-PA21)。對該全分子人源抗體PA21做功能鑒定，結果顯示該 全分子人源抗體能夠與炭疽保護性抗原PA特異性結合；體外細胞中和實驗結果證實，人源 抗PA抗體能夠有效的阻斷炭疽毒素的致病作用。以Fischer344大鼠為模型，體內(nèi)試驗證 實PA21抗體在毒素給予前或是毒素給予后一定時間內(nèi)都具有良好的保護效果。PA是炭疽 芽孢桿菌在血液中釋放的蛋白，因此本發(fā)明的單克隆抗體可應用于有關炭疽病的診斷、治 療及預防工作中。
【附圖說明】
[0022] 圖1為純化IgG抗體PA21的SDS-PAGE檢測結果，M，marker ;1，PA21抗體；2,細 胞培養(yǎng)上清；3,流穿；可見純化的抗體純度很高，且用Pro. A柱純化效果較好；
[0023] 圖2為IgG抗體PA21的酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測結果，可見PA21抗體與PA83蛋白 的結合能力較強；
[0024] 圖3為IgG抗體PA21與減毒株來源的抗原免疫印跡鑒定結果，M，marker ;1，減毒 株裂解上清；2,炭疽無關蛋白表