專利名稱：用于靶向k63連接的多聚遍在蛋白的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗多聚遍在蛋白(polyubiquitin)抗體領(lǐng)域，更具體的說就是不特異 性結(jié)合單遍在蛋白(monoubiquitin)的及能區(qū)分具有不同異肽鍵(isop印tide linkage) 的多聚遍在蛋白的抗多聚遍在蛋白抗體。
背景技術(shù)：
遍在蛋白(ubiquitin)是一種在諸多細(xì)胞途徑中具有重要調(diào)節(jié)作用的小蛋白質(zhì)。 這些作用中最為人所共知的是遍在蛋白在蛋白降解中的作用，在此遍在蛋白與靶蛋白共價(jià) 連接，使得靶蛋白為26S蛋白酶體識(shí)別并受之破壞(參見Wilkinson，Semin. Cell Devel. Biol. 11(3) 141-148 (2000))。不同信號(hào)傳導(dǎo)途徑的蛋白激酶調(diào)節(jié)也與遍在蛋白化作用 有關(guān)(參見 Sun 和 Chen, Curr. Opin. CellBiol. 16 119-126 (2004))。例如，經(jīng) I κ B 激酶 的I κ B磷酸化作用使I κ B的遍在蛋白化作用得以可能，并隨后通過26S蛋白酶體而降 解；由于IkB是NFkB的抑制劑，因此I κ B的降解激活了 NF κ B (Ghosh和Karin，Cell 109(Suppl.) :S81-S96(2002) ；Palombella 等，Cell 78 :773_785 (1994))。遍在蛋白化作用 還介導(dǎo) DNA 修復(fù)(參見 Sun 和 Chen，Curr. Opin. Cell Biol. 16 119-126 (2004))。在 DNA 損傷后，增殖細(xì)胞核抗原的(PCNA)單遍在蛋白化作用激活了不論任何DNA損傷都能合成 DNA的耐損傷聚合酶(Stelter和Ulrich，Nature 425:188-191(2003)。其它其中已知涉 及遍在蛋白化作用的生理過程包括細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞凋亡/細(xì)胞死亡 (Johnson, Nat. Cell Biol. 4 :E295_E298 (2002) ；Pickart, Mol. Cell. 8 :499_504 (2001))。遍在蛋白(一種76個(gè)氨基酸的蛋白)與靶蛋白的共價(jià)連接是一種三步酶促過程 (Pickart, Annu. Rev. Biochem. 70 :503_533 (2001))。首先，在 ATP-依賴性反應(yīng)中遍在蛋白 激活酶El形成遍在蛋白-El硫酯。在第二步中，遍在蛋白由遍在蛋白-El硫酯轉(zhuǎn)移至遍 在蛋白蛋白偶聯(lián)酶(E2)家族的的成員。在第三步中，在遍在蛋白蛋白連接酶(E3)的幫助 下，在遍在蛋白羧基末端和靶蛋白上賴氨酸殘基的ε_(tái)氨基之間形成異肽鍵。稱為去遍在 蛋白酶的酶類從靶蛋白上將遍在蛋白部分除去(Guterman和Glickman，Curr. Prot. P印. Sci. 5 =201-210(2004)) 0遍在蛋白的突出作用在于作為重要的調(diào)節(jié)分子，人基因組含有許 多涉及遍在蛋白化作用或去遍在蛋白化作用的不同蛋白迄今為止已鑒定了至少40種不 同的E2、500種不同的E3和80種不同的去遍在蛋白酶(Wong等，Drug. Discov. Today 8 746-754(2003))。遍在蛋白含有7 個(gè)賴氨酸殘基(Lys6、Lysl 1、Lys27、Lys33、Lys29、Lys48 和Lys63)，因此遍在蛋白自身可作為靶蛋白用于遍在蛋白化作用(Peng等，Nat. Biotechnol.21 921-926 (2003) ；Pickart 禾口 Fushman， Curr.Opin.Chem. Biol. 8 610-616(2004))。遍在蛋白蛋白的遍在蛋白化作用后所產(chǎn)生的分子稱為多聚遍在蛋白分 子，并可包含兩個(gè)或更多個(gè)遍在蛋白部分。理論上，遍在蛋白的遍在蛋白化作用可在7個(gè)賴 氨酸殘基中任何一個(gè)上發(fā)生(Peng等，Nat. Biotechnol. 21 :921_926 (2003))，以致存在具 有異肽鍵合至遍在蛋白內(nèi)不同賴氨酸殘基的不同種類的多聚遍在蛋白。有可能具有多于 兩個(gè)遍在蛋白部分的單個(gè)多聚遍在蛋白分子可具有多于一種的賴氨酸鍵。已有研究表明E2酶影響一個(gè)遍在蛋白分子與另一個(gè)遍在蛋白分子之間所形成的賴氨酸鍵的類型(Termo 等，Genes to Cells 9:865-875(2004) ；Deng 等(2000) ；Hofmann 和 Pickart (2001))。多 聚遍在蛋白和遍在蛋白都能作為游離分子以及與靶蛋白共價(jià)連接的形式存在。像遍在蛋白一樣，已在許多細(xì)胞過程中發(fā)現(xiàn)涉及多聚遍在蛋白，這些過程包括 細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)吞作用、基因表達(dá)/沉默、蛋白水解、激酶激活作用、翻譯和DNA修復(fù) (Hoege 等，Nature 419 135-141 (2002) ；Spence 等，Mol. Cell. Biol. 15 :1265_1273 (1995)； Hofmann和Pickart，Cell 96:645-653(1999)。然而，在相同途徑中與單遍在蛋白和單 遍在蛋白化作用相比，多聚遍在蛋白和多聚遍在蛋白化作用可具有顯著不同的生理學(xué)作 用。例如，當(dāng)在DNA損傷后PCNA的單遍在蛋白化作用導(dǎo)致易錯(cuò)DNA聚合酶激活時(shí)，在 與單遍在蛋白化作用相同殘基處的PCNA的多聚遍在蛋白化作用則被觀察到能導(dǎo)致易 錯(cuò) DNA 修復(fù)的激活(Stelter 和 Ulrich，Nature 425 188-191 (2003) ；Hoege 等，Nature 419:135-141(2002) ；Spence 等，Mol. Cell. Biol. 15 :1265_1273 (1995)；以及 Hofmann 和 Pickart, Cell 96 :645_653(1999))。甚至連具有不同賴氨酸鍵的多聚遍在蛋白都顯示具有不同的生理學(xué)作用。得 到最多研究的兩種多聚遍在蛋白是Lys48連接的和Lys63連接的多聚遍在蛋白，對(duì)這兩 種多聚遍在蛋白的結(jié)構(gòu)研究提出不同賴氨酸連接的多聚遍在蛋白可采用明顯不同的構(gòu) 象，由此容許與所選擇的結(jié)合伴侶具有不同的相互作用(Termo等，Genes to Cells 9 865-875 (2004))。雖然通過Lys48連接的多聚遍在蛋白的共價(jià)修飾通常標(biāo)志著靶蛋白能 蛋白水解降解，但是存在著一些證據(jù)證明Lys48連接的多聚遍在蛋白還可通過非蛋白水 解方式調(diào)節(jié)某些蛋白(Chau 等，Science 243 1576-1583 (1989) ；Finley 等，Mol. Cell. Biol. 14 5501-5509(1994) ；Flick 等，Nat. Cell. Biol. 6 :634_641 (2004))。與此相反， Lys63連接的多聚遍在蛋白已與多種非蛋白水解的細(xì)胞內(nèi)途徑相關(guān)，包括DNA修復(fù)(表 達(dá)K63R-遍在蛋白的酵母細(xì)胞是DNA修復(fù)缺陷型的)、激酶激活作用、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸和翻 譯(Pickart 禾口 Fushman，Curr.Opin. Chem. Biol. 8 610-616(2004) ；Hicke 禾口 Dunn，Annu Rev. Cell Dev. Biol. 19 141-172 (2003) ；Spece 等，Mol. Cell Biol. 15 1265-1273 (1995)； Ulrich, Eukaryot. Cell 1 1-10(2002) ；Spence 等，Celll02 67-76(2000) ；Seibenhener 等，Mol. Cell. Biol. 24(18) =8055-8068 (2004)) 在一個(gè)特定的例子中，以不依賴于蛋 白酶體的方式通過parkin，synphilin-1為K63連接的多聚遍在蛋白所正常地遍在蛋白 化，但synphilin-Ι亦可為K48連接的多聚遍在蛋白的遍在蛋白化作用所靶向破壞(Lim 等，J. Neurosci. 25(8) :2002_9 (2005))。一項(xiàng)對(duì)患有帕金森氏病的受試者的分析顯示 synphilin-Ι的K63-多聚遍在蛋白化作用可能涉及與疾病相關(guān)的Lewy包涵小體(Lewy body inclusion)的形成(Lim 等，J. Neurosci. 25 (8) :2002_9 (2005))。其它的賴氨酸連接的多聚遍在蛋白還未得到詳盡、廣泛的研究，原因在于它們之 間難以區(qū)分。迄今為止，研究依賴于表達(dá)其中一個(gè)或多個(gè)賴氨酸已除去的經(jīng)過誘變的遍在 蛋白的細(xì)胞、酶促合成的具有特定鍵合的多聚遍在蛋白或用于區(qū)分一種類型和另一種類型 的多聚遍在蛋白的諸如質(zhì)譜法的技術(shù)。對(duì)于分析特定賴氨酸連接的多聚遍在蛋白的正常生 理學(xué)行為來說，上述那些方法中任何一種都不適合或麻煩重重。雖然存在與單遍在蛋白相 比特異于多聚遍在蛋白的抗體(Fujimoro等，F(xiàn)EBS Lett. 349 173-180 (1994))，但至今為 止仍然沒有能區(qū)分具有不同賴氨酸鍵的多聚遍在蛋白的抗體。
并不令人吃驚的是，由于已知它們?cè)谥T多細(xì)胞過程中的重要作用，因此遍 在蛋白和多聚遍在蛋白還與許多疾病有關(guān)(參見Argiles，Ubiquitin andDisease， R. G. Landes (1998))。在肌肉萎縮中觀察到遍在蛋白失調(diào)(Mitch和Goldberg，New Engl. J. Med. 335 1897-905 (1996) ；Bodine 等，Science 294:1704-1708(2001))。 已 將一些遺傳性疾病與異常的遍在蛋白活性相關(guān)聯(lián)，包括囊性纖維化(Ward等，Cell 83 121-127 (1995)), Angelman' s 綜合征(Kishino 等，Nature Genet. 15 70-73 (1997))和利 德爾綜合征(Staub等，EMBO J 16:6325-6336(1997))。在免疫和炎癥應(yīng)答中遍在蛋白還 起作用；例如，已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外遍在蛋白作為一種細(xì)胞因子抑制了 TNF α對(duì)外周血單核細(xì)胞 中內(nèi)毒素的應(yīng)答，并調(diào)節(jié)內(nèi)毒素低反應(yīng)性(Majetschak等，Blood 101 1882-1890 (2003)； Ciechanover, EMBO J 17:7151-7160(1998))。同樣地，已發(fā)現(xiàn)在人血清中具有遍在蛋白和 多聚遍在蛋白，在具有寄生蟲病和變應(yīng)性疾病的患者血清中觀察到這兩種分子具有較高的 水平(Takada 等，Clinical Chem. 43 1188-1195 (1997))。一些遍在蛋白介導(dǎo)的途徑的失調(diào)還涉及癌癥(Spataro等，Br. J. Cancer77 448-55(1998) ；Beckmann 等，Hum. Mutat. 25 :507_12 (2005))。例如，異 二聚遍在蛋白 連接酶BRCAI-BARDl中的突變就與乳腺癌相關(guān)(Hashizume等，J. Biol. Chem. 276 14537-40 (2001))，破壞Myc要被遍在蛋白途徑所降解的能力的突變激活了 c-Myc的致癌 潛力(Salghetti等，EMBO J. 18 :717_726 (1999))，并且轉(zhuǎn)化的v-Jun無法被遍在蛋白化 并降解為其非致癌的相關(guān)物c-Jim，由此導(dǎo)致不受控制的生長(zhǎng)(Ciechanover，EMBO J. 17 7151-7160(1998) ；Trier 等，Cell 78:787-798(1994))。在上下文的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中已詳盡地研究了遍在蛋白和多聚遍在蛋白(Chung 等，TINS 24(llSuppl.)S7-S14(2001))。積聚在亨廷頓病、脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、朊病 毒腦病、皮克病、Lewy小體病、帕金森氏病和阿爾茨海默氏病中的包涵物、小體以及神經(jīng) 原纖維纏結(jié)對(duì)單遍在蛋白和/或多聚遍在蛋白是免疫染色陽性(Alves-Rodrigues等， Trends Neurosci. 21 516-520(1998) ；Cammarata φ, Neurosci Lett. 156 96-98(1993)； Kalchman 等，J. Biol. Chem. 271 19385-94 (1996) ；Holmberg 等，Human Mol. Genet. 7 913-918 (1998) ；Yedidia EMBO J. 20 5383-91 (2001) ；Mori Science 235 1641-44(1987) ；Leigh 等，Acta Neuropathol. (Berl.)79 :61_72(1989)；和 Kuzuhara 等，Acta Neuropathologica 75:345-353(1988))。雖然已將一些類型的帕金森氏病與 遍在蛋白羧基末端水解酶Ll (UCH-Ll)基因、去遍在蛋白酶中的突變相關(guān)聯(lián)(Leroy等， Nature 395 :451_452 (1998))，但是其它類型的帕金森氏病卻與Parkin (—種已知與遍在 蛋白偶聯(lián)酶UbcH7相互作用并遍在蛋白化synphilin-Ι的E2-依賴性遍在蛋白蛋白連接 酶)中失活突變相關(guān)聯(lián)(Shimura 等，NatureGenet. 25 302-305 (2000)，Zhang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. 97 13354-13359 (2000) ；Lim 等，J. Neurosci. 25 (8) :2002_9 (2005))。這 兩種類型的突變都導(dǎo)致異常的蛋白水解加工和不適當(dāng)?shù)牡鞍追e聚(參見McNaught等， Nature Rev. Neurosci. 2 :589_594(2001))。還已發(fā)現(xiàn)UCH-L1突變與亨廷頓病是孤立的 (Naze等，Neurosci. Lett. 328 1 1-4 (2002)) 已鑒定了阿爾茨海默氏病人腦中的遍在 蛋白突變體，其非常有效地?fù)饺攵嗑郾樵诘鞍祖溨?，但一旦形成就很難被去遍在蛋白化， 潛在地導(dǎo)致正常細(xì)胞蛋白水解加工系統(tǒng)的突出抑制(Lam等，Proc. Natl. Acad. Sci. 97 9902-9906(2000))ο
顯然不但擁有能區(qū)分具有不同賴氨酸鍵的多聚遍在蛋白的組合物和方法，而且擁 有能有效地靶向并調(diào)節(jié)遍在蛋白和多聚遍在蛋白介導(dǎo)的途徑的組合物和方法應(yīng)當(dāng)是有益 的。在此提供的本發(fā)明涉及上述組合物和方法。所有在此引用的包括專利申請(qǐng)和出版物在內(nèi)的參考文獻(xiàn)以其全文并入作為參考。發(fā)明概述本發(fā)明提供能夠結(jié)合多聚遍在蛋白和/或調(diào)節(jié)與多聚遍在蛋白有關(guān)的生物學(xué)活 性的新抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白的分離 的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體不特異性結(jié)合K48連接的多聚遍在蛋白或單遍在蛋 白。一方面，本發(fā)明提供一種分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO 59-110 和 112 任一之 HVR-H2 和 SEQID NO :7_58 和 111 任一之 HVR-L2 的高變(HVR)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白的分 離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合K48連接的多聚遍在 蛋白或單遍在蛋白，其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)HVR-H2序列，其中HVR-H2包 含氨基酸序列a bcdefghijklmno p(SEQ ID NO :221)，且其中氨基酸a選自氨 基酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是異亮氨酸；氨基酸c選自氨基酸絲氨酸、蘇氨 酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和纈氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基酸e是酪氨酸；氨基酸f 選自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和組氨酸；氨基酸g是甘氨酸；氨基酸h選自氨基酸 絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是蘇氨酸；氨基酸j是絲氨酸；氨基 酸k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸η是絲氨酸；氨基酸ο是 纈氨酸；而氨基酸P是賴氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合Κ63連接的多聚遍在蛋白的分 離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體不特異性結(jié)合Κ48連接的多聚遍在蛋白或單遍在蛋 白，且其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)選自SEQ ID Ν0:59-110和112之HVR-H2 序列的HVR-H2序列。一方面，該抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO :60、63、 和66之HVR-H2序列的HVR-H2序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合Κ63連接的多聚遍在蛋白的分 離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合Κ48連接的多聚遍在 蛋白或單遍在蛋白，且其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)HVR-L2序列，其中HVR-L2 包含氨基酸序列q r s t u ν w x(SEQID NO :222)，其中氨基酸q選自氨基酸酪氨酸和苯丙 氨酸；氨基酸r選自氨基酸丙氨酸和絲氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t(yī)選自氨基酸絲氨 酸、精氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是絲氨酸；氨基酸ν是 亮氨酸；氨基酸w是酪氨酸；而氨基酸χ是絲氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白的分 離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合K48連接的多聚遍在 蛋白或單遍在蛋白，且其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)選自SEQ ID N0:7-58和 111之HVR-L2序列的HVR-L2序列。一方面，該抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO :8、11、和 14 之 HVR-L2 序列的 HVR-L2 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白的分
9離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合K48連接的多聚遍在 蛋白或單遍在蛋白，其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)選自HVR-H2和HVR-L2的序 列，其中 HVR-H2 包含氨基酸序列 a b cd e fg h i j k 1 m η ο ρ (SEQ ID Ν0:221)，其中 氨基酸a選自氨基酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是異亮氨酸；氨基酸c選自氨基 酸絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和纈氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基酸e是酪 氨酸；氨基酸f選自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和組氨酸；氨基酸g是甘氨酸；氨基 酸h選自氨基酸絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是蘇氨酸；氨基酸j 是絲氨酸；氨基酸k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸η是絲氨 酸；氨基酸ο是纈氨酸；而氨基酸ρ是賴氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列q r s t u ν w χ (SEQ ID NO :222)，其中氨基酸q選自氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸；氨基酸r選自氨基酸丙 氨酸和絲氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t(yī)選自氨基酸絲氨酸、精氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、 丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是絲氨酸；氨基酸ν是亮氨酸；氨基酸w是酪氨酸； 而氨基酸χ是絲氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白的分 離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合K48連接的多聚遍 在蛋白或單遍在蛋白，其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)HVR-H2序列和至少一個(gè) HVR-L2 序列，其中 HVR-H2 包含氨基酸序列 a bcdefghijklmno ρ (SEQ ID NO: 221)，其中氨基酸a選自氨基酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是異亮氨酸；氨基酸c 選自氨基酸絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和纈氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基 酸e是酪氨酸；氨基酸f選自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和組氨酸；氨基酸g是甘氨 酸；氨基酸h選自氨基酸絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是蘇氨酸； 氨基酸j是絲氨酸；氨基酸k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸 η是絲氨酸；氨基酸ο是纈氨酸；而氨基酸P是賴氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列q r stuvw χ (SEQ ID NO :222)，其中氨基酸q選自氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸；氨基酸r選自 氨基酸丙氨酸和絲氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t(yī)選自氨基酸絲氨酸、精氨酸、纈氨酸、 蘇氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是絲氨酸；氨基酸ν是亮氨酸；氨基酸w是 酪氨酸；而氨基酸χ是絲氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白的分 離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合K48連接的多聚遍在 蛋白或單遍在蛋白，其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)選自SEQ ID N0:59-110和 112之HVR-H2序列的HVR-H2序列和至少一個(gè)選自SEQ ID NO :7_58和111之HVR-L2序列 的HVR-L2序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白的分 離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合K48連接的多聚遍在 蛋白或單遍在蛋白，其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)選自SEQ ID N0:60、63、和66 之HVR-H2序列的HVR-H2序列和至少一個(gè)選自SEQ ID NO :8、11、和14之HVR-L2序列的 HVR-L2 序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種特異性結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白的分 離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合K48連接的多聚遍在蛋白或單遍在蛋白，其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含選自表B中Apu3. A8-Apu3. HlO任一所 列HVR-H2和HVR-L2氨基酸序列的HVR氨基酸序列。一方面，該HVR氨基酸序列選自表B 中 Apu3. A8、Apu3. A12、和 Apu3. B3 任一所列 HVR-H2 和 HVR-L2 氨基酸序列。一方面，任何上述抗體或抗原結(jié)合片段包含至少一個(gè)選自SEQ ID NO :5之HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-Ll 序列和 SEQ ID NO 4 之 HVR-L3 序列的HVR序列。另一方面，任何上述抗體或抗原結(jié)合片段包含至少兩個(gè)選自SEQ ID NO 5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-L 1 序列和 SEQ ID NO 4之HVR-L3序列的HVR序列。另一方面，任何上述抗體或抗原結(jié)合片段包含至少三個(gè)選自 SEQ ID NO :5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO :3 之 HVR-Ll 序列 和SEQ ID N0:4之HVR-L3序列的HVR序列。另一方面，任何上述抗體或抗原結(jié)合片段包含 SEQ ID NO :5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO :3 之 HVR-Ll 序列 和 SEQ ID NO 4 之 HVR-L3 序列。一方面，任何上述抗體或抗原結(jié)合片段具有相對(duì)于親本Fab Apu2. 16對(duì)K63連接 的多聚遍在蛋白的親和力有改善的對(duì)K63連接的多聚遍在蛋白的親和力。另一方面，任何 上述抗體或抗原結(jié)合片段具有小于或等于IOnM的對(duì)K63連接的多聚遍在蛋白的Kd值。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種與任何上述抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合多聚 遍在蛋白上相同抗原決定簇的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不 特異性結(jié)合單遍在蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種與任何上述抗體或抗原結(jié) 合片段競(jìng)爭(zhēng)對(duì)多聚遍在蛋白的結(jié)合的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合 片段不特異性結(jié)合單遍在蛋白。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白中表位的分 離的抗體或抗原結(jié)合片段。一方面，該表位包括K63連接的多聚遍在蛋白的第一遍在蛋 白亞基和第二遍在蛋白亞基二者中的殘基。另一方面，該表位包括至少一個(gè)選自Glu-18、 Pro-19、Ser-20、Asp-21、Thr-55、Leu-56、Ser-57、Asp-58、Asn-60、Ile-61、禾口 Gln-62 的 第一遍在蛋白亞基中的殘基。另一方面，該表位包括至少一個(gè)選自Leu-8、Thr-9、Glu_34、 Gly-35、Ile-36、Pro-37、Asp-39、Gln-40、Leu-71、Arg-72、Leu-73、Arg-74、和 Gly-75 的第 二遍在蛋白亞基中的殘基。另一方面，該表位包括至少一個(gè)選自Glu-18、Pro-19、Ser-20, Asp-21、Thr-55、Leu-56, Ser-57, Asp-58、Asn-60、Ile-61、和 Gln-62 的第一遍在蛋白亞基 中的殘基，和至少一個(gè)選自 Leu-8、Thr-9、Glu-34、Gly-35、Ile-36、Pro-37、Asp-39、Gln-40、 Leu-71、Arg-72、Leu-73、Arg-74、和Gly-75的第二遍在蛋白亞基中的殘基。另一方面， HVRH3的N端部分接觸來自供體遍在蛋白的C端殘基和Q40。另一方面，HVRH3的遠(yuǎn)端部分 接觸K63-受體遍在蛋白的50s環(huán)。在另一個(gè)這樣的方面，HVRH3的N端部分接觸來自供體 遍在蛋白的C端殘基72-74和Q40，而HVRH3的殘基R102和Y103接觸K63-受體遍在蛋白 的50s環(huán)。另一方面，供體遍在蛋白的C端殘基接觸抗體或抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)這樣 的方面，接觸所涉及的供體遍在蛋白殘基是L73和R74。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含其輕 鏈與K63-受體遍在蛋白表面之間改善的靜電相容性。一方面，該抗體或抗原結(jié)合片段包含 HVRL2第52位Arg。另一方面，該抗體或抗原結(jié)合片段包含輕鏈框架區(qū)第66位Arg。另一 方面，該抗體或抗原結(jié)合片段包含HVRL2第52位Arg和輕鏈框架區(qū)第66位Arg。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，任何上述抗體或抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合K63連接的多聚 遍在蛋白化的蛋白質(zhì)。一方面，該抗體或抗原結(jié)合片段抑制K63連接的多聚遍在蛋白化的 蛋白質(zhì)降解。另一方面，該抗體或抗原結(jié)合片段調(diào)控至少一種由多聚遍在蛋白介導(dǎo)的信號(hào) 傳導(dǎo)途徑。另一方面，該抗體或抗原結(jié)合片段抑制至少一種由多聚遍在蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳 導(dǎo)途徑。另一方面，該抗體或抗原結(jié)合片段刺激至少一種由多聚遍在蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo) 途徑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種編碼任何上述抗體或抗原結(jié)合片段的核酸 分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含此類核酸分子的載體。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，本發(fā)明提供一種包含此類載體的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種能 夠生成任何上述抗體或抗原結(jié)合片段的細(xì)胞系。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種生 成任何上述抗體或抗原結(jié)合片段的方法，包括在該抗體或抗原結(jié)合片段生成的條件下培養(yǎng) 包含編碼該抗體或抗原結(jié)合片段的核酸分子的宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種包含有效量的任何上述抗體或抗原結(jié)合片 段和藥學(xué)可接受載體的組合物。一方面，該組合物包含兩種或更多種上述抗體或抗原結(jié)合 片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種鑒定樣品中K63連接的多聚遍在蛋白或 K63連接的多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì)的存在的方法，包括使該樣品與至少一種上述抗體或 抗原結(jié)合片段接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種用于治療患者中與多聚遍在蛋白失 調(diào)有關(guān)的疾病或狀況的方法，包括對(duì)該患者施用有效量的至少一種上述抗體或抗原 結(jié)合片段。一方面，該患者是哺乳動(dòng)物患者。另一方面，該患者是人。另一方面，該 疾病選自癌癥(cancer)、肌肉病癥(muscular disorder)、遍在蛋白途徑相關(guān)遺傳病 癥(ubi qui tin-pathway-re lated genetic disorder)、免疫 / 炎 生病癥(immune/ inflammatory disorder)、禾口神經(jīng)學(xué)病癥(neurological disorder)。另一方面，該疾病 選自癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、母細(xì)胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)、白血 病(leukemia)、肌營(yíng)養(yǎng)不良(musculardystrophy)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)、 M^^M'MM'it (amyotrophiclateral sclerosis) ,MH^fi^it'M (cystic fibrosis) > Angelman 氏綜合征(Angelman，s syndrome)、禾丨J 德爾綜合征(Liddle syndrome)、阿爾 茨海默氏病(Alzheimer，s disease)、帕金森氏病(Parkinson，s disease)、皮克氏病 (Pick，sdisease)、禾口佩吉特氏病(Paget' s disease)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供依照測(cè)定懷疑含有K63連接的多聚遍在蛋白或 K63連接的多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì)的樣品中K63連接的多聚遍在蛋白或K63連接的多聚 遍在蛋白化的蛋白質(zhì)的存在的方法，包括將該樣品暴露于至少一種上述抗體或抗原結(jié)合片 段并測(cè)定該至少一種抗體或抗原結(jié)合片段對(duì)該樣品中K63連接的多聚遍在蛋白或K63連接 的多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì)的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種將樣品中的K63連接的多聚遍在蛋白化的 蛋白質(zhì)與非K63連接的多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì)分開的方法，包括使該樣品與至少一種上 述抗體或抗原結(jié)合片段接觸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測(cè)定細(xì)胞中K63連接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使該細(xì)胞與至少一種上述抗體或抗原結(jié)合片段接觸并評(píng)估所述 接觸步驟對(duì)該細(xì)胞的影響。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測(cè)定樣品中K63連接的 多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使該樣品與至少一種上述抗體或抗原結(jié)合片 段接觸并評(píng)估所述接觸步驟對(duì)該樣品的影響。本發(fā)明的抗體可以是任何數(shù)目的形式。例如，本發(fā)明的抗體可以是嵌合抗體、 人源化抗體或人抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體不是人抗體，例如它不是在 xenomouse (例如W096/33735中所記載的)中生成的抗體。本發(fā)明的抗體可以是全長(zhǎng)抗體 或其片段(例如包含抗原結(jié)合構(gòu)件的片段)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供任何上述抗體的抗原結(jié)合片段。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示遍在蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)和某些多聚遍在蛋白異肽鍵的示意圖。圖IA顯示人 遍在蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO :223)，其中賴氨酸殘基以粗體、帶下劃線的中文標(biāo)示。 圖IB顯示在第一遍在蛋白分子的賴氨酸-48或賴氨酸-63與第二遍在蛋白分子的C端甘 氨酸殘基之間形成的鍵的示意圖。圖2A-E描繪實(shí)施例4中討論的有關(guān)分子的晶體結(jié)構(gòu)。圖2A描繪K63連接的雙遍 在蛋白(圖的上部)與Apu2. 16Fab片段(圖的下部，其中輕鏈在左、重鏈在右)之間的復(fù)合 物，并且顯示重鏈⑶R3( “H3”)接觸異肽鍵任一側(cè)兩條遍在蛋白鏈。距雙遍在蛋白4.2入 內(nèi)的H3側(cè)鏈和距H34. 2人內(nèi)的遍在蛋白側(cè)鏈以棍顯示。以粗體標(biāo)示的殘基是遍在蛋白殘 基，而以其它方式(非粗體)標(biāo)示的殘基是Fab殘基。受體遍在蛋白中的K63以球體顯示。 圖2B描繪K63連接的(上部)和K48連接的(下部)雙遍在蛋白結(jié)構(gòu)的比較。在這兩種 情況中，賴氨酸受體遍在蛋白在圖的左邊，而供體遍在蛋白在右邊。與K63 二聚體(其中鏈 以更加延長(zhǎng)的方式延伸)相比，K48連接的雙遍在蛋白形成更加緊湊的形狀，鏈垂直于遍在 蛋白二聚體延伸。圖2C是圖2A中所示Apu2. 16晶體結(jié)構(gòu)疊加在Apu3. A8晶體結(jié)構(gòu)上的疊 印，顯示了用于創(chuàng)建Apu3.A8的親和力成熟過程期間在L2(S52R)和H3 (S52T)中引入的兩 處變化的位置。圖2D顯示Apu2. 16、Apu3.A8和一種人源化4D5變體(pdb 1FVE)的結(jié)構(gòu)比 較。Apu2. 16和Apu3. A8的Fv區(qū)以管顯示并疊加在人源化抗Her2抗體4D5變體的Fv區(qū) 上。在頂視圖中，標(biāo)記了⑶R區(qū)；在底視圖中，F(xiàn)v區(qū)旋轉(zhuǎn)90度以顯示N端。圖2E描繪Apu3. A8(下部)和雙遍在蛋白(上部)之間的電荷互補(bǔ)性。靜電表面是用PyMol計(jì)算的。正電 位的區(qū)域用陰影標(biāo)示；負(fù)電位的區(qū)域用陰影標(biāo)示并用虛線指示。圖3A-D描繪實(shí)施例1 (E)中描述的Western印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖3A顯示親本抗 K63連接的多聚遍在蛋白Fab Apu2. 16對(duì)固定化的K63連接的雙遍在蛋白的結(jié)合及對(duì)固 定化的K48連接的雙遍在蛋白的結(jié)合的缺失。圖3B顯示抗K63連接的多聚遍在蛋白Fab Apu3. A8對(duì)固定化的K63連接的雙遍在蛋白的結(jié)合及對(duì)固定化的K48連接的雙遍在蛋白的 結(jié)合的缺失。圖3C顯示抗K63連接的多聚遍在蛋白Fab Apu3. A12對(duì)固定化的K63連接的 雙遍在蛋白的結(jié)合及對(duì)固定化的K48連接的雙遍在蛋白的結(jié)合的缺失。圖3D顯示抗K63 連接的多聚遍在蛋白Fab Apu3. B3對(duì)固定化的K63連接的雙遍在蛋白的結(jié)合及對(duì)固定化的 K48連接的雙遍在蛋白的結(jié)合的缺失。圖4描繪實(shí)施例2中描述的Western印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。該圖顯示親本Apu2. 16IgG 對(duì)固定化的K63連接的雙至七遍在蛋白或固定化的K48連接的雙至七遍在蛋白的弱結(jié)合。該圖還顯示每種親和力成熟的抗1(63連接的多聚遍在蛋白抗體4 113]124 113.83、和 Apu3. A8對(duì)固定化的K63連接的雙至七遍在蛋白的結(jié)合及對(duì)固定化的K48連接的雙至七遍 在蛋白的結(jié)合的缺失。圖5描繪實(shí)施例2中描述的Western印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。該圖顯示在Western印跡 形式中，雖然親本抗K63連接的多聚遍在蛋白抗體Apu2. 16不能夠檢測(cè)K63連接的遍在蛋 白化的Traf6，但是親和力成熟的抗體Apu3. A12、Apu3. B3、和Apu3. A8能夠特異性檢測(cè)K63 連接的遍在蛋白化的Traf6。圖6A-B描繪Western印跡實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用于評(píng)估各種抗K63連接的多聚遍在蛋白 抗體自細(xì)胞溶胞物免疫沉淀K63連接的TrafO的能力，如實(shí)施例2中所描述的。親和力成 熟的抗體Apu3. A8、Apu3. B3、和Apu3. A12比親本抗體Apu2. 16更好地能夠免疫沉淀K63連 接的多聚遍在蛋白化的Traf6。圖7A-K描繪驗(yàn)證性質(zhì)譜術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，如實(shí)施例3中所描述的。圖7A描繪質(zhì)譜 術(shù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，用于驗(yàn)證由親和力成熟的抗體Apu3.A8、Apu3.B3、和Apu3. A12免疫沉淀的 蛋白質(zhì)主要是K63連接的遍在蛋白化的，如實(shí)施例2中所描述的。圖7B顯示使用這種辦法 不富集K48連接，由此顯示K63抗體對(duì)K63鏈連接的特異性。圖7C-F顯示自使用抗K48連 接的多聚遍在蛋白抗體Apu2. 07、抗K63連接的多聚遍在蛋白抗體Apu3.A8、或同種型對(duì)照 抗體(抗Her2)的免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，接著進(jìn)行質(zhì)譜術(shù)分析獲得的數(shù)據(jù)的棒圖，該質(zhì)譜術(shù)分析用 于確定免疫沉淀的遍在蛋白總量(圖7C)，以及溶胞物中存在的多聚遍在蛋白連接類型(圖 7D)和抗體特異性免疫沉淀物(圖7E中的抗K48連接的多聚遍在蛋白；圖7F中的抗K63連 接的多聚遍在蛋白)。圖7G示意性描繪在體外用WT、K48R或K63R遍在蛋白實(shí)施的MuRFl 自我遍在蛋白化反應(yīng)，接著用々 112.074 113^8、或同種型匹配的對(duì)照抗體免疫沉淀。圓括 號(hào)中的數(shù)字指示圖7H-K中有關(guān)的道和柱。圖7H顯示W(wǎng)estern印跡，包括圖7G中示意性描 繪的反應(yīng)。該印跡是用泛遍在蛋白抗體探查的。水平的虛線指示切出來并提交質(zhì)譜術(shù)分析 的凝膠部分。圖7I-K顯示自實(shí)驗(yàn)獲得的質(zhì)譜術(shù)數(shù)據(jù)的棒圖，該實(shí)驗(yàn)用于確定圖7G示意性 描繪的自我遍在蛋白化反應(yīng)和免疫沉淀中的多聚遍在蛋白連接。圖8A示意性描繪在體內(nèi)受結(jié)合至腫瘤壞死因子受體I(TNFRl)的腫瘤壞死因子 α (TNFa)刺激的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。圖8Β示意性描繪在體內(nèi)受結(jié)合至IL-1R1的IL-I β刺激 的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。圖9Α顯示來自免疫沉淀實(shí)驗(yàn)的Western印跡，用于檢測(cè)RIP的遍在蛋白化狀態(tài)， 如實(shí)施例3中所描述的。僅僅為了描述此圖的目的，給各印跡指派1到7的連續(xù)數(shù)字，其中 最上面的印跡指派數(shù)字1、最下面的印跡指派數(shù)字7。印跡6包括用抗K48連接的IgG(用 于捕捉K48連接的多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì))免疫沉淀的樣品。印跡7包括用Apu3. A8和 Apu3. B3的1 1混合物(用于捕捉K63連接的多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì))免疫沉淀的樣 品。兩印跡都是用抗RIP抗體染色的。印跡1-3顯示對(duì)照Western印跡，用于證明RIP和 微管蛋白水平在TNF α處理期間保持相對(duì)恒定(印跡1和3)，而I κ B α水平在在TNF α處 理后降低(印跡2)。印跡4和5顯示對(duì)照Western印跡，用于證明RIP在針對(duì)TNFRl的免 疫沉淀期間共沉淀(印跡4)及TNFRl水平在TNF α處理期間保持恒定(印跡5)。圖9Β示 意性描繪Κ63連接的多聚遍在蛋白添加至RIP并被Α20用Κ48連接的多聚遍在蛋白替換的 細(xì)胞途徑。
圖10顯示實(shí)施例3(B)中描述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，評(píng)估IL-I β刺激細(xì)胞后IRAKI的多 聚遍在蛋白化狀態(tài)?？侷RAKl、IicBa和微管蛋白水平顯示于圖IOA和10B。圖IOC顯示 Western印跡，評(píng)估被K48連接的多聚遍在蛋白(頂部小圖)或K63連接的多聚遍在蛋白 (下部小圖)修飾的IRAKI。圖IOD顯示W(wǎng)estern印跡，指示蛋白酶抑制劑MG-132對(duì)多聚 遍在蛋白化的IRAKI降解的影響。圖11描繪用單獨(dú)的抗K48連接的多聚遍在蛋白抗體或抗K63連接的多聚遍在蛋 白抗體(分別為圖IlA或圖11D)染色或進(jìn)一步包括識(shí)別20S蛋白酶體亞基的多克隆抗體 (分別為圖IlB和11E)的HeLa細(xì)胞免疫熒光顯微術(shù)圖像，如實(shí)施例5中所描述的。箭指示 中體(mid-body)染色。在合并的圖像(圖IlC和11F)中，很亮的染色指示潛在的共定位， 而不太亮的染色對(duì)應(yīng)于DAPI標(biāo)記的核。每幅圖中的棒代表50 μ m。圖12A和12B和圖13描繪供實(shí)施本發(fā)明中使用的例示性受體人共有框架序列，序 列標(biāo)識(shí)符如下可變重鏈(VH)共有框架(圖12A和12B)人VH 亞組 I 共有框架減 Kabat CDR (SEQ ID NO 113-116)人VH亞組I共有框架減延長(zhǎng)的高變區(qū)(SEQ ID NO 117-128)人VH 亞組 II 共有框架減 Kabat CDR(SEQ ID NO 129-132)人VH亞組II共有框架減延長(zhǎng)的高變區(qū)(SEQ ID NO 133-144)人VH 亞組 III 共有框架減 Kabat CDR(SEQ ID NO 145-148)人VH亞組III共有框架減延長(zhǎng)的高變區(qū)(SEQ ID NO 149-160)人VH 受體框架減 Kabat CDR (SEQ ID NO 161-164)人VH受體框架減延長(zhǎng)的高變區(qū)(SEQ ID NO 165-172)人VH 受體 2 框架減 KabatCDR (SEQ ID NO 173-176)人VH受體2框架減延長(zhǎng)的高變區(qū)(SEQ ID NO 177-188)可變輕鏈(VL)共有框架(圖13)人VL κ 亞組 I 共有框架(SEQ ID NO 189-192)人VL κ 亞組 II 共有框架(SEQ ID NO: 193-196)人VL κ 亞組 III 共有框架(SEQ ID NO: 197-200)人VL κ 亞組 IV 共有框架(SEQ ID NO :201_204)圖14描繪huMAb4D5_8輕鏈和重鏈的框架區(qū)序列。上標(biāo)/粗體的數(shù)字指示依照 Kabat的氨基酸位置。 圖15描繪huMAb4D5_8輕鏈和重鏈的經(jīng)修飾/變體框架區(qū)序列。上標(biāo)/粗體的數(shù) 字指示依照Kabat的氨基酸位置。發(fā)明詳述一般技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。文獻(xiàn)中充分 闡述了這些技術(shù)，諸如“Molecular Cloning =ALaboratory Manual，，，第三版(Sambrook et al.,2001) ；"OligonucleotideSynthesis" (Μ.J. Gait, ed. ,1984) ；"Animal Cell Culture，，(R. I. Freshney 編，1987) ；“Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)；"Current Protocols inMolecular Biology"(F. Μ. Ausubel et al.編，1987,and periodic updates) ；“PCR :The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al. H, 1994) ；PCR 2 :A PracticalApproach(M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor 編(1995)) ；Harlowand Lane 編(1988)Antibodies, A Laboratory Manual ；"A Practical Guide toMolecular Cloning，，(Perbal Bernard V. , 1988)；及"Phage Display :A LaboratoryManual，，(Barbas et al.，2001)。定義在用于本文時(shí)，術(shù)語“遍在蛋白(ubiquitin)”(遍在蛋白)和“單遍在蛋白 (monoubiquitin)”可互換使用，定義為所有種類的天然的人的和合成的遍在蛋白，基本上 與在第6位、第11位、第27位、第29位、第33位、第48位、和/或第63位氨基酸處具有至 少一個(gè)賴氨酸殘基的76個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)相似。在用于本文時(shí)，術(shù)語“多聚遍在蛋白(polyubiquitin)”定義為所有種類的天然 的人的和合成的遍在蛋白聚合鏈，其落入遍在蛋白不同聚合連接方式的人的和合成的類 別，包括，但不限于，K6連接的多聚遍在蛋白、Kll連接的多聚遍在蛋白、K27連接的多聚遍 在蛋白、K29連接的多聚遍在蛋白、K33連接的多聚遍在蛋白、K48連接的多聚遍在蛋白和 K63連接的多聚遍在蛋白。多聚遍在蛋白可以是任何長(zhǎng)度的，包括至少兩個(gè)遍在蛋白模塊 (moity)。多聚遍在蛋白有別于最初作為單一蛋白質(zhì)表達(dá)的遍在蛋白串聯(lián)重復(fù)體。在用于本文時(shí)，術(shù)語“K*連接的多聚遍在蛋白”和“Lys*連接的多聚遍在蛋白”可 互換使用，指在一個(gè)遍在蛋白模塊的C-末端與另一個(gè)遍在蛋白模塊中的第*位賴氨酸之間 包含至少一個(gè)異肽鍵的多聚遍在蛋白分子。例如，“K63連接的多聚遍在蛋白”與“Lys63連 接的多聚遍在蛋白”可互換使用，這兩個(gè)術(shù)語都指在分子中一個(gè)遍在蛋白模塊的C-末端與 分子中另一個(gè)遍在蛋白模塊的第63位賴氨酸之間包含異肽鍵的多聚遍在蛋白分子。在用于本文時(shí)，表述第一賴氨酸連接“不同”于第二賴氨酸連接指一個(gè)遍在蛋白模 塊與另一個(gè)遍在蛋白模塊之間的該第一賴氨酸連接所牽涉的賴氨酸殘基(例如，K6、KlU 1(27、1(29、1(33、1(48、和/或1(63)不同于一個(gè)遍在蛋白模塊與另一個(gè)遍在蛋白模塊之間的該 第二賴氨酸連接。在用于本文時(shí)，術(shù)語“遍在蛋白途徑”指細(xì)胞中的或在體外重建的、包括遍在蛋白 和/或多聚遍在蛋白的生化途徑?！胺蛛x的”抗體指已經(jīng)鑒定且自其天然環(huán)境的成分分開和/或回收的抗體。其天然 環(huán)境的污染性成分指將會(huì)干擾該抗體的研究、診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和 其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)例如 Lowry法的測(cè)定，抗體重量超過95%，在有些實(shí)施方案中重量超過99%，(2)足以通過使用 例如轉(zhuǎn)杯式測(cè)序儀獲得至少15個(gè)殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)還 原性或非還原性條件下的SDS-PAGE及使用例如考馬斯藍(lán)或銀染色，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天 然環(huán)境的至少一種成分不會(huì)存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離 的抗體通常將通過至少一個(gè)純化步驟來制備。在用于本文時(shí)，術(shù)語“抗遍在蛋白抗體”和“抗單遍在蛋白抗體”可互換使用，指能 夠特異性結(jié)合遍在蛋白分子的抗體。在用于本文時(shí)，術(shù)語“抗多聚遍在蛋白抗體”指能夠特異性結(jié)合多聚遍在蛋白分子
16的抗體。在用于本文時(shí)，術(shù)語“抗K48連接的多聚遍在蛋白抗體”指能夠特異性結(jié)合K48連 接的多聚遍在蛋白的抗體。在用于本文時(shí)，術(shù)語“抗K63連接的多聚遍在蛋白抗體”指能夠結(jié)合K63連接的多 聚遍在蛋白的抗體。短語“基本上相似” “基本上(實(shí)質(zhì)上)相同”、“相當(dāng)”或“基本上(實(shí)質(zhì)上)相當(dāng)” 在用于本文時(shí)表示兩個(gè)數(shù)值(例如，一個(gè)與某分子相關(guān)，另一個(gè)與參照/比較分子相關(guān))之 間足夠高的相似程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)為在用所述數(shù)值(如，Kd值、抗病毒效應(yīng)、 等)所測(cè)量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個(gè)數(shù)值之間的差異具有很小的或沒有生物學(xué)和/或統(tǒng)計(jì) 學(xué)顯著性。所述兩個(gè)數(shù)值之間的差異為，例如，小于約50%、小于約40%、小于約30%、小于 約20%、和/或小于約10%，作為參照/比較分子的數(shù)值的函數(shù)。短語“實(shí)質(zhì)性降低(substantially reduced)”或“實(shí)質(zhì)性不同 (substantiallydifferent)”在用于本文時(shí)表示兩個(gè)數(shù)值(通常，一個(gè)與某分子相關(guān)，另一 個(gè)與參照/比較分子相關(guān))之間足夠高的差異程度，以致本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)為在用所述 數(shù)值(如，Kd值)所測(cè)量的生物學(xué)特性背景內(nèi)兩個(gè)數(shù)值之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。所 述兩個(gè)數(shù)值之間的差異為，例如，大于約10%、大于約20%、大于約30%、大于約40%、大于 約50%，作為參照/比較抗體該數(shù)值的函數(shù)?！敖Y(jié)合親和力”通常指分子(例如抗體)的單一結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合配偶體(例如抗 原)之間全部非共價(jià)相互作用總和的強(qiáng)度。除非另有說明，在用于本文時(shí)，“結(jié)合親和力”指 反映結(jié)合對(duì)的成員(例如抗體與抗原)之間1 1相互作用的內(nèi)在結(jié)合親和力。分子X對(duì) 其配偶體Y的親和力通?？捎媒怆x常數(shù)(Kd)來表述。親和力可通過本領(lǐng)域知道的常用方 法來測(cè)量，包括本文中所描述的。低親和力抗體通常緩慢地結(jié)合抗原且趨于容易解離，而高 親和力抗體通常更快速地結(jié)合抗原且趨于保持更長(zhǎng)時(shí)間的結(jié)合。本領(lǐng)域知道測(cè)量結(jié)合親和 力的多種方法，其中任一種都可用于本發(fā)明的目的。下文描述了具體的示例性實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的“Kd”或“Kd值”是通過如下測(cè)定法所述使用Fab 型式的目的抗體及其抗原進(jìn)行的放射性標(biāo)記抗原結(jié)合測(cè)定法(RIA)來測(cè)量的通過在存在 未標(biāo)記抗原的滴定系列的條件下，用最小濃度的125I標(biāo)記抗原平衡，然后用抗Fab抗體包被 的平板捕捉結(jié)合的抗原來測(cè)量Fab對(duì)抗原的溶液結(jié)合親和力(Chen，et al. , J Mol Biol 293:865-881(1999))。為了確定測(cè)定條件，用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中的5yg/ml捕捉用 抗Fab抗體(Cappel Labs)包被微量滴定板(Dynex)過夜，隨后用PBS中的2% (w/v)牛 血清清蛋白在室溫(約23°C )封閉2-5小時(shí)。在非吸附平板(Nunc#269620)中，將IOOpM 或26pM[125I]_抗原與連續(xù)稀釋的目的Fab混合(例如與Presta et al.，Cancer Res. 57 4593-4599 (1997)中抗VEGF抗體，F(xiàn)ab_12的評(píng)估一致)。然后將目的Fab保溫過夜；不過， 保溫可持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間(例如65個(gè)小時(shí))以保證達(dá)到平衡。此后，將混合物轉(zhuǎn)移至捕捉板以 進(jìn)行室溫保溫(例如1小時(shí))。然后除去溶液，并用含0. 1 % Tween-20的PBS洗板8次。 平板干燥后，加入150 μ 1/孔閃爍液(MicroScint-20 ；Packard)，然后在Topcount伽馬計(jì) 數(shù)器(Packard)上對(duì)平板計(jì)數(shù)10分鐘。選擇各Fab給出小于或等于最大結(jié)合之20%的濃 度用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定法。依照另一實(shí)施方案，Kd或Kd值是通過表面等離振子共振測(cè)定 法使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000 (BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)在 25°C 使用
17固定化抗原CM5芯片在約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)測(cè)量的。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說明書用 鹽酸N-乙基-N’ -(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。用IOmM乙酸鈉pH 4. 8將 抗原稀釋至5 μ g/ml (約0. 2 μ Μ)，然后以5 μ 1/分鐘的流速注入至獲得約10個(gè)響應(yīng)單位 (RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后，注入IM乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。在每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，在不 固定化蛋白質(zhì)的情況中活化并乙醇胺封閉一個(gè)斑點(diǎn)，以用于參照扣除。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè) 量，在25°C以約25 μ 1/分鐘的流速注入在含0. 05% Tween-20的PBS(PBST)中兩倍連續(xù) 稀釋的Fab(0. 78nM至500nM)。使用簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)通過同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(k。n) 和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd)以比率k。ff/k。n計(jì)算。參見例如Chen，Y.，et al.， J Mol Biol 293:865-881(1999)。如果根據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過 IO6M-1S-1，那么結(jié)合速率可使用熒光淬滅技術(shù)來測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的 分光光度計(jì)(a stop-flowequipped spectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量，在存在濃度漸增的 抗原的條件下，測(cè)量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25°C的熒光發(fā)射強(qiáng) 度(激發(fā)=295nm;發(fā)射=340nm，16nm帶通)的升高或降低。it M H _ 白勺 “g ^ ! “ (on-rate, rate of association, association rate)或“k。n”也可通過上文所述相同的表面等離振子共振技術(shù)使用BIACore -2000或 BIAcore -3000 (BIAcore, Inc.，Piscataway, NJ)在 25°C使用固定化抗原 CM5 芯片在約 10 個(gè)響應(yīng)單位(RU)來測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨 基丙基)_碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物傳感 器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用IOmM乙酸鈉pH 4. 8將抗原稀釋至5 μ g/ml (約0· 2 μ Μ)， 然后以5 μ 1/分鐘的流速注入至獲得約10個(gè)響應(yīng)單位(RU)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)。注入抗原后， 注入IM乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團(tuán)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)測(cè)量，在25°C以約25 μ 1/分鐘的流速 注入在含0. 05% Tween-20的PBS (PBST)中兩倍連續(xù)稀釋的Fab (0. 78nM至500nM)。使用 簡(jiǎn)單一對(duì)一朗格繆爾(Langmuir)結(jié)合模型(BIAcore Evaluation Software version 3. 2) 通過同時(shí)擬合結(jié)合和解離傳感圖計(jì)算結(jié)合速率(k。n)和解離速率(k。ff)。平衡解離常數(shù)(Kd) 以比率 k。ff/k。n 計(jì)算。參見例如 Chen，Y.，et al. ,J Mol Biol 293:865-881(1999)。然而， 如果根據(jù)上文表面等離振子共振測(cè)定法，結(jié)合速率超過IO6M-1S-1,那么結(jié)合速率可以使用熒 光淬滅技術(shù)來測(cè)定，即根據(jù)分光計(jì)諸如配備了斷流裝置的分光光度計(jì)(Aviv Instruments) 或8000系列SLM-Aminco分光光度計(jì)(ThermoSpectronic)中用攪拌比色杯的測(cè)量，在存在 濃度漸增的抗原的條件下，測(cè)量PBS，pH 7. 2中的20nM抗抗原抗體(Fab形式)在25°C的 熒光發(fā)射強(qiáng)度(激發(fā)=295nm ；發(fā)射=340nm, 16nm帶通)的升高或降低。術(shù)語“載體”在用于本文時(shí)意指能夠運(yùn)輸與其連接的其它核酸的核酸分子。一類 載體是“質(zhì)?！保钙渲锌蛇B接另外的DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一類載體是噬菌體載 體。另一類載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區(qū)段連接到病毒基因組中。某些載體能 夠在其所導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳 動(dòng)物載體)。其它載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)可在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后整合到宿主細(xì) 胞的基因組中，由此隨著宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與其可操作連接的基因表達(dá)。此類載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡(jiǎn)稱為“重組載體”)。通常，在重 組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體常常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使 用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體的最常用形式?！岸嗪塑账帷被颉昂怂帷痹诒疚闹锌苫Q使用，指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合物，包括DNA 和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸或堿基、和/或其 類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應(yīng)摻入聚合物的任何底物。多核 苷酸可包含經(jīng)過修飾的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對(duì)核苷酸結(jié) 構(gòu)的修飾可以在裝配聚合物之前或之后進(jìn)行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核 苷酸可以在合成后進(jìn)一步修飾，諸如通過與標(biāo)記物偶聯(lián)。其它類型的修飾包括例如“帽”， 將一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接 (例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連 接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety)諸如例 如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如 吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修 飾、含有烷化劑的修飾、具有經(jīng)修飾連接(例如α端基異構(gòu)核酸(anomericnucleic acid) 等)的修飾、以及未修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如 膦酸(phosphonate)基團(tuán)、磷酸(phosphate)基團(tuán)替換，用標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或活化以制 備與別的核苷酸的別的連接，或者可偶聯(lián)至固體或半固體支持物。5'和3'末端OH可磷 酸化或者用胺或1-20個(gè)碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)模塊取代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù) 基團(tuán)。多核苷酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如 2'-氧-甲基、2' _氧-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，α-端 基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類 似物及脫堿基核苷類似物諸如甲基核糖核苷?？捎脗溥x連接基團(tuán)替換一個(gè)或多個(gè)磷酸二 酯連接。這些備選連接基團(tuán)包括但不限于以下實(shí)施方案，其中磷酸酯用P(0)S( “硫代酸 酯，，(thioate)),P(S)S( “二硫代酸酯”(dithioate))、(0) NR2 ( “酰胺酯” (amidate)) ,P (0) R> P (O)OR'、⑶或CH2 (“甲縮醛”(formacetal))替代，其中R或R'各自獨(dú)立為H或者取 代或未取代的烷基(1-20個(gè)C)，任選含有醚(-0-)連接、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷 基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及 的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。“寡核苷酸”在用于本文時(shí)一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長(zhǎng)度 一般但不是必需小于約200個(gè)核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”與“多核苷酸”并不互相排斥。上 文關(guān)于多核苷酸的描述同樣且完全適用于寡核苷酸?！翱贵w” (Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。雖然抗體展現(xiàn) 出對(duì)特定抗原的結(jié)合特異性，但是免疫球蛋白包括抗體和一般缺乏抗原特異性的其它抗體 樣分子二者。后一類多肽例如由淋巴系統(tǒng)以低水平生成而由骨髓瘤以升高的水平生成。術(shù)語“抗體”和“免疫球蛋白”以最廣義互換使用，包括單克隆抗體(例如全長(zhǎng)或 完整單克隆抗體)、多克隆抗體、單價(jià)、多價(jià)抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體，只要 它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性)，而且還可以包括某些抗體片段(如本文中更為詳細(xì)描述 的)?？贵w可以是嵌合的、人的、人源化的和/或親和力成熟的。
抗體的“可變區(qū)”或“可變域”指抗體重鏈或輕鏈的氨基末端結(jié)構(gòu)域。這些結(jié)構(gòu)域 一般是抗體的最易變部分且包含抗原結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語“可變的，，指可變域中的某些部分在抗體序列間差異廣泛且用于每種特定抗 體對(duì)其特定抗原的結(jié)合和特異性的實(shí)情。然而，變異性并非均勻分布于抗體的整個(gè)可變域。 它集中于輕鏈和重鏈可變域中稱作互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變區(qū)的三個(gè)區(qū)段。可變域中較 保守的部分稱作框架區(qū)(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變域各自包含四個(gè)FR，它們大多采取 β _折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成β _折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個(gè)⑶R 連接。每條鏈中的CDR通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的CDR —起促成抗體 的抗原結(jié)合位點(diǎn)的形成(參見 Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, H 5 fiji, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。 H胃^fi 接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性中 抗體的參與。用木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為“Fab”片段，各自具有 一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，及剩余的“Fe”片段，其名稱反映了它易于結(jié)晶的能力。胃蛋白酶處理 產(chǎn)生一個(gè)F(ab' )2片段，它具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)且仍能夠交聯(lián)抗原?！癋v”是包含完整抗原識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv種類中，此區(qū)由 緊密、非共價(jià)結(jié)合的一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域的二聚體組成。在單鏈Fv種類中， 一個(gè)重鏈可變域和一個(gè)輕鏈可變域可以通過柔性肽接頭共價(jià)相連，使得輕鏈和重鏈在與雙 鏈Fv種類類似的“二聚體”結(jié)構(gòu)中相結(jié)合。正是在這種構(gòu)造中，各可變域的三個(gè)⑶R相互 作用而在二聚體表面上確定了抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè)CDR共同賦予抗體以抗原結(jié)合特 異性。然而，即使是單個(gè)可變域(或只包含對(duì)抗原特異的三個(gè)CDR的半個(gè)Fv)也具有識(shí)別 和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點(diǎn)。Fab片段還包含輕鏈的恒定域和重鏈的第一恒定域(CHl)。Fab'片段與Fab片段 的不同之處在于重鏈CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端增加了少數(shù)殘基，包括來自抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè) 或多個(gè)半胱氨酸。Fab' -SH是本文中對(duì)其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab' 的稱謂。F(ab' )2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對(duì)Fab‘片 段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。根據(jù)其恒定域的氨基酸序列，來自任何脊椎動(dòng)物物種的抗體(免疫球蛋白)的“輕 鏈”可歸入兩種截然不同的型中的一種，稱作卡帕(K)和拉姆達(dá)(λ)。根據(jù)其重鏈恒定域的氨基酸序列，抗體(免疫球蛋白)可歸入不同的類。免疫球蛋 白有五大類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、 IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。將與不同類的免疫球蛋白對(duì)應(yīng)的重鏈恒定域分別稱作α、 δ、ε、γ和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的，一般記載于例 如 Abbas et al. ,Cellular and Mol. Immunology，第 4 版(2000)?？贵w可以是抗體與一種 或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價(jià)或非共價(jià)關(guān)聯(lián)而形成的更大融合分子的一部分。術(shù)語“全長(zhǎng)抗體”和“完整抗體”在本文中可互換使用，指基本上完整形式的抗體 而非如下文所定義的抗體片段。該術(shù)語具體指重鏈包含F(xiàn)c區(qū)的抗體?！翱贵w片段”只包含完整抗體的一部分，其中所述部分保留該部分存在于完整抗體 中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng)、多至大多數(shù)或所有功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段包含完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，如此保留結(jié)合抗原的能力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段，例 如包含F(xiàn)c區(qū)的抗體片段，保留通常與Fc區(qū)存在于完整抗體中時(shí)通常與之有關(guān)的至少一項(xiàng) 生物學(xué)功能，諸如FcRn結(jié)合、抗體半衰期調(diào)控、ADCC功能和補(bǔ)體結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中， 抗體片段是體內(nèi)半衰期與完整抗體基本上相似的單價(jià)抗體。例如，這樣的抗體片段可包含 一個(gè)抗原結(jié)合臂且其與能夠賦予該片段以體內(nèi)穩(wěn)定性的Fc序列相連。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時(shí)指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成 群體的各個(gè)抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在變異外。如此，修飾語“單 克隆”指明抗體不是不同的抗體的混合物的特征。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶 物的多肽序列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物 結(jié)合多肽序列在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌 體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨(dú)特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，選定的靶物結(jié)合序列可進(jìn)一步 改變，例如為了提高對(duì)靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn) 量、降低其在體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗 體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對(duì)不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆 抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對(duì)抗原上的單一決定簇。在它們 的特異性之外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢(shì)在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修 飾語“單克隆”指明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定 方法來生產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來生成，包括例 如雜交瘤法(例如 Kohler et al.，Nature256 495(1975) ；Harlow et al.，Antibodies A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press,第 2 版，1988 ；Hammerling et al., 于MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas,563-681, Elsevier, N. Y.，1981)、重組DNA法(參見例如美國(guó)專利No. 4，816，567)、噬菌體展示技術(shù)(參見 例如 Clackson et al.，Nature 352 :624_628 (1991) ；Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 581-597(1992) ；Sidhu et al. , J. Mol. Biol. 338 (2) :299_310 (2004) ；Lee et al.， J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093 (2004) ；Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USAlOl (34) 12467-12472(2004) ；Lee et al. , J. Immunol. Methods 284 (1-2) 119-132 (2004))、及用 于在具有部分或整個(gè)人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動(dòng)物中生成 人或人樣抗體的技術(shù)(參見例如 WO 98/24893 ；W096/34096 ；WO 96/33735 ；WO 91/10741 ； Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993) ；Jakobovits et al., Nature 362:255-258(1993) ；Bruggemannet al. , Year in Immunol. 7 :33 (1993)；美國(guó)專 利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016 ；Marks et al.，Bio/TechnologylO :779_783(1992) ；Lonberg et al.，Nature 368 :856_859 (1994)； Morrison, Nature368 812-813 (1994) ；Fishwild et al. ， Nature Biotechnol. 14 845-851 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 :826 (1996) ；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍 生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部 分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此 類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利No. 4，816，567 ；Morrison etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA81 :6851_6855 (1984))。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變 區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和/或能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔 或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的框 架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體中或在供體 抗體中沒有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能。一般而言，人源化 抗體將包含至少一個(gè)、通常兩個(gè)基本上整個(gè)如下的可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán) 對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人 源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。 更多細(xì)節(jié)參見 Jones et al. , Nature 321:522-525(1986) ；Riechmann et al. , Nature 332 323-329 (1988) ；Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)。還可參見以下 綜述及其弓I用的參考文獻(xiàn)Vaswani andHamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 105-115(1998) ；Harris, Biochem.Soc.Transactions 23 1035-1038 (1995) ；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5 :428_433(1994)。術(shù)語“高變區(qū)”、“HVR”或“HV”在用于本文時(shí)指抗體可變域中序列上高度可變和/ 或形成結(jié)構(gòu)上定義的環(huán)的區(qū)域。通常，抗體包含六個(gè)高變區(qū)三個(gè)在VH中(H1、H2、H3)，三 個(gè)在VL中(L1、L2、L3)。本文中使用且涵蓋許多高變區(qū)的敘述。Kabat互補(bǔ)決定區(qū)(OTR) 是以序列變異性為基礎(chǔ)的，而且是最常用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins of
Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothia 改為指結(jié)構(gòu)環(huán)的位置(Chothia and Lesk，J.Mol. Biol. 196 :901-917(1987))。AbM高變區(qū)代表Kabat CDR與Chothia結(jié)構(gòu)環(huán)之間的折衷，而 且得到Oxford Molecular的AbM抗體建模軟件的使用?！敖佑|”高變區(qū)是以對(duì)可獲得的復(fù) 合物晶體結(jié)構(gòu)的分析為基礎(chǔ)的。下文記錄了這些高變區(qū)中每一個(gè)的殘基。
環(huán) Kabat
AbM
Chothia 接觸
L1L24-L34
L2L50-L56
L3L89-L97
H1H31-H35B
L24-L34L26-L32L30-L36
L50-L56L50-L52L46-L55
L89-L97L91-L96L89-L96
H26-H35BH26-H32H30-H35B
權(quán)利要求
一種特異性結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白的分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合K48連接的多聚遍在蛋白或單遍在蛋白。
2.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)選自SEQID NO :59_110和112 任一之 HVR-H2 和 SEQ ID NO :7_58 和 111 任一之 HVR-L2 的高變(HVR)序列。
3.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)HVR-H2序列，其中HVR-H2包含 氨基酸序列a bcdefghijklmno ρ (SEQ ID NO :221)，其中氨基酸a選自氨基 酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是異亮氨酸；氨基酸c選自氨基酸絲氨酸、蘇氨酸、 丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和纈氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基酸e是酪氨酸；氨基酸f選 自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和組氨酸；氨基酸g是甘氨酸；氨基酸h選自氨基酸絲 氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是蘇氨酸；氨基酸j是絲氨酸；氨基酸 k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸η是絲氨酸；氨基酸ο是纈氨 酸；而氨基酸P是賴氨酸。
4.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)選自SEQID Ν0:59-110和112 之HVR-H2序列的HVR-H2序列。
5.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)選自SEQID Ν0:60、63、和66 之HVR-H2序列的HVR-H2序列。
6.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)HVR-L2序列，其中HVR-L2包含 氨基酸序列q r s t u ν w χ (SEQ ID NO :222)，其中氨基酸q選自氨基酸酪氨酸和苯丙氨 酸；氨基酸r選自氨基酸丙氨酸和絲氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t(yī)選自氨基酸絲氨酸、 精氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是絲氨酸；氨基酸ν是亮氨 酸；氨基酸w是酪氨酸；而氨基酸Χ是絲氨酸。
7.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)選自SEQID N0:7-58和111之 HVR-L2序列的HVR-L2序列。
8.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)選自SEQID N0:8、ll、和14之 HVR-L2序列的HVR-L2序列。
9.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)選自HVR-H2和HVR-L2的序列， 其中 HVR-H2 包含氨基酸序列 a bcdefghijklmno ρ (SEQ ID N0:221)，其中 氨基酸a選自氨基酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是異亮氨酸；氨基酸c選自氨基 酸絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和纈氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基酸e是酪 氨酸；氨基酸f選自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和組氨酸；氨基酸g是甘氨酸；氨基 酸h選自氨基酸絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是蘇氨酸；氨基酸j 是絲氨酸；氨基酸k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸η是絲氨 酸；氨基酸ο是纈氨酸；而氨基酸ρ是賴氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列q r s t u ν w x(SEQID NO :222)，其中氨基酸q選自氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸；氨基酸r選自氨基酸丙 氨酸和絲氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t(yī)選自氨基酸絲氨酸、精氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、 丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是絲氨酸；氨基酸ν是亮氨酸；氨基酸w是酪氨酸； 而氨基酸χ是絲氨酸。
10.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)HVR-H2序列和至少一個(gè) HVR-L2 序列，其中 HVR-H2 包含氨基酸序列 a b c d ef g h i j k 1 m no ρ (SEQ ID NO 221)，其中氨基酸a選自氨基酸酪氨酸、天冬氨酸和色氨酸；氨基酸b是異亮氨酸；氨基酸c 選自氨基酸絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、和纈氨酸；氨基酸d是脯氨酸；氨基 酸e是酪氨酸；氨基酸f選自氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、和組氨酸；氨基酸g是甘氨 酸；氨基酸h選自氨基酸絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、和色氨酸；氨基酸I是蘇氨酸； 氨基酸j是絲氨酸；氨基酸k是酪氨酸；氨基酸1是丙氨酸；氨基酸m是天冬氨酸；氨基酸 η是絲氨酸；氨基酸ο是纈氨酸；而氨基酸P是賴氨酸；且其中HVR-L2包含氨基酸序列q r stuvw χ(SEQ ID NO :222)，其中氨基酸q選自氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸；氨基酸r選自 氨基酸丙氨酸和絲氨酸；氨基酸s是丙氨酸；氨基酸t(yī)選自氨基酸絲氨酸、精氨酸、纈氨酸、 蘇氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、和亮氨酸；氨基酸u是絲氨酸；氨基酸ν是亮氨酸；氨基酸w是 酪氨酸；而氨基酸χ是絲氨酸。
11.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)選自SEQID N0:59-110和 112之HVR-H2序列的HVR-H2序列和至少一個(gè)選自SEQ ID NO :7_58和111之HVR-L2序列 的HVR-L2序列。
12.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)選自SEQID NO :60、63、和66 之HVR-H2序列的HVR-H2序列和至少一個(gè)選自SEQ ID NO :8、11、和14之HVR-L2序列的 HVR-L2 序列。
13.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含選自表B中 Apu3. A8-Apu3. HlO任一所列HVR-H2和HVR-L2氨基酸序列的HVR氨基酸序列。
14.權(quán)利要求1的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段包含選自表B中 Apu3. A8、Apu3. A12、和Apu3. B3任一所列HVR-H2和HVR-L2氨基酸序列的HVR氨基酸序列。
15.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少一個(gè)選自SEQIDNO 5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-Ll 序列和 SEQ ID NO 4之HVR-L3序列的HVR序列。
16.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少兩個(gè)選自SEQIDNO 5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-Ll 序列和 SEQ ID NO 4之HVR-L3序列的HVR序列。
17.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含至少三個(gè)選自SEQIDNO 5 之 HVR-Hl 序列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-Ll 序列和 SEQ ID NO 4之HVR-L3序列的HVR序列。
18.權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其包含SEQID NO 5之HVR-Hl序 列、SEQ ID NO 6 之 HVR-H3 序列、SEQ ID NO 3 之 HVR-Ll 序列和 SEQ ID NO 4 之 HVR-L3 序列。
19.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段對(duì)K63 連接的多聚遍在蛋白的親和力相對(duì)于親本Fab Apu2. 16的親和力有改善。
20.權(quán)利要求1-18任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段對(duì)K63 連接的多聚遍在蛋白的Kd小于或等于ΙΟηΜ。
21.一種與權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段結(jié)合多聚遍在蛋白上相同抗 原決定簇的分離的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合單遍在 蛋白。
22.—種與權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的抗體競(jìng)爭(zhēng)對(duì)多聚遍在蛋白的結(jié)合的分離的抗體或 抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段不特異性結(jié)合單遍在蛋白。
23.權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段特異性 結(jié)合K63連接的多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì)。
24.權(quán)利要求23的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段抑制K63連接的 多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì)降解。
25.權(quán)利要求23的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段調(diào)控至少一種由 多聚遍在蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
26.權(quán)利要求23的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段抑制至少一種由 多聚遍在蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
27.權(quán)利要求23的抗體或抗原結(jié)合片段，其中該抗體或抗原結(jié)合片段刺激至少一種由 多聚遍在蛋白介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑。
28.一種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段。
29.—種載體，其包含權(quán)利要求28的核酸。
30.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求29的載體。
31.一種細(xì)胞系，其能夠生成權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段。
32.—種生成權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段的方法，包括在該抗體或抗 原結(jié)合片段生成的條件下培養(yǎng)包含編碼該抗體或抗原結(jié)合片段的核酸分子的宿主細(xì)胞。
33.一種組合物，其包含有效量的權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的抗體或抗原結(jié)合片段和藥學(xué) 可接受載體。
34.一種鑒定樣品中K63連接的多聚遍在蛋白或K63連接的多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì) 的存在的方法，包括使該樣品與權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的至少一種抗體或抗原結(jié)合片段接 觸。
35.一種治療患者中與多聚遍在蛋白失調(diào)有關(guān)的疾病或狀況的方法，該方法包括對(duì)該 患者施用有效量的權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的至少一種抗體或抗原結(jié)合片段。
36.權(quán)利要求35的方法，其中該患者是哺乳動(dòng)物患者。
37.權(quán)利要求36的方法，其中該患者是人。
38.權(quán)利要求35的方法，其中該疾病選自癌癥、肌肉病癥、遍在蛋白途徑相關(guān)遺傳病 癥、免疫/炎性病癥、和神經(jīng)學(xué)病癥。
39.權(quán)利要求38的方法，其中該疾病選自癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤、白血病、肌營(yíng) 養(yǎng)不良、多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索硬化、囊性纖維化病、Angelman氏綜合征、利德爾綜合征、 阿爾茨海默氏病、帕金森氏病、皮克氏病、和佩吉特氏病。
40.一種測(cè)定懷疑含有K63連接的多聚遍在蛋白或K63連接的多聚遍在蛋白化的蛋白 質(zhì)的樣品中K63連接的多聚遍在蛋白或K63連接的多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì)的存在的方 法，包括使該樣品暴露于權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的至少一種抗體或抗原結(jié)合片段并測(cè)定該 至少一種抗體或抗原結(jié)合片段對(duì)該樣品中K63連接的多聚遍在蛋白或K63連接的多聚遍在 蛋白化的蛋白質(zhì)的結(jié)合。
41.一種將樣品中的K63連接的多聚遍在蛋白化的蛋白質(zhì)與非K63連接的多聚遍在蛋 白化的蛋白質(zhì)分開的方法，包括使該樣品與權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的至少一種抗體或抗原結(jié)合片段接觸。
42.一種測(cè)定細(xì)胞中K63連接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使該細(xì)胞 接觸權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的至少一種抗體或抗原結(jié)合片段并評(píng)估所述接觸步驟對(duì)該細(xì)胞 的影響。
43.一種測(cè)定樣品中K63連接的多聚遍在蛋白的功能和/或活性的方法，包括使該樣品 與權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)的至少一種抗體或抗原結(jié)合片段接觸并評(píng)估所述接觸步驟對(duì)該樣 品的影響。全文摘要
提供抗K63連接的多聚遍在蛋白單克隆抗體，及使用該抗體的方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101977934SQ200980109579
公開日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月18日
發(fā)明者瑪麗薩·L·瑪特蘇莫托, 羅伯特·F·凱莉 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司