專利名稱：Sfrp-3在評價心力衰竭中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種評估個體心力衰竭的方法，該方法包括以下步驟a)測量從個 體獲得的樣品中標(biāo)記分泌型卷曲相關(guān)蛋白3(SFRP_3)的濃度，b)任選測量樣品中一種或 多種其它心力衰竭標(biāo)記的濃度，并通過將步驟(a)中測定的濃度以及任選的在步驟(b)中 測定的濃度與對照樣品確立的所述一種或多種標(biāo)記的濃度進(jìn)行比較，來評估心力衰竭。 還公開了 SFRP-3作為標(biāo)記蛋白評估心力衰竭的用途，包括SFRP-3的標(biāo)記組合，以及用 于測量SFRP-3的試劑盒。
背景技術(shù)：
心力衰竭(HF)是危害大眾健康的一個重要問題，并且日趨嚴(yán)重。例如，在美 國，大約5百萬患者患有HF，并且每年超過550000名患者被首次診斷為HF(載于 American Heart Association, Heart Diseaseand Stroke Statistics 2008 Update, Dallas, Texas, American HeartAssociation(2008))。同樣，美國統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，對于每年1200萬 至1500萬個診所就診次數(shù)和650萬個住院日而言，HF是主要原因。從1990年至1999 年，每年以HF作為主要診斷結(jié)論住院治療的患者數(shù)量從大約81萬增長至超過100萬，以 HF作為主要或次要診斷結(jié)論的人數(shù)從240萬增至360萬。在2001年，接近53000名患 者死于HF作為主因的疾病。心力衰竭主要是老年人的病癥，因此，人們普遍認(rèn)為“人口 老齡化”也促使HF發(fā)病率增加。在年齡大于65歲的人群中，HF的發(fā)病率接近10%0。 僅僅在美國，2005年由HF引起的直接和間接損失總共估計約為$279億，并且每年在治 療HF的藥物上花費大約為$29億(參照上述引用的AHA-統(tǒng)計數(shù)據(jù))。心力衰竭心力衰竭的特征是心臟泵出身體所需血液量的能力喪失。衰竭并不意味著心臟 停止泵送，而是指不能有效地泵出血液。NYHA[紐約心臟協(xié)會(New York Heart Association)]和 ACC/AHA[美國心臟病學(xué) 十辦會 / 美國 A、臟協(xié)、會(American Associationof Cardiology/American Heart Association)]者β建
立了 HF的功能分類以評價該疾病的進(jìn)程。NYHA分類方案有四級疾病狀態(tài)1級為在 任何行為程度下均無癥狀，2級為在重體力行為下有癥狀，而III級和IV級分別在輕度行 為和無行為下有癥狀。在四階段的ACC/AHA方案中，階段A為無癥狀但有發(fā)展為HF的危險。階段 B有心臟功能紊亂的證據(jù)而無癥狀。在階段C中，有心臟功能紊亂的證據(jù)并伴有癥狀。 在階段D中，患者盡管受到最大程度的治療但仍有癥狀。HF的病原學(xué) 在醫(yī)學(xué)上，必須將心力衰竭(HF)理解為一種復(fù)合型疾病。它可能由觸發(fā)事件而 引起，比如心肌梗死(心臟病發(fā)作)，或者是其它病因的后續(xù)，比如高血壓、糖尿病或心 臟畸形(例如心瓣膜病)。心肌梗死或其它的HF病因會導(dǎo)致心臟泵送能力的初始減退， 例如因為損傷心肌。由于一種或多種代償機(jī)制的激活，可能不會感覺不到這種泵送能力 的減退。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HF的進(jìn)展與患者的血液動力狀態(tài)無關(guān)。因此，由疾病所引起的損害性變化已經(jīng)出現(xiàn)發(fā)展，而患者甚至仍無癥狀。事實上，在HF早期階段維持正常心血管功能的代償機(jī)制，實際上可能最終促進(jìn)了疾病的進(jìn)展，例如因為對心臟及其功能施 加有害作用從而維持足夠水平的血流循環(huán)。HF出現(xiàn)的一些更重要的病理生理變化有(i)下丘腦_垂體_腎上腺軸的活化， ( )全身性內(nèi)皮功能紊亂和Gii)心肌重塑。⑴專門針對拮抗下丘腦-垂體-腎上腺軸活化的治療包括β -腎上腺素能阻滯 劑(B-阻滯劑)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、某些鈣通道阻滯劑、硝酸鹽和內(nèi)皮 素-1阻滯劑。鈣通道阻滯劑和硝酸鹽雖然產(chǎn)生臨床改善，卻沒有明確顯示出能延長生存 期，而B-阻滯劑和ACE抑制劑已經(jīng)表現(xiàn)出明顯延長壽命，醛留酮拮抗藥也是如此。使 用內(nèi)皮素-1阻滯劑的實驗研究已展示出有益效果。( )全身性內(nèi)皮功能紊亂是HF的一種公知特征，在左心室功能紊亂體征出現(xiàn)時 會明顯表現(xiàn)。內(nèi)皮功能紊亂對于心肌微循環(huán)與心臟肌細(xì)胞的密切關(guān)系十分重要。該證 據(jù)表明微血管功能紊亂明顯促發(fā)肌細(xì)胞功能紊亂，并且導(dǎo)致進(jìn)行性心肌衰竭的形態(tài)學(xué)變 化。依據(jù)潛在的病理生理學(xué)，有證據(jù)表明內(nèi)皮功能紊亂可能由NO的相對缺乏所引 起，而NO的相對缺乏可以歸結(jié)為NADH依賴性氧化酶引起的血管O2生成增加和隨后的 NO過度清除。潛在的提高O2生成的作用因素包括升高的交感緊張性、去甲腎上腺素、 血管緊張素II、內(nèi)皮素-1和TNF-Ci。此外，相對于TNF-Ci水平，一種關(guān)鍵的抗炎細(xì) 胞因子IL-IO的水平過低。現(xiàn)在，人們認(rèn)為，TNF-Ci與相關(guān)的促炎細(xì)胞因子(包括IL-6 和可溶性TNF-α受體)的水平升高，通過引起心肌收縮性降低、雙心室膨大和血壓過低 而在HF的發(fā)展中起著重要作用，并且可能涉及內(nèi)皮細(xì)胞活化和功能紊亂。人們還認(rèn)為 TNF-α可能在嚴(yán)重HF患者中發(fā)生肌肉消瘦的這種至今仍無法解釋的現(xiàn)象中起作用。對 少數(shù)患者使用可溶性TNF受體療法的初步研究已顯示了對于NYHA功能分類及患者健康 狀況(依據(jù)對生活質(zhì)量指數(shù)的測量)的改善。(iii)心肌重塑是一個復(fù)雜過程，其伴隨著從無癥狀向有癥狀的心力衰竭轉(zhuǎn) 變，并可被描述成心肌內(nèi)的一系列適應(yīng)性改變，例如心室形狀、質(zhì)量和體積的改變 (Piano, M.R.等人，J.Cardiovasc.Nurs. 14 (2000) 1-23 ； Molkentin，J.D., Ann.Rev. Physiol.63 (2001) 391-426)。心肌重塑的主要內(nèi)容是肌細(xì)胞生物學(xué)的改變，如肌細(xì)胞肥 大，因為壞死或凋亡而引起的肌細(xì)胞損失，胞外基質(zhì)的改變和左心室腔的幾何學(xué)改變。 還不清楚心肌重塑是否只是受到長期神經(jīng)激素刺激產(chǎn)生的毒性效應(yīng)數(shù)年之后發(fā)生的終末 器官效應(yīng)，或者心肌重塑是否獨立地促使心力衰竭進(jìn)展。迄今為止的證據(jù)提示，適當(dāng)?shù)?治療可以減緩或停止心肌重塑的進(jìn)展。標(biāo)記和疾病狀態(tài)如上所述，肌細(xì)胞肥大可能代表發(fā)展至HF的最初步驟之一。肌細(xì)胞肥大的特征 為某些編碼收縮蛋白(如P-肌球蛋白重鏈和肌鈣蛋白T(TnT))的基因和一些非收縮蛋白 (如A型和B型利鈉肽)的表達(dá)升高，細(xì)胞體積增加和細(xì)胞骨架變化(Piano，M.R.等人， J.Cardiovasc.Nurs.14 (2000) 1-23 ； Molkentin, J.D., Ann.Rev.Physiol.63 (2001) 391-426)。對人類和動物心力衰竭模型的研究表明，在心力衰竭的后期，肌細(xì)胞功能降 低?，F(xiàn)已表明，導(dǎo)致肌細(xì)胞功能紊亂的機(jī)制涉及鈣處理網(wǎng)絡(luò)、肌絲和細(xì)胞支架的改變(deTombe, P.P., Cardiovasc.Res.37 (1998) 367-380)。例如，在心力衰竭的人類和動物模型 中，肌漿網(wǎng)鈣-ATP酶的酶活性降低，而肌膜NaVCa2+交換器的mRNA水平和蛋白水平 都得以提高。而且，在心力衰竭的人類和動物模型中都具有TnT的同種型轉(zhuǎn)換、肌鈣蛋 白I(TnI)磷酸化減少、肌纖維肌動球蛋白ATP酶活性降低和微管形成增加。最初，導(dǎo)致心肌重塑的心臟改變是為了補(bǔ)償心肌病變部分，以維持身體對氧和 營養(yǎng)的需要。但是，心力衰竭的代償期是有限的，于是在最后，衰竭的心臟不能維持足 夠滿足身體需求的心輸出量。因此，將會從代償期轉(zhuǎn)變?yōu)槭Т鷥斊?。在失代償期?nèi)，心 臟級聯(lián)變化持續(xù)但不再是有利的，這使得患者的心力衰竭發(fā)展為慢性狀態(tài)并最終死亡。根據(jù)“ACC/AHA 2005成年人慢性心力衰竭的診斷和管理的更新指南)” (S. Hunt等人，www.acc.org = ACC/AHA實踐指南),如今，在心力衰竭領(lǐng)域內(nèi)，該疾病進(jìn) 程被分為如上所述的四個階段。在階段A和B中，發(fā)現(xiàn)個體處于心力衰竭發(fā)展的危險 中，而階段C和D表示這些患者組顯示了心力衰竭的體征和癥狀。A至D不同階段定義 的詳細(xì)說明如上述參考資料中給出，通過引用包括在本文中。心力衰竭的診斷方法評價HF患者唯一最有效的診斷測試是采用全面的2維超聲心動圖聯(lián)同多普勒血 流研究，以確定心肌、心臟瓣膜或心包是否出現(xiàn)異常，以及涉及哪些腔室。必須考慮三 個基本問題DLVEF是維持還是減少，2) LV結(jié)構(gòu)是正常還是異常，和3)是否還有其它 可以解釋臨床表現(xiàn)的結(jié)構(gòu)異常，如瓣膜、心包或右心室的異常？該信息應(yīng)該由EF的數(shù)值 預(yù)期、心室尺度和/或體積的測量、壁厚度的測量和腔室的幾何結(jié)構(gòu)以及局部室壁活動 的評價來量化。應(yīng)該評估右心室的大小以及收縮性能。此外還應(yīng)該半定量地確定心房的 大小并測量左心房的尺度和/或體積。對于EF保持或減少的患者來說，在進(jìn)行超聲心動描記時獲得的非侵襲性血液動 力學(xué)數(shù)據(jù)是重要的附加關(guān)聯(lián)指標(biāo)。綜合二尖瓣輸入模型、肺靜脈輸入模型和二尖瓣環(huán)流 速的組合定量提供了關(guān)于LV充盈和左房壓特征的數(shù)據(jù)。評定三尖瓣回流梯度以及測量下 腔靜脈的尺度及其在呼吸過程的反應(yīng)，可估算收縮肺動脈壓和中心靜脈壓。心搏量可以聯(lián)合尺度測量和LV流出道的脈沖多普勒加以確定。但是，在沒有 HF時，這些參數(shù)的任何一項都可能出現(xiàn)異常。這些參數(shù)沒有一個必然與HF特異關(guān)聯(lián)； 然而，總體正常的充盈模型可排除臨床HF。由臨床觀點來看，該疾病在代償期和失代償初期無臨床癥狀(階段A完全無癥 狀，階段B有結(jié)構(gòu)性心臟病但沒有HF的體征和癥狀，參考ACC/AHA實踐指南)。直到 徹底進(jìn)入失代償期(即依照ACC/AHA指南的階段C和D)，疾病的外部體征(如氣促) 才會出現(xiàn)?，F(xiàn)行的診斷方式基于階段C和D的患者的外部癥狀。通常，心力衰竭患者接受使用符合心力衰竭特異性機(jī)制的藥物的標(biāo)準(zhǔn)治療。沒 有診斷性試驗?zāi)芸煽康胤从衬切┨禺悪C(jī)制并幫助醫(yī)師為適當(dāng)?shù)幕颊哌x擇適當(dāng)?shù)乃幬?和 劑量)(例如ACE抑制劑、AT II、阻滯劑等等)。用標(biāo)記早期診斷HF 似乎可能僅由生化標(biāo)記對具有心力衰竭風(fēng)險的患者進(jìn)行早期評估，因為有發(fā)展 心力衰竭風(fēng)險的個體在那個階段仍是沒有HF臨床癥狀的?，F(xiàn)在尚無確定的生化標(biāo)記能在 該疾病癥狀出現(xiàn)前進(jìn)行可靠評估?，F(xiàn)在到了確立HF診斷的時候，該疾病已經(jīng)有了深度發(fā)展。近年來，利 鈉肽家族，尤其是心房利鈉肽家族和腦利鈉肽家族，被證明對評估 HF有重要價值。HF的預(yù)后和需求至少部分因為滯后的診斷，50%的HF患者在診斷后兩年之內(nèi)死亡。5年生存率 小于30%。急需有助于心力衰竭早期診斷的新型生化標(biāo)記。已批準(zhǔn)對心力衰竭風(fēng)險個體(即無心力衰竭臨床癥狀的個體)早期評估的改進(jìn)方案。近年來，已經(jīng)將B型利鈉肽標(biāo)記確定為一種監(jiān)測HF患者疾病進(jìn)程的良好手段， 并用其評估患者心血管并發(fā)癥如心臟病發(fā)作的風(fēng)險。然而，對于其它很多診斷方面，單一標(biāo)記是不夠的。盡管NT-proBNP值低是排除HF或LV的非常好的陰性預(yù)測指標(biāo)值，但在上述的 和其它的研究(參考Triepels R.H.等人，Clin.Chem.49，SuppLA (2003) 37-38)中，已發(fā) 現(xiàn)心力衰竭的陽性預(yù)測值在50-60%的范圍內(nèi)。因此，可用于評估個體心力衰竭風(fēng)險的標(biāo) 記具有很高的臨床/實踐重要性，這樣的標(biāo)記獨立具有較高的HF陽性預(yù)測率，或者，相 對于單獨的NT-proBNP，其組合NT-proBNP具有更好的HF陽性預(yù)測率。在這個臨床上非常重要并急需的診斷領(lǐng)域中，輔助評估心力衰竭患者的標(biāo)記對 于取得更深遠(yuǎn)的技術(shù)進(jìn)步也意義重大。發(fā)明_既述現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)并確定，標(biāo)記分泌型卷曲相關(guān)蛋白3(SFRP_3)能輔助評估心力衰 竭。在一個實施方案中，它可幫助評估個體是否具有發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險。在進(jìn)一步的 方面，它可以輔助評估疾病的進(jìn)展。在另一個實施方案中，它可以輔助預(yù)測心力衰竭的 發(fā)生。在另一個實施方案中，它能輔助評估并選擇一種適當(dāng)?shù)闹委煼桨敢灶A(yù)防或治療心 力衰竭。本文公開一種評估個體心力衰竭的方法，其包括以下步驟測量從該個體獲得 的樣品中標(biāo)記SFRP-3的濃度；任選測量樣品中一種或多種其它心力衰竭標(biāo)記的濃度； 并通過將SFRP-3的濃度和任選的所述一種或多種其它標(biāo)記的濃度與對照樣品確定的所述 一種或多種標(biāo)記的濃度進(jìn)行比較，來評估心力衰竭。本發(fā)明還涉及使用蛋白SFRP-3作為標(biāo)記分子在心力衰竭評估中的用途。本文進(jìn)一步公開了包括SFRP-3和一種或多種其它心力衰竭標(biāo)記的標(biāo)記組合在評 估心力衰竭中的用途。本文還提供實施體外評估心力衰竭方法的試劑盒，所述方法包括以下步驟測 量樣品中標(biāo)記SFRP-3的濃度；任選測量樣品中一種或多種其它的心力衰竭標(biāo)記的濃度； 并通過將SFRP-3的濃度和任選的一種或多種其它標(biāo)記的濃度與用參考群體中確定的所述 一種或多種標(biāo)記的濃度進(jìn)行比較，以評估心力衰竭，該試劑盒包括特異性測定SFRP-3所 需試劑和任選特異性測定一種或多種其它心力衰竭標(biāo)記的所需試劑。本發(fā)明的其它方面和優(yōu)點將通過隨后的描述而變得明顯。然而，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng) 提及本發(fā)明的優(yōu)選實施方案時，提供的詳細(xì)描述和具體實施例僅作為示例說明，因為本 領(lǐng)域技術(shù)人員由該詳細(xì)描述顯而易見在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的各種變化和修改。
發(fā)明詳述在第一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種評估個體心力衰竭的方法，其包括以下步驟a)測量從該個體獲得的樣品中標(biāo)記SFRP-3的濃度，b)任選測量樣品中一種或多 種其它心力衰竭標(biāo)記的濃度，和c)通過將步驟(a)中測得的濃度和任選的步驟(b)測得 的濃度與對照樣品確定的所述一種或多種標(biāo)記的濃度比較，以評估心力衰竭。在本文中，以下每一個術(shù)語都具有與其在本節(jié)中相關(guān)的意義。本文使用的冠詞“一個”或“一種”是指一或超過一(即至少一)的該冠詞的 語法客體。例如，“一種抗體”表示一種抗體或一種以上的抗體。表述“一或更多”、“一種或多種”表示1至50，優(yōu)選1到20，也優(yōu)選2、3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 12 或 15。本文使用的術(shù)語“標(biāo)記”或“生化標(biāo)記”是指一種分子，該分子用作分析患者 的測試樣品的靶標(biāo)。在一個實施方案中，這些分子靶標(biāo)的實例是蛋白質(zhì)或多肽。在本 發(fā)明中用作標(biāo)記的蛋白或多肽預(yù)計包括所述蛋白的天然片段，特別是免疫學(xué)可檢測的片 段。免疫學(xué)可檢測的片段優(yōu)選包含所述標(biāo)記多肽的至少6、7、8、10、12、15或20個連 續(xù)氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，細(xì)胞釋放的蛋白或細(xì)胞外基質(zhì)中存在的蛋白可能 被損壞，比如在炎癥階段，并且可被降解或者裂解成這樣的片段。某些標(biāo)記以非活性的 形式合成，隨后可能通過蛋白水解被活化。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，蛋白質(zhì)或其片段也 可以作為復(fù)合物的一部分存在。這些復(fù)合物也可能用作本發(fā)明意義上的標(biāo)記。此外，或 替代地，標(biāo)記多肽可以帶有翻譯后修飾。翻譯后修飾的實例有糖基化、酰化和/或磷酸 化等等。術(shù)語“評估/評價心力衰竭”用于表示本發(fā)明的方法將輔助醫(yī)師評估個體是否 具有發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險，或輔助醫(yī)師在一個或幾個其它HF診斷相關(guān)方面評估HF患 者。在評估HF個體時，優(yōu)選的診斷方面有心力衰竭的分期、鑒別診斷急性和慢性心力衰 竭、判斷疾病發(fā)展的風(fēng)險、指導(dǎo)選擇適當(dāng)?shù)乃幬?、監(jiān)控治療反應(yīng)和隨訪HF患者。就本發(fā)明而言，“心力衰竭標(biāo)記”是一種標(biāo)記，該標(biāo)記如果與標(biāo)記SFRP-3組 合，就會為正在進(jìn)行的診斷增加評估HF的相關(guān)信息。對評估HF而言，將所述標(biāo)記納入 已包含標(biāo)記SFRP-3的標(biāo)記組合，如果在給定特異性下的靈敏度或如果在給定靈敏度下的 特異性可分別提高，則該信息被認(rèn)為是相關(guān)的或具有附加價值。優(yōu)選地，靈敏度或特異 性的提高分別具有統(tǒng)計學(xué)上的顯著水平ρ = 0.05、0.02、0.01或更低。優(yōu)選所述一種或 多種心力衰竭的其它標(biāo)記選自利鈉肽標(biāo)記、心肌肌鈣蛋白標(biāo)記和炎癥標(biāo)記。本文使用的術(shù)語“樣品”是指為了進(jìn)行體外評價而獲取的生物樣品。在本發(fā) 明方法中，樣品或患者樣品可優(yōu)選包含任何體液。優(yōu)選的試驗樣品包括血液、血清、血 漿、尿液、唾液和關(guān)節(jié)液。優(yōu)選樣品是全血、血清、血漿或關(guān)節(jié)液，血漿或血清是最方 便的樣品種類。技術(shù)人員將會知道，任何這樣的評估均在體外進(jìn)行。然后丟棄患者樣 品。患者樣品僅僅用于本發(fā)明的體外方法，并且患者樣品中的物質(zhì)不會回輸給患者身 體。一般地，樣品是液體樣品，例如，全血、血清或血漿?！皩?.....濃度與對照樣品確定的濃度進(jìn)行比較”的表述僅用于進(jìn)一步說明對于技
術(shù)人員來說顯而易見的內(nèi)容。對照樣品可以是內(nèi)部對照樣品或外部對照樣品。在一個實 施方案中，使用內(nèi)部對照樣品，即評估受試樣品中的標(biāo)記水平，以及評估取自于同一受試者的一個或更多個其它樣品中的標(biāo)記水平，以確定所述標(biāo)記水平是否有任何的變化。 在另一個實施方案中，使用外部對照樣品。對于外部對照樣品，將來自某個體的樣品中 標(biāo)記的存在或數(shù)量與另一個體中該標(biāo)記的存在或數(shù)量進(jìn)行比較，后一體已知患有某種給 定病癥或已知具有某種給定病癥的風(fēng)險；或者一個個體已知沒有給定病癥，即“正常個 體”。例如，患者樣品中的標(biāo)記水平可與已知與HF特定病程有關(guān)的水平相比較。通常， 樣品標(biāo)記水平直接或間接與診斷相關(guān)，并且例如標(biāo)記水平用于例如確定個體是否具有HF 風(fēng)險?；蛘?，樣品的標(biāo)記水平例如可以與已知與以下情況有關(guān)的標(biāo)記水平相比較HF患 者對治療的反應(yīng)、急性和慢性心力衰竭的鑒別診斷、指導(dǎo)選擇適當(dāng)?shù)乃幬镏委烪F、鑒別 疾病發(fā)展風(fēng)險或隨訪HF患者。根據(jù)計劃的診斷用途，選擇適當(dāng)?shù)膶φ諛悠?，并且確定 其中標(biāo)志物的對照值或參考值。技術(shù)人員將認(rèn)識到，在一個實施方案中這些對照樣品是 從參考群體獲得的，該群體年齡匹配并且沒有混雜的疾病。同時技術(shù)人員明了，在對照 樣品中確定的標(biāo)記絕對值將取決于所用的測定。對照(參考)值用來自于適當(dāng)參考群體 的100位明確表征的個體的優(yōu)選樣品確定。還優(yōu)選的是，可以選擇參考群體由20、30、 50、200、500或1000個個體組成。健康個體為確定對照值的優(yōu)選參考群體。分泌型卷曲相關(guān)蛋白3 (SFRP-3)Wingless(Wnt)蛋白是分泌性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的大家族，所述分子調(diào)節(jié)發(fā)育的至 關(guān)重要的方面，包括細(xì)胞命運特化、增殖、存活、遷移和粘附(參見Nusse，R.，Cell Res.15 (2005) 28-32)。Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)由經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑組成。在經(jīng)典Wnt信 號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，鏈接素是關(guān)鍵介導(dǎo)物。Wnt受體結(jié)合活化胞內(nèi)胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子 Dishevelled,其又失活一般磷酸化β -鏈接素的蛋白復(fù)合體，并靶向其使其降解。然而， 在Wnt刺激時，抑制降解復(fù)合體使得高水平的β-鏈接素在細(xì)胞核中累積，在細(xì)胞核中其 活化Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄。盡管經(jīng)典Wnt途徑介導(dǎo)許多Wnt作用，但某些Wnt調(diào)節(jié)的過程是非β -鏈接 素依賴性的。因此，非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)經(jīng)常歸結(jié)于稱為Ca2+/蛋白激酶C(PKC)和 RhoA/JNK途徑這兩種途徑中的一種(參見Veeman，M.T.等人，Developmental Cell 5(2003)367-377)。分泌性卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)是可溶性蛋白家族。因為其與卷曲(Fz)受體上的 Wnt結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源，所以SFRP被表征為Wnt拮抗劑。SFRP直接結(jié)合Wnt蛋白，并 阻斷經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 人SFRP家族包含5個成員。它們同時被發(fā)現(xiàn)，以不同的組別命名，但 現(xiàn)在統(tǒng)稱為SFRP 1-5。 在1996年，在牛軟骨提取物中鑒別出SFRP家族的第一 個成員(現(xiàn)在叫做SFRP-3)，并作為成軟骨因子分離(Hoang，B.等人，J.Biol. Chem.271 (1996) 26131-26137,表明了在骨骼形態(tài)發(fā)生中的作用)。序列比較和系統(tǒng)發(fā) 生分析表明，SFRP1、SFRP2和SFRP5密切相關(guān)，且亞組中的簇共同分化自由相關(guān)的 SFRP-3和SFRP4形成的簇。SFRP折疊成兩個獨立的結(jié)構(gòu)域。N-末端包含分泌性信號肽，后接富含半胱氨 酸的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域被提出為Wnt結(jié)合區(qū)。SFRP蛋白的C末端部分的特征在于帶正 電荷的殘基的區(qū)段和鄰接的6個半胱氨酸殘基。分泌型卷曲相關(guān)蛋白3( = SFRP-3)為36kD蛋白，這是一種模蛋白，已知在多種人類組織中分泌，包括胎盤、心臟、腦、骨骼肌、腎臟和胰腺、肺以及肝臟。在文 獻(xiàn)中，該分子還被稱為FRE ； FRITZ ； FZRB ； FRP 3 ；卷曲相關(guān)蛋白；FRZB PEN ； hFIZ ； FRZB 1 ；卷曲相關(guān)蛋白 1 ； OASF、OA。迄今還沒有明確確定SFRP-3的生物學(xué)作用。實驗數(shù)據(jù)涉及SFRP-3的不同作 用，并已由 Bovolenta, P.等人(J.Cell Sci.121 (2008) 737-746)綜述。在胎兒和胚 胎發(fā)育過程中，SFRP-3主要在骨中表達(dá)，這暗示其在骨骼發(fā)育中的 作用。最近的研究已揭示，SFRP-3是腫瘤抑制劑候選物。SFRP-3的表達(dá)經(jīng)常被 多種癌癥中的啟動子過度甲基化沉默。已表明恢復(fù)的SFRP-3表達(dá)在體外抑制細(xì)胞 生長，并在體內(nèi)抑制腫瘤生長。SFRP-3被描述為在侵襲性癌癥中缺失或被下 調(diào)，所 述癌癥例如乳腺、胃、子宮頸、肝細(xì)胞和前列腺腫瘤(Shi，Y.等人，Acta Pharmacal Sin.28(2007) 1499-1504)。已報道SFRP-3的多形性與骨關(guān)節(jié)炎易感性相關(guān)(Rodriguez-Lopez，J.等人， Ann.Rheum.Dis.66 (2007) 1052-1055)。一項檢測過載誘導(dǎo)型心力衰竭的研究表明，SFRP-3和SFRP-4的mRNA 水平與促凋亡的Fas/Fas拮抗比率的表達(dá)無關(guān)(Schumann，H.等人，Cardiovasc. Res.45 (2000) 720-728)。另外，在罹患肌肉萎縮癥的患者中檢測到SFRP_3mRNA的差異 表達(dá)(Chen，Y.-W.等人，J.Cell.Biology 151 (2000) 1321-1336)。幾個專利文獻(xiàn)涉及將SFRP作為診斷劑、預(yù)防劑和治療劑用于各種完全不同的疾 病的潛在用途。WO 2004/053063涉及在核酸或蛋白水平上差異表達(dá)的SFRP-3的檢測，用于對 罹患多發(fā)性骨髓瘤的患者診斷骨疾病。WO 2006/081379使用免疫測定SFRP-3評價細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)活性 的存在情況。US 2004/849643要求保護(hù)SFRP-3治療骨病的用途，W02006/130076更具體地
涉及SFRP-3治療骨關(guān)節(jié)炎的用途。WO 2007/082733公開了免疫測定血清和或尿液中的循環(huán)SFRP-3，以及其任選 用于檢測多囊性腎病的診斷應(yīng)用。WO 2005/070448推測，SFRP-3可以用于診斷和治療多種多樣的免疫和增殖性 疾病。其宣稱SFRP-3可以用作卵巢、結(jié)腸、胰腺、間皮瘤、乳腺、腎臟、子宮頸和膀 胱腫瘤的治療劑。另外其宣稱，SFRP-3也可以用于治療炎癥或者治療自身免疫性疾病， 以及用于治療骨或軟骨疾病。WO 2008/031009提供了多種用于與細(xì)胞Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和Wnt介導(dǎo)的障礙(包括 癌癥)相關(guān)的診斷和治療用途的嵌合Wnt拮抗劑。一種構(gòu)建物包含SFRP-3的序列。WO 2004/050894描述了篩選治療充血性心力衰竭的潛在治療性化合物的方法。 列出了 90種以上的mRNA序列，這些序列涉及心力衰竭的發(fā)展和內(nèi)源性心肌恢復(fù)及修 復(fù)機(jī)制。這些序列提供了篩選潛在治療性化合物的基礎(chǔ)。其中列出的一種基因序列為 SFRP-3的基因序列。WO 1999/000138描述了 SFRP-3治療阿爾茨海默病的用途。
WO 2007/022515描述了 SFRP-3減少與缺血性病癥相關(guān)的細(xì)胞死亡和/或組織 損傷的用途。WO 2004/103394涉及SFRP-3作為治療劑在神經(jīng)再生調(diào)節(jié)方面的用途。 WO 2004/113513推測了藥物組合物中的多種SFRP(例如SFRP-3)調(diào)節(jié)患者干 細(xì)胞的增殖、分化或增殖和分化這二者的用途。應(yīng)當(dāng)看到，在先有技術(shù)中，并不知道體液中蛋白SFRP-3的存在情況或水平對評 價心力衰竭具有診斷用途。本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)并確定，來自個體的體液樣品中的SFRP-3測定值升高 代表心力衰竭。將對照組或?qū)φ杖后w中測得的SFRP-3值用于例如確定截止值或參考范圍。數(shù) 值高于該截止值或超出參考范圍及其高端，就表示數(shù)值升高了。在一個實施方案中，確定了固定的截止值。根據(jù)診斷目標(biāo)選定截止值。在一個實施方案中，將對照組或?qū)φ杖后w測得的SFRP-3值用于確定參考范圍。 在優(yōu)選的實施方案中，如果測量值高于參考范圍的90%，則SFRP-3濃度被認(rèn)為升高。 在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，如果測量值高于參考范圍的95%、96%, 97%或97.5%， 則SFRP-3濃度被認(rèn)為升高。在一個實施方案中，對照樣品為內(nèi)部對照樣品。在該實施方案中，從研究的個 體中獲得系列樣品并比較標(biāo)記水平。這樣可能對例如評價療效有用。本發(fā)明的方法基于從個體獲得的液體樣品，并基于這些樣品中的SFRP-3測量。 本文使用的“個體”指單個人類或非人類生物體。因此，在此描述的方法和組合物可應(yīng) 用到人類和獸醫(yī)疾病。優(yōu)選的個體是人。標(biāo)記SFRP-3優(yōu)選通過使用特異結(jié)合試劑由液體樣品特異性測定。特異性結(jié)合試劑例如為SFRP-3受體，結(jié)合SFRP-3的凝集素或SFRP-3的抗 體。特異性結(jié)合試劑對其相應(yīng)的靶分子具有至少107l/mol的親合力。特異性結(jié)合試劑 對靶分子優(yōu)選具有IO8IAnoU甚至更優(yōu)選IO9IAnol的親合力。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解， 術(shù)語特異性用于表示存在于樣品中的其它生物分子不能與SFRP-3特異性結(jié)合試劑明顯結(jié) 合。優(yōu)選地，與非靶分子的生物分子結(jié)合的結(jié)合親合力僅僅為與靶分子的親合力的10% 或更小，更優(yōu)選僅5%或更小。優(yōu)選的特異性結(jié)合試劑應(yīng)具有上述親合力以及特異性的最 低標(biāo)準(zhǔn)。特異性結(jié)合試劑優(yōu)選是與SFRP-3反應(yīng)的抗體。術(shù)語“抗體”指多克隆抗體、 單克隆抗體、這些抗體的抗原結(jié)合片段、單鏈抗體以及包括抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的遺傳構(gòu)建 體?？梢允褂萌魏伪Ａ羯鲜鎏禺愋越Y(jié)合試劑標(biāo)準(zhǔn)的抗體片段?？贵w可通過目 前工藝水平步驟生產(chǎn)，例如 Tijssen 所述(Tijssen，P.，Practice andtheory of enzyme immunoassays, Elsevier Science Publishers B.V.， Amsterdam (1990),全書，特另ll是 43—78 頁)。此外，技術(shù)人員非常了解基于可用于抗體特異性分離的免疫吸附劑的方法。通過 這些方法，多克隆抗體的質(zhì)量及其由此在免疫測定中的性能將得以提高(Tijssen，P.,上 文，108-115 頁)。對于在本發(fā)明中公開的成果，可以使用在山羊中產(chǎn)生的多克隆抗體。顯然也可以使用得自不同物種(例如大鼠、兔子或豚鼠)的多克隆抗體以及單克隆抗體。因為單克 隆抗體能以恒定性能按需要的任意量生產(chǎn)，所以它們是開發(fā)臨床常規(guī)測定的理想工具。在本發(fā)明的方法中，抗SFRP-3單克隆抗體的產(chǎn)生和使用分別代表其它的優(yōu)選實 施方案。從天然來源純化SFRP-3并不容易。SFRP-3的重組生產(chǎn)是獲得更高數(shù)量SFRP-3 的可選方法。在一個優(yōu)選實施方案中，使用真核表達(dá)系統(tǒng)重組表達(dá)生產(chǎn)SFRP-3。真核 表達(dá)系統(tǒng)的實例是桿狀病毒表達(dá)、在酵母中表達(dá)以及在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。在一 個優(yōu)選實施方案中，SFRP-3表達(dá)在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行。哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)的實例 為CHO細(xì)胞、HEK細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞等等。在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，重組生產(chǎn)的 SFRP-3用作抗原，以生產(chǎn)抗SFRP-3的多克隆或單克隆抗體。也優(yōu)選利用本文上述方法 重組生產(chǎn)的SFRP-3，通過在SFRP-3免疫吸附劑上進(jìn)行免疫吸附來純化多克隆抗體?，F(xiàn)在，技術(shù)人員應(yīng)理解，SFRP-3已被鑒定為有效評估HF的標(biāo)記，可用替代方 法獲得與本發(fā)明成果相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。例如，可使用產(chǎn)生抗體的替代策略。這樣的策略包括 使用合成肽或重組肽，這些肽代表SFRP-3的臨床相關(guān)免疫表位。或者，可以使用DNA 免疫(又稱做DNA接種免疫)。對于測量，將從個體獲得的液體樣品和SFRP-3的特異性結(jié)合試劑在適合形成 結(jié)合試劑SFRP-3復(fù)合體的條件下溫育。這樣的條件無須特別指定，因為技術(shù)人員即便 沒有任何創(chuàng)造性勞動也可以很容易地鑒定這些適當(dāng)?shù)臏赜龡l件。測定結(jié)合試劑SFRP-3 復(fù)合體的數(shù)量并用于HF的評估。技術(shù)人員應(yīng)理解，有許多方法可測定特異性結(jié)合試劑 SFRP-3復(fù)合體的數(shù)量，這些方法在相關(guān)教科書中均有詳細(xì)描述(參見例如Tijssen P.，上 文，Diamandis, E.P.禾口 Christopoulos，T.K.(編輯)，Immunoassay, Academic Press, Boston (1996))。優(yōu)選地，以夾心型測定形式檢測SFRP-3。在這種測定中，用第一特異性結(jié)合 試劑從一側(cè)捕獲SFRP-3，另一側(cè)使用帶有能直接或間接檢測的標(biāo)記的第二特異性結(jié)合試 齊IJ。優(yōu)選地，在定性(有或無SFRP-3)或定量(確定SFRP-3的量)的免疫測定中使用 抗SFRP-3的抗體。如在實施例部分詳細(xì)描述的，已經(jīng)將兩種小鼠模型用于通過先進(jìn)的微陣列和蛋 白組方法鑒定存在于實驗動物心臟組織中的mRNA和多肽。然而，這些模型得到至少部 分矛盾的數(shù)據(jù)，當(dāng)然，mRNA或相應(yīng)多肽的組織數(shù)據(jù)并不能代表這些多肽在循環(huán)中的有 或無。在一個模型中被發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的標(biāo)記可能不在第二個模型中差異表達(dá)，或者，在 又一個模型中甚至顯示出矛盾的數(shù)據(jù)?？梢园l(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的mRNA與循環(huán)中相應(yīng)多肽的 增強(qiáng)水平不相關(guān)。即使蛋白可以在組織中差異表達(dá)，但如果從體液中測定，大多數(shù)情況 下，這種蛋白沒有任何診斷性關(guān)聯(lián)，因為它可能不被釋放至循環(huán)中，可能變成片段或者 被修飾，例如從細(xì)胞或者組織釋放時，可能在循環(huán)系統(tǒng)中不穩(wěn)定，可能在循環(huán)中不能被 檢測，可能對于特定的疾病不是特異性的，等等。令人驚訝的是，本發(fā)明的發(fā)明人能檢測體液樣品中的蛋白SFRP-3。更令人驚訝 的是，他們 能證明在這種獲自個體的液體樣品中SFRP-3的存在情況可以與HF相關(guān)聯(lián)。 使用標(biāo)記SFRP-3評估HF無需組織和活檢樣品。測量蛋白SFRP-3的水平在HF領(lǐng)域被 認(rèn)為是非常有益的。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法是以血清作為液體樣品材料進(jìn)行的。在 一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法是以血漿作為液體樣品材料進(jìn)行的。在另一個 優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法是以全血作為液體樣品材料進(jìn)行的。

在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及蛋白SFRP-3作為標(biāo)記分子從獲自個體 的液體樣品來評價心力衰竭的用途。用于診斷的理想情況應(yīng)是其中單一事件或者過程會導(dǎo)致相應(yīng)疾病的情況，例如 傳染病。在其它所有的病例中，正確的診斷可能是很難的，尤其是該疾病的病原學(xué)沒有 被充分認(rèn)識時，HF就是這種情況。技術(shù)人員應(yīng)理解，在HF領(lǐng)域，針對某一診斷問題， 沒有生化標(biāo)記在診斷上有100%特異性并同時具有100%靈敏度。相反，生化標(biāo)記以某種 可能性或者預(yù)測值用于評估潛在的診斷問題。技術(shù)人員十分熟悉通常用來計算所評價的 診斷指標(biāo)的相對危險性或者可能性的數(shù)學(xué)/統(tǒng)計學(xué)方法。在常規(guī)臨床實踐中，醫(yī)師在診 斷、治療和處置潛在疾病時通常會同時考察各種的臨診癥狀和生物標(biāo)志。優(yōu)選地，在本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，用于評估HF的方法如下進(jìn)行 測量SFRP-3和一種或多種其它標(biāo)記的濃度，并利用SFRP-3和所述一種或多種其它標(biāo)記 的濃度評估HF。在HF評估中，標(biāo)記SFRP-3將會在以下一個或更多個方面輔助醫(yī)師評估個 體患心力衰竭的風(fēng)險或者評估患有心力衰竭的患者，例如想鑒定心力衰竭的階段；區(qū)分 急性和慢性心力衰竭；判斷疾病進(jìn)程的風(fēng)險；對選擇適當(dāng)治療提供指導(dǎo)；監(jiān)測患者對治 療的反應(yīng)；以及監(jiān)測病程，即隨訪HF患者。篩選(評估個體是否有發(fā)生心力衰竭的風(fēng) 險)在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及評估個體是否有發(fā)展心力衰竭風(fēng)險的體 外方法，其包括以下步驟測量樣品中標(biāo)記SFRP-3的濃度；任選測量樣品中一種或多 種心力衰竭的其它標(biāo)記的濃度；并通過將該SFRP-3濃度和任選測量的所述一種或多種其 它標(biāo)記的濃度與所述一種或多種標(biāo)記濃度的參考值比較，來評價所述個體發(fā)生心力衰竭 的風(fēng)險。從本發(fā)明角度上講，篩選涉及相關(guān)個體發(fā)生或出現(xiàn)心力衰竭風(fēng)險的無偏差評 估。而這種篩選在理論上可以對任何樣品進(jìn)行，在臨床實踐中，這種篩選通常會給予具 有以某種方式發(fā)生心力衰竭風(fēng)險的個體。如上所述，這樣的個體可以無臨床癥狀，即他 們沒有HF的體征或者癥狀。在一個優(yōu)選實施方案中，將對具有發(fā)展心力衰竭風(fēng)險的個體 進(jìn)行HF篩選，例如屬于按ACC/AHA實踐指南定義的階段A或B。如上所述，心力衰竭是發(fā)達(dá)國家中最主要的、花費高的威脅生命的疾病之一。 因為它的高發(fā)病率且長時間無癥狀期，為了干預(yù)并阻斷該病程(如果可能的話)，對于個 體發(fā)生HF風(fēng)險的鑒定將變得極其重要。只有盡早進(jìn)行風(fēng)險評估，才可能阻止HF病程從 無癥狀期進(jìn)入有癥狀期。心力衰竭風(fēng)險的評估是通過數(shù)學(xué)/統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行的，技術(shù)人員對這些方法有 充分的認(rèn)識和理解。優(yōu)選地，個體患心力衰竭的風(fēng)險以相對值表示，并按所謂的相對風(fēng) 險性( = RR)給出。為了計算這種心力衰竭的RR，將SFRP-3的個體數(shù)值與在參考群體 中確定的SFRP-3數(shù)值進(jìn)行對比，參考群體優(yōu)選為不發(fā)生心力衰竭的健康個體。還優(yōu)選 對這種心力衰竭RR的評估基于在研究期內(nèi)(優(yōu)選一年或者也可優(yōu)選兩年之內(nèi))發(fā)展心力衰竭的個體群和在相同研究期內(nèi)未發(fā)展心力衰竭的個體群。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及標(biāo)記SFRP-3篩選心力衰竭的用途。如技術(shù)人員所知，術(shù)語“用作標(biāo)記”表示通過適當(dāng)手段對標(biāo)記分子的濃度進(jìn)行定量后，用 測得的標(biāo)記值指示(即標(biāo)示)疾病的有無或者臨床狀況的有無。用于定量的適當(dāng)手段例 如為特異性結(jié)合試劑，如抗體。優(yōu)選地，對懷疑將出現(xiàn)心力衰竭的風(fēng)險個體實施HF篩選。在該意義上，具有未 來心力衰竭風(fēng)險的患者是已診斷有高血壓、動脈粥樣硬化疾病、糖尿病、肥胖和代謝綜 合征的患者。優(yōu)選地，對患有高血壓、動脈粥樣硬化疾病、糖尿病和/或代謝綜合征的 個體評估未來心力衰竭的風(fēng)險。還優(yōu)選使用標(biāo)記SFRP-3對按照ACC/AHA實踐指南定義的階段B的個體(即呈 現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)改變但沒有顯示心力衰竭癥狀的個體)評估未來心力衰竭風(fēng)險。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及使用SFRP-3作為HF標(biāo)記組合中的一 種標(biāo)記用于篩選HF。在篩選中，SFRP-3的水平升高是個體發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險增加的陽性指標(biāo)?；颊叩姆旨壴谝粋€優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及輔助對心力衰竭患者分級的體外方法， 其包括以下步驟a)測量樣品中標(biāo)記SFRP-3的濃度，b)任選測量樣品中一種或多種心 力衰竭的其它標(biāo)記的濃度，并通過將在步驟(a)中測定的濃度和任選步驟(b)中測定的 濃度與所述一種或多種標(biāo)記濃度的參考值進(jìn)行比較，來對心力衰竭進(jìn)行分級。優(yōu)選地， 標(biāo)記SFRP-3的水平用于輔助將受試個體分入個體組，這些組為臨床“正?！?即按照 ACA/ACC分類在階段A的個體)、具有結(jié)構(gòu)性心臟病但無癥狀的患者(按照ACA/ACC 分類的階段B)和心力衰竭患者組(即按照ACA/ACC分類處于階段C或階段D的患者)。區(qū)別急性心臟事件和慢性心臟病在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及輔助鑒別診斷急性心臟事件和慢性心臟 病的體外方法，其包括以下步驟測量樣品中標(biāo)記SFRP-3的濃度；任選測量樣品中一 種或多種心力衰竭的其它標(biāo)記的濃度；并通過將步驟(a)測定的濃度和任選步驟(b)中測 定的濃度與這個標(biāo)記或這些標(biāo)記濃度的參考值進(jìn)行比較，來確立對急性心臟事件和慢性 心臟病的鑒別診斷。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉“急性心臟事件”和“慢性心臟病”的含義。優(yōu)選地，“急性心臟事件”涉及心臟的急性狀況、疾病或機(jī)能紊亂，特別指急 性心力衰竭，例如心肌梗死(MI)或心律失常。根據(jù)MI的程度，其可能后續(xù)LVD和 CHF。優(yōu)選地，“慢性心臟病”是心臟功能的減弱，例如，由于心臟缺血、冠狀動脈 病或前期的特別小的心肌梗死(也許后續(xù)發(fā)生進(jìn)行性LVD)造成。其也可能是由炎性疾 病、心臟瓣膜缺陷(例如二尖瓣缺陷)、擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病、心臟節(jié)奏缺陷 (心律失常)和慢性阻塞性肺病造成的虛弱。因此，慢性心臟病顯然也可以包括患有急性 冠狀動脈綜合征如MI的患者，但他們當(dāng)前沒有急性心臟事件。區(qū)分急性心臟事件和慢性心臟病十分重要，因為急性心臟事件和慢性心臟病可 能要求相當(dāng)不同的治療方案。例如對于急性心肌梗塞患者，再灌注早期治療可能極度重要。而對慢性心力衰竭患者進(jìn)行再灌注治療，最多是對這個患者無害或僅僅是幾乎無害。 在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，標(biāo)記SFRP-3用于鑒別診斷急性和慢性心 力衰竭。評估疾病進(jìn)展的風(fēng)險在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種評估HF患者疾病進(jìn)展風(fēng)險的體外方 法，其包括以下步驟測量樣品中標(biāo)記SFRP-3的濃度；任選測量樣品中一種或多種心 力衰竭的其它標(biāo)記的濃度；并通過將該SFRP-3濃度和任選測定的所述一種或多種其它標(biāo) 記濃度與所述一種或多種標(biāo)記的濃度參考值比較，來確定所述個體疾病進(jìn)展的風(fēng)險。目前，很難以合理的可能性評估乃至預(yù)言一位診斷患有HF的患者是否具有或 多或少的穩(wěn)定狀態(tài)，或疾病是否將會發(fā)展，以及患者的健康狀態(tài)是否可能惡化。在臨床 上，心力衰竭的嚴(yán)重性和進(jìn)展通常通過評估臨床癥狀來確定，或者，使用成像技術(shù)(如 超聲波心動描記術(shù))鑒定有害變化來確定。在一個實施方案中，心力衰竭的惡化是通過 監(jiān)測左側(cè)心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)來確定的。LVEF減少5%或更多就被認(rèn)為是疾病進(jìn)展或
T^ ο因此，在進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及使用標(biāo)記SFRP-3評估患有HF 的患者疾病進(jìn)展風(fēng)險。在患有HF的患者的疾病進(jìn)展評估中，SFRP-3水平的升高指示疾 病進(jìn)展的風(fēng)險升高。指導(dǎo)選擇適當(dāng)?shù)腍F療法在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及輔助選擇適當(dāng)?shù)腍F療法的體外方法，其 包括以下步驟測量樣品中標(biāo)記SFRP-3的濃度；任選測量樣品中一種或多種心力衰竭 的其它標(biāo)記的濃度，并通過將該SFRP-3濃度和任選測定的所述一種或多種其它標(biāo)記濃度 與所述一種或多種標(biāo)記的濃度的參考值比較，來選擇適當(dāng)?shù)寞煼?。預(yù)期標(biāo)記SFRP-3能輔助醫(yī)師從目前心力衰竭領(lǐng)域的各種治療方案中選擇最適當(dāng) 的治療方案。因此，更優(yōu)選的實施方案涉及使用標(biāo)記SFRP-3為HF患者選擇治療方案。監(jiān)測患者對療法的反應(yīng)在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種監(jiān)測患者對HF治療反應(yīng)的體外方 法，其包括以下步驟a)測量樣品中標(biāo)記SFRP-3的濃度，b)任選測量樣品中一種或多 種心力衰竭的其它標(biāo)記的濃度，并通過將步驟(a)測定的濃度和任選步驟(b)測定的濃度 與所述一種或多種標(biāo)記的濃度的參考值比較，來監(jiān)測患者對HF療法的反應(yīng)。或者，上述用于監(jiān)測患者對療法反應(yīng)的方法可以通過如下實施確定治療前后 的SFRP-3和任選的一種或多種其它標(biāo)記的標(biāo)記水平并對治療前后的標(biāo)記水平加以比較。心力衰竭的診斷在臨床上是確立的。根據(jù)本發(fā)明，如果患者達(dá)到ACC/AHA實 踐指南定義的階段C或D的標(biāo)準(zhǔn)，則認(rèn)為HF在臨床上是確立的。依據(jù)這些指南，階段 C指患者具有結(jié)構(gòu)性心臟病并有心力衰竭的較早或當(dāng)前癥狀。階段D的患者是具有難治 性心力衰竭的患者，他們需要專門的干預(yù)。進(jìn)一步如上所示，測得的NT-proBNP值與心力衰竭的嚴(yán)重性密切相關(guān)。然而， BNP和NT-proBNP在監(jiān)測患者對療法的反應(yīng)上似乎均不理想，參見例如Beck-da_Silva， L.等人，Congest.Heart Fail. 11 (2005) 248-253，quiz 254-255。標(biāo)記SFRP-3看來適于監(jiān)測患者對療法的反應(yīng)。本發(fā)明因此也涉及使用SFRP-3監(jiān)測患者對療法的反應(yīng)。在該診斷領(lǐng)域，標(biāo)記SFRP-3還可以用于確定在治療之前的基 線值，并測定在治療之后的一個時間點或幾個時間點的SFRP-3。在HF患者的隨訪中， SFRP-3的水平升高是有效的HF治療的陽性指示。標(biāo)記組合 生化標(biāo)記可以單獨測定，或者，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，它們可以用 基于芯片或基于珠的陣列技術(shù)同時測定。然后用每個標(biāo)記的截止值獨立解釋生物標(biāo)記的 濃度，或?qū)⑺鼈兘M合起來解釋，即它們形成標(biāo)記組合。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可以用不同的方法實施并完成將標(biāo)記水平與某種可能性 或風(fēng)險聯(lián)系起來的步驟。優(yōu)選地，將標(biāo)記SFRP-3和一種或多種其它標(biāo)記的測定值用數(shù) 學(xué)的方法進(jìn)行組合，然后將該組合值與潛在的診斷問題關(guān)聯(lián)?？梢杂萌魏文壳斑m當(dāng)?shù)臄?shù) 學(xué)法將標(biāo)記值與SFRP-3的測量數(shù)據(jù)組合起來。應(yīng)用于標(biāo)記組合的數(shù)學(xué)算法優(yōu)選邏輯函數(shù)。應(yīng)用這種數(shù)學(xué)算法或這種邏輯函數(shù) 的結(jié)果優(yōu)選單一值。視潛在的診斷問題而定，該值可以很容易地與例如個體患心力衰竭 的風(fēng)險關(guān)聯(lián)起來，或者，與例如有益于評估HF患者的其它預(yù)定診斷應(yīng)用關(guān)聯(lián)起來。在一 個優(yōu)選的方式中，該邏輯函數(shù)如下獲得a)將個體分成組，例如正常個體組、心力衰竭 風(fēng)險個體組、急性或慢性心力衰竭患者組等，b)用單變量分析法鑒定這些組之間有顯著 相異的標(biāo)記，c)邏輯回歸分析以評估在評估這些不同的組時有用的標(biāo)記的獨立判別值， 和d)構(gòu)建邏輯函數(shù)來組合獨立判別值。在這類分析中，所述標(biāo)記不再是獨立的，而是代 表標(biāo)記組合。在一個優(yōu)選的實施方案中，如下獲得用于組合SFRP-3值和另外至少一個標(biāo)記值 的邏輯函數(shù)a)將個體分別地分入正常組和心力衰竭風(fēng)險個體組，b)確立SFRP-3的值 和另外至少一個標(biāo)記的值，C)進(jìn)行邏輯回歸分析，和d)構(gòu)建邏輯函數(shù)來組合SFRP-3的 標(biāo)記值和另外至少一個標(biāo)記的值。用于將標(biāo)記組合與疾病關(guān)聯(lián)的邏輯函數(shù)，優(yōu)選使用通過應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)方法開發(fā)得 到的算法。適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法例如判別分析(DA)(即線性DA、二次方程DA、正則 化DA)、核方法(即SVM)、非參數(shù)法(即k-最近-相鄰分級法)、PLS (偏最小二乘 法)、基于樹狀法(即邏輯回歸、CART、隨機(jī)Forest法、Boosting/Bagging法)、廣義 線性模型(即邏輯回歸)、基于主分量的方法(即SIMCA)、廣義加性模型、基于模糊邏 輯的方法、基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該能夠選擇適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計 方法來評價本發(fā)明的標(biāo)記組合，并藉此獲得適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)算法。優(yōu)選用統(tǒng)計學(xué)方法來獲得 用于評估心力衰竭的數(shù)學(xué)算法，該統(tǒng)計學(xué)方法選自DA(即線性、二次方程、正則化的判 別分析)、核方法(即SVM)、非參數(shù)法(即k-最近-相鄰分級法)、PLS (偏最小二乘 法)、基于樹狀法(即邏輯回歸、CART、隨機(jī)Forest法、Boosting方法)或廣義線性模 型(即邏輯回歸)。關(guān)于這些統(tǒng)計學(xué)方法的詳細(xì)描述可見于以下的參考文獻(xiàn)Ruczinski， I.等人，J.of Computational and GraphicalStatistics 12(2003)475-511 ； Friedman, J.H., J.of the American StatisticalAssociation 84(1989) 165-175 ； Hastie, Τ.等人，The Elements ofStatistical Learning, Springer Verlag (2001) ； Breiman, L.等 人，Classification and regression trees, Wadsworth International Group, California(1984) ； Breiman, L., Machine Learning 45(2001) 5—32 ; Pepe, M.S.， The Statistical Evaluation of Medical Testsfor Classification andPrediction, Oxford Statistical Science Series, 28, Oxford University Press (2003)；禾Π Duda，R.O.等人，Pattern Classification，John Wiley & Sons，Inc.,第 2
版，(2001)。本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是將優(yōu)化多變量截止值用于生物標(biāo)記的潛在組合， 并區(qū)分狀態(tài)A和狀態(tài)B，例如，分別區(qū)分正常個體和心力衰竭風(fēng)險個體、對治療有反應(yīng) 的HF患者和治療失敗的HF患者、急性心力衰竭患者和慢性心力衰竭HF患者、顯示疾 病進(jìn)展的HF患者和未顯示疾病進(jìn)展的患者。受試者工作曲線以下的面積(=AUC)指示診斷程序的有效性或正確性。診 斷方法的正確性最好是由它的受試者工作特征(ROC)來描述(特別見Zweig，M.H.和 Campbell, G.，Clin.Chem.39 (1993) 561-577)。ROC圖是從連續(xù)改變所觀測的整個數(shù)據(jù) 范圍內(nèi)的判定閾得到的全部靈敏度/特異性配對的繪圖。實驗室試驗的臨床效果取決于它診斷的準(zhǔn)確性，或取決于將受試者正確分類為 臨床相關(guān)亞群的能力。診斷準(zhǔn)確性能衡量該試驗正確區(qū)別研究對象兩種不同情況的能 力。這兩種不同情況例如為健康與疾病或者有疾病進(jìn)展與沒有疾病進(jìn)展。在每個病例中，ROC曲線圖通過在判定閾全范圍中繪制靈敏度對1-特異性的 曲線來描述兩種分布之間的重疊。y軸是靈敏度，或真陽性分?jǐn)?shù)[按(真陽性測定結(jié)果 數(shù))/(真陽性測定結(jié)果數(shù)+假陰性測定結(jié)果數(shù))確定]。這也被稱為疾病或病癥存在的陽 性。它僅由受影響亞群計算得到。X軸是假陽性分?jǐn)?shù)，或1-特異性[按(假陽性結(jié)果 數(shù))/(真陰性結(jié)果數(shù)+假陽性結(jié)果數(shù))確定]。它是特異性的指標(biāo)，完全由未受影響亞群 計算得到。因為真假陽性分?jǐn)?shù)通過使用來自兩種不同亞群的試驗結(jié)果完全分開計算，所 以ROC曲線圖與樣品中的疾病流行性無關(guān)。曲線圖上的每個點均表示靈敏度/1-特異性 配對，其對應(yīng)于一個特定的判定閾。辨別力很好的測定(兩種結(jié)果分布沒有重疊)具有 的ROC曲線圖穿過左上角，其真陽性分?jǐn)?shù)為1.0或100% (非常好的靈敏度)，假陽性分 數(shù)是0(非常好的特異性)。對于一個無辨別力的測定(兩組的結(jié)果分布相同)來說，理 論曲線圖是一條從左下角到右上角的45°對角線。大多數(shù)曲線在這兩個極端之間。(如 果ROC曲線圖完全落在45°對角線下，則這種情況很容易補(bǔ)救，即通過顛倒“陽性”標(biāo) 準(zhǔn)，從“大于”到“小于”，或反之亦然)。在性質(zhì)上，曲線圖越接近左上角，測定的 總精度越高。 定量實驗室試驗的診斷準(zhǔn)確性的一個便利目的是通過單一數(shù)字來表示它的效 果。最常用的總體量度是ROC曲線下的面積(AUC)。按照慣例，該面積總?cè)绻?是這樣，人們可以顛倒判定規(guī)則來使它如此)。數(shù)值介于1.0 (非常好地分開兩組測試值) 和0.5(兩組測試值無明顯的分布差異)之間。該面積不僅僅依賴曲線圖的特定部分，如 最接近對角線的點或在90%特異性處的靈敏度，而是整個曲線圖。這是一個定量的、描 述性的表達(dá)式，表示ROC曲線圖接近完美(面積=1.0)的程度?？偟臏y定靈敏度取決于特異性，該特異性是實踐本文公開的方法所需要的。在 某些優(yōu)選的設(shè)定中，75%的特異性可能是足夠的，并且統(tǒng)計方法和結(jié)果算法可以基于 該特異性需求。在一個優(yōu)選的實施方案中，應(yīng)用于評估個體心力衰竭風(fēng)險的方法基于 80%, 85%的特異性，或者，還優(yōu)選90%或95%的特異性。如上所述，標(biāo)記SFRP-3有助于評估個體發(fā)生心力衰竭的風(fēng)險，還有助于體外診斷性評估患有心力衰竭的患者。因此，一個優(yōu)選實施方案是使用SFRP-3作為評估心力 衰竭的標(biāo)記分子。使用包括SFRP-3和一種或多種其它HF標(biāo)記的標(biāo)記組合來評估HF患者或評估個體患HF風(fēng)險代表了本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案。在這樣的標(biāo)記組合中，一種或多 種其它的標(biāo)記優(yōu)選選自利鈉肽標(biāo)記、心肌肌鈣蛋白標(biāo)記和炎癥標(biāo)記?？膳cSFRP-3測量組合的一種或多種優(yōu)選的其它HF標(biāo)記優(yōu)選是或者選自利鈉肽 標(biāo)記、心肌肌鈣蛋白標(biāo)記和炎癥標(biāo)記。這些優(yōu)選的其它標(biāo)記的測量優(yōu)選地與SFRP-3的測 量組合，或者形成包括SFRP-3在內(nèi)的HF標(biāo)記組合的一部分，以下分別更詳細(xì)地討論。利鈉肽標(biāo)記在本發(fā)明意義上，利鈉肽標(biāo)記是選自心房利鈉肽(ANP)家族的標(biāo)記，或是選自 腦利鈉肽(BNP)家族的標(biāo)記。心房利鈉肽家族或腦利鈉肽家族中的多肽標(biāo)記都源自于相應(yīng)活性激素的前原形 式。本發(fā)明優(yōu)選的利鈉肽標(biāo)記是NT-proANP、ANP> NT-proBNP、BNP和可用免疫
法檢測的其生理片段。技術(shù)人員很容易理解，可用免疫法檢測的片段必須包括至少一個 表位，以允許特異性檢測這樣的生理片段。生理片段是天然存在于個體循環(huán)中的片段。兩種利鈉肽家族中的標(biāo)記代表相應(yīng)激素原(分別是proANP和proBNP)的片段。 因為對于兩個家族的考慮是相似的，所以僅對BNP標(biāo)記家族作略微詳細(xì)描述。BNP家 族的激素原，即proBNP，由108個氨基酸組成。proBNP被剪切成為32個C末端氨基 酸(77-108)，其代表有生物活性的激素BNP，和叫做N末端proBNP (或NT-proBNP)的 N末端氨基酸1-76。BNP、N末端proBNP (1-76)以及進(jìn)一步的分解產(chǎn)物(Hunt，P.J.等 人，Biochem.Biophys.Res.Com.214(1995) 1175-1183)在血液中循環(huán)。完整的前體分子 (proBNP 1-108)是否也存在于血漿中現(xiàn)在還不完全明確。不過有論述(Hunt，P.J.等人， Peptides 18(1997) 1475-1481)指出，proBNP(1-108)在血漿中的低釋放量是可檢測的， 但由于在其N末端的非?？焖俚木植拷到猓恍┌被崾侨笔У摹，F(xiàn)在普遍接受例如對 于NT-proBNP，該分子于氨基酸10至50之間的中心部分代表生理上更穩(wěn)定的部分。包 括該中心部分的NT-proBNP分子能從體液中可靠測定?；诿庖叻z測該NT-proBNP 分子中心部分的方法在WO 00/45176中有詳細(xì)的公開內(nèi)容，讀者可以參考該文獻(xiàn)了解細(xì) 節(jié)。僅測定NT-proBNP的某一亞組份可能更有利，對此已提出了術(shù)語天然NT-proBNP。 關(guān)于此NT-proBNP亞組份的詳細(xì)公開內(nèi)容見于WO 2004/099253。技術(shù)人員將在那里找 到所有必需的指導(dǎo)。優(yōu)選地，測定的NT-proBNP是(或?qū)?yīng)于)使用來自德國Roche Diagnostics 的Elecsys NT-proBNP 測定檢測的 NT-proBNP。應(yīng)用NT-proBNP進(jìn)行預(yù)分析是有效的，這樣可使樣品轉(zhuǎn)移至中心實驗室變得 容易(Mueller，Τ.等人，Clin.Chem.Lab.Med.42 (2004) 942-944)。血樣可以在室溫下存 儲幾天，或可郵寄或運輸，而沒有回收率的損失。相反，將BNP在室溫下或4°C儲存 48小時可能造成至少20%的濃度損失(Mueller，Τ.等人，上文；Wu，A.H.等人，Clin. Chem.50 (2004) 867-873)。在篩選某些群體的HF中已經(jīng)對腦源的利鈉肽家族(尤其是BNP和NT-proBNP) 進(jìn)行了徹底的研究。這些標(biāo)記，尤其是NT-proBNP的發(fā)現(xiàn)，是相當(dāng)鼓舞人心的。NT-proBNP的值甚至在無癥狀“患者”中升高，明確預(yù)示了 “心臟問題”(Gremmler， B.等人，Exp.Clin.Cardiol.8 (2003) 91-94)。這些作者表明，升高的 NT-proBNP 顯示了 ‘心-腎不適’的存在，并應(yīng)該迅速安排進(jìn)一步檢查。與幾個其它小組研究人員相一 致，Gremmler等人也發(fā)現(xiàn)了 NT-proBNP濃度異常對于排除群體中的HF和排除氣喘患 者中的左心室功能紊亂(=LVD)是準(zhǔn)確的診斷性試驗。陰性BNP或NT-proBNP值排 除HF或LVD的作用被其它組研究人員確證，參考如McDonagh，Τ.Α.等人，Eur.J.Heart Fail.6 (2004) 269-273 ；禾Π Gustafsson，F(xiàn).等人，J.Card.Fail.ll，增刊 5 (2005) S 15-20。

BNP主要在心室中產(chǎn)生(雖然不是唯一的)，并在壁壓力升高時釋放。因此， BNP釋放的增加主要反映了心室功能紊亂或發(fā)生于心房但影響到心室的功能紊亂，例 如，通過流入量減少或血容量過載。與BNP相反，ANP主要從心房產(chǎn)生并釋放。因此 ANP的水平可能主要反映心房的功能。ANP和BNP是活性激素，與其相應(yīng)的非活性對應(yīng)物NT_proANP和NT-proBNP
相比，具有較短的半衰期。BNP在血液中被代謝，而NT-proBNP則作為完整的分子在 血液中循環(huán)，并通過腎臟除去。NT-proBNP的體內(nèi)半衰期比BNP長120分鐘，BNP的 體內(nèi)半衰期為 20 分鐘(Smith，M.W.等人，J.Endocrinol. 167 (2000) 239-246)。因此，取決于時間過程或目標(biāo)特性，對活性形式或非活性形式的利鈉肽進(jìn)行測 量可能是有益的。在個體心力衰竭風(fēng)險的評估中，測定的SFRP-3值優(yōu)選與NT-proANP和/或 NT-proBNP的值相組合。NT-proBNP的值優(yōu)選與SFRP-3的值相組合。類似的考慮適 用于選擇適當(dāng)?shù)寞煼?、鑒別疾病進(jìn)展的風(fēng)險和監(jiān)測疾病的過程。SFRP-3用于評估患者對療法的反應(yīng)時，優(yōu)選將其檢測與ANP或BNP的測量組 合起來。SFRP-3用來區(qū)分急性和慢性心力衰竭時，優(yōu)選的標(biāo)記組合包括SFRP-3、ANP 或 proANP 和 BNP 或 proBNP。心肌肌鈣蛋白標(biāo)記術(shù)語心肌肌鈣蛋白涉及肌鈣蛋白I和肌鈣蛋白T的心臟同種型。按上述已說明 的，術(shù)語標(biāo)記也涉及標(biāo)記分子的生理變異體，如生理片段或復(fù)合體。對于心肌肌鈣蛋白 標(biāo)記，已知它們的生理學(xué)存在的復(fù)合體具有診斷價值，并因此明確包含在本發(fā)明內(nèi)。肌鈣蛋白T具有約37.000Da的分子量。發(fā)現(xiàn)于心臟組織的肌鈣蛋白T同 種型(CTnT)與骨骼肌TnT有相當(dāng)大的區(qū)別，以至于可以生產(chǎn)抗體來判別這兩種TnT 同種型。TnT被認(rèn)為是急性心肌損傷的標(biāo)記；參見Katus，H.A.等人，J.Mol.Cell. Cardiol.21 (1989) 1349-1353 ； Hamm, C.W.等人，N.Engl.J.Med.327 (1992) 146-150 ； Ohman, E.M.等人，N.Engl.J.Med.335 (1996) 1333-1341 ； Christenson，R.H.等人，Clin. Chem.44 (1998) 494-501 ；禾Π EP 0 394 819。肌鈣蛋白I(TnI)是肌鈣蛋白復(fù)合物的抑制元件，為25kDa，存在于肌肉組織 中。TnI在沒有Ca2+時結(jié)合肌動蛋白，抑制肌動球蛋白的ATP酶活性。存在于心臟 組織的TnI同種型(cTnl)與骨骼肌TnI有40 %的差異，使得可以用免疫法判別兩種同 種型。cTnl的正常血漿濃度小于0.1ng/ml(4pM)。cTnl在心臟細(xì)胞死亡后釋放進(jìn)入 血流中；因此，在有急性心肌梗塞的患者中血漿cTnl濃度升高(Benamer，H.等人，Am.J.Cardiol.82 (1998) 845-850)。 肌鈣蛋白I和T獨特的心臟同種型讓它們可以通過免疫法與其它的骨骼肌肌鈣蛋 白加以區(qū)別。因此，由損傷心肌釋放進(jìn)入血液的肌鈣蛋白I和T可以特異性地與心臟組 織損傷相關(guān)?，F(xiàn)在技術(shù)人員也知道，心肌肌鈣蛋白可從循環(huán)中檢出，其可是游離態(tài)或者 復(fù)合物組成部分(參考例如 US 6,333,397、US 6,376,206 和 US 6,174,686)。在評估個體患心力衰竭的風(fēng)險以及評估已患心力衰竭的患者的時候，測定的 SFRP-3值優(yōu)選與肌鈣蛋白T和/或肌鈣蛋白I心臟同種型的值相結(jié)合。與標(biāo)記SFRP-3 組合使用的優(yōu)選心肌肌鈣蛋白是心肌肌鈣蛋白T。炎癥標(biāo)記技術(shù)人員對術(shù)語炎癥標(biāo)記是熟悉的。優(yōu)選的炎癥標(biāo)記是白介素_6、C-反應(yīng)蛋 白、血清淀粉樣蛋白A和SlOO蛋白。白介素-6(IL_6)是一種21kDa的分泌性蛋白質(zhì)，它具有多種生物活性，可分為 參與紅細(xì)胞生成作用的活性和參與活化先天免疫反應(yīng)的活性。IL-6是急性期反應(yīng)物并刺 激多種蛋白(包括粘著分子)的合成。它的主要功能是介導(dǎo)急性期肝臟蛋白的生產(chǎn)，細(xì)胞 因子IL-I和TNF-α誘導(dǎo)它的合成。IL_6通常是由巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。IL_6 的正常血清濃度小于5pg/ml。C-反應(yīng)蛋白(CRP)是一種同型五聚體Ca2+結(jié)合急性期蛋白，具有參與宿主防御 的21kDa亞基。CRP的合成可被IL-6誘導(dǎo)，并被IL-I間接誘導(dǎo)，因為IL-I可以通過肝 血竇的Kupffer細(xì)胞觸發(fā)合成IL-6。在90 %的健康群體中CRP的正常血漿濃度小于3 μ g/ ml(30nM)，在99%的健康個體中小于10 μ g/ml (IOOnM)。例如血漿的CRP濃度可以通 過血清淀粉樣蛋白A( = SAA)來測定，血清淀粉樣蛋白A是一種11.7kDa的低分子量急 性期蛋白。它主要由肝臟響應(yīng)于IL-1、IL-6或TNF-Ci刺激合成，并參與調(diào)控T細(xì)胞依 賴性免疫反應(yīng)。在急性事件中，SAA的濃度增加至1000倍，達(dá)到1毫克/毫升。它可 以用來監(jiān)測在如囊性纖維化、腎移植排斥、外傷或感染的多種疾病中的炎癥。在類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎的某些病例中已被用于替代CRP，但是SAA仍然沒有被廣泛認(rèn)可。SlOO蛋白形成不斷擴(kuò)大的Ca2+結(jié)合蛋白家族，該家族現(xiàn)在包括20個以上的 成員。SlOO蛋白的生理性相關(guān)結(jié)構(gòu)是一種同二聚體，但有些也可以互相形成異二聚 體，例如S100A8和S100A9。其細(xì)胞內(nèi)功能涵蓋調(diào)控蛋白質(zhì)磷酸化、酶活性或涉及細(xì) 胞增殖和分化的細(xì)胞骨架動力學(xué)。因為某些SlOO蛋白也可以從細(xì)胞中釋放，其胞外 功能現(xiàn)在也已有描述，例如神經(jīng)元存活、星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡以及炎性過程 的調(diào)控。S100A8、S100A9、異二聚體S100A8/A9以及S100A12已經(jīng)在炎癥中發(fā)現(xiàn)， S100A8對慢性炎癥應(yīng)答，而S100A9、S100A8/A9和S100A12在急性炎癥中增多。已 發(fā)現(xiàn)S100A8、S100A9、S100A8/A9和S100A12與有炎性成分的不同疾病有關(guān)聯(lián)，包括 某些癌癥、腎同種異體移植排斥、結(jié)腸炎，最重要的是與RA有關(guān)聯(lián)(Burmeister，G.和 Gallacchi, G.，Inflammopharmacology 3 (1995) 221-230 ； Foell, D.等人，Rheumathology 42(2003) 1383-1389)。例如，對于本發(fā)明使用的標(biāo)記組合，在用于評估個體HF風(fēng)險或 HF患者時，最優(yōu)選的SlOO標(biāo)記是S100A8、S100A9、S100A8/A9異二聚體和S100A12。sE-選擇蛋白(可溶的內(nèi)皮性白細(xì)胞粘著分子-1，ELAM-1)是一種115kDa的 I型跨膜糖蛋白，只在內(nèi)皮細(xì)胞上并僅受炎性細(xì)胞因子(IL-1 β、TNF-α)或內(nèi)毒素活化后表達(dá)。細(xì)胞表面的E-選擇蛋白是白細(xì)胞轉(zhuǎn)動附著至內(nèi)皮的介導(dǎo)物，該過程是白細(xì)胞在炎癥位點外滲的必需步驟，由此該蛋白在局部炎性反應(yīng)中具有重要作用。在健康個體 的血液中存在可溶性E-選擇蛋白，這可能是由于表面表達(dá)的分子被蛋白酶剪切后生成 的。已有報道稱，在許多病理狀況下血清中的sE-選擇蛋白水平升高(Gearing，A.J.和 Hemingway, I., Ann.N.Y.Acad.Sci.667 (1992) 324-331)。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及將SFRP-3作為HF的標(biāo)記分子與一種或多 種HF標(biāo)記分子組合用于對得自個體的液體樣品進(jìn)行HF評價。如上所示，在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，SFRP-3的測定值至少與至少另一種選自以 下標(biāo)記的值組合利鈉肽標(biāo)記、心肌肌鈣蛋白標(biāo)記和炎癥標(biāo)記。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及使用SFRP-3和NT-proBNP的標(biāo)記組合評 估心力衰竭的用途。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及使用SFRP-3和肌鈣蛋白T的標(biāo)記組合評估 心力衰竭的用途。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及使用SFRP-3和CRP的標(biāo)記組合評估心力衰 竭的用途。在一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及包括標(biāo)記SFRP-3、肌鈣蛋白T、 NT-proBNP和CRP的標(biāo)記組合。在再一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及用于在體外通過生化標(biāo)記評估HF的 方法的標(biāo)記組，所述方法包括測量樣品中SFRP-3和一種或多種其它HF標(biāo)記的濃度，并 使用測定的濃度評估HF。本發(fā)明的標(biāo)記組優(yōu)選用蛋白陣列技術(shù)測定。陣列是可尋址的個體標(biāo)記集合。 這樣的標(biāo)記可以在空間上被尋址，如包含于微量滴定板中或印在平面表面的陣列，其 中每個標(biāo)記存在于不同的X和Y軸坐標(biāo)?；蛘撸瑯?biāo)記也可根據(jù)標(biāo)簽、珠、納米顆粒 或物理性質(zhì)來尋址。微陣列可按照普通技術(shù)人員已知的方法(參見如US 5,807,522 ； Robinson, W.H.等人，Nat.Med.8 (2002) 295-301 ； Robinson，W.H.等人，Arthritis Rheum.46 (2002) 885-893)制備。本文使用的陣列是指任何具有多種可尋址標(biāo)記的免疫學(xué) 測定。在一種實施方案中，可尋址標(biāo)記是抗原。在另一個實施方案中，可尋址元件是自 身抗體。微陣列是小型化形式的陣列。本文使用的抗原是指任何可以特異性結(jié)合于抗體 的分子。術(shù)語自身抗體在本領(lǐng)域已有明確的定義。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及蛋白陣列，其包括標(biāo)記SFRP-3和任選的一 種或多種HF的其它標(biāo)記。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及蛋白陣列，其包括標(biāo)記SFRP-3和 NT-proBNP。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及蛋白陣列，其包括標(biāo)記SFRP-3和肌鈣蛋白 T。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及蛋白陣列，其包括標(biāo)記SFRP-3和CRP。在一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及包括標(biāo)記SFRP-3、肌鈣蛋白T、 NT-proBNP和CRP的蛋白陣列。在再一個更優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及試劑盒，其包括特異性測定SFRP-3需要的試劑。優(yōu)選的另一種試劑盒包括特異性測定SFRP-3需要的試劑和測定一種或多 種其它心力衰竭標(biāo)記需要的試劑，這些標(biāo)記在HF標(biāo)記組合中一起使用。以下提供的實施例、序列表和附圖用于輔助理解本發(fā)明，本發(fā)明的真實范圍在 權(quán)利要求中闡述。需要理解，在未偏離本發(fā)明精神的前提下，可以修改所述方法。附圖簡述

圖1野生型小鼠和R9C小鼠的表型分析。(A)野生型小鼠(η = 79)和R9C小 鼠(η = 44)在24周后產(chǎn)生的生存曲線。(B)用超聲波心動描記術(shù)進(jìn)行的心臟縮短評估 (=縮短分?jǐn)?shù))。早在8周齡R9C轉(zhuǎn)基因動物就開始出現(xiàn)明顯的功能性損害。圖2野生型小鼠和AB小鼠的超聲心動圖和血液動力學(xué)參數(shù)。(A)術(shù)后2、4和 8周最高壓強(qiáng)的變化(mmHg)。 (B)術(shù)后2、4和8周左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)變化百分 數(shù)。(實心圓表示數(shù)據(jù)來源于假手術(shù)小鼠，空心圓表示數(shù)據(jù)來源于主動脈結(jié)扎(AB)小 鼠)O圖3分別從242例HF患者和118例對照樣品中測得的SFRP-3。濃度在y軸上 以ng/ml給出。分別將來源于心力衰竭患者的樣品標(biāo)記為HF (HF=菱形)，將健康對照 標(biāo)記為NHS (正常人血清=NHS =正方形)。圖4分別從臨床常規(guī)組和擴(kuò)展對照組的HF樣品中檢出的SFRP-3值。分別根據(jù) 由心力衰竭患者樣品(標(biāo)記HF)和健康對照樣品(正常人血清標(biāo)記= NHS)測得的SFRP-3 計算其濃度。盒須圖顯示了較低和較高的四分位值(盒)以及最高和最低的值(須)。實施例1心力衰竭的小鼠模型1.1R9C小鼠模型已報道一種遺傳性人類擴(kuò)張型心肌病源于人受磷蛋白(PLN)基因中的Arg9轉(zhuǎn)變 為 Cys(PLN_R9C) (Schmitt，J.P.等人，Science 299 (2003) 1410-1413)。擴(kuò)張型心肌病患 者的發(fā)病一般開始于青春期，隨后心臟功能漸進(jìn)性惡化，導(dǎo)致危險和死亡。該突變的轉(zhuǎn) 基因小鼠模型顯示出與患病患者類似的心臟表型，出現(xiàn)擴(kuò)張型心肌病、心臟收縮力降低 和過早死亡(Schmitt等人，2003，上文)。我們建立了轉(zhuǎn)基因小鼠的存活曲線。PLN-R9C小鼠平均存活僅約20周，少于 15%的存活超過24周(圖1A)。在PLN-R9C系中，觀察到的最早死亡記錄是12周齡， 而僅一只野生型對照鼠在24周死亡。在最早的死亡記錄之前，八周被選為疾病‘早期’ 的代表性時間點，同時選擇16周，是因為其是8至24周之間的中點(經(jīng)典DCM)。離 體心臟的詳細(xì)病理學(xué)分析顯示了 PLN-R9C小鼠甚至在8周齡時心室和心房擴(kuò)大的證據(jù)。 橫切片離體心肌(得自野生型和PLN-R9C小鼠)，然后蘇木紫及伊紅染色，證據(jù)也顯示 轉(zhuǎn)基因動物在8周開始左心室擴(kuò)張或心室壁變薄，隨年齡增長擴(kuò)張繼續(xù)加重。對8、16和24周齡的雄性小鼠用超聲波心動描記術(shù)進(jìn)行心臟功能測定(匯總于 表1中)。前后壁厚度的超聲波心動描記術(shù)測定結(jié)果顯示R9C小鼠在8周時具有顯著的 擴(kuò)張，且在小鼠生存期內(nèi)持續(xù)惡化。收縮性用心臟縮短來 評估(圖1B)，也是在8周時 輕微但顯著地減低，而更顯著的減低在16周時變得明顯。所分析的雌性小鼠與雄性顯示 相同的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。表1
野生型和R9C雄性小鼠在8、16和24周時的超聲心動圖和血液動力學(xué)參數(shù)

權(quán)利要求
1.一種評估個體心力衰竭的方法，其包括以下步驟a)測量從個體獲得的樣品中標(biāo)記分泌型卷曲相關(guān)蛋白3(SFRP_3)的濃度，b)任選測量所述樣品中一種或多種其它心力衰竭標(biāo)記的濃度，和c)將步驟(a)測得的濃度以及任選步驟(b)測得的濃度與對照樣品確定的所述一種或 多種標(biāo)記的濃度進(jìn)行比較，從而評估心力衰竭。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步的特征是所述樣品選自血清、血漿以及全血。
3.權(quán)利要求1和2的任一項的方法，其進(jìn)一步的特征是所述一種或多種其它標(biāo)記選自 利尿鈉肽標(biāo)記、心肌肌鈣蛋白標(biāo)記以及炎癥標(biāo)記。
4.權(quán)利要求3的方法，其進(jìn)一步的特征是所述一種或多種其它標(biāo)記是NT-pmBNP。
5.權(quán)利要求3的方法，其進(jìn)一步的特征是所述一種或多種其它標(biāo)記是肌鈣蛋白T。
6.蛋白SFRP-3作為標(biāo)記分子在評估心力衰竭中的用途。
7.包括SFRP-3和一種或多種其它心力衰竭標(biāo)記的標(biāo)記組合在評估心力衰竭中的用途。
8.權(quán)利要求7的標(biāo)記組合的用途，其中所述一種或多種其它標(biāo)記選自利尿鈉肽標(biāo)記、 心肌肌鈣蛋白標(biāo)記和炎癥標(biāo)記。
9.權(quán)利要求8的標(biāo)記組合的用途，其包括至少SFRP-3和NT-proBNP。
10.一種用于實施權(quán)利要求1的方法的試劑盒，所述試劑盒包括特異性測定SFRP-3以 及任選的所述一種或多種其它心力衰竭標(biāo)記所需要的試劑。
11.權(quán)利要求1的方法，其中測量獲自心力衰竭風(fēng)險個體的樣品中的標(biāo)記SFRP-3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種體外評估心力衰竭的方法，所述方法包括以下步驟測量樣品中標(biāo)記SFRP-3的濃度，任選測量樣品中一種或多種其它心力衰竭標(biāo)記的濃度，并通過將測定的SFRP-3濃度和任選測定的所述一種或多種其它標(biāo)記濃度與在對照人群確定的所述一種或多種標(biāo)記的濃度進(jìn)行比較來評估心力衰竭。還公開了SFRP-3作為標(biāo)記蛋白用于評估心力衰竭的用途，包括SFRP-3的標(biāo)記組合和用于測量SFRP-3的試劑盒。其它優(yōu)化標(biāo)記選自利尿鈉肽標(biāo)記、心肌肌鈣蛋白標(biāo)記、炎癥標(biāo)記、NT-proBNP和肌鈣蛋白T。
文檔編號G01N33/68GK102027374SQ200980116163
公開日2011年4月20日 申請日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月30日
發(fā)明者A·埃米利, A·格拉莫利尼, D·布洛克, D·麥克倫南, G·赫斯, H·許迪希, P·劉, S·阿拉布, U-H·溫許斯-特倫 申請人:多倫多大學(xué)董事局, 霍夫曼-拉羅奇有限公司