專利名稱：衍生提取法測定食品中甲醛的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種液相色譜法測定食品中甲醛的測定方法，尤其涉及進(jìn)出口水產(chǎn)、蔬菜(包括香菇)、谷類制品、乳制品、啤酒等中甲醛的測定方法。

背景技術(shù)：
甲醛俗稱福爾馬林，是無色、具有強(qiáng)烈氣味的刺激性氣體，其35％～40％的水溶液通稱福爾馬林。甲醛是原漿毒物，能與蛋白質(zhì)結(jié)合，吸入高濃度甲醛后，會出現(xiàn)呼吸道的嚴(yán)重刺激和水腫、眼刺痛、頭痛，也可發(fā)生支氣管哮喘。皮膚直接接觸甲醛，可引起皮炎、色斑、壞死。經(jīng)常吸入少量甲醛，能引起慢性中毒，出現(xiàn)粘膜充血、皮膚刺激癥、過敏性皮炎、指甲角化和脆弱、甲床指端疼痛，孕婦長期吸入可能導(dǎo)致新生嬰兒畸形，甚至死亡，男子長期吸入可導(dǎo)致男子精子畸形、死亡，性功能下降，嚴(yán)重的可導(dǎo)致生殖能力缺失，全身癥狀有頭痛、乏力、胃納差、心悸、失眠、體重減輕以及植物神經(jīng)紊亂等。
2001年日本炮制香菇中“甲醛事件”日本及境外媒體大量宣傳我國出口香菇含致癌甲醛，對香菇進(jìn)行”進(jìn)口限量“和”反傾銷調(diào)查“。我國香菇全部停止出口，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。近年來魷魚等制品中的“甲醛超標(biāo)問題”，嚴(yán)重影響了魷魚加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和魷魚制品出口。浙江舟山市作為主要出口基地，受損嚴(yán)重。2007年菲律賓檢測大白兔奶糖等4種糖果含有甲醛，菲律賓及海外市場相關(guān)產(chǎn)品遭遇撤架，食品安全性再次受到全球性質(zhì)疑。
由于甲醛具有較高的反應(yīng)活性，可以和帶有-OH(羥基)、-SH(巰基)、-NH2(氨基)基團(tuán)的分子發(fā)生親核加成反應(yīng)，動物體的細(xì)胞內(nèi)、酶系統(tǒng)中存在著大量的上述基團(tuán)，接觸甲醛后會立即發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，使蛋白質(zhì)變性。甲醛超強(qiáng)的殺菌能力正是原自這種反應(yīng)。試樣中富含蛋白質(zhì)時，添加的甲醛易與蛋白質(zhì)中基團(tuán)結(jié)合，形成甲醛-蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此，對食品中內(nèi)源性甲醛產(chǎn)生機(jī)理進(jìn)行研究，提出一種靈敏度高、操作簡便的甲醛測定方法將為我國食品出口突破國際“綠色壁壘”做出貢獻(xiàn)。
現(xiàn)有技術(shù)中食品中甲醛測定方法如下 1、AOAC 931.08(第17版)蒸餾法，鉻變酸定性。
2、SCT 3025-2006水產(chǎn)品中甲醛的測定水蒸氣蒸餾法，分光光度法、HPLC法測定。
3、NYT 1283-2007香菇中甲醛含量的測定水蒸氣蒸餾法，比色法測定。
4、DB33T 555-2005植物源食品中甲醛殘留量的測定高效液相色譜法60℃水浴提取，香菇中甲醛用乙酸鋅溶液提取，HPLC法測定。
5、GBT 5009.49-2003發(fā)酵酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法水蒸氣蒸餾法，比色法測定。
6、SNT 1547-2005進(jìn)出口食品中甲醛含量測定液相色譜法40℃水浴提取，HPLC法測定。
對于水蒸氣蒸餾法利用甲醛易揮發(fā)，在酸性條件下，可蒸餾分離得到試樣中游離態(tài)和可逆結(jié)合態(tài)的甲醛。但高溫可能導(dǎo)致內(nèi)源性甲醛的產(chǎn)生，而且水蒸氣蒸餾法對實(shí)驗(yàn)裝置的氣密性要求高，操作復(fù)雜，不利于大批量試樣的檢測。
對于SN/T 1547-2005采用水浸法提取甲醛用水充分提取試樣中甲醛，再將提取液與2，4-二硝基苯肼衍生反應(yīng)，直接液相色譜測定。水浸法能有效提取試樣中游離態(tài)的甲醛，但試樣(如水產(chǎn)、乳制品等)富含蛋白質(zhì)時，添加的甲醛易與蛋白質(zhì)中基團(tuán)結(jié)合，形成甲醛-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使得水浸法測定富含蛋白質(zhì)試樣中甲醛的回收率不佳。SN/T 1547-2005采用了甲醛的校正工作溶液，在甲醛含量低的基質(zhì)中添加不同濃度水平的甲醛，按試樣提取操作后液相色譜測定，使得甲醛回收率提高。但是實(shí)際操作中，空白基質(zhì)的選擇、甲醛校正工作曲線的制作、不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的比對等，都存在一定的難度。


發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述的甲醛含量的測定方法中存在的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種衍生提取法測定食品中甲醛的方法，該方法直接提取衍生樣品中甲醛，將甲醛校正工作溶液改為甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，提高了富含蛋白質(zhì)試樣中甲醛的回收率，測定低限改為“液體類試樣中 甲醛的測定低限為2.0mg/L，固體類試樣中甲醛的測定低限為5.0mg/kg”。
為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明的衍生提取法測定食品中甲醛的方法由以下的步驟構(gòu)成 (1)提取 ①固體類試樣稱取試樣2g，精確至0.01g，置于50mL具塞塑料離心管中，準(zhǔn)確加入20.0mL衍生液；旋緊塞子，混勻后置于60℃恒溫振蕩器中，150r/min振搖，間隔20min取出混勻，振搖1h后取出冷卻；上述的衍生液為2，4-二硝基苯肼乙腈溶液與pH 5的緩沖溶液構(gòu)成的混合溶液，2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的濃度為0.6g/L，衍生液中乙腈∶緩沖溶液的體積比為1∶1；； ②液體類試樣移取試樣1mL，精確至0.1mL，置于10mL具塞比色管中，加入4.0mLpH 5的緩沖溶液，用2，4-二硝基苯肼乙腈溶液定容至10mL，蓋上塞后混勻，60℃水浴加熱1h，取出冷卻；上述的2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的濃度為0.6g/L； (2)凈化 ①固體類試樣將上述制得的固體類試樣提取液，以不低于4000r/min離心5min；對于離心后溶液澄清，過微孔濾膜后，直接供HPLC測定；對于離心后溶液渾濁，在提取液中加入8g硫酸銨，混勻，以不低于4000r/min離心5min，移取上清液，下層溶液用10mL乙腈重復(fù)萃取1次，合并萃取液，用乙腈定容至20mL，混勻后過微孔濾膜，濾液供HPLC測定； ②液體類試樣提取液的凈化方法與固體類試樣相同，所用試劑量減半； (3)甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 分別取5檔或以上不同濃度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備方法如下移取試樣1mL，精確至0.1mL，置于10mL具塞比色管中，加入4.0mLpH 5的緩沖溶液，用2，4-二硝基苯肼乙腈溶液定容至10mL，蓋上塞后混勻，60℃水浴加熱1h，取出冷卻；冷卻后過微孔濾膜，濾液供HPLC測定；上述的2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的濃度為0.6g/L； (4)測定 根據(jù)樣液中甲醛濃度的情況選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中甲醛衍生物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測定，用保留時間定性，外標(biāo)法定量； (5)空白試驗(yàn) 除不加試樣外，均按上述(1)～(4)操作步驟進(jìn)行； (6)結(jié)果計算和表述 按以下公式計算試樣中甲醛的殘留量或采用色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算，計算結(jié)果需扣除空白值 式中 X——試樣中甲醛的殘留量，單位為mg/kg； A——樣液中甲醛衍生物的峰面積； c——標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醛衍生物的濃度，單位為mg/L； V——樣液最終定容體積，單位為mL； As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醛衍生物的峰面積； m——試樣溶液所代表的試樣質(zhì)量，單位為g。
作為進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述的液相色譜條件為 a)色譜柱C18柱，250mm×4.6mm(內(nèi)徑)，5μm，或相當(dāng)者； b)流動相甲醇-水(70+30，V+V)， c)流速1.0mL/min； d)檢測波長365nm； e)進(jìn)樣量20μL。
作為進(jìn)一步改進(jìn)的方案，對于步驟(2)固體類試樣中脂肪含量較高，用乙腈飽和的正己烷液-液分配除脂凈化。
作為進(jìn)一步改進(jìn)的方案，上述的pH 5的緩沖溶液采用稱取2.64g乙酸鈉，以適量水溶解，加入1.0mL冰乙酸，用水定容至500mL制成。
作為優(yōu)選，上述的試樣為銀魚、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油、乳飲料或啤酒。
本發(fā)明采用2，4-二硝基苯肼的乙腈-醋酸緩沖液(50+50，V+V)，直接衍生提取試樣中甲醛，液液萃取凈化后，液相色譜測定。60℃水浴提取試樣中甲醛的同時，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。2，4-二硝基苯肼與蛋白質(zhì)中基團(tuán)競爭反應(yīng)溶液中的甲醛，能有效抑制甲醛與試樣中蛋白質(zhì)結(jié)合，從而比水浸法有較高的甲醛回收率。該方法直接提取衍生樣品中甲醛，將甲醛校正工作溶液改為甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，提高了富含蛋白質(zhì)試樣中甲醛的回收率。該方法能夠有效提取香菇中甲醛，同時又能阻斷香菇中酶反應(yīng)，抑制內(nèi)源性甲醛的釋放，提高了檢測值的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。該方法將提取步驟和衍生化反應(yīng)相結(jié)合，有效提高了檢測效率。測定低限改為“液體類樣品中甲醛的測定低限為2.0mg/L，固體類樣品中甲醛的測定低限為5.0mg/kg”。



圖1～圖4為試驗(yàn)例3中不同體系香菇中甲醛的測定結(jié)果圖；其中 圖1為純水體系，圖2為乙腈/水(1/1)體系，圖3為乙腈/水(2/1)體系和乙腈，圖4為乙腈/水(1/1)衍生體系。
圖5為濃度0.2μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液的色譜圖。
圖6～圖13分別為各空白樣品和添加標(biāo)樣后的樣品色譜圖；其中 圖6(a)銀魚空白樣品和圖6(b)添加5.0mg/kg甲醛樣品色譜圖； 圖7(a)香菇空白樣品和圖7(b)添加5.0mg/kg甲醛樣品色譜圖； 圖8(a)面粉空白樣品和圖8(b)添加5.0mg/kg甲醛樣品色譜圖； 圖9(a)奶粉空白樣品和圖9(b)添加5.0mg/kg甲醛樣品色譜圖； 圖10(a)奶糖空白樣品和圖10(b)添加5.0mg/kg甲醛樣品色譜圖； 圖11(a)奶油空白樣品和圖11(b)添加5.0mg/kg甲醛樣品色譜圖； 圖12(a)乳飲料空白樣品和圖12(b)添加2.0mg/L甲醛樣品色譜圖； 圖13(a)啤酒空白樣品和圖13(b)添加2.0mg/L甲醛樣品色譜圖。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1 下面對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
做一個詳細(xì)的說明。
1.1 方法提要 直接提取衍生試樣中的甲醛。液液萃取凈化后，在365nm波長處液相色譜測定，外標(biāo)法定量。
1.2 試劑和材料 除另有說明外，所用試劑均為分析純。所用水為煮沸10min后冷卻的超純水。
1.2.1 乙腈色譜純。
1.2.2 正己烷色譜純。
1.2.3 硫酸銨。
1.2.4 乙酸鈉。
1.2.5 冰乙酸 1.2.6 緩沖溶液(pH 5)稱取2.64g乙酸鈉，以適量水溶解，加入1.0mL冰乙酸，用水定容至500mL制成。
1.2.7 2，4-二硝基苯肼純度≥99％。
1.2.8 2，4-二硝基苯肼溶液稱取2，4-二硝基苯肼300mg，用乙腈溶解定容至500mL。
1.2.9 衍生液取100mL緩沖溶液(1.2.6)和100mL 2，4-二硝基苯肼溶液(1.2.8)，混勻。
1.2.10 甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL)GSB07-1179。
1.2.11 甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液移取適量甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.2.7)，用緩沖溶液(1.2.3)稀釋至適當(dāng)濃度。
1.2.12 微孔濾膜0.45μm，有機(jī)相。
1.3 儀器和設(shè)備 1.3.1 高效液相色譜儀配有二極管陣列檢測器或紫外檢測器。
1.3.2 搗碎機(jī)。
1.3.3 恒溫振蕩器。
1.4 測定步驟 1.4.1 提取 1.4.1.1 固體類試樣 稱取試樣2g(精確至0.01g)，置于50mL具塞塑料離心管中，準(zhǔn)確加入20.0mL衍生液(1.2.9)。旋緊塞子，混勻后置于60℃恒溫振蕩器中，150r/min振搖，間隔20min取出混勻，振搖1h后取出冷卻。
1.4.1.2 液體類試樣 移取試樣1mL(精確至0.1mL)，置于10mL具塞比色管中，加入4.0mL緩沖溶液(1.2.6)，用2，4-二硝基苯肼溶液(1.2.8)定容至10mL，蓋上塞后混勻，60℃水浴加熱1h，取出冷卻。
1.4.2 凈化 1.4.2.1 固體類試樣 將1.4.1.1提取液，以不低于4000r/min離心5min。如離心后溶液澄清，過微孔濾膜(1.2.12)后，直接供HPLC測定。如離心后溶液渾濁，在提取液中加入8g硫酸銨(1.2.3)，混勻，以不低于4000r/min離心5min，移取上清液，下層溶液用10mL乙腈重復(fù)萃取1次，合并萃取液，用乙腈定容至20mL，混勻后過微孔濾膜(1.2.12)，濾液供HPLC測定。
注若試樣中脂肪含量較高，可以用10mL乙腈飽和的正己烷液-液分配除脂凈化。
1.4.2.2 液體類試樣 1.4.1.2 提取液的凈化參見1.4.2.1，所用試劑量減半。
1.4.3 甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備 分別取5檔或以上不同濃度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1.2.11)，按1.4.1.2操作，冷卻后過微孔濾膜(1.2.12)，濾液供HPLC測定。
1.4.4 測定 1.4.4.1 液相色譜條件 液相色譜條件為 a)色譜柱C18柱，250mm×4.6mm(內(nèi)徑)，5μm，或相當(dāng)者； b)流動相甲醇-水(70+30，V+V)； c)流速1.0mL/min； d)檢測波長365nm； e)進(jìn)樣量20μL。
1.4.4.2 色譜測定 根據(jù)樣液中甲醛濃度的情況選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中甲醛衍生物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測定。用保留時間定性，外標(biāo)法定量。在上述色譜條件下甲醛衍生物的保留時間約為6.5min。
1.4.5 空白試驗(yàn) 除不加試樣外，均按上述操作步驟進(jìn)行。
1.5 結(jié)果計算和表述 按式(1)計算試樣中甲醛的殘留量或采用色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算。計算結(jié)果需扣除空白值。
式中 X——試樣中甲醛的殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg)； A——樣液中甲醛衍生物的峰面積； c——標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醛衍生物的濃度，單位為毫克每升(mg/L)； V——樣液最終定容體積，單位為毫升(mL)； As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醛衍生物的峰面積； m——試樣溶液所代表的試樣質(zhì)量，單位為克(g)。； 試驗(yàn)例1 動物源食品中甲醛的測定 甲醛具有較高的反應(yīng)活性，可以和帶有-OH(羥基)、-SH(巰基)、-NH2(氨基)基團(tuán)的分子發(fā)生親核加成反應(yīng)，動物體的細(xì)胞內(nèi)、酶系統(tǒng)中存在著大量的上述基團(tuán)，接觸甲醛后會立即發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，使蛋白質(zhì)變性。甲醛超強(qiáng)的殺菌能力正是原自這種反應(yīng)。試樣中富含蛋白質(zhì)時，添加的甲醛易與蛋白質(zhì)中基團(tuán)結(jié)合，形成甲醛-蛋白質(zhì)復(fù)合物。
本方法采用實(shí)施例1所述的技術(shù)方案測定甲醛用2，4-二硝基苯肼的乙腈/pH5醋酸緩沖液(1/1，v/v)溶液，直接衍生提取試樣中甲醛，液相色譜測定。60℃水浴提取試樣中甲醛的同時，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。2，4-二硝基苯肼與蛋白質(zhì)中基團(tuán)競爭反應(yīng)溶液中的甲醛，能有效抑制甲醛與試樣中蛋白質(zhì)結(jié)合，從而比水浸法有較高的甲醛回收率。
選擇銀魚、奶粉空白基質(zhì)，添加5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg三檔濃度水平的甲醛，分別用水浸法和衍生提取法操作處理，甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液作為校正曲線，平行測定3次取平均值，結(jié)果對比見表1。衍生提取法和水浸法的空白測定值相近，表明衍生提取法未導(dǎo)致含蛋白試樣中內(nèi)源性甲醛的明顯產(chǎn)生；水浸法銀魚中甲醛回收率為35～46％，衍生提取法銀魚中甲醛回收率70～74％；水浸法奶粉中甲醛回收率為66～74％，衍生提取法奶粉中甲醛回收率82～88％，表明衍生提取法能較好的提取試樣中甲醛。
表1 水浸法和衍生提取法測定含蛋白試樣中甲醛對比

試驗(yàn)例2 植物源食品(除香菇外)中甲醛的測定 采用實(shí)施例1所述的技術(shù)方案測定甲醛，選擇面粉、脫水甘藍(lán)空白基質(zhì)，添加5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg三檔濃度水平的甲醛，分別用水浸法和衍生提取法操作處理，甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液作為校正曲線，平行測定3次取平均值，結(jié)果對比見表2。衍生提取法和水浸法的空白測定值相近，表明衍生提取法未導(dǎo)致植物源性試樣中內(nèi)源性甲醛的明顯產(chǎn)生；水浸法的甲醛回收率為75～88％，衍生提取法的甲醛回收率90～99％，表明衍生提取法能較好的提取試樣中甲醛。
表2 水浸法和衍生提取法測定植物源性試樣中甲醛對比
試驗(yàn)例3 香菇中甲醛的測定 香菇中甲醛被證明是香菇子實(shí)體自身代謝產(chǎn)生的。日本學(xué)者Yasumotoc及Fujimoto等人分離出參與香菇甲醛代謝的關(guān)鍵酶及其前體物質(zhì)一香菇精，認(rèn)為甲醛是香菇特征風(fēng)味物質(zhì)酶學(xué)代謝的副產(chǎn)物。因此，香菇的運(yùn)輸、保存等過程中，均可能分解釋放甲醛。
香菇中甲醛的提取方法，采用較多的有鮮香菇勻漿或粉碎后再通過蒸餾提取甲醛，蒸餾過程中香菇中活性酶可能不斷釋放甲醛而影響測定結(jié)果。日本官方的檢測方法注解提及香菇類食品，由于加酸水解或酶解可使試樣中的成分生成甲醛，這種情況有時采用冷水提取，立即作為試驗(yàn)溶液進(jìn)行測定。國內(nèi)學(xué)者改進(jìn)的方法有，60℃水浴萃取香菇中甲醛同時用乙酸鋅溶液滅酶活性，以及鮮香菇勻漿后沸水浴熱滅酶后再蒸餾提取等，通過滅酶活性以阻斷香菇中甲醛的不斷釋放。
香菇甲醛的測定方法，存在分歧較多，測定結(jié)果重現(xiàn)差等問題。如何提取使甲醛提取效率最高，同時能有效阻斷香菇中酶反應(yīng)，我們以甲醛含量較高的香菇干為研究對象，進(jìn)行了系列研究。將香菇干樣品粉碎均勻后，用塑料袋密封儲存，以備試驗(yàn)用。采用實(shí)施例1所述的技術(shù)方案測定甲醛 1、提取溶劑的選擇 稱取1.0g樣品，分別用20mLpH2水、pH5水、pH7水、乙腈/pH2水(1/1)、乙腈/pH5水(1/1)、乙腈/pH7水(1/1)、乙腈/pH2水(1/2)、乙腈/pH5水(1/2)、乙腈/pH7水(1/2)和乙腈作為提取劑，室溫條件下，均質(zhì)勻漿30s后4000rpm/min離心5min，取2mL濾液，采用“1甲醛與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)條件”衍生，其中pH7濾液調(diào)至pH5衍生。將上述10種勻漿液渦旋混勻后，放置60℃水浴振搖提取，分別在0.5h，1h，2h，3h取2mL濾液衍生，衍生液用液相色譜測定。
測定結(jié)果見圖1～3，香菇均質(zhì)提取后立即衍生測定即t＝0時，酶促反應(yīng)釋放甲醛對測定影響較小，此時基本可以考察不同提取試劑對甲醛的萃取效果；比較不同提取試劑t＝0.5～3h時與t＝0時測定結(jié)果，可以考察提取過程中酶反應(yīng)活性對甲醛測定的影響。
如圖1所示，香菇均質(zhì)勻漿后立即衍生測定即t＝0時，pH2、pH5、pH7水提取液甲醛含量分別為34.0、26.5、94.9mg/kg，初步說明香菇水溶液中酶活性pH5＜pH2＜pH7。隨提取時間增加，pH7提取液甲醛含量最高，pH2提取液次之，pH5提取液最低，進(jìn)一步證明了上述觀點(diǎn)。pH5提取液酶反應(yīng)活性較低，甲醛含量隨提取時間增加而緩慢增加，提取3h達(dá)到最高值198mg/kg。pH2、pH7提取液酶反應(yīng)活性較高，振搖0.5h甲醛含量分別達(dá)到最高值390、806mg/kg，提取時間增加至1h～3h，甲醛含量反而越來越低。推測香菇樣品經(jīng)均質(zhì)后，細(xì)胞充分破碎，較高的酶反應(yīng)活性使得振搖0.5h甲醛已充分釋放；隨著萃取時間增加，甲醛可能參與香菇基體代謝反應(yīng)，使得甲醛含量降低。
如圖2所示，t＝0時，乙腈/pH2(1/1)、乙腈/pH5(1/1)、乙腈/pH7水(1/1)甲醛含量分別為27.3、22.6、28.0mg/kg，與pH5水均質(zhì)提取甲醛結(jié)果相近。說明如果忽略酶促反應(yīng)的影響，乙腈/水(1/1)體系對香菇中甲醛的萃取效果跟純水體系基本相當(dāng)。隨提取時間增加，甲醛含量沒有明顯增加，說明乙腈/水(1/1)體系能較好的抑制香菇中酶活性。圖中3條曲線形狀相似，而且非常相近，說明相對于水溶液pH值，乙腈對香菇酶活性的抑制起主要作用。
如圖3所示，t＝0時，乙腈/pH2水(1/2)、乙腈/pH5水(1/2)、乙腈/pH7水(1/2)和乙腈中甲醛含量分別為8.52、8.00、10.4、2.84mg/kg。表明相比較乙腈/水(1/1)體系，乙腈/水(2/1)體系對香菇中甲醛的萃取效果較差，純乙腈萃取效果最差。隨提取時間增加，甲醛含量稍有增加，但低于圖2乙腈/水(1/1)體系相對應(yīng)值。推測提取溶劑中乙腈比例的增加，能有效抑制香菇中酶活性，但不利于甲醛的釋放和提取。
綜合考慮，乙腈/水(1/1)體系具有與純水體系相當(dāng)?shù)膶ο愎街屑兹┹腿⌒Ч瑫r相比較純水體系，能有效抑制香菇中酶反應(yīng)活性，因此選擇乙腈/水(1/1)體系作為香菇中甲醛提取試劑。乙腈/水(1/1)體系提取過程中，甲醛含量有上下波動，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性不佳，下面進(jìn)一步考察乙腈/水(1/1)體系作為溶劑的2，4-二硝基苯肼衍生液的提取效果。
2、衍生提取法 考察不同pH值的乙腈/水(1/1)衍生劑溶液，對香菇中甲醛提取的影響。稱取1.0g樣品，分別加入20mL 2，4-二硝基苯肼的乙腈/pH2水(1/1)、乙腈/pH5水(1/1)、乙腈/pH7水(1/1)溶液，2，4-二硝基苯肼濃度為0.3g/L。均質(zhì)勻漿30s后，60℃水浴振搖衍生提取，分別在0.5h，1h，2h，3h，4h取1mL濾液進(jìn)行液相色譜測定。忽略pH值對衍生反應(yīng)的影響，以甲醛的乙腈/pH5水(1/1)衍生液，60℃水浴振搖1h衍生后測定值作校準(zhǔn)曲線，不同提取液的甲醛測定結(jié)果見圖4。
由圖4可知，乙腈/pH5水(1/1)衍生劑提取甲醛的最大值為40mg/kg，比圖2中相對應(yīng)溶劑提取最大值27mg/kg稍有增加，表明衍生劑的加入，能促使甲醛衍生反應(yīng)平衡向右進(jìn)行，以達(dá)到最大程度提取測定香菇中甲醛。乙腈/pH7水(1/1)衍生劑提取曲線跟乙腈/pH5水(1/1)衍生劑相似，但測定結(jié)果較低，分析原因可能是pH7條件下衍生反應(yīng)靈敏度較低。乙腈/pH2水(1/1)衍生劑提取甲醛最大值為77mg/kg，比圖2中相對應(yīng)溶劑提取最大值39 mg/kg，增加1倍。表明pH2條件下，衍生劑的加入誘導(dǎo)了香菇中內(nèi)源性甲醛的釋放。
綜上所述，乙腈/pH5水(1/1)衍生劑，具有和甲醛較高的衍生反應(yīng)靈敏度，能夠最大程度對香菇中甲醛進(jìn)行衍生提取，而且未見明顯導(dǎo)致香菇中內(nèi)源性甲醛的釋放，提取結(jié)果1h～4h都比較穩(wěn)定。均質(zhì)勻漿30s后水浴衍生1h與未勻漿直接衍生1h進(jìn)行對比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。
因此，衍生提取法能夠有效提取香菇中甲醛，同時又能阻斷香菇中酶反應(yīng)，將提取步驟和衍生化反應(yīng)相結(jié)合，有效提高了檢測效率，選擇其為提取方法。
試驗(yàn)例4 凈化條件的選擇 乙腈/水(1/1)對水溶性樣品和脂溶性樣品都有較好的浸潤性，選擇試樣量的10倍的提取溶劑量來進(jìn)行甲醛的提取。植物源食品中，通常含有纖維、淀粉等化合物，樣品用衍生劑提取稀釋后，如離心溶液澄清，則不必凈化處理，直接液相色譜測定，雜質(zhì)干擾較少。但QQ糖果等富含明膠、礦物質(zhì)和糖類等，衍生液不易過濾膜，需要凈化處理。乳制品、動物源食品中，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪，衍生液需要沉淀蛋白和除脂凈化。
蛋白質(zhì)的沉淀劑有乙酸鉛、三氯乙酸、鹽類、乙腈等，乙酸鉛和三氯乙酸的本底值較高，鹽析法能夠較好的沉淀蛋白質(zhì)和水溶性雜質(zhì)，乙腈/水比例為2～3時能較好的沉淀蛋白。為了簡化操作步驟，選擇乙腈飽和的正己烷脫脂、鹽析沉淀蛋白和除水溶性雜質(zhì)。在20mL衍生液中，加入10mL乙腈飽和的正己烷，渦旋后靜置分層，除去上層溶液，即可除去大部分脂肪。在20mL衍生液中，加入約8g硫酸銨，鹽析作用使得大部分蛋白質(zhì)沉淀，水溶性雜質(zhì)析出，同時使乙腈和水分層，甲醛衍生物進(jìn)入乙腈層。離心后，提取乙腈層，再用10mL乙腈萃取水溶液中殘留甲醛衍生物。合并乙腈溶液，定容至20mL，達(dá)到凈化目的。純乙腈進(jìn)樣，衍生物的色譜峰略變寬，但不影響甲醛的定量。用10mL濃度為1.0μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)衍生物的乙腈/水(1/1)溶液，分別進(jìn)行上述除脂、沉淀蛋白處理后測定濃度分別為0.96μg/mL和0.99μg/mL。
實(shí)施例1 的方法的三項(xiàng)指標(biāo)測定 1、線性關(guān)系和檢測限 在本方法確定的實(shí)驗(yàn)條件下，甲醛在0.20～5.00mg/L范圍內(nèi)與響應(yīng)值有很好的線性關(guān)系，線性方程為y＝344.6x+7.222，相關(guān)系數(shù)為0.99999。本方法對液體類樣品中甲醛的測定低限為2.0mg/L；對固體類樣品中甲醛的測定低限為5.0mg/kg。
2、回收率和精密度 本方法的回收率試驗(yàn)是添加回收率的試驗(yàn)。選擇銀魚、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油空白樣品，分別添加甲醛濃度為5.0mg/kg、10.0mg/kg、20.0mg/kg，平行測定6次。選擇乳飲料、啤酒空白樣品，分別添加甲醛濃度為2.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L，平行測定6次。選擇的空白樣品中含有微量甲醛，回收測定值需減去空白樣品本底值。回收率和精密度見表4～表11。
表4 銀魚中甲醛的添加回收率試驗(yàn)
表5 香菇中甲醛的添加回收率試驗(yàn)
表6 面粉中甲醛的添加回收率試驗(yàn)
表7 奶粉中甲醛的添加回收率試驗(yàn)
表8 奶糖中甲醛的添加回收率試驗(yàn)
表9 奶油中甲醛的添加回收率試驗(yàn)
表10 乳飲料中甲醛的添加回收率試驗(yàn)
表11 啤酒中甲醛的添加回收率試驗(yàn)
3.方法檢出限 本方法對液體類樣品中甲醛的測定低限為2.0mg/L，對固體類樣品中甲醛的測定低限為5.0mg/kg。
在銀魚、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油空白樣品中分別添加5.0mg/kg甲醛標(biāo)準(zhǔn)品，在乳飲料、啤酒空白樣品中添加2.0mg/L甲醛標(biāo)準(zhǔn)品，按實(shí)驗(yàn)方法操作，液相色譜測定。圖5為濃度0.2μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)衍生溶液的色譜圖，圖6～圖13分別為各空白樣品和添加標(biāo)樣后的樣品色譜圖。
4.方法驗(yàn)證 選用銀魚、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油、乳飲料、啤酒空白樣品，分別請上海出入境檢驗(yàn)檢疫局、湖北出入境檢驗(yàn)檢疫局、寧波出入境檢驗(yàn)檢疫、海南出入境檢驗(yàn)檢疫和浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院五家權(quán)威檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證方法采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，添加濃度和檢測結(jié)果匯總見表12。
表12 驗(yàn)證試驗(yàn)測定匯總


權(quán)利要求
1.衍生提取法測定食品中甲醛的方法，其特征在于該測定方法由以下的步驟構(gòu)成
(1)提取
①固體類試樣稱取試樣2g，精確至0.01g，置于50mL具塞塑料離心管中，準(zhǔn)確加入20.0 mL衍生液；旋緊塞子，混勻后置于60℃恒溫振蕩器中，150r/min振搖，間隔20min取出混勻，振搖1h后取出冷卻；上述的衍生液為2，4-二硝基苯肼乙腈溶液與pH5的緩沖溶液構(gòu)成的混合溶液，2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的濃度為0.6 g/L，衍生液中乙腈∶緩沖溶液的體積比為1∶1；
②液體類試樣移取試樣1mL，精確至0.1mL，置于10mL具塞比色管中，加入4.0mLpH5的緩沖溶液，用2，4-二硝基苯肼乙腈溶液定容至10mL，蓋上塞后混勻，60℃水浴加熱1h，取出冷卻；上述的2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的濃度為0.6g/L；
(2)凈化
①固體類試樣將上述制得的固體類試樣提取液，以不低于4000r/min離心5min；對于離心后溶液澄清，過微孔濾膜后，直接供HPLC測定；對于離心后溶液渾濁，在提取液中加入8g硫酸銨，混勻，以不低于4000r/min離心5min，移取上清液，下層溶液用10mL乙腈重復(fù)萃取1次，合并萃取液，用乙腈定容至20mL，混勻后過微孔濾膜，濾液供HPLC測定；
②液體類試樣提取液的凈化方法與固體類試樣相同，所用試劑量減半；
(3)甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備
分別取5檔或以上不同濃度的甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備方法如下
移取試樣1mL，精確至0.1mL，置于10mL具塞比色管中，加入4.0mLpH5的緩沖溶液，用2，4-二硝基苯肼乙腈溶液定容至10mL，蓋上塞后混勻，60℃水浴加熱1h，取出冷卻；冷卻后過微孔濾膜，濾液供HPLC測定；上述的2，4-二硝基苯肼乙腈溶液的濃度為0.6g/L；
(4)測定
根據(jù)樣液中甲醛濃度的情況選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中甲醛衍生物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液等體積參插進(jìn)樣測定，用保留時間定性，外標(biāo)法定量；
(5)空白試驗(yàn)
除不加試樣外，均按上述(1)～(4)操作步驟進(jìn)行；
(6)結(jié)果計算和表述
按以下公式計算試樣中甲醛的殘留量或采用色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計算，計算結(jié)果需扣除空白值
式中
X——試樣中甲醛的殘留量，單位為mg/kg；
A——樣液中甲醛衍生物的峰面積；
c——標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醛衍生物的濃度，單位為mg/L；
V——樣液最終定容體積，單位為mL；
As——標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲醛衍生物的峰面積；
m——試樣溶液所代表的試樣質(zhì)量，單位為g。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的衍生提取法測定食品中甲醛的方法，其特征在于液相色譜條件為
a)色譜柱C18柱，250mm×4.6mm(內(nèi)徑)，5μm，或相當(dāng)者；
b)流動相甲醇-水(70+30，V+V)；
c)流速1.0mL/min；
d)檢測波長365nm；
e)進(jìn)樣量20μL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的衍生提取法測定食品中甲醛的方法，其特征在于對于步驟(2)固體類試樣中脂肪含量較高，用乙腈飽和的正己烷液-液分配除脂凈化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的衍生提取法測定食品中甲醛的方法，其特征在于pH5的緩沖溶液采用稱取2.64g乙酸鈉，以適量水溶解，加入1.0mL冰乙酸，用水定容至500mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的衍生提取法測定食品中甲醛的方法，其特征在于試樣為銀魚、香菇、面粉、奶粉、奶糖、奶油、乳飲料或啤酒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種液相色譜法測定食品中甲醛含量的測定方法，尤其涉及進(jìn)出口水產(chǎn)、蔬菜(包括香菇)、谷類制品、乳制品、啤酒等中甲醛的測定方法。液相色譜法測定食品中甲醛含量的測定方法，該測定方法由(1)提取、(2)凈化、(3)甲醛標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備、(4)測定、(5)空白試驗(yàn)、(6)結(jié)果計算和表述步驟構(gòu)成。本發(fā)明采用2，4-二硝基苯肼的乙腈/pH5醋酸緩沖液(1/1，v/v)溶液，直接衍生提取試樣中甲醛，液相色譜測定。60℃水浴提取試樣中甲醛的同時，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。2，4-二硝基苯肼與蛋白質(zhì)中基團(tuán)競爭反應(yīng)溶液中的甲醛，能有效抑制甲醛與試樣中蛋白質(zhì)結(jié)合，從而比水浸法有較高的甲醛回收率。
文檔編號G01N30/02GK101762660SQ20101003960
公開日2010年6月30日 申請日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月8日
發(fā)明者呂春華, 陳笑梅, 劉海山, 史穎珠, 謝文, 黃超群, 朱曉雨 申請人:浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心