專利名稱：：一種采用間接elisa方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種血清學(xué)檢測病毒抗體的方法，特別是涉及一種采用間接ELISA方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體的方法。
背景技術(shù)：
：1999年，德國學(xué)者首次報道了鵝圓環(huán)病毒(GoCV)感染的病例，發(fā)病鵝群主要表現(xiàn)為死亡率偏高、個體生長速度減慢參差不齊、羽毛發(fā)育不良等癥狀，病理剖解通常僅見輕度的氣囊渾濁，但組織病理學(xué)檢測可見法氏囊、脾臟和胸腺有不同程度的淋巴細胞缺失的特征性病理變化，其它病變還包括肺、肝、心肌散在的炎性細胞浸潤等，一些病例中可見法氏囊結(jié)構(gòu)的嚴重破壞，并在法氏囊髓質(zhì)、皮質(zhì)和個別囊上皮細胞內(nèi)觀察到了嗜堿性的病毒包涵體；經(jīng)提純和磷鎢酸負染，在鵝法氏囊、脾、胸腺等組織提取物中觀察到了圓環(huán)病毒樣顆粒。此后，Tod、chen等對鵝圓環(huán)病毒全基因組序列進行了克隆、測定和序列分析。2004年，Ball等用PCR和斑點雜交法(DBH)對匈牙利一些鵝場的病死鵝樣品進行了檢測，發(fā)現(xiàn)用這兩種方法的陽性檢出率分別為48.1%和24.6%。2005年，Glavits等報道了匈牙利一鵝場爆發(fā)西尼羅河熱與圓環(huán)病毒的共感染病例，病死率達14%。2006年英國學(xué)者Scott等應(yīng)用SFV(Semliki森林病毒)真核表達載體在幼倉鼠腎細胞(BabyHamsterKidneyCell)中表達了GoCV核衣殼蛋白，并以此為抗原，以兔抗鴨熒光抗體為二抗，建立了間接免疫熒光(IFA)檢測方法，并應(yīng)用該方法對英國的一些鵝場進行血清學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)16歲鵝的抗體陽性率為88.6%，30周齡以下的為40.9%。2005年本實驗室在國內(nèi)首次從浙江永康禽流感病死鵝的樣品中檢測到了GoCV，進一步應(yīng)用PCR方法對從浙江省不同地區(qū)的8個鵝場采集的樣品進行了檢測，并克隆測定了10株GoCV全基因組序列，進行了GoCV的分子流行病學(xué)分析。除英國學(xué)者Scott等建立的IFA夕卜，GoCV的檢測目前主要應(yīng)用PCR和斑點雜交等核酸學(xué)方法。我們在采用PCR方法開展GoCV檢測和分子流行病學(xué)的調(diào)查工作時發(fā)現(xiàn)，被檢鵝通常需要屠宰取法氏囊等淋巴組織樣品進行試驗成功率才高，直接用血清樣品檢測的檢出率很低，其它核酸學(xué)方法如斑點雜交、原位雜交等也會存在同樣的問題。為更好地開展我國GoCV的流行情況和感染范圍調(diào)查，并為進一步開展GoCV的致病性和免疫機制的研究奠定基礎(chǔ)，有必要建立一種更加快速、敏感、特異、便于大規(guī)模應(yīng)用且不需要撲殺動物的血清學(xué)檢測診斷方法。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種快速、敏感、特異、便于大規(guī)模應(yīng)用且不需要撲殺動物的血清學(xué)檢測鵝圓環(huán)病毒抗體的方法，特別是提供一種采用間接ELISA方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體的方法。本發(fā)明在已建立的鵝圓環(huán)病毒重組核衣殼蛋白的原核表達基礎(chǔ)上，利用羊抗雞二抗的交叉反應(yīng)性，替代抗鵝二抗，開展了鵝圓環(huán)病毒抗體檢測間接ELISA方法的研究，本發(fā)明的技術(shù)方案提供一種采用間接ELISA方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體的方法，其采用原核表達的鵝圓環(huán)病毒重組核衣殼蛋白作為ELISA檢測的包被抗原，以HRP-羊抗雞IgG酶標抗體作為二抗，進行鵝血清GoCV抗體的間接ELISA方法檢測。上述原核表達鵝圓環(huán)病毒重組核衣殼蛋白的菌株為含融合表達GoCV外殼蛋白重組質(zhì)粒pET-28a-AC即的BL21(DE3)工程菌，構(gòu)建方法見參考文獻余旭平等，鵝圓環(huán)病毒重組核衣殼蛋白的原核表達，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008年7月第30巻第7期，P505-509，其在IPTG誘導(dǎo)下能融合表達鵝圓環(huán)病毒缺失核定位序列的核衣殼蛋白(ACap蛋白)。將含陽性重組表達質(zhì)粒的工程菌接種于10mLLB液體培養(yǎng)基中(含50ug/mL卡那霉素)，37t:振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的量轉(zhuǎn)接10mLLB液體培養(yǎng)基(含50ug/mL卡那霉素)，37。C振蕩培養(yǎng)，待0D6。。值達0.6左右，加IPTG至終濃度為lmM，誘導(dǎo)4h。離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎后離心收集包涵體，分別以含4M尿素、1%Triton100的緩沖液對包涵體進行洗滌，重復(fù)兩次，最后用8M的尿素溶解包涵體。離心后取上清，用鎳瓊脂糖凝膠柱進行進一步純化，用咪唑洗脫，具體操作參照試劑使用說明。含重組質(zhì)粒pET-28a-AC即的BL21(DE3)工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后GoCV外殼蛋白(AC即，已缺失核定位序列)獲得了較高水平的表達，經(jīng)Bandscan4.5生物圖象分析軟件分析其表達的融合蛋白約占菌體蛋白總量的18.6%。菌體經(jīng)超聲破碎后離心，發(fā)現(xiàn)融合蛋白均在沉淀中，上清液未見可見的條帶，可見融合蛋白是以包涵體形式存在。分別以含4M尿素、1%TritonIOO的緩沖液對包涵體進行洗滌，除去部分雜蛋白。最后用8M的尿素溶解包涵體，并進一步對粗提蛋白進行鎳柱純化，獲得了高純度的AC即蛋白，經(jīng)Bandscan4.5掃描分析純度達95.5%。上述GoCV外殼蛋白采用透析法復(fù)性將用8mol/L尿素溶解的包涵體溶液裝入已處理好的透析袋內(nèi)，置于復(fù)性緩沖液(含不同濃度尿素的0.02MpH7.4PBS)中，在4。C下進行梯度透析，復(fù)性緩沖液中尿素濃度依次遞減，分別為4mol/L、2mol/L、lmol/L、0.5mol/L和Omol/L，蛋白復(fù)性換液間隔時間為10h-12h。經(jīng)過復(fù)性可使重組蛋白折疊成具有活性的正確構(gòu)型。獲得了上述高純AC即蛋白后，進行ELISA反應(yīng)，較合適條件為抗原包被濃度為0.26-4.1iig/mL，鵝血清稀釋度為1:25_1:100，羊抗雞IgG辣根過氧化物酶標記抗體稀釋度為1:1000-1:4000，封閉液為1%BSA或5X脫脂奶，待測血清和二抗均于37t:反應(yīng)l-2h，底物于室溫顯色10-20min。最優(yōu)選條件為抗原包被濃度為2.05yg/mL，鵝血清稀釋度為l:50，羊抗雞IgG辣根過氧化物酶標記抗體稀釋度為1:2000，封閉液為1%BSA或5%脫脂奶，待測血清和二抗均于37t:反應(yīng)1.5h，底物于室溫顯色10min。采用上述間接ELISA方法檢測出的抗體效價的陰陽性臨界點為0.25。本發(fā)明根據(jù)上述方法，還提供一種采用間接ELISA方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體的快診板產(chǎn)品，即將包被好抗原的酶標板用封閉液封閉后洗滌吸干水分，密封后得，所述抗原為原核表達的鵝圓環(huán)病毒重組核衣殼蛋白。上述快診板，其中所述包被抗原的濃度優(yōu)選為0.26-4.1iig/mL。上述快診板，采用的封閉液為1%BSA或5X脫脂奶。上述快診板可直接用在間接ELISA方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體中，具體反應(yīng)條件分別為鵝血清稀釋度為l:25-1:lOO，羊抗雞IgG辣根過氧化物酶標記抗體稀釋度為1:1000-1:4000，封閉液為lXBSA或5X脫脂奶，待測血清和二抗均于37t:滴于所述快診板上反應(yīng)l-2h，底物于室溫顯色10-20min。圖1是本發(fā)明實施例中ACap蛋白的誘導(dǎo)表達、提純與復(fù)性的電泳圖，其中A:1:誘導(dǎo)前；2:IPTG誘導(dǎo)4小時后；3:超聲裂解液離心沉淀；4:超聲裂解液離心上清；5:包涵體洗滌后；6:洗滌上清液；7:8M尿素超聲離心沉淀；8:8M尿素超聲離心上清;9:蛋白mark;B:1:過柱前；2:過柱后；3:復(fù)性后上清；4:復(fù)性后沉淀；圖2是間接ELISA方法對幾個鵝群血清的測定結(jié)果。具體實施例方式下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍?！N采用間接ELISA方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體的方法，其采用原核表達的鵝圓環(huán)病毒重組核衣殼蛋白作為ELISA檢測的包被抗原，以HRP-羊抗雞IgG酶標抗體作為二抗，進行鵝血清GoCV抗體的間接ELISA方法檢測。具體的試驗過程如下1材料與試劑1.1菌株含融合表達GoCV外殼蛋白重組質(zhì)粒pET-28a-AC即的BL21(DE3)工程菌，由發(fā)明人構(gòu)建(構(gòu)建方法見參考文獻余旭平等，鵝圓環(huán)病毒重組核衣殼蛋白的原核表達，中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2008年7月第30巻第7期，P505-509)，在IPTG誘導(dǎo)下能融合表達鵝圓環(huán)病毒缺失核定位序列的核衣殼蛋白(ACap蛋白)。1.2血清(l)GoCV陰性血清首先以10份正常雞的血清混合作為陰性參考血清，建立方法；隨后對經(jīng)PCR反復(fù)多批次檢測為GoCV陰性的1個種鵝群及其商品鵝的血清進行抗體檢測，并與PCR確認為陽性的鵝群采集的血清的抗體測定結(jié)果相對照，確認該種鵝群為陰性群；以該種鵝群4個批次(2批次種鵝、2批次商品鵝)共38份血清為陰性參考血清進行平均值和標準差的計算，確定陰陽性臨界點。(2)GoCV陽性血清自寧波某自繁自養(yǎng)(外來品種)鵝場的商品肉鵝采集法氏囊，經(jīng)核酸抽提和PCR檢測發(fā)現(xiàn)GoCV具有很高的檢出率(4/5)，確定該場為GoCV陽性種鵝場。采集該鵝場1年齡左右種鵝11份血清，每份各取100iiL混合，作GoCV陽性血清樣品；另選取經(jīng)PCR和抗體檢測確認為陰性的種鵝群所產(chǎn)的雛鵝，隔離飼養(yǎng)，于3周齡時用GoCV陽性組織病毒樣品進行攻毒，一直飼養(yǎng)到16周齡撲殺，采集血清，合并作為GoCV陽性血清。采集寧波另一自繁自養(yǎng)(本地浙東白鵝)鵝場1年齡左右種鵝的血清10份，作為GoCV陽性待檢血清，用建立的ELISA方法進行血清抗體檢測。(3)雞大腸桿菌01、新城疫陽性標準血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，禽流感H5、H9陽性標準血清購自哈爾濱獸醫(yī)研究所，小鵝瘟、鵝副粘病毒病等陽性血清，本實驗室保存。51.3主要試劑羊抗雞IgG辣根過氧化物酶標記抗體為德國SBA公司產(chǎn)品；鎳瓊脂糖凝膠購自北京韋氏博慧色譜科技有限公司，其它試劑為國產(chǎn)分析純。2方法2.IELISA抗原的制備與純化2.1.1目的蛋白初步純化將含陽性重組表達質(zhì)粒的工程菌接種于10mLLB液體培養(yǎng)基中(含50ug/mL卡那霉素)，37。C振蕩培養(yǎng)過夜，按1%的量轉(zhuǎn)接10mLLB液體培養(yǎng)基(含50ug/mL卡那霉素)，37t:振蕩培養(yǎng)，待0D6。。值達0.6左右，加IPTG至終濃度為lmM，誘導(dǎo)4h。離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎后離心收集包涵體，分別以含4M尿素、1%Triton100的緩沖液對包涵體進行洗滌，重復(fù)兩次，最后用8M的尿素溶解包涵體。離心后取上清，用鎳瓊脂糖凝膠柱進行進一步純化，用咪唑洗脫，具體操作參照試劑使用說明。2.1.2目的蛋白的復(fù)性采用透析法復(fù)性GoCV外殼蛋白將用8mol/L尿素溶解的包涵體溶液裝入已處理好的透析袋內(nèi)，置于復(fù)性緩沖液(含不同濃度尿素的0.02MpH7.4PBS)中，在4。C下進行梯度透析，復(fù)性緩沖液中尿素濃度依次遞減，分別為4mol/L、2mol/L、lmol/L、0.5mol/L和Omol/L，蛋白復(fù)性換液間隔時間為10h-12h。2.2間接ELISA檢測方法的建立2.2.1抗原包被濃度和血清工作濃度的確定采用棋盤滴定法確定抗原的最適包被濃度和血清稀釋倍數(shù)將ACap蛋白用包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸鹽緩沖液)做8.2iig/ml、4.1iig/ml、2.05iig/ml、l.02iig/ml、0.51iig/ml、0.26iig/ml共6個倍比稀釋度，每稀釋度每孔100yL，4。C包被過夜；將包被好的酶標板用PBS-T(含0.5%Tween20的0.01MpH7.4的PBS)洗滌，用5%脫脂奶粉封閉液封閉；用封閉液將GoCV陽性血清和陰性血清進行i:25、i:50、i:ioo、i:200倍稀釋，組成方陣以HRP-羊抗兔IgG(l:2000)為二抗，OPD顯色。具體操作按常規(guī)間接ELISA進行。2.2.2封閉液確定以最適抗原濃度包被酶標板，洗滌后，分成3組分別用5%脫脂奶粉，1%明膠、1%BSA等3種不同的封閉液進行封閉。封閉時每孔均加入200i!L，每孔重復(fù)2次，37。C作用2h。洗滌后，加入陰陽性血清，按常規(guī)間接ELISA程序進行，比較陽性血清和陰性血清的0D492值及P/N值，以確定最佳包被條件。2.2.3血清最適作用時間的選擇以最適抗原濃度包被酶標板，血清按最適稀釋度稀釋，分別作用30、60、90、120min，按間接ELISA程序進行，取平均值。選取陽性0D值在1.0附近，P/N比值最大的一組作為最適血清作用時間。2.2.4最佳顯色時間的確定室溫避光條件下，設(shè)立四組顯色時間，分別為5min、10min、15min、20min，比較0D492值和P/N值，以確定最佳顯色時間。2.2.5間接ELISA方法陰陽性的判斷對經(jīng)PCR反復(fù)多批次檢測為GoCV陰性的1個種鵝群及其商品鵝的血清進行抗體檢測，并與正常雞血清及與PCR確認為陽性的鵝群采集的血清的抗體測定結(jié)果相對照，確認該種鵝群為陰性群；以該鵝群的種鵝和商品鵝血清為陰性血清，按優(yōu)化好的條件進行間接ELISA操作，檢測0D492值，每個個體的血清單獨檢測。通過對4個批次共38份血樣進行測定，求得OD平均值(Average)X，標準差(StandardDifference)SD，并設(shè)定陰陽性臨界值為X+3承SD，大于該值定為陽性，小于為陰性。2.2.6特異性試驗以純化的ACap蛋白包被酶標板，分別對雞大腸桿菌、新城疫、禽流感、小鵝瘟、鵝副粘病毒病等陽性標準(參考)血清，按建立的間接ELISA方法進行操作測定，每孔重復(fù)2次，以確定該方法的特異性。2.2.7重復(fù)性試驗2.2.7.1批內(nèi)重復(fù)性試驗用同一批制備的重組AC即蛋自包被酶標板，取5份GoCV抗體水平不同的血清和l份陰性血清在不同時間，應(yīng)用本方法進行檢測，每份樣品重復(fù)4孔，結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。2.2.7.2批間重復(fù)性試驗取3份不同時間制備純化的AC即蛋白(批次分別為070925，071213和080125)，經(jīng)包被、封閉后，將陽性血清和陰性血清在相同條件下進行檢測，每份血清檢測4孔，結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。2.2.8快診板保存期試驗將包被好的酶標板用封閉液封閉后洗滌吸干水分，用塑料袋密封后，分別置于-2(TC冰箱中和4t:冰箱中保存2周、3周、4周、6周、8周，進行間接ELISA檢測。2.2.9間接ELISA方法初步應(yīng)用取PCR檢測為GoCV陽性的寧波某鵝場1年左右的10份鵝血清，以及用于陰性(4批次38份)和陽性(11份)對照的血清，按建立好的間接ELISA檢測方法進行抗體檢測。3結(jié)果3.1AC即蛋白表達、純化和復(fù)性含重組質(zhì)粒pET-28a-AC即的BL21(DE3)工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后GoCV外殼蛋白(AC即，已缺失核定位序列)獲得了較高水平的表達(圖1A，泳道1，2)，經(jīng)Bandscan4.5生物圖象分析軟件分析其表達的融合蛋白約占菌體蛋白總量的18.6%。菌體經(jīng)超聲破碎后離心，發(fā)現(xiàn)融合蛋白均在沉淀中，上清液未見可見的條帶(圖1A，泳道3，4)，可見融合蛋白是以包涵體形式存在。分別以含4M尿素、1%Triton100的緩沖液對包涵體進行洗滌，除去部分雜蛋白(圖1A，泳道5，6)。最后用8M的尿素溶解包涵體(圖1A，泳道7，8)，并進一步對粗提蛋白進行鎳柱純化，經(jīng)洗滌條件等探索，獲得了高純度的AC即蛋白，經(jīng)Bandscan4.5掃描分析純度達95.5%(圖1B，泳道2)。純化后的蛋白如果直接對水進行透析復(fù)性，其復(fù)性率很低(小于10%，數(shù)據(jù)未給出)，本發(fā)明經(jīng)透析條件的摸索，在不同濃度的尿素中梯度復(fù)性，最終獲得了GoCV融合外殼蛋白的高效復(fù)性(圖1B，泳道3，4)。3.2最適包被濃度與血清稀釋度由表1可知，隨著抗原濃度的減少和血清稀釋倍數(shù)的增大，血清0D492值逐漸降低，當(dāng)重組蛋白抗原的包被濃度為2.05iig/ml，血清50倍稀釋時，陽性血清的0D492值在1.0左右，且陰性血清(正常雞血清)OD艦值低，P/N值高。一般酶標儀在OD值為l.O左右時誤差最小，反應(yīng)敏感。據(jù)此，我們確定抗原的包被濃度最優(yōu)為2.05ug/ml，血清的稀釋度為i:50。表1重組蛋白包被濃度及血清稀釋倍數(shù)的測定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注+:表示陽性血清；_:表示陰性血清3.3最適封閉液從表2中可知，用1%BSA、5X脫脂奶粉的封閉時P/N值均較高，考慮到經(jīng)濟與方便性，本發(fā)明優(yōu)選5%脫脂奶粉作為封閉液。表2封閉液的確定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.4血清最適作用時間從表3可知當(dāng)一抗血清的作用時間為1.5h時，其陰、陽血清0D492值之比最高，且陰性血清數(shù)值比較低。因此，可確定一抗作用時間優(yōu)選為1.5h。表3—抗血清不同作用時間的0D492測定值作用時間陽性血清陰性血清P/N值0.5h0.5070.0677.6lh0.8840.1038.51.5h1.1130.1349.82h1.2370.1647.63.5最佳顯色時間按照確定的最適條件進行ELISA檢測，底物室溫避光作用時間分別為5min、10min、15min、20min，測其0D492數(shù)值如表4?？芍诘孜镒饔?0min-15min時讀數(shù)，數(shù)值均接近1.0且P/N值均較大。因此，確定實際操作的底物作用時間優(yōu)選為10min。表4顯色時間的選擇顯示時間5min10min15min20min陽性O(shè)D柳0.6331.0161.0591.276陰性O(shè)D柳0.0350.0940.1090.132P/N值_^_^_^_9.63.6陰陽性臨界值的確定按優(yōu)化的抗原包被濃度、血清稀釋倍數(shù)、封閉條件、顯色時間進行間接ELISA，測得4個批次陰性鵝的38份血樣的0D492值，其范圍在0.0750.237。經(jīng)統(tǒng)計其平均值為0.131，標準差為0.0383，按公式X+3ASD確定間接ELISA的陰陽臨界值為0.246，為便于判斷，以O(shè)D艦>0.25判為陽性，OD艦<0.25判為陰性。3.7特異性實驗交叉反應(yīng)試驗結(jié)果如表5所示，可見各標準陽性血清的0D492值均小于0.25，表明重組蛋白不與大腸桿菌、新城疫、禽流感H5、H9、小鵝瘟、鵝副粘病毒等陽性(參考)血清反應(yīng)，僅與GoCV陽性血清反應(yīng)，說明我們建立的以AC即重組蛋白為包被抗原的ELISA方法具有很好的特異性。表5交叉反應(yīng)試驗血清雞大腸雞新城禽流感禽流感小鵝瘟鵝副粘GoCVGoCV桿菌疫H5H9病毒陽性陰性O(shè)D4920.2010.1220.1410.1280.1730.1461.2410.1323.8重復(fù)性實驗批內(nèi)重復(fù)試驗結(jié)果見表6，批間重復(fù)試驗結(jié)果見表7。如表6和表7所示，批內(nèi)重復(fù)試驗的變異系數(shù)基本小于10%;三個批次的抗原檢測的陽性、陰性血清檢測的OD值，其變異系數(shù)也在10%左右。表明該方法具有良好的重復(fù)性。表6批內(nèi)重復(fù)性試髮<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表7批間重復(fù)性試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3.9快診板保存期試驗抗原包被封閉后的快診板分別于4t:和-201:保存，對不同保存期的快診板用同一份血清樣品進行檢測，結(jié)果保存于-2(TC(8周)的快診板陰陽性血清的變異系數(shù)都小于10%，而保存于4°。(2周)的快診板陰陽性O(shè)D值明顯增大(數(shù)據(jù)未給出)。這可能是4。C保存的快診板易受污染而微生物滋生，使包被的AC即或封閉用的脫脂奶粉等發(fā)生變性，造成非特異性吸附和反應(yīng)的緣故。3.10間接ELISA方法初步應(yīng)用結(jié)果應(yīng)用建立好的間接ELISA檢測方法，對1歲左右的陽性鵝群共10份血清進行抗體檢測，結(jié)果6份陽性4份陰性，陽性率60%;而用于陽性對照的ll份陽性血清的測定結(jié)果為10份陽性1份陰性，陽性率為90.9%;結(jié)合用于陰陽性界限判定的4個批次的38份陰性鵝血清一起作圖，結(jié)果見圖2。4結(jié)論到目前為止，GoCV尚不能通過細胞培養(yǎng)進行病毒增殖，因此給GoCV的研究，包括GoCV感染的流行病學(xué)調(diào)查帶來極大的困難。目前GoCV的檢測主要是通過PCR、斑點雜交等核酸學(xué)方法，但應(yīng)用PCR等核酸學(xué)方法開展的分子流行病學(xué)檢測需要撲殺鵝取樣，操作不夠簡便快捷。而ELISA檢測方法具有簡便、快速、批量檢測等優(yōu)點，且檢測僅需要少量的血清樣品。因此，建立GoCV的ELISA檢測方法，非常有利于大面積地開展鵝圓環(huán)病毒感染的流行病學(xué)普查，同時也為GoCV的致病性和免疫機制等進一歩研究提供技術(shù)手段，具有重要意義。應(yīng)用本實驗獲得的高純度GoCV重組AC即蛋白做為包被抗原，并應(yīng)用商品的羊抗雞酶標抗體可替代抗鵝二抗(試驗顯示進口二抗較自制的兔抗鵝二抗結(jié)果更佳，數(shù)據(jù)未給出)，這為GoCVELISA檢測方法的建立奠定了重要基礎(chǔ)。但由于國內(nèi)外對GoCV的相關(guān)研究較少，且無標準GoCV陽性血清及陰性血清，給方法的建立帶來了困難。英國學(xué)者Scott等以SFV真核表達載體表達的鵝圓環(huán)病毒Cap蛋白為抗原，以兔抗鴨熒光抗體為二抗，通過有無熒光染色判斷陰陽性，建立了間接免疫熒光檢測法，并對不同的鵝群的血清進行了GoCV抗體檢測，發(fā)現(xiàn)大于l年的鵝群其抗體陽性率達88.7%，且血清中圓環(huán)病毒抗體熒光強度1年以上的鵝要比1年以下的鵝普遍較強。我們采集了經(jīng)PCR檢測其商品鵝為高陽性率(4/5)的對應(yīng)群種鵝(1年齡左右)血清11份，每份血清各取lOOiiL等量混合作為陽性血清(隨后的血清樣品個體檢測結(jié)果也顯示，該11份血清陽性率為90.9%，它們的ELISA測定值在0.196-1.973之間，數(shù)據(jù)見圖2);由于圓環(huán)病毒具有嚴格的感染動物種屬特異性(鵝圓環(huán)病毒不會感染雞)，因此我們首先以正常雞血清為陰性血清，確定ELISA條件，建立方法；以經(jīng)PCR反復(fù)多次檢測為GoCV陰性的1個種鵝群不同批次的血清為假定陰性血清，用建立的ELISA方法對該4個批次的38份血清進行復(fù)核，結(jié)果測定值均很低，在0.0750.237間，而同時進行對照測定的陽性群的值有高有低，變異范圍很大(0.196-1.973)，二者區(qū)別明顯；由此，經(jīng)2種方法復(fù)核，確定該種鵝群為陰性群，并經(jīng)計算確定陰陽性0D臨界值為0.25。在試驗中我們利用建立好的間接ELISA檢測方法，對經(jīng)PCR檢測為GoCV陽性的另一個1年左右鵝群的10份血清進行GoCV抗體檢測，結(jié)果其血清抗體陽性率為60.0%(6/10，見圖2)，該結(jié)果與Scott等對相同日齡GoCV陽性鵝群檢測的抗體(IFA法)陽性率基本符合。相對地，IFA法只能定性地確定是否為抗體陽性，而本發(fā)明建立的GoCV間接ELISA檢測方法能很好的顯示血清中GoCV抗體效價，并對抗體情況進行量化。GoCV的血清抗體間接ELISA檢測方法的建立，為進一步了解GoCV的流行情況及疾病防控等提供了方便。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。權(quán)利要求一種采用間接ELISA方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體的方法，其特征在于，采用原核表達的鵝圓環(huán)病毒重組核衣殼蛋白作為ELISA檢測的包被抗原，以HRP-羊抗雞IgG酶標抗體作為二抗，進行鵝血清GoCV抗體的間接ELISA方法檢測。2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，ELISA反應(yīng)條件分別為抗原包被濃度為0.26-4.1iig/mL，鵝血清稀釋度為1:25_1:100，羊抗雞IgG辣根過氧化物酶標記抗體稀釋度為l:1000-1:4000，封閉液為1%BSA或5X脫脂奶，待測血清和二抗均于37t:反應(yīng)l-2h，底物于室溫顯色10-20min。3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，ELISA反應(yīng)條件分別為抗原包被濃度為2.05g/mL，鵝血清稀釋度為1:50，羊抗雞IgG辣根過氧化物酶標記抗體稀釋度為1:2000，封閉液為lXBSA或5X脫脂奶，待測血清和二抗均于37t:反應(yīng)1.5h，底物于室溫顯色10min。4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用所述間接ELISA方法檢測出的抗體效價的陰陽性臨界點為O.25。5.—種采用間接ELISA方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體的快診板，其特征在于，將包被好抗原的酶標板用封閉液封閉后洗滌吸干水分，密封后得，所述抗原為原核表達的鵝圓環(huán)病毒重組核衣殼蛋白。6.如權(quán)利要求5所述的快診板，其特征在于，所述包被抗原的濃度為0.26-4.1iig/mL。7.如權(quán)利要求5或6所述的快診板，其特征在于，所述封閉液為1XBSA或5X脫脂奶。8.權(quán)利要求5-7任一項所述的快診板在間接ELISA方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體中的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，ELISA反應(yīng)條件分別為鵝血清稀釋度為i:25-1:ioo，羊抗雞igG辣根過氧化物酶標記抗體稀釋度為i:iooo-i:4000，封閉液為1%BSA或5%脫脂奶，待測血清和二抗均于37t:滴于所述快診板上反應(yīng)l-2h，底物于室溫顯色10-20min。10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，ELISA反應(yīng)條件分別為抗原包被濃度為2.05iig/mL，鵝血清稀釋度為1:50，羊抗雞IgG辣根過氧化物酶標記抗體稀釋度為1:2000，封閉液為1%BSA或5%脫脂奶，待測血清和二抗均于37t:反應(yīng)1.5h，底物于室溫顯色10min。全文摘要本發(fā)明公開了一種采用間接ELISA方法檢測鵝圓環(huán)病毒抗體的方法，其采用原核表達的鵝圓環(huán)病毒重組核衣殼蛋白作為ELISA檢測的包被抗原，以HRP-羊抗雞IgG酶標抗體作為二抗，進行鵝血清GoCV抗體的間接ELISA方法檢測。本發(fā)明能夠快速、敏感、特異地利用鵝血清檢測鵝圓環(huán)病毒抗體，便于大規(guī)模應(yīng)用且不需要撲殺動物。本文建立的間接ELISA方法具有較好的特異性、重復(fù)性，為調(diào)查GoCV的流行情況提供了便捷的手段。文檔編號G01N33/569GK101776687SQ201010122698公開日2010年7月14日申請日期2010年3月2日優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日發(fā)明者于洪濤,余旭平,俞永裕,劉曉寧,孫紅霞,胡東建,趙秀玲,郭婧,陳維虎申請人:浙江大學(xué)