豬圓環(huán)病毒2型(pcv2)亞單位疫苗的制作方法
【專利說明】豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)亞單位疫苗
[0001 ] 序列表
[0002] 本申請包含按照37C. F. R. 1.821 -1.825的序列表。本申請所附序列表整體援引加 入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是小的（直徑17-22M1)、二十面體的、無包膜的DNA病毒，其 包含單鏈環(huán)狀基因組。PCV2與豬圓環(huán)病毒1型(PCV-I)共享約80%序列相同性。但是，與一般 無毒力的PCVl相反，感染PCV2的豬表現(xiàn)出通常稱作斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMff S)的綜合 征。PMWS的臨床特征是消瘦、皮膚蒼白、瘦弱、呼吸窘迫、腹瀉、黃疸（i c terus)和黃疸病 (jaundice)。在一些受感染的豬中，所有表現(xiàn)的組合會變得明顯，而其他豬僅具有這些臨床 表現(xiàn)中的一種或兩種。在尸檢中，微觀和宏觀病變也出現(xiàn)在多個組織和器官上，其中淋巴器 官是最常見的病變部位。已觀察到PCV2核酸或抗原的量與微觀淋巴病變的嚴重程度之間的 高相關(guān)性。感染PCV2的豬的死亡率可以達到80%。除了?1^3，？(^2與幾種其他感染有關(guān)，包 括偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)、格拉塞氏病(Glasser ' s disease)、鏈球菌性腦 膜炎、沙門氏菌病、斷奶后大腸桿菌病、營養(yǎng)性肝功能障礙和化膿性支氣管肺炎。
[0004] 目前，已知有3種亞型的PCV2(PCV2a、PCV2b和PCV2C)，它們根據(jù)PCV2基因型的統(tǒng)一 命名進行分類（Segales,J.et al.，2008，PCV-2genotype definition and nomenclature, Vet Rec 162:867-8)。已提出另外兩種亞型（PCV2d 和 PCV2e)(Wang et al.Virus Res.2009145(l): 151-6)，但是，后來證實它們屬于PCV2a和PCV2b組（Cortey et al.Vet Microbiol .2011149(3-4) :522-32011)。根據(jù)PCV2基因型的這種統(tǒng)一命名，orf2基因用來進 行pcv-2的基因型分型，其中所述基因型分型是基于所比較的兩個序列不同的核苷酸位點 的比例(P距離）。這個值通過核苷酸差異的數(shù)量除以所比較的核苷酸的總數(shù)獲得(Kumar et al.2001Bioinformatics 17,1244-1245)，隨后，p距離/頻率直方圖的構(gòu)建使得能夠確定可 能截斷值以區(qū)分不同的基因型（Rogers and Harpending 1992Molecular Biology and Evolution 9，552-569;Biagini et al.1999Journal of General Virology 80,419-424)。利用這種方法，當orf2pCV-2序列之間的遺傳距離為0 · 035時將它們分配至不同基因 型。
[0005] US 2011/0305725A1描述了在豬中測試新疫苗制劑以評價其對豬圓環(huán)病毒和豬肺 炎支原體(M·hyopneumoniae)的效力的研究。在這個研究的過程中，觀察到對照和疫苗接種 組中的一些豬表現(xiàn)出PMWS的臨床表現(xiàn)。隨后證實這些豬在攻擊之前暴露于環(huán)境PCV2。來自 這些豬的血液和組織樣品的分子分析顯示它們包含不同于用來攻擊的毒株的2B型毒株(US 2011/0305725 Al的[0152]段）。
[0006] 因此，需要新的和增強的疫苗接種方法以控制不同PCV2亞型的PCV2感染。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 上述技術(shù)問題的解決通過說明書和權(quán)利要求書表征的實施方案完成。
[0008] 因此，本發(fā)明在其不同方面是根據(jù)權(quán)利要求書實施的。
[0009] 本發(fā)明是基于令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，給藥僅一個劑量的PCV2b亞型（PCV2b)0RF2蛋白， 特別是如果其包含在免疫原性組合物中，足以減少和預防感染PCV2a或PCV2b所引起的臨床 表現(xiàn)。
【附圖說明】
[00?0] 圖1證實攻擊之后28天的淋巴耗竭（lymphoid depletion)結(jié)果。表現(xiàn)出扁桃體、 髂、氣管支氣管和腸系膜淋巴結(jié)淋巴耗竭的豬陽性的百分比。示出用PCV2a免疫接種和攻擊 的豬以及用PCV2b免疫接種和攻擊的豬。
[0011]圖2證實攻擊之后28天的淋巴炎癥結(jié)果。表現(xiàn)出扁桃體、髂、氣管支氣管和腸系膜 淋巴結(jié)淋巴炎癥的豬陽性的百分比。示出用PCV2a免疫接種和攻擊的豬以及用PCV2b免疫接 種和攻擊的豬。
[0012] 圖3證實攻擊之后28天的IHC組織結(jié)果。來自以下組織的豬陽性IHC陽性的百分比； 扁桃體、髂、氣管支氣管和腸系膜淋巴結(jié)。示出用PCV2a免疫接種和攻擊的豬以及用PCV2b免 疫接種和攻擊的豬。
[0013] 圖4證實攻擊之后28天的平均肺炎癥評分。攻擊之后28天豬的平均組肺炎癥評分。 示出用PCV2a免疫接種和攻擊的豬以及用PCV2b免疫接種和攻擊的豬。
[0014] 圖5證實攻擊之后28天治療組的PCV2病毒血癥。通過利用PCV2a/2b引物和PCV2b特 異性引物的PCR的豬陽性的百分比。示出用PCV2a免疫接種和攻擊的豬以及用PCV2b免疫接 種和攻擊的豬。
[0015] 圖6證實總嚴重程度評分，所有淋巴樣組織，其用于確定每組缺失、炎癥和定殖的 緩解分數(shù)。
[0016] 圖7證實攻擊之后的PCV2b病毒血癥，其中在第28天之后觀察病毒血癥的減少。
【具體實施方式】
[0017] 本發(fā)明因此特別地分另Ij基于PCV2b 0RF2蛋白或包含PCV2b 0RF2蛋白的免疫原性 組合物，其中所述PCV2b 0RF2蛋白或所述包含PCV2b 0RF2蛋白的免疫原性組合物可以用于 特定目的。
[0018] 在一方面，本發(fā)明因此涉及PCV2b亞型(PCV2b)0RF2蛋白或包含PCV2b 0RF2蛋白的 免疫原性組合物，其用在治療或預防感染PCV2,減少、預防或治療感染PCV2所引起的臨床表 現(xiàn)，或者預防或治療感染PCV2所引起的疾病的方法中。
[0019] 本發(fā)明還提供一種治療或預防感染PCV2,減少、預防或治療感染PCV2所引起的臨 床表現(xiàn)，或者預防或治療感染PCV2所引起的疾病的方法，所述方法包括向動物，特別是有需 要的動物給藥PCV2b 0RF2蛋白或包含PCV2b 0RF2蛋白的免疫原性組合物。
[0020] 而且，本發(fā)明提供PCV2b 0RF2蛋白或包含PCV2b 0RF2蛋白的免疫原性組合物在制 備藥物中的用途，所述藥物用于治療或預防感染PCV2,減少、預防或治療感染PCV2所引起的 臨床表現(xiàn)，或者預防或治療感染PCV2所引起的疾病。
[0021] 特別地，在本發(fā)明的上下文中，優(yōu)選PCV2b 0RF2蛋白或包含PCV2b 0RF2蛋白的免 疫原性組合物，其中所述PCV2b 0RF2蛋白為重組PCV2b 0RF2蛋白，更優(yōu)選重組桿狀病毒表 達的PCV2b 0RF2蛋白。
[0022] 特別地，為了本發(fā)明目的，優(yōu)選PCV2b 0RF2蛋白或包含PCV2b 0RF2蛋白的免疫原 性組合物，其中所述PCV2b 0RF2蛋白包含或由以下序列組成：與SEQ ID No: 1的序列至少 94%、優(yōu)選至少95 %、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97 %、更優(yōu)選至少98%、并且最優(yōu)選至少 99 %相同的序列。
[0023]術(shù)語"重組蛋白"指通過重組DNA技術(shù)制備的多肽。這類技術(shù)的實例包括將編碼所 表達的蛋白的DNA插入合適的表達載體，優(yōu)選桿狀病毒表達載體，所述表達載體轉(zhuǎn)而用來轉(zhuǎn) 化宿主細胞以產(chǎn)生所述DNA編碼的蛋白或多肽。
[0024]如本文所用，術(shù)語"重組蛋白"因此特別地指表達自重組DNA分子的蛋白分子。
[0025] 應當進一步理解術(shù)語"由序列組成的重組蛋白"特別地還涉及任何共翻譯和/或翻 譯后修飾或者受到其中表達多肽的細胞影響的序列修飾。因此，如本文所用，術(shù)語"由序列 組成的重組蛋白"還涉及具有受到其中表達多肽的細胞影響的一個或多個修飾的序列，特 別是蛋白生物合成和/或蛋白加工中影響的氨基酸殘基修飾，優(yōu)選選自糖基化、磷酸化和乙 ?；?br>[0026] 在一優(yōu)選方面，如本文所述，感染PCV2是感染PCV2b亞型(PCV2b)和/或感染除2b亞 型以外PCV2的亞型。
[0027] 如本文所用，術(shù)語"感染PCV2"等于術(shù)語"PCV2感染"。
[0028] 特別地，如本文提到的，感染除2b亞型以外PCV2的亞型是感染PCV2a亞型(PCV2a) 和/或PCV2c亞型(PCV2c)，并且優(yōu)選感染PCV2a。
[0029] 如本文所述，術(shù)語"PCV2b亞型(PCV2b)0RF2蛋白"涉及如PCV2基因型定義的標準化 命名所定義的PCV_2b的0RF2基因編碼的蛋白（Segales，J.et al.，2008，PCV_2genotype definition and nomenclature,Vet Recl62:867_8)其援引加入本文）。
[0030]根據(jù)另一優(yōu)選方面，如本文所述，感染除2b亞型以外PCV2的亞型是同時感染(i)除 2b亞型以外PCV2的亞型和（i i) PCV2b，特別是同時感染PCV2a和PCV2b。
[0031] 如本文所述，根據(jù)PCV2基因型定義的標準化命名，術(shù)語"PCV2a"、"PCV2b"和 "？(^2。"分別涉及卩(^-2&、？(^-213和？(^-2。（568&168，了.6七&1.，2008，？(^-28611〇七7口6 definition and nomenclature，Vet Rec 162:867-8,其援引加入本文）。
[0032]特別地，如本文提到的，感染PCV2b是感染（i)包含與SEQ ID NO: 1的序列至少 94%、更優(yōu)選至少95 %、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97 %、更優(yōu)選至少98%、并且最優(yōu)選至 少99%相同的多肽的PCV2,或者（ii)包含多核苷酸的PCV2,所述多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO: 1的序列至少94%、優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少 98%、并且最優(yōu)選至少99%的多肽的序列。
[0033]如本文所用，特別應當理解術(shù)語"與SEQ ID Ν0:Χ的序列相同"分別等于術(shù)語"在 SEQ ID NO:X的長度與SEQ ID NO:X的序列相同"或術(shù)語"在SEQ ID NO:X的整個長度與SEQ ID Ν0:Χ的序列相同"。在這個上下文中，"X"是選自1-2的任何整數(shù)，從而"SEQ ID Ν0:Χ"代 表本文中提到的任何SEQ ID N0。
[0034] 優(yōu)選地，如本文所述，感染PCV2a是感染（i)包含與SEQ ID N0:2的序列至少94%、 更優(yōu)選至少95 %、更優(yōu)選至少96 %、更優(yōu)選至少97 %、更優(yōu)選至少98 %、并且最優(yōu)選至少 99%相同的多肽的PCV2,或者（ii)包含多核苷酸的PCV2,所述多核苷酸包含編碼與SEQ ID NO :2的序列至少94%、優(yōu)選至少95 %、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97 %、更優(yōu)選至少98%、 并且最優(yōu)選至少99%的多肽的序列。
[0035]優(yōu)選地，在本發(fā)明的上下文中，治療或預防感染PCV2是基于或包括或由以下組成： 誘導針對所述PCV2的免疫應答，臨床表現(xiàn)和/或疾病，如本文提到的，所述臨床表現(xiàn)選自：淋 巴耗竭、淋巴炎癥、淋巴組織的PCV2抗原的陽性IHC、病毒血癥、鼻脫落、發(fā)熱、減少的平均日 增重、肺部炎癥、肺組織的PCV2抗原的陽性IHC、增加的死亡率，如本文提到的，所述疾病為 PMffS0
[0036]特別地，在本發(fā)明的上下文中，治療或預防感染除2b以外PCV2的亞型是基于或包 括或由以下組成:誘導針對所述除2b以外PCV2的亞型的免疫應答或者同時誘導針對所述除 2b以外PCV2的亞型和PCV2b的免疫應答。
[0037] 如本文所用，術(shù)語"預防（prevention)"或"減少（reduction)"或"預防 (preventing)"或"減少(reducing)"表示但不限于這樣的方法，所述方法包括向動物給藥 PCV2抗原，即本發(fā)明的PCV2b 0RF2蛋白，其包括在本發(fā)明的組合物中，其中當給藥至所述動 物時，所述PCV2抗原引發(fā)或能夠引發(fā)所述動物中針對PCV2的免疫應答?？傊?，這樣的治療分 別導致PCV2引起的疾病的臨床表現(xiàn)或與PCV2感染相關(guān)的臨床表現(xiàn)減少。更特別地，如本文 所用，術(shù)語"預防（prevention)