專利名稱：一種用于Ⅴ型腺病毒滴度檢測的試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于V型腺病毒滴度檢測的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腺病毒是一種沒有包膜的直徑為70 90 nm的顆粒，由252個(gè)殼粒呈廿面體排列構(gòu)成。每個(gè)殼粒的直徑為7 9 nm。衣殼里是線狀雙鏈DNA分子，約含35000bp，兩端各有長約100 bp的反向重復(fù)序列。由于每條DNA鏈的5’端同相對分子質(zhì)量為55X IO3Da的蛋白質(zhì)分子共價(jià)結(jié)合，可以出現(xiàn)雙鏈DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。上個(gè)世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)并成功分離腺病毒以來，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了 100余個(gè)血清型，其中人腺病毒有47種，分為A、B、C、D、E和F六個(gè)亞群(subgroup)。而V型腺病毒是目前最常用的腺病毒，具有廣泛的應(yīng)用前景。腺病毒可以感染并且在HEK293細(xì)胞中復(fù)制，而5型腺病毒表達(dá)一種特殊的外殼蛋白Hexon，感染腺病毒的HEK293細(xì)胞使用甲醇固定后，再用抗Hexon的一抗孵育，一抗會與腺病毒上的Hexon 蛋白結(jié)合，此時(shí)加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育，待二抗與一抗結(jié)合后再加入辣根過氧化物酶的底物DAB進(jìn)行染色，然后洗脫多余的染色液，被病毒感染的陽性細(xì)胞會被染成褐色，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞，利用公式計(jì)算病毒滴度。而其測定方法目前僅限于TCID50法，該檢測方法耗時(shí)長，可重復(fù)性低，為精確測定帶來極大挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種測定V型腺病毒滴度的酶聯(lián)免疫法。本發(fā)明的目的之二在于提供該酶聯(lián)免疫法的操作方法。本發(fā)明的目的之三在于提供該酶聯(lián)免疫法的應(yīng)用。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種用于V型腺病毒滴度檢測的試劑盒，其特征在于該該試劑盒測定V型腺病毒滴度采用了酶聯(lián)免疫法?！N制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于測定V型腺病毒滴度的酶聯(lián)免疫法，其特征在于該方法的具體步驟為
(1)選取狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備成2. 5X IO5個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液二4孔板每個(gè)孔中種入Iml細(xì)胞，37°C、5%0)2培養(yǎng)1小時(shí)。(2)準(zhǔn)備好10倍梯度稀釋的病毒樣品，每孔逐滴加入100 μ 1病毒樣品。(3) 37°C、5% CO2 感染 2 天。(4)輕輕的去除培養(yǎng)液，沿著M孔板側(cè)壁緩緩加入預(yù)冷的甲醇0. 5ml, _20°C孵育 20mino(5)使用PBS輕輕的沖洗細(xì)胞3次，每次5min。(6)使用1%BSA的PBS室溫封閉1小時(shí)。(7)加入0. 25ml的IXanti-Hexon抗體溶液至每個(gè)孔中，室溫孵育1小時(shí)。(8)使用PBS輕輕的沖洗細(xì)胞3次，每次5min。
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(9)加入0. 25mlIX辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗至每孔，室溫孵育1小時(shí)。(10)使用PBS輕輕的沖洗細(xì)胞3次，每次5min。(11)加入0. 25ml新配置的IXDAB工作液至每孔，室溫孵育lOmin。(12)棄DAB，使用PBS沖洗2次，每孔加入lmlPBS。(13)每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野，使用光學(xué)顯微鏡IOX物鏡下計(jì)算陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。(14)計(jì)算每孔陽性細(xì)胞的平均個(gè)數(shù)和病毒滴度，公式如下
\*iral Titer ^ifivmL) = Cavgrage positive celis/fieid) χ (79 tiekb/wsli) s (cliliitioii factor)
(0.1 iiiL)
根據(jù)權(quán)利要求1所述的V型腺病毒滴度檢測的試劑盒在測定V型腺病毒滴度中的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)對測定V型腺病毒滴度采用了酶聯(lián)免疫法，并應(yīng)用人胚胎腎細(xì)胞 HEK293為模型研究其對V型腺病毒滴度檢測的精確性。為酶聯(lián)免疫法在V型腺病毒滴度檢測應(yīng)用提供了一種新手段。
具體實(shí)施例方式
HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)人胚胎腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞系培養(yǎng)于37°C，5%C02恒溫培養(yǎng)箱。對數(shù)生長期的細(xì)胞用胰酶消化脫壁，再加入適量培養(yǎng)液以易于混勻細(xì)胞；用移液器將其移入 15ml離心管中，1500rpm離心!Bmin ；去上清；用5ml無菌IXPBS將細(xì)胞懸起，并吹打混勻； 加約7ml細(xì)胞懸液于裝有Iml新鮮培養(yǎng)基的新培養(yǎng)瓶中，放入37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 約2天左右傳代1次(主要查看細(xì)胞有無鋪滿培養(yǎng)瓶)。病毒的感染(1)選取狀態(tài)良好的兩組HEK293細(xì)胞TCID50病毒滴度，使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備成2. 5X105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，M孔板每個(gè)孔中種入Iml細(xì)胞， 37°C、5%C02培養(yǎng)1小時(shí)。(2)準(zhǔn)備好10倍梯度稀釋的病毒樣品，每孔逐滴加入100 μ 1病毒樣品。(3) 37°C、5%C02感染10天或2天。然后分別用TCID50和V型腺病毒滴度檢測的試劑盒進(jìn)行檢測，如

圖1，圖2和表一所示。圖1為TCID50法檢測V型腺病毒滴度的結(jié)果。圖2為和V型腺病毒滴度檢測的試劑盒檢測V型腺病毒滴度的結(jié)果。
表一 .V型腺病毒滴度檢測的試劑盒和TCID50腺病毒滴度檢測的差異
|TCID50法IV型腺病毒滴度檢測的試劑盒
實(shí)驗(yàn)原理病毒感染細(xì)胞,在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制使細(xì)胞病變,觀察病變細(xì)胞病毒感染細(xì)胞,抗體耦合病毒顆粒,
__染色計(jì)數(shù)_
實(shí)驗(yàn)操作將HEK293細(xì)胞接種于96孔板中，病毒原液做梯度稀釋，加入96只需將HEK293細(xì)胞接種于樹孔板
孔板中，共需要加80個(gè)孔,操作復(fù)雜中,4個(gè)孔即可,病毒稀釋液也只需
__加8個(gè)孔,操作簡單_
實(shí)驗(yàn)結(jié)果不容易觀察，10天之后病變細(xì)胞于未病變細(xì)胞不容易區(qū)分陽性細(xì)胞被染成褐色,容易觀察
重復(fù)性I實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本不可重復(fù)I實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性高—
五、結(jié)果通過V型腺病毒滴度檢測的試劑盒進(jìn)行病毒滴度檢測，比傳統(tǒng)的TCID50法更精確，可重復(fù)性高，時(shí)程短，極大地促進(jìn)了 V型腺病毒滴度檢測的效率和數(shù)據(jù)可信度。
權(quán)利要求
1.一種用于V型腺病毒滴度檢測的試劑盒及其應(yīng)用，其特征在于該試劑盒測定V型腺病毒滴度采用了酶聯(lián)免疫法。
2.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于測定V型腺病毒滴度的酶聯(lián)免疫法，其特征在于該方法的具體步驟為(1)選取狀態(tài)良好的HEK293細(xì)胞，使用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備成2.5 X IO5個(gè)/ ml的細(xì)胞懸液，M孔板每個(gè)孔中種入Iml細(xì)胞，37°C、5%C02培養(yǎng)1小時(shí)。(2)準(zhǔn)備好10倍梯度稀釋的病毒樣品，每孔逐滴加入100μ 1病毒樣品。 (3) 37°C、5%C02 感染 2 天。(4)輕輕的去除培養(yǎng)液，沿著M孔板側(cè)壁緩緩加入預(yù)冷的甲醇0.5ml, -20°C孵育20mino(5)使用PBS輕輕的沖洗細(xì)胞3次，每次5min。(6)使用1%BSA的PBS室溫封閉1小時(shí)。(7)加入0.25ml的IXanti-Hexon抗體溶液至每個(gè)孔中，室溫孵育1小時(shí)。(8)使用PBS輕輕的沖洗細(xì)胞3次，每次5min。(9)加入0.25mlIX辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗至每孔，室溫孵育1小時(shí)。(10)使用PBS輕輕的沖洗細(xì)胞3次，每次5min。(11)加入0.25ml新配置的IXDAB工作液至每孔，室溫孵育lOmin。(12)棄DAB,使用PBS沖洗2次，每孔加入ImlPBS0(13)每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野，使用光學(xué)顯微鏡IOX物鏡下計(jì)算陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)。 (14)計(jì)算每孔陽性細(xì)胞的平均個(gè)數(shù)和病毒滴度，公式如下Viral Titer lifu/uiL) = (average positive celb.;field) χ P9 fields/weil) χ (dilution factor)(0.1 niL)°
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的V型腺病毒滴度檢測的試劑盒在測定V型腺病毒滴度中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于Ⅴ型腺病毒滴度檢測的試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)對Ⅴ型腺病毒滴度檢測采用酶聯(lián)免疫的方法，極大地提高了測定的精度，縮短了時(shí)程。為Ⅴ型腺病毒滴度檢測應(yīng)用提供了一種新方法。
文檔編號G01N15/10GK102455359SQ20101051144
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月19日
發(fā)明者葉思靈, 夏清梅, 武佳, 潘謳東, 陳國澤, 黃紅軍 申請人:上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司