專利名稱：一種同時標記腫瘤iv型膠原、巨噬細胞和新生血管的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于組織免疫熒光技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種檢測腫瘤間質(zhì)IV型膠原、巨 噬細胞和腫瘤新生血管的量子點三色熒光標記方法，適用于人腫瘤組織微環(huán)境成分變化的 準確、定量檢測。
背景技術(shù)：
腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅涉及腫瘤細胞本身，而且還與腫瘤細胞周圍的微環(huán)境有密 切關(guān)系。惡性腫瘤(腫瘤)微環(huán)境由腫瘤細胞及其周圍纖維母細胞、上皮細胞、固有及特異性 免疫細胞、腫瘤血管、間葉細胞及其表達產(chǎn)物、代謝產(chǎn)物。腫瘤微環(huán)境內(nèi)成分眾多，因缺乏有 效地技術(shù)，當前對腫瘤微環(huán)境的研究仍然以單一成分為主，無法同時顯示腫瘤微環(huán)境內(nèi)的 多種改變，如腫瘤間質(zhì)的重塑、巨噬細胞浸潤和腫瘤血管發(fā)生。腫瘤微環(huán)境成分眾多且相互作用的特性提示研究腫瘤微環(huán)境必須有良好的標記 技術(shù)能同時研究多種成分。石蠟切片免疫組織化學染色在一定程度上標記特定分子，在腫 瘤病理研究中有重要意義。但該方法染色背景高、特異性差，而且傳統(tǒng)的酶-底物顯色系統(tǒng) 依賴于色原的沉積，在組織上非常近似，難以同時觀察一張切片同一部位兩種抗原的共表 達定位。這種局限性使其無法滿足腫瘤多成分標記的需要。雖然免疫熒光標記抗原也是 研究腫瘤的常用方法，且比酶-底物顯示系統(tǒng)更有優(yōu)勢，但異硫氰酸熒光素(fluorescein iSOthiOCyanate，F(xiàn)ITC)、羅丹明(rhodamine)等普通有機熒光基團敏感度低，發(fā)生光譜寬而 重疊，抗光漂白能力差，且與組織的高自發(fā)熒光難以區(qū)分。此外，在傳統(tǒng)的免疫熒光雙標染 色法中，有機染料必須在不同波長下激發(fā)，然后利用圖像處理軟件進行圖像疊加，才能獲得 合成的最后的熒光雙標染色結(jié)果。因此，普通有機熒光染料也不能滿足多重染色的需要。量子點是直徑2 10nm的近球形納米顆粒，半徑小于或接近于激子玻爾半徑的新 型半導體納米晶粒，與傳統(tǒng)有機熒光染料、熒光蛋白和稀土元素螯合物相比，量子點有諸多 優(yōu)勢，激發(fā)光波譜寬、連續(xù)，紫外光可以激發(fā)任何大小的量子點，發(fā)射光波譜窄而對稱；光穩(wěn) 定性好。這些特性使量子點在生物成像領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢，在腫瘤研究中具有廣闊的應(yīng) 用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種同時標記腫瘤間質(zhì)IV型膠原、巨噬細胞和新生血 管的方法，本發(fā)明中提供的量子點多重染色方法可用于腫瘤組織微環(huán)境多種成分的高效、 準確、快速、同時檢測，該方法可推廣用于一種操作步驟簡單、快速、靈敏、高效、經(jīng)濟實用的 通用腫瘤微環(huán)境分子病理學檢測技術(shù)。一種同時標記腫瘤間質(zhì)IV型膠原、巨噬細胞和新生血管的方法，其步驟是
A、福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織4 μ m厚切片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的防脫 載玻片上。B、組織切片的準備，將組織切片放入二甲苯中脫蠟三次(不同的器皿中)，每次4-6分鐘，脫蠟后將組織切片依次放入無水乙醇4-6分鐘、95% (體積比，以下相同)酒精1-3 分鐘、95%酒精1-3分鐘和80%酒精1-3分鐘，流水沖洗3飛分鐘。C、抗原修復，用檸檬酸三鈉29. 41g，雙蒸水IOOOml配制檸檬酸三鈉緩沖液，檸檬 酸10. 5g，雙蒸水500 ml配制檸檬酸緩沖液，分別取檸檬酸三鈉緩沖液20. 25ml、檸檬酸緩 沖液4. 75ml和225ml雙蒸水配制成檸檬酸抗原修復液(0. Olmol, pH 6. 0，250ml)。將組織 切片置于加入了 250ml抗原修復液的抗原修復盒中微波修復，即低火(微波功率136W)修 復4-6分鐘后轉(zhuǎn)至中火(微波功率440W)修復9-11分鐘，然后室溫(2(T25°C以下相同)放 置待玻片自然冷卻至36-38°C。D、自來水沖洗后取出切片，洗滌切片，用三羥基氨基甲烷(trisQiydroxymethyl) aminomethane, Tris)6. 05g 和氯化鈉 38. Og 及雙蒸水 5000ml，配制 0. 01M/L、pH7. 2-7. 4 的 三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水(tris buffered saline, TBS)作為洗滌液，洗滌3次，每次3 分鐘；
E、封閉，封閉液位含有2%Wt/vol牛血清白蛋白的TBS，封閉條件為濕盒孵育，37°C， 30min ；
F、加一抗，去除上述封閉液后，滴加鼠抗人巨噬細胞單克隆抗體、兔抗人IV型膠原多 克隆抗體、山羊抗人⑶105多克隆抗體的一抗混合物，37°C濕盒內(nèi)孵育;T4h或4°C冰箱過夜 (不少于12h)；所述的一抗為對應(yīng)的免疫球蛋白G (Ig G)抗原結(jié)合片段。G、洗滌切片，清洗液為(含0. 5%/vol/vol吐溫#20的TBS(TBST)，洗滌3次，每次 3min ；
H、封閉，同步驟4;
I、本實驗中所用二抗為量子點(F(ab' )2_)QDs525標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G (IgG)的抗原結(jié)合片段(Fragment antigen-binding, Fab 段)量子點(F(ab' )2-)QDs525、 量子點(F(ab' )2_)QDs585標記的山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)的抗原結(jié)合片段(Fragment antigen-binding, Fab 段)量子點(F (ab' ) 2_) QDs585、量子點(F (ab ‘ )2-)QDs655 標 記的兔抗山羊免疫球蛋白G (IgG)的抗原結(jié)合片段(Fragment antigen-binding, Fab段) (F(ab' )2-QDs655)，(F(ab' )2-QDs525)、(F(ab' ) 2-QDs585)和(F (ab' )2-QDs655)均 購自美國hvitrogen公司。去除上述封閉液后，滴加F (ab ‘ ) 2-QDs525、F (ab ‘ ) 2-QDs585 和F(ab' )2-QDs655混合物，稀釋液為含2%Wt/vol牛血清白蛋白的TBS，濕盒孵育，37°C， 2H所述的二抗為量子點(F(ab' )2_)QDs525標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G (IgG)的 抗原結(jié)合片段(Fragment antigen-binding, Fab 段)量子點(F(ab' )2_) QDs525、量子 點(F(ab' )2_)QDs585標記的山羊抗兔免疫球蛋白G (IgG)的抗原結(jié)合片段(Fragment antigen-binding, Fab 段)量子點(F(ab' )2_) QDs585、量子點(F(ab‘ )2-)QDs655 標 記的兔抗山羊免疫球蛋白G (IgG)的抗原結(jié)合片段(Fragment antigen-binding, Fab段) (F(ab' )2-QDs655)。J、洗滌切片，清洗液與上述步驟7所用清洗液相同，TBS按上述步驟4的配方制 備，洗滌2次，每次2min，再用TBS洗滌一次，!Min。K、封片，用甘油90ml和TBSlOml配成90%(體積比)緩沖甘油，緩沖甘油封片后4°C 保存。在熒光顯微鏡下用紫外光(33(T385nm)激發(fā)即可觀察到顯示綠色熒光的巨噬細胞、 顯示橙黃色熒光的IV型膠原和顯示紅色熒光的腫瘤新生血管。
為了檢測此技術(shù)能否進行量化分析，做了以下實驗
按照上述的步驟，通過熒光顯微鏡，在紫外光(波長33(T385nm)激發(fā)下，得到了 IV型膠 原、巨噬細胞和腫瘤新生血管的三色標記成像(圖5A)，組織結(jié)構(gòu)和抗原分布部位清晰、易于 MffiCRi Nuance ^7 ] ^ ^ (Cabridge Research & Instrumentation， Inc, Woburn, MA, USA)采集光譜信號(圖5Β)，既能得到更清楚地三色圖像(圖5C)，也能對不同 的熒光信號定量(圖5D-E)。巨噬細胞既可以直接記數(shù)，在圖5中有13個巨噬細胞。IV型 膠原可觀察其分布趨勢，并根據(jù)熒光強度定量，在圖5中將其劃分為186個連續(xù)的區(qū)域定量 計算其表達量。腫瘤新生血管也可以直接計數(shù)，在圖5中有14個新生血管。本發(fā)明中提供的量子點多重染色方法可用于腫瘤組織微環(huán)境多種成分的高效、準 確、快速、同時檢測，該方法可推廣用于一種操作步驟簡單、快速、靈敏、高效、經(jīng)濟實用的通 用腫瘤微環(huán)境分子病理學檢測技術(shù)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點和效果
1.檢測特異性強，背景清晰，便于組織形態(tài)學分析(圖1)。2.方法簡便、快速，易于標準化及大量檢測，重復性較好。從切片脫蠟至觀察結(jié)果， 實驗全程約7、h，可同時對多張組織切片進行染色。3.要觀察腫瘤微環(huán)境內(nèi)的多種成分，采用傳統(tǒng)的免疫組織化學染色時只能單獨染 色，無法實現(xiàn)同一切片上的共表達定位(圖4)。本發(fā)明有效地解決了次難題，能同時觀察到 多種成分，綜合分析微環(huán)境變化。4.檢測靈敏度高、便于量化。量子點熒光亮度強、穩(wěn)定而持久，可采用光譜分析量 化結(jié)果(圖5)。5.無需后期圖片合成等復雜分析步驟，封片后即能直接觀察。6.熒光亮度高，持續(xù)時間長，結(jié)果容易保存及反復觀察。


圖1為一種量子點單色標記法顯示腫瘤微環(huán)境內(nèi)重要成分示意圖。圖1中A為用特異性兔抗人IV型膠原抗體作為一抗，量子點QDs585標記的山羊 抗兔IgG Fab段(F(ab' )2-QDs585)作為二抗的標記結(jié)果，顯示腫瘤微環(huán)境間質(zhì)的重塑。圖1中B為用特異性山羊抗人⑶105抗體作為一抗，量子點QDs655標記的兔抗山 羊IgG Fab段(F(ab' )2-QDs655)作為二抗的標記結(jié)果，顯示腫瘤新生血管。圖1中C為用鼠抗人巨噬細胞作為一抗，量子點QDs525標記的山羊抗鼠IgG Fab 段(F(ab' )2-QDs525)作為二抗的標記結(jié)果，顯示浸潤巨噬細胞。圖1中D為用TBS作為一抗，量子點QDs655標記的兔抗山羊IgG Fab段(F(ab' )2-QDs655)作為二抗的標記結(jié)果，證明基于量子點探針的標記技術(shù)特異性強。放大倍數(shù)200X(A, B), 400X (C, D)；標尺50 μ m (Α, B), 20 μ m (C, D).量子點圖象由紫外光(波長33(T385 nm)激發(fā)下，通過Olympus DP72成像系統(tǒng)采集圖 象
圖2為一種量子點三色標記同時顯示腫瘤微環(huán)境內(nèi)三種成分的結(jié)果示意圖。圖3為一種量子點三色標記同時顯示腫瘤微環(huán)境內(nèi)三種成分的結(jié)果示意圖。實驗中采用鼠抗人巨噬細胞單克隆抗體、兔抗人IV型膠原多克隆抗體、山羊抗人 CD105 多克隆抗體的混合物為一抗，F(xiàn)(ab' ) 2-QDs525、F (ab ‘ ) 2-QDs585 和 F (ab ‘ )2-QDs655的混合物為二抗。圖2顯示，兩個癌巢之間有豐富的新生血管和浸潤巨噬細胞， 而間質(zhì)的重要成分IV型膠原則被降解，發(fā)生間質(zhì)重塑。圖3顯示，隨著腫瘤細胞的擴增，間 質(zhì)屏障逐漸消失，在此過程中可見巨噬細胞在癌巢周邊聚集，癌巢周邊新生血管豐富。放大倍數(shù)400X(圖2，圖3)；標尺20 μ m (圖2，圖3)。在紫外光(波長 330^385 nm)激發(fā)下，通過Olympus DP72成像系統(tǒng)采集圖象
圖4為一種傳統(tǒng)免疫組織化學染色分別顯示腫瘤微環(huán)境內(nèi)三種成分的結(jié)果示意圖。因無法實現(xiàn)在同一切片上對這三張成分同時染色，因此只能分別染色后再綜合分 析腫瘤微環(huán)境成分的變化。圖4中A為用特異性兔抗人IV型膠原抗體作為一抗，生物素化的山羊抗兔IgG 為二抗，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶為反應(yīng)劑，二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine， DAB)為顯色底物的記結(jié)果，顯示腫瘤微環(huán)境間質(zhì)成分。圖4中B為用特異性山羊抗人⑶105抗體作為一抗，生物素化的兔抗山羊IgG為二 抗，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶為反應(yīng)劑，二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB) 為顯色底物的記結(jié)果，顯示腫瘤新生血管。圖4中C為用鼠抗人巨噬細胞作為一抗，生物素化的山羊抗鼠IgG為二抗，鏈霉素 抗生物素蛋白-過氧化物酶為反應(yīng)劑，二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)為顯色底 物的記結(jié)果，顯示浸潤巨噬細胞。圖4中D為用TBS作為一抗，生物素化的山羊抗鼠IgG為二抗，鏈霉素抗生物素蛋 白-過氧化物酶為反應(yīng)劑，二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)為顯色底物的記結(jié)果， 作為對照組。放大倍數(shù)400X (A, B, C, D)；標尺20 μ m (Α, B, C, D)。在紫外光(波 長33(T385 nm)激發(fā)下，通過Olympus DP72成像系統(tǒng)采集圖象
圖5為一種光譜定量分析三色標記結(jié)果的示意圖
圖5中A為一種量子點三色標記同時顯示腫瘤微環(huán)境內(nèi)三種成分的結(jié)果示意圖。實驗 中采用鼠抗人巨噬細胞單克隆抗體、兔抗人IV型膠原多克隆抗體、山羊抗人CD105多克隆 抗體的混合物為一抗，F(xiàn)(ab' )2-QDs525, F(ab' )2-QDs585 和 F(ab‘ )2_QDs655 的混合 物為二抗。圖5中B為采用光譜定量分析時所分離的F(ab' )2-QDs525, F(ab' )2_QDs585 和F (ab ‘ ) 2-QDs655光譜信號。圖5中C為根據(jù)B所分離的信號重新賦色后的合成圖片。圖5中D為對分離出的F(ab' )2_QDs525信號進行定量檢測的結(jié)果示意圖。圖5中E為對分離出的F(ab' )2_QDs585信號進行定量檢測的結(jié)果示意圖。圖5中F為對分離出的F(ab' )2_QDs655信號進行定量檢測的結(jié)果示意圖。放大倍數(shù)400X(A, B, C, D)，在紫外光(波長330 385 nm)激發(fā)下，通過 Olympus DP72成像系統(tǒng)及CRi Nuance多光譜成像系統(tǒng)采集圖象。
具體實施例方式
實施例1 一種同時標記腫瘤間質(zhì)IV型膠原、巨噬細胞和生血管的方法，其步驟是 1.福爾馬林固定石蠟包埋的胃癌組織4μπι厚切片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的防脫 載玻片上。2.組織切片的準備，將組織切片放入二甲苯中脫蠟三次(不同的器皿中)，每次5 分鐘，脫蠟后將組織切片依次放入無水乙醇5分鐘、95%酒精2分鐘、95%酒精2分鐘和80% 酒精2分鐘，流水沖洗3飛分鐘。3.抗原修復，用檸檬酸三鈉29. 41g(國藥集團化學試劑有限公司)，雙蒸水IOOOml 配制檸檬酸三鈉緩沖液，檸檬酸10. 5g (國藥集團化學試劑有限公司)，雙蒸水500 ml配制 檸檬酸緩沖液，分別取檸檬酸三鈉緩沖液20. 25ml、檸檬酸緩沖液4. 75ml和225ml雙蒸水配 制成檸檬酸抗原修復液(0. Olmol,pH 6. 0，250ml)。將組織切片置于加入了 250ml抗原修復 液的抗原修復盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)中微波(美的微波爐-MK823ESJ-PA)修 復(低火修復5分鐘后轉(zhuǎn)至中火修復10分鐘)，然后室溫放置待玻片自然冷卻。4.洗滌切片，用三羥基氨基甲烷(Tris) 6. 05g和氯化鈉38. Og (均為國藥集團化 學試劑有限公司)及雙蒸水5000，配制0. 01M/L、pH7. 2-7. 4的TBS作為洗滌液，洗滌3次， 每次3min ；
5.封閉，封閉液位含有2%Wt/vol牛血清白蛋白(上海如吉生物科技發(fā)展有限公司)的 TBS，封閉條件為濕盒孵育，37°C (GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限 公司)，30min ；
6.傳統(tǒng)的加一抗，去除上述封閉液后，滴加鼠抗人巨噬細胞單克隆抗體(MA1-38069， ABR, USA)、兔抗人IV型膠原多克隆抗體(ab-6586，Abeam, England)、山羊抗人CD105 多克隆抗體(sc-13595，Santa Cruz, USA)的一抗混合物(三種抗體的稀釋比分別為 1:200，1:50和1:50，稀釋液為TBS)，濕盒孵育，37°C (GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海 精宏實驗設(shè)備有限公司)3^4h或4°C冰箱過夜(不少于12h)；
7.洗滌切片，清洗液為TBST(含0. 5%/vol/vol吐溫#20的TBS)，洗滌3次，每次3min ；
8.封閉，同步驟4;
9.免疫組織化學染色方法染色背景高、特異性差，為解決此問題，本實驗采用與一抗種 屬相對應(yīng)的免疫球蛋白G (Ig G)抗原結(jié)合片段(Fragment antibody binding, F(ab' )2 段)作為二抗及顯示劑(見后述)，減少了 IgG可結(jié)晶片段(Fragment crystallizable, Fc 段)在組織染色過程中的非特異性吸附及交叉反應(yīng)。本實驗中所用二抗為量子點QDs525標 記的山羊抗鼠免疫球蛋白G (IgG)的抗原結(jié)合片段(Fragment antigen-binding, Fab段) (F(ab' )2-QDs525)、量子點QDs585標記的山羊抗兔免疫球蛋白G (IgG)的抗原結(jié)合片段 (Fragment antigen-binding, Fab g) (F(ab' )2-QDs585)>fi^;i( QDs655 feidW^^l 山羊免疫球蛋白G (IgG)的抗原結(jié)合片段(Fragment antigen-binding, Fab段)(F(ab' )2-QDs655)，均購自hvitrogen公司。去除上述封閉液后，滴加F(ab' )2-QDs525、F(ab' )2-QDs585和F(ab' ) 2_QDs655混合物(三種二抗稀釋比均為1:100，稀釋液為含2%wt/vol 牛血清白蛋白的TBS)，濕盒孵育，37°C (GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備 有限公司)，2 3h。10.洗滌切片，TBST洗滌2次，每次2min，再用TBS洗滌一次，!3min。11.封片，用甘油90ml和TBSlOml配成90%緩沖甘油，緩沖甘油封片后即可觀察結(jié)果。傳統(tǒng)的酶-底物顯色系統(tǒng)依賴于色原的沉積，在組織上非常近似，難以同時觀察一 張切片同一部位兩種抗原的共表達定位。而在傳統(tǒng)的免疫熒光雙標染色法中，有機染料必 須在不同波長下激發(fā)，然后利用圖像處理軟件進行圖像疊加，才能獲得合成的最后的熒光 雙標染色結(jié)果。但本技術(shù)采用新型納米熒光材料量子點顯色，在熒光顯微鏡下經(jīng)紫外光 (33(T385nm)激發(fā)后即可觀察到顯示綠色熒光的巨噬細胞、顯示橙黃色熒光的IV型膠原和 顯示紅色熒光的腫瘤新生血管。實現(xiàn)了對多種抗原(IV型膠原、巨噬細胞、⑶105)進行多種 顏色(綠色F(ab' )2-QDs525,橙黃色F(ab' )2-QDs585和紅色F(ab' )2-QDs655)標記， 無需圖像疊加及處理，實現(xiàn)了實驗結(jié)果的所見即所得，簡化了多色標記結(jié)果的獲取途徑，減 少了圖像處理引起的偏倚。 用量子點進行免疫熒光多重染色，在敏感度高、特異性強的前提下，同時顯示腫瘤 微環(huán)境內(nèi)多種成分的變化特點，并具有石蠟切片免疫組化染色組織細胞結(jié)構(gòu)清晰、抗原定 位準確的特點。通過量子點免疫熒光三標法，同時顯示了腫瘤微環(huán)境內(nèi)間質(zhì)重塑，巨噬細胞 浸潤、腫瘤血管發(fā)生的過程。該方法適用于石蠟包埋的任何腫瘤組織，更重要的是，采用該 方法能夠簡便、快捷、靈敏而準確地對腫瘤微環(huán)境進行分析，無需圖片合成等后期步驟。
權(quán)利要求
1. 一種同時標記腫瘤IV型膠原、巨噬細胞和新生血管的方法，其步驟是A、福爾馬林固定石蠟包埋的腫瘤組織4μ m厚切片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的防脫 載玻片上；B、組織切片的準備，將組織切片放入二甲苯中脫蠟三次，每次4-6分鐘，脫蠟后將組 織切片依次放入無水乙醇4-6分鐘、95%體積比酒精1-3分鐘、95%體積比酒精1_3分鐘和 80%體積比酒精1-3分鐘，流水沖洗3飛分鐘；C、抗原修復，用檸檬酸三鈉29.41g，雙蒸水IOOOml配制檸檬酸三鈉緩沖液，檸檬酸 10. 5g，雙蒸水500 ml配制檸檬酸緩沖液，分別取檸檬酸三鈉緩沖液20. 25ml、檸檬酸緩沖 液4. 75ml和225ml雙蒸水配制成檸檬酸抗原修復液0. Olmol, pH 6. 0，250ml，將組織切片 置于加入了 250ml抗原修復液的抗原修復盒中微波修復，低火修復4-6分鐘后轉(zhuǎn)至中火修 復9-11分鐘，然后室溫放置待玻片自然冷卻；D、自來水沖洗后取出切片，洗滌切片，用三羥基氨基甲烷6.05g和氯化鈉38. Og及雙蒸 水5000ml，配制0. 01M/L、pH7. 2-7. 4的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水作為洗滌液，洗滌3次， 每次3分鐘；E、封閉，封閉液位含有2%Wt/vol牛血清白蛋白的TBS，封閉條件為濕盒孵育，370C， 30min ；F、加一抗，去除上述封閉液后，滴加鼠抗人巨噬細胞單克隆抗體、兔抗人IV型膠原多 克隆抗體、山羊抗人⑶105多克隆抗體的一抗混合物，37°C濕盒內(nèi)孵育3 4h或4°C冰箱過 夜；G、洗滌切片，清洗液為含0.5%/vol/vol吐溫#20的TBS，洗滌3次，每次^iin ；H、封閉，同步驟(D)；I、用二抗為量子點QDs525標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G的抗原結(jié)合片段量子點 QDs525、量子點QDs585標記的山羊抗兔免疫球蛋白G的抗原結(jié)合片段量子點QDs585、量子 點QDs655標記的兔抗山羊免疫球蛋白G的抗原結(jié)合片段F(ab' )2_QDs655，去除上述封閉 液后，滴加量子點QDs525、量子點QDs585和量子點QDs655混合物，稀釋液為含2%Wt/vol牛 血清白蛋白的TBS，濕盒孵育，37°C，2 3h ；J、洗滌切片，清洗液與步驟(G)所用清洗液相同，TBS按步驟(D)的配方制備，洗滌2次， 每次2min，再用TBS洗滌一次，3min ；K、封片，用甘油90ml和TBSlOml配成90%體積比緩沖甘油，緩沖甘油封片后4°C保存， 在熒光顯微鏡下用紫外光33(T385nm激發(fā)觀察到顯示綠色熒光的巨噬細胞、顯示橙黃色熒 光的IV型膠原和顯示紅色熒光的腫瘤新生血管。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時標記腫瘤IV型膠原、巨噬細胞和新生血管的方法，其步驟1、組織切片，固定于經(jīng)多聚賴氨酸處理的防脫載玻片上；2、將組織切片放入二甲苯中脫蠟；3、抗原修復；4、洗滌切片；5、封閉；6、加一抗；7、洗滌切片；8封閉，同步驟4；9、用二抗為量子點QDs525標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G的抗原結(jié)合片段F(ab′)2-QDs525、量子點QDs585標記的山羊抗兔免疫球蛋白G的抗原結(jié)合片段F(ab′)2-QDs585、量子點QDs655標記的兔抗山羊免疫球蛋白G的抗原結(jié)合片段F(ab′)2-QDs655，去除封閉液后，滴加混合物；10、洗滌切片；11、封片，用甘油和TBS10ml配成緩沖甘油，緩沖甘油封片后保存。本發(fā)明用于腫瘤組織微環(huán)境多種成分的高效、準確、快速、同時檢測。
文檔編號G01N33/533GK102072959SQ201010546038
公開日2011年5月25日 申請日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月16日
發(fā)明者龐代文, 彭春偉, 朱小波, 李雁 申請人:武漢大學