專利名稱：一種檢測n-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法。
背景技術(shù)：
嗜水氣單胞菌在自然界中具有廣泛的病原性，是人獸共患病的重要病源菌。自然 存在于水樣環(huán)境中，嚴重威脅著水產(chǎn)業(yè)。該菌的致病性與其產(chǎn)生多種毒力因子有關(guān)，毒力因 子主要有外腸毒素，內(nèi)毒素，溶血素，細胞毒素，蛋白酶等。Quorum Sensing(QS)系統(tǒng)是指細菌根據(jù)特定信號分子的濃度可以檢測周圍環(huán)境 中自身或其他細菌的數(shù)量變化，當(dāng)信號分子達到一定的濃度閾值時，能啟動菌體中相關(guān)基 因的表達來適應(yīng)環(huán)境中的變化的現(xiàn)象。許多革蘭氏陰性細菌產(chǎn)生?；呓z氨酸內(nèi)酯類化合 物(acyl-homoserine lactones，簡稱AHL)信號分子，AHL通過類LuxI蛋白合成，并與胞內(nèi) 的類LuxR受體蛋白結(jié)合，形成受體-自體誘導(dǎo)物復(fù)合體，當(dāng)該復(fù)合體與目的基因啟動子結(jié) 合，就能激活該基因的轉(zhuǎn)錄。這類自體誘導(dǎo)物在高細胞密度時能自由地通過細胞膜，在細胞 外累積。LuxR類蛋白含有兩個結(jié)構(gòu)域，其氨基端含有一特定區(qū)域負責(zé)結(jié)合AHLs分子并調(diào)節(jié) 蛋白的寡聚化，而梭基端含有一高度保守的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)能與DNA結(jié)合從而調(diào)控 基因的轉(zhuǎn)錄。絕大多數(shù)水產(chǎn)細菌性病原菌的毒性效應(yīng)表達均是由AHLs濃度來調(diào)控的，并表 現(xiàn)正反饋效應(yīng)。水產(chǎn)細菌性病原菌種類繁多，通過病魚體征、病原菌變化、水質(zhì)指標等來預(yù) 警細菌疾病的爆發(fā)缺乏預(yù)見性與準確性，但于這類病原菌共有的群體感應(yīng)機制，均通過特 定信號分子(G-菌N-?；呓z氨酸內(nèi)酯AHLs)的活性濃度來調(diào)控病原菌的“毒性開關(guān)”， 不同病原菌可能在毒性效應(yīng)上存在差異，但由于AHLs存在化學(xué)結(jié)構(gòu)共性與受體特異性，通 過對AHLs活性濃度實施監(jiān)測則可以準確預(yù)警細菌性疾病的爆發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠。本發(fā)明所提供的與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠，按照包括如下步 驟的方法制備用偶聯(lián)緩沖液懸浮活化磁珠，再加入N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體，在25°C反 應(yīng)3 h，得到N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的磁珠；所述偶聯(lián)緩沖液按照如下方法配制得 到將PH值為7.4,1 χ PBS緩沖液和Tween-20混合，得到偶聯(lián)緩沖液，pH值為7.4,1 χ PBS緩沖液與Tween-20的體積比為IOOml 0. 05ml ；每IOOml所述pH值為7. 4,1 χ PBS 緩沖液按照如下方法配制得到將1. 9ml濃度為0. 2mol/L的NaH2PO4水溶液和8. Iml濃度 為0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合，用水定容至100ml，得到所述pH值為7. 4、1 χ PBS緩 沖液。上述與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠制備方法中，所述N-酰化高絲 氨酸內(nèi)酯受體與所述活化磁珠的投料比為5μ g 10μ gN-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體2mg磁 珠，具體為 ο μ gN-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體2mg磁珠。上述與N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠制備方法中，所述活化納米磁珠按照包括如下步驟的方法制備得到將EDC溶液、NHS溶液和納米磁珠混合，孵育，得到活 化的納米磁珠。上述與N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠制備方法中，所述EDC、NHS和納 米磁珠的投料比為Img Img 2mgo上述與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠制備方法中，所述孵育的溫度 為37°C，時間為30min。上述與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠制備方法中，所述EDC溶液的 溶質(zhì)是EDC固體，溶劑是濃度為10mM、pH值為6. O的MES緩沖液，溶質(zhì)和溶劑的配比為 5mg Iml。上述與N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠制備方法中，所述NHS溶液的 溶質(zhì)是NHS固體，溶劑是濃度為10mM、pH值為6. O的MES緩沖液，溶質(zhì)和溶劑的配比為 5mg Iml。上述與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠制備方法中，所述N-?；呓z 氨酸內(nèi)酯受體的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；上述與N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠制備方法中，所述N-?；呓z 氨酸內(nèi)酯為C4-HSL。本發(fā)明的另一個目的是提供一種輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯 的方法。本發(fā)明所提供的輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法，包括如 下步驟1)按照如下方法配制實驗液將待測樣品、上述任一所述與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯 受體偶聯(lián)的納米磁珠和緩沖液混合，將混合物孵育，得到實驗液；所述緩沖液的PH值為pH 7.4；2)檢測所述實驗液遇到菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55后是否變藍， 若變藍，則確定所述待測樣品中候選含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯。上述輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法中，所述步驟1)中，所 述緩沖液為PBS緩沖液，所述孵育的溫度為30°C，所述孵育的時間為30min ；上述輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法中，所述步驟2)中， 所述檢測所述實驗液遇到菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55后是否變藍的方法 包括如下步驟制備葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，在所述培養(yǎng)基上沿著一條直線且等距地點上菌株 (Agrobacterium tumefaciens) KYC55培養(yǎng)液，將裝有實驗液的牛津杯放置于所述培養(yǎng)基 上，牛津杯與各點菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培養(yǎng)液也成一條直線，牛津杯 的中心點與離牛津杯最近的一點菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55培養(yǎng)液有距離， 在30°C保持4 后，觀察各點菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培養(yǎng)液是否顯示藍 色。上述輔助檢測樣品中是否含有N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯的方法中，所述步驟1)中，所 述待測樣品、與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠和緩沖液的體積之和為IOOuL ； 或所述待測樣品、與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠和緩沖液的體積比為 5μ 1 20 μ 1 75μ 1 ；
上述輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法中，所述步驟2)中， 所述點上菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55培養(yǎng)液的方法為是用牙簽蘸取菌株 (Agrobacterium tumefaciens)KYC55培養(yǎng)液，然后再點到所述培養(yǎng)基上。上述輔助檢測樣品中是否含有N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯的方法中，所述步驟1)中，每 IOOml所述PBS緩沖液按照如下方法配制得到將1. 9ml濃度為0. 2mol/L的NaH2PO4水溶 液和8. Iml濃度為0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合，用水定容至100ml，得到所述PBS緩沖 液。上述輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法中，所述步驟2)中，所 述牛津杯的中心點與離牛津杯最近的一點菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55培養(yǎng) 液的距離為8mm。上述輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法中，所述步驟2)中， 所述菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55的培養(yǎng)液按照如下方法得到將所述菌 株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55接種到培養(yǎng)基中，30 V培養(yǎng)48h，得到所述菌株 (Agrobacterium tumefaciens) KYC55的培養(yǎng)液；所述培養(yǎng)基組成為LB培養(yǎng)基+2 μ g/mL四 環(huán)素+100 μ g/mL壯觀霉素+100 μ g/mL慶大霉素；上述輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法中，所述步驟2)中，所 ii^^^tt (Agrobacterium tumefaciens) KYC554mm ；上述輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法中，所述步驟2)中，所 述實驗液的量為IOOul ；上述輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法中，所述檢測的樣品 為水。N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體在如下⑴或⑵或(3)或(4)或(5)或(6)中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護范圍(1)檢測樣品中是否含有N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯；(2)制備檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的試劑盒；(3)檢測樣品是否含有SEQ ID NO 7所示DNA片段；(4)制備檢測樣品中是否含有SEQ ID NO 7所示DNA片段的試劑盒；(5)檢測樣品中N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的量；(6)制備檢測樣品中N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的量的試劑盒；上述應(yīng)用中，所述檢測的樣品為水；上述應(yīng)用中，所述N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示； 所述N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯為C4-HSL。本發(fā)明的N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體分子用于檢測N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法靈 敏度高、特異性好，在檢測N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯號分子和檢測細菌病原菌毒性領(lǐng)域具有廣 闊的應(yīng)用前景。本文主要利用AhyR受體蛋白可與信號分子結(jié)合的特點，富集檢測水體中信號分 子，提高信號分子的檢出濃度，從而及時快速的對水體中水產(chǎn)爆發(fā)性流行病做預(yù)警。


圖IAh ATCC 7966的信號分子受體蛋白(AhyR)純化圖2在1. 5%瓊脂糖凝膠下Ah ATCC 7966的信號分子受體蛋白(AhyR)與其識別 DNA (inter)序列互作的凝膠阻滯實驗圖3在12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠下Ah ATCC 7966的信號分子受體蛋白 (AhyR)與其識別DNA(inter)序列互作的凝膠阻滯實驗圖4AhyR對不同信號分子識別作用的擴散阻滯試驗圖5磁珠-AhyR對C4-HSL識別作用的擴散阻滯試驗
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。1、菌株及載體嗜水氣單孢菌(Aeromonas hydrophilia ATCC 7966，Ah ATCC 7966)購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)，該菌ACCC保藏編號為10482。宿主大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21 (DE3)，載體pED8a均購自于 hvitrogen 公司，pGEM-T Easy載體購自Promega公司。^11] (Agrobacterium tumefaciens)KYC55 ^tJCM (Cho, K. ， C. Fuqua, and S.C.ffinans. 1997. Transcriptional regulation and locations of Agrobacterium tumefaciens genesrequired for complete catabolism of octopine. J. Bacteriol. 179 1-8.)中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所獲得。2、試劑盒、工具酶和生化試劑細菌基因組DNA提取試劑盒，瓊脂糖膠回收試 劑盒，DNAC純化試劑盒均為天根生物公司，限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購 自 hvitrogen 公司，其它都為國產(chǎn)試劑。N-butyryl-L-homoserine lactone (C4-HSL)、 N-hexanoyl-L-homoserine lactone(C6-HSL)、 N-Octanoyl-L-homoserine lactone(C8-HSL)、 N-decanoyl-L-homoserine lactone(C10-HSL)、 N-dodec anoyl-L-homoserinelactone(C12-HSL) > N-(3-0xohexanoyl)-D-homoserine lactone (3-oxo-C6_HSL)、N- (3-0xooctanoyl) -L-homoserine lactone (3-oxo-C8_HSL)、 N- (3-0xodecanoyl) -L-homoserine lactone (3-oxo-ClO-HSL)、 N-3-oxo-dodecanoyl-L-homoserine lactone(3-oxo-C12_HSL)、N- (3-Oxotetradec anoyl)-L-homoserine lactone(3-oxo-C14_HSL)、N- (3-hydroxyoctanoyl)-homose rine lactone (3-hydroxy-C8-HSL)、N- (3-Hydroxytetradecanoyl) -DL-homoserine lactone (3-hydroxy-C14-HSL)均購自 Sigma (St. Louis, Mo, USA)。3、培養(yǎng)基。大腸桿菌培養(yǎng)基為LB (1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl, ρΗ7. 0)。實施例1、ahyr受體蛋白的制備一、嗜水氣單孢菌ATCC 7966總DNA提取，及ATCC 7966受體蛋白AhyR的基因的克隆嗜水氣單孢菌ATCC 7966總DNA提取參照細菌DNA提取試劑盒說明書(天根生 化科技有限公司，中國，北京)。根據(jù)發(fā)表的ATCC 7966受體蛋白ahyr的基因的序列設(shè) 計合成了 弓丨物 AhyR-EF(5 ‘ -ccggaattca tgaccgttaa aaaactttac-3 ‘ ) (SEQ ID 3)禾口AhyR-ER(5‘ -attgcggccg cttataaaaa ttcaggaaat g_3' ) (SEQ ID :4),在弓丨物的末端分 別引入內(nèi)切酶EcoR I和Not I酶切位點(下劃線部分)，以嗜水氣單孢菌ATCC 7966總DNA 為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C變性5min后冷卻至4°C;然后94°C變性30sec， 58°C退火30sec，72°C延伸lmin，30個循環(huán)后72°C保溫lOmin。得到的PCR片段與pGEM_T Easy連接，測序驗證，結(jié)果得到插入序列如SEQ ID NO 2所示基因的重組載體，正確，記作 pGEM-T Easy/ahyR。SEQ ID NO :2所示基因編碼的ahyr受體蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。二、制備含有ATCC 7966受體蛋白ahyr的基因的重組蛋白將步驟一得到的陽性重組載體pGEM-T Easy/ahyR用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I進行酶切，與經(jīng)同樣酶切的質(zhì)粒pET28a連接，重組載體熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DH3)感 受態(tài)細胞，抗性篩選，挑取單克隆，擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測序鑒定，結(jié)果在pET28a的EcoR I 和Not I酶切位點間插入的基因序列如SEQ ID NO :2所示，表明構(gòu)建的重組表達載體結(jié)構(gòu) 正確，記作 pET28a-ahyR。取含有pET28a_ahyR的BL21 (DE3)菌株接種于50mL LB液體培養(yǎng)液中 (LB+100 μ g/mL的卡那霉素)，37°C、振蕩培養(yǎng)1 活化菌種。取細1培養(yǎng)液加入200mL LB培 養(yǎng)液(LB+ΙΟΟμ g/mL卡那霉素)(2%接種量)中，37°C振蕩培養(yǎng)約2_3h (OD6tltl達到0. 6-0. 8) 后加入終濃度lmmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG，20°C 180rpm震蕩培養(yǎng)12h。培養(yǎng)液12，OOOrpm離 心5min，分別收集培養(yǎng)基上清和沉淀，細胞沉淀用pH 7. 41xPBS緩沖液重懸，超聲破碎后 12，OOOrpm離心lOmin，收集上清為細胞裂解液。細胞裂解液經(jīng)Ni-NTA柱Oliagen，German) 進行純化，得到純化蛋白。將蛋白進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖1所示。得到電泳純的單 一條帶(第7泳道)，分子量約為30kDa與預(yù)測分子量相近。以轉(zhuǎn)入空載體pET28a的大腸桿菌作為對照，結(jié)果沒有檢測到目的分子量大小的蛋白。實施例2、受體蛋白的應(yīng)用一、與目的DNA結(jié)合功能UAh ATCC 7966受體蛋白AhyR的基因識別DNA (inter)序列獲得根據(jù)發(fā)表的ATCC 7966受體蛋白AhyR的識別序列設(shè)計合成了引物AhyR_BE(5' -C TCGTTTTCTACCTCCCATC-3‘ )(SEQ ID 幻和AhyR-BR(5‘ -CAGTTGGTCTTGTTTCATATGC-3‘) (SEQ ID 6)，以嗜水氣單孢菌ATCC 7966總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應(yīng)參數(shù)為 94°C變性5min后冷卻至4°C ；然后94°C變性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸lmin，30個 循環(huán)后72°C保溫lOmin。純化保存。得到的DNA片段的核苷酸序列為SEQ ID NO :7所示。2,AhATCC 7966的信號分子受體蛋白(AhyR)與其識別DNA(inter)序列互作的凝 膠阻滯實驗受體蛋白(AhyR)與其識別DNA(inter)按1 1(物質(zhì)量比)比例在室溫下共同 結(jié)合作用30min后，以目的DNA(inter)與1 χ PBS在室溫下共同作用為CK，用1. 5%瓊脂 糖凝膠電泳檢驗，電泳圖(圖2，1表示CK，2表示結(jié)合物)中受體蛋白(AhyR)與其識別 DNA(inter)結(jié)合的帶遷移率明顯滯后于CK帶。以同樣方法在12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上進行凝膠阻滯實驗，結(jié)果(圖 3，1表示CK，2表示結(jié)合物)結(jié)合物也出現(xiàn)明顯滯后現(xiàn)象。結(jié)果表明受體蛋白可以識別該段DNA序列，從而導(dǎo)致其在電泳過程中受到阻滯。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果均一致。二、Ah ATCC 7966的信號分子受體蛋白(AhyR)與其識別的信號分子相互作用試 驗檢測方法與實施例3中步驟二所述方法相同，不同的是實驗液的組成不同。本實 驗中實驗液按照如下方法配制將信號分子C4-HSL溶液5 μ 1 (5 μ M)，ahyr受體蛋白溶液20 μ 1 (5 μ g/ml)和 pH7. 4的1 χ PBS緩沖液25 μ 1混合，30°C共同水浴30min，再加入Ni-NTA柱質(zhì)50 μ 1 (加 入Ni-NTA柱質(zhì)的目的是以吸附固定AhyR蛋白，使其不能自由擴散)，得到實驗液。CK為信號分子C4-HSL溶液5 μ 1 (5 μ Μ)、pH 7. 4的Ix PBS緩沖液95 μ 1加入牛 津杯中，放30°C溫箱中48h，得到對照液。信號分子C4-HSL溶液的制備方法與實施例3中步驟二中所述相同。結(jié)果ck組的藍點個數(shù)比實驗組多2個點(圖4中C4組)。說明受體蛋白與C4-HSL 可以相互吸附。用相同方法測定受體蛋白與其余信號分子作用(C6-HSL，C7-HSL，C8-HSL， ClO-HSL, C12-HSL, oxo-C6-HSL, oxo-C8-HSL, oxo-C10-HSL, oxo-C12-HSL, oxo-C14-HSL, 3-hydroxy-C8-HSL, 3-hydroxy-C14-HSL)，結(jié)果如圖4，對照組和實驗組的藍點個數(shù)沒有差 別，說明ahyr受體蛋白與其余信號分子沒有吸附作用。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果均一致。實施例3、Ah ATCC 7966的信號分子受體蛋白(AhyR)納米磁珠表面修飾納米磁珠購自上海奧潤微納新材料科技有限公司(上海，中國)， AllMag PM3-008o一、修飾的納米磁珠的制備1、碳二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺法(EDC/NHS法)活化磁珠(1)取2mg PM3-008磁珠到1. 5ml離心管中，用500 μ 1 MEST緩沖液洗滌兩次，磁 分離后移除上清。MEST緩沖液按照如下方法配制將IOOml濃度為IOmM的pH 6. 0的MES 緩沖液(2-(N-嗎啉)乙磺酸)和0.05ml Tween 20混合，得到MEST緩沖液。(2) EDC溶液配制用4°C貯存的濃度為IOmM的pH 6. 0的MES緩沖液溶解EDC固 體(Iml 5mg)，得到EDC溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)；NHS溶液配制用4°C貯存的濃度為IOmM的pH 6. 0的MES緩沖液溶解NHS固體 (Iml 5mg)，得到NHS溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)；(3)將200 μ 1的EDC溶液和200 μ 1 NHS溶液加入到裝有ΡΜ3-008磁珠的離心管 中(EDC、NHS和納米磁珠的投料比為Img Img ^iig ；)，螺旋混勻磁珠充分懸浮，37°C保 溫30min，期間保持磁珠的懸浮狀態(tài)，得到活化的磁珠。2、磁珠偶聯(lián)的AhyR蛋白制備(1)用500 μ 1的偶聯(lián)緩沖液重新洗滌已經(jīng)活化的磁珠3遍后，再用500 μ 1的偶聯(lián) 緩沖液洗滌磁珠2遍。所述偶聯(lián)緩沖液按照如下方法配制得到將pH值為7. 4、1 χ PBS緩沖液和 Tween-20混合，得到偶聯(lián)緩沖液，pH值為7. 4、1 χ PBS緩沖液與Tween-20的體積比為
9IOOml 0. 05ml ；每IOOml所述pH值為7. 4、1 χ PBS緩沖液按照如下方法配制得到將 1. 9ml濃度為0. 2mol/L的NaH2PO4水溶液和8. Iml濃度為0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合， 用水定容至100ml，得到所述pH值為7. 4、1 χ PBS緩沖液。(2)加400 μ 1偶聯(lián)緩沖液重懸洗滌后的磁珠，再加入100 μ 1 100 μ g/ml的純化的 AhyR蛋白，使得磁珠表面活化的羧基同AhyR蛋白的氨基室溫)反應(yīng)池，將蛋白偶聯(lián) 于磁珠表面，得到偶聯(lián)的磁珠。AhyR蛋白與納米磁珠的投料比為IOyg AhyR蛋白2mg磁珠。(3)用500 μ 1偶聯(lián)緩沖液洗滌偶聯(lián)后磁珠2遍，加入500 μ 1含有牛血清白蛋 白(BSA)的偶聯(lián)緩沖液25°C封閉磁珠30min (期間保持磁珠的懸浮狀態(tài))(BSA將AhyR未結(jié) 合位點封閉)。(4)用500 μ 1的偶聯(lián)緩沖液洗滌封閉后的磁珠2遍，用100 μ 1保存液重懸磁珠， 保存于4°C冰箱，待用。保存液的配制將PBST緩沖液中添加0. 02% NaN3和0. 05% BSA混 合，得到保存液。二、用偶聯(lián)AhyR的納米磁珠檢測信號分子的方法原理信號分子C4-HSL遇到指示菌KYC55后變藍，而當(dāng)信號分子C4-HSL與磁珠偶 聯(lián)AhyR蛋白結(jié)合后該復(fù)合體不能擴散，因此指示菌KYC55不變藍。檢測方法1)配置葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，將其切割成條狀，再置于畫有十字網(wǎng)格的平板上；2)用牙簽蘸取指示菌KYC55培養(yǎng)液，在每個條狀培養(yǎng)基的中間的十字交叉處點上 指示菌KYC55培養(yǎng)液，每點相距4mm且各點在同一條直線上；3)在培養(yǎng)基條的最前方放置牛津杯，牛津杯與各點菌株KYC55培養(yǎng)液也成一條直 線，將100μ 1實驗液置于牛津杯中，牛津杯的中心點與離其最近的菌株KYC55培養(yǎng)液點距 離 8mm ；4)再將檢測平板和牛津杯一起置于30°C溫箱中培養(yǎng)48h，然后觀察各點菌株 KYC55培養(yǎng)液是否變成藍色；若距離牛津杯最近的一點菌株KYC55培養(yǎng)液顯示藍色，則確定 實驗液中候選含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯且達到了可檢測的數(shù)量級。5)再統(tǒng)計藍點的個數(shù)。藍點的個數(shù)越少說明信號分子擴散的越少，信號分子擴散 的越少說明實驗液中含有C4-HSL的量越少，實驗液中含有C4-HSL的量越少表明制備的偶 聯(lián)納米磁珠與C4-HSL發(fā)生了結(jié)合作用。指示菌(Agrobacterium tumefaciens)KYC55的培養(yǎng)液按照如下方法得到將所 述菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55接種到培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48h，得到所述菌 株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55的培養(yǎng)液；所述培養(yǎng)基組成為LB培養(yǎng)基+2 μ g/mL 四環(huán)素+100 μ g/mL壯觀霉素+100 μ g/mL慶大霉素。葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的組成(mg/L)=KH2PO4 535，(NH4)2SO4 10，MgSO4 3. 9， CaCl2O. 38，F(xiàn)eSO4 · 7H20 0. 25，MnSO4 · H2O 0.11，葡萄糖 5000，瓊脂 2 %，其余為水。實驗液的制備將信號分子C4-HSL溶液5 μ 1 (5 μ M)，磁珠偶聯(lián)的AhyR蛋白 20μ 1，和pH 7.4,1 χ PBS緩沖液75 μ 1混合，30°C共同水浴30min,即得到實驗液。CK的制備將信號分子C4-HSL溶液5 μ 1 (5 μ M)和pH值為7. 4、1 χ PBS緩沖液 95 μ 1 混合，30°C水浴 30min。
信號分子C4-HSL溶液的配制方法將C4-HSL和乙醇混合，得到的混合物即為信號 分子C4-HSL溶液；混合物中C4-HSL的濃度為5 μ Μ。-20°C保存。每IOOml所述pH值為7. 4、1 χ PBS緩沖液按照如下方法配制得到將1. 9ml濃度 為0. 2mol/L的NaH2PO4水溶液和8. Iml濃度為0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合，用水定容 至100ml，得到所述pH值為7.4,1 χ PBS緩沖液。結(jié)果如圖5所示。實驗組的第一點菌株KYC55培養(yǎng)液變藍，但顏色明顯比對照 組淺，且變藍點數(shù)少于CK組，說明偶聯(lián)AhyR的納米磁珠制備成功，并且可以有效地結(jié)合 C4-HSL。三、方法的靈敏度檢測實驗組將C4-HSL溶于pH 7. 4的PBS緩沖液中，終濃度為5 μ Μ，得到C4-HSL溶 液。向45 μ L pH 7. 4的PBS緩沖液中添加5 μ L C4-HSL的溶液(C4-HSL濃度記作10—1)， 并依次進行10倍的梯度稀釋至C4-HSL濃度為10_6，制備成不同濃度C4-HSL的溶液。按照 實驗二中所述方法檢測。對照組(Ni-NTA吸附方法)除實驗液的配制與實驗組不同外，其余條件均與實驗 組相同。對照組中實驗液按照如下方法配制將C4-HSL溶于pH 7. 4的PBS緩沖液中，終濃 度為5 μ Μ，得到C4-HSL溶液。向45 μ L pH 7. 4的PBS緩沖液中添加5 μ L C4-HSL的溶液 (C4-HSL濃度記作10—1)，并依次進行10倍的梯度稀釋至C4-HSL濃度為10_6，制備成不同濃 度C4-HSL的溶液。按照實驗二中所述方法檢測。牛津杯里放有Ni-NTA柱質(zhì)，目的是以吸 附固定AhyR蛋白，使其不能自由擴散。檢測結(jié)果顯示，實驗組的檢測靈敏度約為25pmol[即能夠檢測濃度為 25pmol(10-6)的C4-HSL溶液]；對照組的檢測靈敏度約為2. 5nmol [即能夠檢測濃度為 25pmol (10_3)的C4-HSL溶液]；磁珠偶聯(lián)的AhyR蛋白比Ni-NTA吸附AhyR蛋白的檢測靈敏 度提高約100倍，達到pmol級。實驗設(shè)3次重復(fù)，結(jié)果均一致。
權(quán)利要求
1.一種與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠，按照包括如下步驟的方法制備 用偶聯(lián)緩沖液懸浮活化后的納米磁珠，再加入N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體，在25°C反應(yīng)3h， 得到與N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠；所述偶聯(lián)緩沖液按照如下方法配制得 到將PH值為7.4,1 χ PBS緩沖液和Tween-20混合，得到偶聯(lián)緩沖液，pH值為7.4,1 χ PBS緩沖液與Tween-20的體積比為IOOml 0. 05ml ；每IOOml所述pH值為7. 4,1 χ PBS 緩沖液按照如下方法配制得到將1. 9ml濃度為0. 2mol/L的NaH2PO4水溶液和8. Iml濃度 為0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合，用水定容至100ml，得到所述pH值為7. 4、1 χ PBS緩 沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米磁珠，其特征在于所述N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體與所 述活化后的納米磁珠的投料比為5 μ g 10 μ g N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體2mg磁珠，具體 為10 μ gN-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體2mg磁珠。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的納米磁珠，其特征在于所述活化后的納米磁珠按照包 括如下步驟的方法制備得到將EDC溶液、NHS溶液和納米磁珠混合，孵育，得到活化后的納 米磁珠；所述EDC、NHS和納米磁珠的投料比為Img Img 2mg ；所述孵育的溫度為37°C，時間為30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的納米磁珠，其特征在于所述EDC溶液的溶質(zhì)是EDC 固體，溶劑是濃度為10mM、pH值為6. 0的MES緩沖液，溶質(zhì)和溶劑的配比為5mg Iml ；所述NHS溶液的溶質(zhì)是NHS固體，溶劑是濃度為10mM、pH值為6. 0的MES緩沖液，溶質(zhì) 和溶劑的配比為5mg Iml ；所述N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；或，所述N-?；呓z氨酸內(nèi)酯為C4-HSL。
5.一種輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法，包括如下步驟1)按照如下方法配制實驗液將待測樣品、權(quán)利要求1-4中任一所述與N-酰化高絲氨 酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠和緩沖液混合，將混合物孵育，得到實驗液；所述緩沖液的PH 值為7. 4 ；2)檢測所述實驗液遇到菌株(Agrobacteriumtumefaciens) KYC55后是否變藍，若變 藍，則確定所述待測樣品中候選含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述緩沖液為PBS緩沖 液，所述孵育的溫度為30°C，所述孵育的時間為30min ；或，所述步驟2)中，所述檢測所述實驗液遇到菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55后是否變藍的方法包括如下步驟制備葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，在所述培養(yǎng)基上沿著 一條直線且等距地點上菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55培養(yǎng)液，將裝有實驗 液的牛津杯放置于所述培養(yǎng)基上，牛津杯與各點菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培養(yǎng)液也成一條直線，牛津杯的中心點與離牛津杯最近的一點菌株(Agrobacterium tumefaciens)KYC55培養(yǎng)液有距離，在30°C保持48h后，觀察各點菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培養(yǎng)液是否顯示藍色。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述待測樣 品、與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠和緩沖液的體積之和為IOOuL ；或所述待測樣品、與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠和緩沖液的體積比為 5μ 1 20 μ 1 75μ 1 ；或，所述步驟幻中，所述點上菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培養(yǎng)液的方法 為是用牙簽蘸取菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培養(yǎng)液，然后再點到所述培養(yǎng)基上。
8.根據(jù)權(quán)利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，每IOOml所述 PBS緩沖液按照如下方法配制得到將1. 9ml濃度為0. 2mol/L的NaH2PO4水溶液和8. Iml 濃度為0. 2mol/L的Na2HPO4水溶液混合，用水定容至100ml，得到所述PBS緩沖液?；?，所述步驟2)中，所述牛津杯的中心點與離牛津杯最近的一點菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培養(yǎng)液的距離為8mm。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于所述步驟幻中，所述菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55的培養(yǎng)液按照如下方 法得到將所述菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55接種到培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48h， 得到所述菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55的培養(yǎng)液；所述培養(yǎng)基按照包括如下 步驟的方法得到向LB培養(yǎng)基中添加四環(huán)素、壯觀霉素和慶大霉素，得到所述培養(yǎng)基；四環(huán) 素在所述培養(yǎng)基中的濃度為2 μ g/mL，壯觀霉素在所述培養(yǎng)基中的濃度為100μ g/mL，慶大 霉素在所述培養(yǎng)基中的濃度為100 μ g/mL ；所述步驟幻中，所述各點菌株(Agrobacterium tumefaciens) KYC55培養(yǎng)液相距4mm ；所述步驟幻中，所述實驗液的量為IOOul ；所述待測樣品為水；或，所述N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯為C4-HSL。
10.N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯受體在如下⑴或⑵或(3)或(4)或(5)或(6)中的應(yīng)用(1)檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯；(2)制備檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的試劑盒；(3)檢測樣品是否含有SEQID NO 7所示DNA片段；(4)制備檢測樣品中是否含有SEQID NO :7所示DNA片段的試劑盒；(5)檢測樣品中N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的量；(6)制備檢測樣品中N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的量的試劑盒；所述檢測的樣品為水；所述N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；所述N-酰化高絲 氨酸內(nèi)酯為C4-HSL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯的方法。該輔助檢測樣品中是否含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法，包括如下步驟1)按照如下方法配制實驗液將待測樣品、與N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體偶聯(lián)的納米磁珠和緩沖液混合，將混合物孵育，得到實驗液；所述緩沖液的pH值為pH 7.4。2)檢測所述實驗液遇到菌株(Agrobacteriumtumefaciens)KYC55后是否變藍，若變藍，則確定所述待測樣品中候選含有N-?；呓z氨酸內(nèi)酯。該新用途是N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體在檢測樣品中N-?；呓z氨酸內(nèi)酯中的應(yīng)用。本發(fā)明的N-?；呓z氨酸內(nèi)酯受體分子用于檢測N-?；呓z氨酸內(nèi)酯的方法靈敏度高、特異性好，在檢測N-酰化高絲氨酸內(nèi)酯信號分子和檢測細菌病原菌毒性領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N21/78GK102128828SQ201010578919
公開日2011年7月20日 申請日期2010年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月3日
發(fā)明者何夙旭, 劉玉春, 周志剛, 姚斌, 崔浩, 張美超, 曹雅男, 毛瑋 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所