一種磷脂酰絲氨酸的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化合物的制備方法，具體涉及一種由天然卵磷脂經(jīng)酶催化反應(yīng)制備磷脂酰絲氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine)又稱絲氨酸磷脂，二酰甘油酰磷酸絲氨酸，是一類普遍存在的磷脂，通常位于細(xì)胞膜的內(nèi)層，磷酯化合物中的磷酸甘油酯類，是細(xì)胞膜組分之一，與一系列的膜功能有關(guān)。尤其在人體的神經(jīng)系統(tǒng)，是大腦的細(xì)胞膜的重要組成成分之一，同時對大腦的各種功能(尤其是對大腦的記憶力和情緒的穩(wěn)定)起到重要的調(diào)節(jié)作用，如它能影響著細(xì)胞膜的流動性、通透性，并且能激活多種酶類的代謝和合成。具有重要的功能與作用:延緩衰老、維持機(jī)體健康年輕、強(qiáng)化腦部功能、增強(qiáng)記憶力、運(yùn)動員等的營養(yǎng)必需品、治療多動癥兒童、促進(jìn)血液循環(huán)、分解過高的血脂和過高的膽固醇、清掃血管，使血管順暢，從而減低脂肪肝的發(fā)病率，有“血管清道夫”的美譽(yù)。
[0003]磷脂酰絲氨酸的主要來源于動植物，在動物體中，大腦及肝臟中的細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸的含量比較豐富，但是動物容易染病，例如歐洲的瘋牛病影響了磷脂酰絲氨酸的提取，而在植物中，磷脂酰絲氨酸的含量僅僅不足8 %，提取也相對困難。目前磷脂酰絲氨酸的制備方法主要是酶催化合成法，是將天然卵磷脂溶解于正己烷、乙酸乙酯、乙醚、甲苯、醋酸丁酯、氯仿等有機(jī)溶劑，再將L-絲氨酸，磷脂酶D、無機(jī)鹽溶于水，最后將有機(jī)相和水相混合進(jìn)行兩相界面反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，進(jìn)行萃取、濃縮、柱層析等純化步驟。生產(chǎn)設(shè)備要求高，工藝復(fù)雜，不易操作，成本高低收率，同時去除終產(chǎn)品中殘留的有機(jī)溶劑仍是工藝難點(diǎn)之一，且有機(jī)溶劑的加入與當(dāng)今社會綠色生產(chǎn)的原則相違背。盡管專利JP2002051794和專利DE102004002053都使用單一水相反應(yīng)，但制備過程中均需要有特殊的均質(zhì)化設(shè)備以保證反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，仍存在設(shè)備投入大，成本高，對均質(zhì)設(shè)備依賴強(qiáng)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率難以保證的問題。而專利CN101230365在以上方法的基礎(chǔ)上做出了修正，也是單一水相反應(yīng)，但轉(zhuǎn)化反應(yīng)中純品磷脂酶D加入增加了生產(chǎn)成本，并且反應(yīng)最后純化工藝中使用乙酸乙酯萃取和乙腈處理增加了產(chǎn)品中有機(jī)溶劑的殘留。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種由天然卵磷脂經(jīng)酶催化反應(yīng)制備磷脂酰絲氨酸的制備方法，此方法特點(diǎn)在于簡便、經(jīng)濟(jì)，制備的產(chǎn)品經(jīng)高效液相色譜法測定含量不低于70wt%，并且產(chǎn)品收率在60wt%以上，從而克服現(xiàn)有技術(shù)存在的反應(yīng)工序復(fù)雜、設(shè)備投入大、成本高、反應(yīng)轉(zhuǎn)化率低、有機(jī)溶劑殘留和產(chǎn)品純度難以保證的問題。本發(fā)明采用天然卵磷脂為反應(yīng)基質(zhì)，在磷脂酶D的催化下與L-絲氨酸進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化從而得到相關(guān)規(guī)格磷脂酰絲氨酸產(chǎn)品。
[0005]其技術(shù)方案如下:
[0006](1)將天然卵磷脂L-絲氨酸、氯化鈣溶液與醋酸緩沖液一并加入合成酶酶液中，在溫度為42?46°C條件下，攪拌反應(yīng)18?24h。
[0007](2)反應(yīng)結(jié)束后，過濾，再將濾渣加入其質(zhì)量為20倍的體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液中，攪拌20分鐘，再過濾，如此進(jìn)行兩次，最后將濾渣加入其質(zhì)量為20倍的純化水中，攪拌20分鐘后進(jìn)行過濾，濾渣經(jīng)干燥后得到產(chǎn)率為60wt%、含量為70wt%以上(HPLC含量測定)的磷脂酰絲氨酸產(chǎn)品。
[0008]所述天然卵磷脂為優(yōu)選大豆卵磷脂，其主要成分磷脂酰膽堿的含量為60被％以上。
[0009]所述步驟(1)中的卵磷脂的濃度為50mg/mL。
[0010]所述步驟(1)中的L-絲氨酸的濃度為0.2g/mL。
[0011]所述步驟(1)中的氯化鈣溶液與反應(yīng)酶液的體積比為12: 1，氯化鈣濃度為lmol/L0
[0012]所述步驟(1)中的醋酸緩沖溶液與反應(yīng)酶液的體積比為3: 1，醋酸緩沖溶液的濃度為 lmol/L，pH 為 5.5。
[0013]所述含量分析按高效液相色譜法測定。色譜條件為:采用Merck LiChrospher 100D1l Si色譜柱(250mm*4mm，5 μ m)，流動相由A相和B相組成，進(jìn)行梯度洗脫(0?17min:17% B ?80% B ；17 ?25min:80% B ?17% B ；25 ?32min:17% B)。其中，所述 A 相為正己烷:異丙醇:冰醋酸:三乙胺，體積比為815: 170: 15: 0.8，B相為異丙醇:水:冰醋酸:三乙胺，體積比為837: 140: 15: 0.8。所述檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器(漂移管溫度為80°C ;霧化器溫度為36°C ;氣體壓力為40psi)。
[0014]磷脂酶D酶液為一種放線菌(穗產(chǎn)色鏈霉菌Streptomyces racemochromogenes)的含磷脂酶D的酶液(磷脂酶D的活力大于0.4u/mL)。
【附圖說明】
[0015]圖1:磷脂酰膽堿對照品色譜圖；
[0016]圖2:磷脂酰絲氨酸對照品色譜圖；
[0017]圖3:大豆卵磷脂中磷脂酰膽堿的色譜圖；
[0018]圖4:本發(fā)明產(chǎn)品中磷脂酰絲氨酸色譜圖。
[0019]其中，A-磷脂酰膽堿對照品磷脂酰絲氨酸對照品；C_大豆卵磷脂中磷脂酰膽堿；D_本發(fā)明產(chǎn)品中磷脂酰絲氨酸。
實(shí)施例
[0020]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明實(shí)施例所述方法僅僅是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例中用到的所有原料和溶劑均購自Sigma B1chemical and Organic Compounds for Research and Diagnostic ClinicalReagents 公司 0
[0021]實(shí)施例1:
[0022]稱取80g醋酸鈉溶于1L水，并加入醋酸調(diào)整pH值為5.5 ;再稱取5.5g CaCl2S于250mL水，最后將1L醋酸緩沖液、250mL氯化鈣溶液、120g大豆卵磷脂(磷脂酰膽堿含量62.35wt% )、500g L-絲氨酸和3L磷脂酶D酶液中攪拌，加熱溫度為45 °C，反應(yīng)24h后，過濾，濾渣使用1.6L濃度為體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液洗2次，過濾后，將濾渣使用1.6L純水清洗1次，最后過濾、干燥，使用高效液相色譜儀檢測含量為72.01wt%，產(chǎn)率為62.56wt%。
[0023]實(shí)施例2:
[0024]稱取80g醋酸鈉溶于1L水，并加入醋酸調(diào)整pH值為5.5 ;再稱取5.5g CaCl2S于250mL水，最后將1L醋酸緩沖液、250mL氯化鈣溶液、120g大豆卵磷脂(磷脂酰膽堿含量78.22wt% )、500g L-絲氨酸和3L磷脂酶D酶液中攪拌，加熱溫度為45 °C，反應(yīng)24h后，過濾，濾渣使用1.6L濃度為體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液洗2次，過濾后，將濾渣使用1.6L純水清洗1次，最后過濾、干燥，使用高效液相色譜儀檢測含量為76.02wt%，產(chǎn)率為68.44wt%。
[0025]實(shí)施例3:
[0026]稱取80g醋酸鈉溶于1L水，并加入醋酸調(diào)整pH值為5.5 ;再稱取5.5g CaCl2S于250mL水，最后將1L醋酸緩沖液、250mL氯化鈣溶液、120g大豆卵磷脂(磷脂酰膽堿含量88