專利名稱：利用魚類血細胞監(jiān)測海水苯并a芘污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于本發(fā)明涉及基于魚類血細胞免疫粘附活性變化的海水有毒有機污染 物的檢測方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著科學技術(shù)的進步和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展，越來越多人工合成的有毒有 機污染物(包括石油烴、多氯聯(lián)苯、有機氯農(nóng)藥、多環(huán)芳烴、三丁基錫等)在近岸海水、沉積 物和海洋生物體內(nèi)普遍檢出，有機污染問題日漸突出，已成為世界各國科學界和政府關(guān)注 的新熱點。研究表明，有毒有機污染物毒性大，容易溶解在生物有機相中，在海洋生物體內(nèi) 高度富集，破壞海洋生物的遺傳物質(zhì)，影響海洋生物的繁殖能力，改變受污染水域的海洋生 物的種群組成，導致海洋生態(tài)系統(tǒng)失調(diào)，而且可通過魚類、貝類及其它海產(chǎn)品進入人體，危 及人類健康。因此，國內(nèi)外研究學者越發(fā)關(guān)注海洋中有毒有機化合物的污染監(jiān)測及其潛在 危害。對于海洋中有毒有機化合物的監(jiān)測，主要有化學監(jiān)測和生物監(jiān)測兩種方法，其中 化學監(jiān)測法主要通過液-液萃取方法，富集海水中有毒有機化合物，通過測定萃取液中有 機化合物的量來反映它們對海洋環(huán)境的污染程度，包括熒光分光光度法\紫外分光光度 法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MQ聯(lián)用技術(shù)等2。生物監(jiān)測方法主要是利用海洋底棲生物貽 貝、蛤、蠔等濾食性貝類體內(nèi)有機污染物的殘留水平來反映背景水體中各種有毒有機污染 物質(zhì)含量3。但在實際海洋有毒有機污染物監(jiān)測過程，化學監(jiān)測方法相對繁瑣，并且檢測靈 敏度越高所需儀器價格就越貴，因此在地方基層海洋環(huán)境監(jiān)測單位不容易推廣。生物監(jiān)測 方法則主要以底棲貝類作為指示物種，并不能真實反映表層海水中的有機污染情況。因此 以魚類作為有毒有機污染物的指示物種，建立一種相對靈敏而便捷的檢測分析方法，對于 豐富海水中有毒有機污染物檢測方法、完善海水水質(zhì)檢測標準具有重要意義。參考文獻1.韋蔓新，何本茂.欽州灣近20a來水環(huán)境指標變化趨勢II油類的分布特征及其 污染狀況.海洋環(huán)境科學，2003，22 O) :49-52.2.江桂斌，徐福正，何濱等.有機錫化合物測定方法研究進展.海洋環(huán)境化學， 1999,18(3) :61-68.3.劉仁沿，吳世培，王斌.長江口以北沿海主要經(jīng)濟貝類中有機氯農(nóng)藥和多氯聯(lián) 苯的分布及評價.海洋環(huán)境科學，1996，15 (3) :29-35.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在建立一種基于不同海水環(huán)境條件下牙鲆血細胞免疫粘附活性變化的 快速監(jiān)測海水中苯并a芘污染的方法。通過在正常海水和含苯并a芘海水中牙鲆的血細胞 對金黃色葡萄球菌的免疫粘附活性的變化，初步建立研究分析海水中苯并a芘的污染情況 及其毒性效應的實驗方法。在0. lmol/L PBS++緩沖液體系中，分別采集養(yǎng)殖在正常海水和含苯并a芘海水中的牙鲆血細胞，與金黃色葡萄球孵育，觀察計算魚類血細胞免疫粘附金 黃色葡萄球菌形成Ob受體花環(huán)的百分率。將每個血細胞粘附兩個及兩個以上金黃色葡萄 球菌記為一個花環(huán)，計數(shù)200個血細胞，算出花環(huán)陽性細胞百分率。血細胞Ob受體花環(huán)率 =成花環(huán)細胞數(shù)/200X100%。具體方法和步驟為1.牙鲆血清和菌懸液的制備用無菌注射器分別從實驗牙鲆的尾靜脈采血，注入5mL離心管中，平放于桌面上， 室溫放置30min。待血凝固后，放于4°C冰箱中過夜。吸出析出的血清，分裝于1. 5mL滅菌 離心管中，-80°C保存?zhèn)溆?。取處理好的金黃色葡萄球菌懸液300 μ L于2mL滅菌離心管中， 加入等體積牙鲆血清，冰上充分混勻后，于20°C孵育30min。每隔IOmin輕輕混勻一次，防 止菌體沉淀。孵育完成后，4°C條件下IOOOOrpm離心5min，菌體沉淀用300 μ L相應緩沖液 重懸，恢復至原來的菌懸液濃度，4°C保存?zhèn)溆谩?.牙鲆紅細胞的制備從實驗牙鲆的尾靜脈取血，采用阿氏抗凝劑與牙鲆外周血1 1混合。利用比重 為1. 083的淋巴細胞分離液(TBD公司)分離制備牙鲆紅細胞。將最底層的紅細胞沉淀用 0. IM PBS于4°C下離心洗滌兩次，用血球計數(shù)板計數(shù)后調(diào)整濃度至IX 107mL。然后取適量 紅細胞用緩沖液于4°C離心洗滌兩次，恢復至1 X 107mL。3.紅細胞免疫粘附活性的檢測分別取50 μ L用緩沖液處理的菌懸液與紅細胞懸液等體積混合，細胞數(shù)的比例約 為20 1 (上述操作在冰上進行)，于20°C恒溫孵育30min。孵育過程中每隔IOmin輕輕搖 動混勻，防止紅細胞和菌體細胞沉淀。孵育完成后，于冰上終止反應。每管加入20 μ L預冷 的0.25%的戊二醛溶液，4°C冰箱中固定15min。取適量孵育液制作涂片，晾干后甲醇固定 anin。每張涂片經(jīng)Wright’ s染液染色;3min，用蒸餾水沖洗至水流無色為止。晾干后油鏡 下觀察計算紅細胞Ob受體花環(huán)率。實驗中將每個紅細胞粘附兩個及兩個以上金黃色葡萄 球菌記為一個花環(huán)。每個樣品涂3張平行片觀察計數(shù)。紅細胞Ob受體花環(huán)率=成花環(huán)細 胞數(shù) /200X100%。實驗結(jié)果的統(tǒng)計學處理采用SPSS 13. O統(tǒng)計軟件進行t檢驗分析。本檢測方法，主要是做定性檢測海洋環(huán)境中的有機污染狀況，但在需要精確定量 檢測時，不建議采用此法。本發(fā)明檢測過程操作簡單，所需試劑配制方便，而且不需要使用復雜的儀器設備。


圖1 為正常自然海水中和受到有機污染海水中牙鲆紅細胞免疫粘附金黃色葡萄 球菌的粘附狀態(tài)。圖2 苯并a芘加標海水中牙鲆紅細胞免疫粘附金黃色葡萄球菌的粘附狀態(tài)
具體實施例方式實施例11.將金黃色葡萄球菌用0. lmol/L PBS緩沖液離心洗滌3次，并調(diào)整成濃度為2 X 108CFU/mL的菌懸液，4°C保存?zhèn)溆谩?.取50μ L金黃色葡萄球菌懸液分別與在正常海水和含苯并a芘海水中養(yǎng)殖的牙 鲆的紅細胞懸液等體積混合，細胞數(shù)比例約為20 1，輕輕混勻后，于20°C恒溫孵育30min。3.孵育過程中每隔IOmin輕輕搖動混勻，防止紅細胞和菌體細胞沉淀。4.孵育完成后，于冰上終止反應。每管加入20yL預冷的0.25%的戊二醛溶液， 4°C固定15min。取適量孵育液制作涂片，晾干后甲醇固定aiiin。5.每張涂片加入適量的feight’ s染液染色;3min，用蒸餾水沖洗至水流無色。晾 干后油鏡下觀察紅細胞對抗原的免疫粘附，計算紅細胞Ob受體花環(huán)率。6.每個樣品涂3張片觀察計數(shù)取平均值。將每個紅細胞粘附兩個及兩個以上金黃 色葡萄球菌記為一個花環(huán)。7. 0. lmol/L PBS++實驗組中200個紅細胞中形成的花環(huán)數(shù)記為X1,0. Imol/ LPBS-EDTA陰性對照組中200個紅細胞中形成的花環(huán)數(shù)記為&。8.紅細胞C3b受體花環(huán)率=(X1-X2)/200 X 100%。實驗結(jié)果采用SPSS 13. 0軟件 進行統(tǒng)計學分析。實施例2選用3L的玻璃燒杯作為實驗容器，加入總體積為2L的加標海水，每個燒杯放實驗 魚5尾，每個加標濃度2個平行。苯并a芘濃度梯度0. 49 μ g/L、0. 98 μ g/L、1. 96 μ g/L、 3. 92 μ g/L、7. 84 μ g/L。實驗周期14d，溫度(20 士 2) °C，24h換加標液，測定血細胞免疫粘附 率的變化情況。1.用2. 5mL無菌注射器從實驗魚尾靜脈采血，采用阿氏抗凝劑與牙鲆外周血
1 1混合，放于4°C冰箱保存?zhèn)溆?.將金黃色葡萄球菌用0. lmol/L PBS緩沖液離心洗滌3次，并調(diào)整成濃度為
2X 108CFU/mL的菌懸液，4°C保存?zhèn)溆?.取50 μ L金黃色葡萄球菌懸液分別與在正常海水和加標海水中養(yǎng)殖的牙鲆的 紅細胞懸液等體積混合，細胞數(shù)比例約為20 1，輕輕混勻后，于20°C恒溫孵育30min。4.孵育完成后，于冰上終止反應。每管加入20yL預冷的0.25%的戊二醛溶液， 4°C固定15min。取適量孵育液制作涂片，晾干后甲醇固定aiiin。5.每張涂片加入適量的feight’ s染液染色;3min，用蒸餾水沖洗至水流無色。晾 干后油鏡下觀察紅細胞對抗原的免疫粘附，計算紅細胞Ob受體花環(huán)率。6.每個樣品涂3張片觀察計數(shù)取平均值。將每個紅細胞粘附兩個及兩個以上金黃 色葡萄球菌記為一個花環(huán)。7. 0. lmol/L PBS++實驗組中200個紅細胞中形成的花環(huán)數(shù)記為X1,0. Imol/ LPBS-EDTA陰性對照組中200個紅細胞中形成的花環(huán)數(shù)記為&。紅細胞C3b受體花環(huán)率=(X1-X2)/200 X 100%。實驗結(jié)果采用SPSS 13. 0軟件進 行統(tǒng)計學分析。
權(quán)利要求
1.利用魚類血細胞監(jiān)測海水苯并a芘污染的方法，其特征在于具體的檢測分析方法(1)將金黃色葡萄球菌用0.lmol/L PBS緩沖液離心洗滌3次，并調(diào)整成濃度為 2 X 108CFU/mL的菌懸液，4°C保存?zhèn)溆茫?2)取50μ L金黃色葡萄球菌懸液分別與在正常海水和含有苯并a芘海水養(yǎng)殖的牙鲆 的紅細胞懸液等體積混合，細胞數(shù)比例約為20 1，輕輕混勻后，于20°C恒溫孵育30min ；(3)孵育過程中每隔IOmin輕輕搖動混勻，防止紅細胞和菌體細胞沉淀；(4)孵育完成后，于冰上終止反應。每管加入20yL預冷的0.25%的戊二醛溶液，4°C 固定15min。取適量孵育液制作涂片，晾干后甲醇固定aiiin ；(5)每張涂片加入適量的Wright’s染液染色;3min，用蒸餾水沖洗至水流無色。晾干后 油鏡下觀察紅細胞對抗原的免疫粘附，計算紅細胞Ob受體花環(huán)率；(6)每個樣品涂3張片觀察計數(shù)取平均值。將每個紅細胞粘附兩個及兩個以上金黃色 葡萄球菌記為一個花環(huán)；(7)0.lmol/L PBS++實驗組中200個紅細胞中形成的花環(huán)數(shù)記為X1,0. lmol/LPBS-EDTA 陰性對照組中200個紅細胞中形成的花環(huán)數(shù)記為& ；(8)紅細胞C!3b受體花環(huán)率=(X1-X2)/200X 100%。實驗結(jié)果采用SPSS 13. 0軟件進 行統(tǒng)計學分析；所述金黃色葡萄球菌懸液的制備方法是將金黃色葡萄球菌單菌落于LB液體培養(yǎng)基 中，37°C過夜振蕩培養(yǎng)。用0. IM PBS緩沖液離心洗滌兩次，用終濃度的福爾馬林溶液 65°C水浴40min將其滅活。取金黃色葡萄球菌懸液300 μ L于2mL滅菌離心管中，加入等體 積牙鲆血清，冰上充分混勻后，于20°C孵育30min。孵育完成后，4°C條件下IOOOOrpm離心 5min，菌體沉淀用300 μ L相應緩沖液重懸，恢復至原來的菌懸液濃度，4°C保存?zhèn)溆?；所述反應中所用緩沖液及其它液體為PBS 緩沖液NaCl 8g，KCl 0. 2g, KH2PO4 0. 24g，Na2HP04_12H20 2. 9g，蒸餾水定容至 1000ml, pH7. 4 ；牙鲆血清稀釋10倍。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用魚類血細胞監(jiān)測海水苯并a芘污染的方法，其特征在于步 驟(2)中，將暴露于苯并a芘污染海水中的魚類血細胞與金黃色葡萄球菌懸液混勻孵育，于 20°C恒溫孵育30min，輕微搖動。
全文摘要
利用魚類血細胞監(jiān)測海水中苯并a芘的方法。取50μL經(jīng)緩沖液在冰上處理好的金黃色葡萄球菌懸液與暴露于含有苯并a芘海水中的牙鲆紅細胞懸液等體積混合，細胞數(shù)的比為20∶1，20℃恒溫孵育30min。其間每隔10min搖動混勻，防止沉淀。孵育完成后終止反應。每管加入20μL預冷的0.25％的戊二醛溶液，4℃冰箱中固定15min。取孵育液涂片，晾干后甲醇固定。每張涂片經(jīng)Wright’s染液染色3min，用蒸餾水沖洗至無色為止。晾干后油鏡下觀察計算紅細胞C3b受體花環(huán)率。將每個紅細胞粘附兩個及兩個以上金黃色葡萄球菌為一個花環(huán)。檢測方法在1h內(nèi)完成，可以較好的監(jiān)測分析海水是否受到苯并a芘的污染。
文檔編號G01N15/10GK102087277SQ20101058780
公開日2011年6月8日 申請日期2010年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月14日
發(fā)明者張振冬, 王睿睿, 王立俊, 米盛景, 閆啟侖 申請人:張振冬