一種含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒。所述含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒由產(chǎn)堿菌Alcaligenes?sp.的菌液經(jīng)過提取與純化得到的。向加入苯并[a]芘及基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液的玻璃瓶內(nèi)接種產(chǎn)堿菌Alcaligenes?sp.，培養(yǎng)20天后得到菌液，對菌液經(jīng)過提取與純化得了到含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒。本發(fā)明得到的含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒可以構(gòu)建對苯并[a]芘具有降解功能的菌株，提高以苯并[a]芘為代表的多環(huán)芳烴污染物的生物降解效果，對于多環(huán)芳烴苯并[a]芘污染土壤及水體有應(yīng)用潛力。
【專利說明】一種含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物學(xué)與分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒。
【背景技術(shù)】
[0002]多環(huán)芳經(jīng)(PolycyclicAromatic Hydrocarbons,PAHs)是一類含有兩個或兩個以上苯環(huán)的有毒有機污染物，具有強烈的致癌作用、致畸作用和致突變作用。PAHs能通過生物累積及食物鏈的傳遞作用對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害，已引起各國環(huán)境科學(xué)家的高度重視。對環(huán)境中多環(huán)芳烴的治理技術(shù)主要有物理法、化學(xué)法和生物法，其中生物法具有操作簡單、運行費用低、無二次污染等優(yōu)點。一般來說，隨著多環(huán)芳烴苯環(huán)數(shù)量的增加，其降解速率降低。低分子量的多環(huán)芳烴在環(huán)境中能較快被降解，在環(huán)境中存在的時間較短，而高分子量的多環(huán)芳烴，例如芘、熒蒽、苯并[a]花、苯并[a]蒽、茚并[l，2，3_cd]花、苯并[b]熒蒽及苯并[k]熒蒽等則難于降解，較長期存在于環(huán)境中。因此，構(gòu)建多環(huán)芳烴高效降解菌來強化降解已成為去除多環(huán)芳烴污染的一種重要方法。
[0003]多環(huán)芳烴降解質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)能夠自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀的小分子DNA，能降解芳香族化合物的代謝酶通常是由降解質(zhì)?；蚓幋a的。因此，多環(huán)芳烴降解質(zhì)粒上攜帶了部分的降解基因信息，可通過轉(zhuǎn)化作用連接到宿主細(xì)菌中構(gòu)成重組菌，從而使重組菌表現(xiàn)相應(yīng)的降解多環(huán)芳烴的性能。從多環(huán)芳烴降解菌株中提取與純化得到多環(huán)芳烴降解質(zhì)粒對于構(gòu)建新的多環(huán)芳烴高效降解菌以及提高多環(huán)芳烴的降解性能都具有重要的意義。但是，國內(nèi)外缺少關(guān)于多環(huán)芳烴降解質(zhì)粒方面的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種 含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒。所述含有能夠降解苯并[a]花基因的降解質(zhì)粒由產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp.的菌液經(jīng)過提取與純化得到的。提取與純化含有能夠降解苯并[a]花基因的降解質(zhì)粒所用的產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp.在2010年3月I日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該中心位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC N0.3638。從產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp.中提取與純化含有能夠降解苯并[a]花基因的降解質(zhì)粒的具體方案為:
[0005](I)向體積為500mL的錐形瓶內(nèi)加入400mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1.0mL微量金屬液、0.1mL維生素c溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為=NH4NO3:1.7g.L—1，KH2PO4:1.0g.?ΛΚ.2HP04:1.0g.L—1，MgCl2:0.30g.?Λ CaCl2.2H20:0.15g.L-1 ;微量金屬液的組成為:CoCl2.6H20:55mg.?Λ CuCl2:0.35mg.?Λ H3BO3:11.0mg.?Λ MnCl2.4Η20:45mg.L \ Na2MoO4.2Η20:5.5mg.L1, NiCl2.2Η20:4.5mg.L1, ZnCl2:4.5mg.L 1 ；
[0006](2)在超凈工作臺中向體積為IOOmL的錐形瓶中加入6.0mL濃度為lg/L的苯并[a]芘丙酮溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天；
[0007](3)向步驟(2)中的錐形瓶內(nèi)加入60mL按步驟(I)配制的液體培養(yǎng)基；[0008](4)在超凈工作臺中挑取產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp.,將其接種至步驟(3)中的錐形瓶中，在溫度為25-30°C、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)20-22天；
[0009](5)將步驟(4)中的菌液轉(zhuǎn)移到容積為15mL的離心管中，在10000r/min條件下離心10min,棄去上清液；
[0010](6)向步驟(5)中的離心管中加入IOmL pH值為9.0濃度為0.08M的NaH2PO4緩沖液，旋潤振蕩5min后再進行超聲波振蕩15min,在10000r/min條件下離心IOmin,棄去上清液分離出菌體；
[0011](7)向由步驟(6)的離心管中加入7mL溶液A，然后混勻；溶液A的組成為:50mL0.45M三羥基甲基氨基甲烷_HCl，20mL0.25M EDTA, 20mL0.9M KCl，IOmL百分比濃度為
2.0%的氯化十六烷基三甲胺，pH8.2 ;然后加入2.2mg N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，在O-4°C條件下振蕩IOmin后加入1.5mL濃度為50g/L的乙氧基化烷基硫酸鈉溶液，旋渦振蕩5min后在55?條件下水浴振蕩Ih,在10000r/min條件下離心IOmin,收集上清液；
[0012](8)向由步驟(7)得到的上清液中加入ImL濃度為5.5M的醋酸鉀和0.5mL異丙醇，在O-4°C條件下振蕩15min,在10000r/min條件下離心IOmin,收集上清液；
[0013](9)將由步驟(8)得到的上清液加入到離心純化柱上，將離心純化柱放入離心管中，在10000r/min條件下離心lOmin，倒去離心管中的液體；重復(fù)這一過程，直至所有由步驟(8)得到的上清液都經(jīng)過離心純化柱純化；
[0014](10)向經(jīng)步驟(9)處理后的離心純化柱中加入0.5mL溶液B，溶液B的組成為:5mL4.5M鹽酸胍，10mL3.5M醋酸鉀與85mL無水乙醇，pH7.0 ;在O-4°C條件下振蕩15min，在10000r/min條件下離心5min,倒去離心管中的液體；
[0015](11)向經(jīng)步驟(10)處理后的離心純化柱中加入0.6mL溶液C，溶液C的組成為:40mL10mM三羥基甲基氨基甲烷-HCl，30mL3.0M NaCl,30mLl.5mM EDTA,pH8.5 ;在55°0條件下振蕩20min,在10000r/min條件下離心5min ;將離心管中的液體重新加入到該離心純化柱中，在55°C水浴中放置lOmin，在10000r/min條件下離心5min ;離心管中液體即為含有
能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒溶液，在_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0016]本發(fā)明得到的含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)?？梢詷?gòu)建對苯并[a]芘具有降解功能的菌株，提高以苯并[a]芘為代表的多環(huán)芳烴污染物的生物降解效果，對于多環(huán)芳烴苯并[a]芘污染土壤及水體有應(yīng)用潛力。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合實例進一步說明本發(fā)明。
[0018]材料:
[0019](1)產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp.,該菌株在2010年3月I日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該中心位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號為CGMCC N0.3638。
[0020](2)大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞(天津博美科生物技術(shù)有限公司)。
[0021](3)苯并[a]花(純度> 99%, Sigma Aldrich)。
[0022](4)丙酮、N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶、異丙醇。
[0023](5) pH值為9.0濃度為0.08M的NaH2PO4緩沖液。[0024](6)濃度為50g/L的乙氧基化烷基硫酸鈉溶液。
[0025](7)濃度為5.5M的醋酸鉀溶液。
[0026](8)溶液AlOOmL，其組成為:50mL0.45M三羥基甲基氨基甲烷-HCl，20mL0.25MEDTA, 20mL0.9M KCl，IOmL百分比濃度為2.0 %的氯化十六烷基三甲胺，pH8.2。[0027](9溶液BlOOmL，其組成為:5mL4.5M鹽酸胍，10mL3.5M醋酸鉀與85mL無水乙醇，ρΗ7.0。
[0028](10)溶液ClOOmL，其組成為:40mL10mM三羥基甲基氨基甲烷-HCl，30mL3.0MNaCl，30mLl.5mM EDTA,pH8.5。
[0029](I I)基礎(chǔ)培養(yǎng)基1L，其組成及各組分的濃度為=NH4NO3:1.7g.L-1，KH2PO4:1.0g.ΙΛ K.2HP04:1.0g.ΙΛ MgCl2:0.30g.ΙΛ CaCl2.2Η20:0.15g.L'
[0030](12)微量金屬液1L，其組成及各組分的濃度為=CoCl2.6H20:55mg.L-1，CuCl2:0.35mg.L \ H3BO3:11.0mg.L \ MnCl2.4H20:45mg.L \ Na2MoO4.2H20:5.5mg.L \NiCl2.2H20:4.5mg.L S ZnCl2:4.5mg.L10
[0031]實施例[0032]向已加入苯并[a]芘及基礎(chǔ)培養(yǎng)基、微量金屬液和維生素c溶液的玻璃瓶內(nèi)接種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp.,然后將培養(yǎng)瓶在培養(yǎng)溫度為25-28°C、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)20d，得到擴增培養(yǎng)后的菌液。將菌液在10000r/min條件下離心IOmin,向分離的菌體中加入IOmL pH值為9.0濃度為0.08M的NaH2PO4緩沖液，旋渦振蕩5min后再進行超聲波振蕩15min，在10000r/min條件下離心IOmin,棄去上清液后加入7mL溶液A并混合均勻。然后加入2.2mg N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，在O-4°C條件下振蕩IOmin后加入1.5mL濃度為50g/L的乙氧基化烷基硫酸鈉溶液，旋潤振蕩5min后在55°C條件下水浴振蕩Ih,在10000r/min條件下離心IOmin,收集上清液。然后向收集到的上清液中加入ImL濃度為5.5M的醋酸鉀和0.5mL異丙醇，在O-4°C條件下振蕩15min,在10000r/min條件下離心IOmin,收集上清液。將收集到的上清液加入到離心純化柱中，然后在10000r/min條件下離心lOmin，倒去離心管中的液體。重復(fù)這一過程,直至所有的上清液都經(jīng)過離心純化柱純化。向離心純化柱中加入
0.5mL溶液B，在10000r/min條件下離心5min，倒去離心管中的液體。然后向離心純化柱中加入0.6mL溶液C,在55°C條件下振蕩20min,在10000r/min條件下離心5min。將離心管中的液體重新加入到該離心純化柱中，在55°C水浴中放置lOmin，在10000r/min條件下離心5min。離心管中液體即為含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒溶液，在_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0033]運用電轉(zhuǎn)化的方法將含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21中，得到的重組菌能夠在以苯并[a]芘為唯一碳源的無機鹽培養(yǎng)基中生長，且對苯并[a]芘具有降解功能，運用得到的重組菌對初始濃度為0.09mg/L的苯并[a]芘溶液進行降解試驗，結(jié)果表明7天后苯并[a]芘的去除率達(dá)到84.1 %。
[0034]通過導(dǎo)入質(zhì)粒的方法創(chuàng)造新菌株，獲得高效的降解能力。
[0035]目的基因產(chǎn)物的保護通過方法進行保護。具體的氨基酸序列保護。
[0036]目的基因表達(dá)的載體
[0037]用電轉(zhuǎn)化法將菌株ZL5的質(zhì)粒導(dǎo)入[0038]大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞
[0039]接合子Pseudom onas.stu tzeri能利用鄰氯硝基苯為唯一碳源、氮源與能源,表明該質(zhì)粒為降解質(zhì)粒。
【權(quán)利要求】
1.一種含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒，其特征在于，該降解質(zhì)粒由產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp.的菌液經(jīng)過提取與純化得到的,產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp.的菌種保藏號為CGMCCN0.3638，其中，從產(chǎn)堿菌Alcaligenes sp.中提取與純化含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒的具體方案為: (1)向體積為500mL的錐形瓶內(nèi)加入400mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基、1.0mL微量金屬液、0.1mL維生素c溶液，搖勻后作為液體培養(yǎng)基備用；其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成為=NH4NO3:1.7g.L—1，KH2PO4:1.0g.?ΛΚ.2HP04:1.0g.L—1，MgCl2:0.30g.?Λ CaCl2.2H20:0.15g.L-1 ;微量金屬液的組成為:CoCl2.6H20:55mg.?Λ CuCl2:0.35mg.?Λ H3BO3:11.0mg.?Λ MnCl2.4Η20:45mg.L \ Na2MoO4.2Η20:5.5mg.L1, NiCl2.2Η20:4.5mg.L1, ZnCl2:4.5mg.L 1 ； (2)在超凈工作臺中向體積為IOOmL的錐形瓶中加入6.0mL濃度為lg/L的苯并[a]花丙酮溶液，為除去丙酮將錐形瓶開口放置2天； (3)向步驟(2)中的錐形瓶內(nèi)加入60mL按步驟(I)配制的液體培養(yǎng)基； (4)在超凈工作臺中挑取產(chǎn) 堿菌Alcaligenessp.,將其接種至步驟(3)中的錐形瓶中，在溫度為25-30°C、轉(zhuǎn)速為100r/min的振蕩器中培養(yǎng)20-22天； (5)將步驟(4)中的菌液轉(zhuǎn)移到容積為15mL的離心管中，在10000r/min條件下離心IOmin,棄去上清液； (6)向步驟(5)中的離心管中加入IOmLpH值為9.0濃度為0.08M的NaH2PO4緩沖液，旋潤振蕩5min后再進行超聲波振蕩15min,在10000r/min條件下離心IOmin,棄去上清液分離出菌體； (7)向由步驟(6)的離心管中加入7mL溶液A，然后混勻；溶液A的組成為:50mL0.45M三羥基甲基氨基甲烷-HCl，20mL0.25M EDTA, 20mL0.9M KCl，IOmL百分比濃度為2.0%的氯化十六烷基三甲胺，PH8.2 ;然后加入2.2mgN-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，在O-4°C條件下振蕩IOmin后加入1.5mL濃度為50g/L的乙氧基化烷基硫酸鈉溶液，旋渦振蕩5min后在55°C條件下水浴振蕩Ih,在10000r/min條件下離心IOmin,收集上清液； (8)向由步驟(7)得到的上清液中加入ImL濃度為5.5M的醋酸鉀和0.5mL異丙醇，在O-4°C條件下振蕩15min,在10000r/min條件下離心IOmin,收集上清液； (9)將由步驟(8)得到的上清液加入到離心純化柱上，將離心純化柱放入離心管中，在10000r/min條件下離心lOmin，倒去離心管中的液體；重復(fù)這一過程，直至所有由步驟(8)得到的上清液都經(jīng)過離心純化柱純化； (10)向經(jīng)步驟(9)處理后的離心純化柱中加入0.5mL溶液B，溶液B的組成為:5mL4.5M鹽酸胍，10mL3.5M醋酸鉀與85mL無水乙醇，pH7.0 ;在O-4°C條件下振蕩15min，在IOOOOr/min條件下離心5min,倒去離心管中的液體； (11)向經(jīng)步驟(10)處理后的離心純化柱中加入0.6mL溶液C，溶液C的組成為:40mL10mM 三羥基甲基氨基甲烷-HCl，30mL3.0M NaCl,30mLl.5mM EDTA,pH8.5 ;在55°0條件下振蕩20min,在10000r/min條件下離心5min ;將離心管中的液體重新加入到該離心純化柱中，在55°C水浴中放置lOmin，在10000r/min條件下離心5min ;離心管中液體即為含有能夠降解苯并[a]芘基因的降解質(zhì)粒溶液，在_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號】C12N15/10GK103451178SQ201310159883
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月26日
【發(fā)明者】豆俊峰, 秦偉, 王營營, 丁愛中, 杜勇超 申請人:北京師范大學(xué)