專利名稱：可同時(shí)檢測80種自身抗體的蛋白質(zhì)芯片和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測自身抗體的芯片和檢測方法，具體涉及一種可同時(shí)檢測80 種自身抗體的蛋白質(zhì)芯片和方法。
背景技術(shù)：
自身抗體為人體內(nèi)出現(xiàn)的針對自體蛋白質(zhì)(或稱自身抗原)的抗體。自身抗體的出現(xiàn)通常預(yù)示著機(jī)體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)異常狀況，不能正確識別和處理凋亡壞死的自身抗原物質(zhì)，從而產(chǎn)生針對自身抗原的抗體。自身抗體的出現(xiàn)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，特別是自身免疫性疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、強(qiáng)直性脊柱炎等，自身抗體在疾病發(fā)展的早期即可以出現(xiàn)在血液中，隨著病情的發(fā)展，自身抗體的種類和滴度不斷增加。因此，測定體內(nèi)自身抗體的種類和水平對疾病的早期診斷、病情監(jiān)測以及預(yù)后判定都有重要意義。傳統(tǒng)檢測自身抗體方法為基于微孔板的酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)，或基于微球載體的免疫熒光檢測技術(shù)，這些技術(shù)的缺點(diǎn)是檢測的自身抗體數(shù)量有限(一般不超過 10種)，且需要較大量的樣本(一般需要100 μ L血清)。近年雖有應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測自身抗體的方法和產(chǎn)品問世，但一般僅能檢測8種自身抗體。能同時(shí)檢測十種以上自身抗體的蛋白質(zhì)芯片和技術(shù)目前尚未成熟。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可同時(shí)檢測80種自身抗體的蛋白質(zhì)芯片和方法，它可同時(shí)檢測80種自身抗體，用生物素標(biāo)記抗原為內(nèi)參，利用橡膠分隔片和玻片固定夾，可在一張芯片上同時(shí)檢測16個生物樣本，操作簡便、節(jié)省樣本和時(shí)間，可自動進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正， 并生成各自身抗體信號強(qiáng)度的圖表。為了解決背景技術(shù)所存在的問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案它的檢測裝置是由玻片、橡膠分隔片和金屬固定夾組成，橡膠分隔片設(shè)置在玻片上方，兩側(cè)分別插入金屬固定夾的凹槽中，將芯片和橡膠分隔片固定在一起。它的檢測方法為1、玻片表面硝酸纖維素膜的活化；2、抗原蛋白與生物素交聯(lián) 增加抗原的結(jié)合強(qiáng)度和靈活度；3、制備抗原芯片；4、利用抗原芯片檢測微量血液標(biāo)本中多種自身抗體；5、數(shù)據(jù)分析。所述的玻片上有16個硝酸纖維素膜包被的區(qū)域，玻片用親合素溶液浸泡處理，用蛋白點(diǎn)樣儀將80種自身抗原和6種對照蛋白打印在親合素處理后的玻片上制作成自身抗原芯片，每張芯片上含有16個蛋白微陣列區(qū)。所述的橡膠分隔片厚度約1mm，大小和玻片一致，分隔片上有16個孔，孔的位置和孔徑與抗原點(diǎn)樣區(qū)相當(dāng)，將橡膠分隔片覆蓋在芯片表面，抗原點(diǎn)樣區(qū)位于各個孔的正中位置。本發(fā)明精選80種目前已經(jīng)臨床證實(shí)的與自身免疫性疾病相關(guān)的自身抗體，首先選擇與這些自身抗體相對應(yīng)的抗原(蛋白質(zhì))，通過蛋白質(zhì)交聯(lián)技術(shù)，將抗原蛋白和生物素(Biotin)聯(lián)接，然后利用微陣列技術(shù)，用微陣列點(diǎn)樣儀將生物素化的抗原固定于包被了親和素(Sti^ptavidin)的玻片載體上。每張玻片05mmX73mm)被劃分為16個區(qū)塊，每個區(qū)塊均含有70種自身抗原和8種對照蛋白，每種蛋白均重復(fù)兩次。因此，每張芯片均含有16 個包含了 80種自身抗原和8種對照蛋白的蛋白質(zhì)微陣列，可同時(shí)檢測16個樣本。檢測裝置為一個有16個孔的橡膠分隔墊片和兩個固定夾，橡膠分隔墊片與玻片大小一致，其孔的位置和大小與玻片上16個蛋白點(diǎn)樣區(qū)的位置符合。檢測時(shí)，首先將橡膠分隔片放置于玻片表面，用固定夾將玻片和橡膠分隔片固定在一起，將1 μ L樣本與50 μ L樣本稀釋劑混合后，加入橡膠分隔片的孔中進(jìn)行反應(yīng)，60min后棄反應(yīng)液，加入100 μ L洗滌液，振蕩洗滌3次，每次 5min。然后加入熒光素Cy3標(biāo)記的親合素和熒光素Cy5標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(1 1000 稀釋)，室溫反應(yīng)60min，吸去反應(yīng)液，加入洗滌液洗3次，除去固定夾和分隔墊片，將玻片浸入PBS緩沖液中漂洗30s，低速離心(500rpm);3min使玻片干燥。用激光掃描儀掃描玻片，掃描波長為5;35nm(Cy3)和632nm(Cy5)。圖像用Gen印ix6. 0軟件分析，得出各點(diǎn)Cy3和Cy5 的熒光強(qiáng)度，并以Cy3為內(nèi)參算出各點(diǎn)的校正信號強(qiáng)度，然后用自身抗體分析軟件，計(jì)算出各個自身抗體的平均強(qiáng)度。本發(fā)明可同時(shí)檢測80種自身抗體，用生物素標(biāo)記抗原為內(nèi)參，利用橡膠分隔片和玻片固定夾，可在一張芯片上同時(shí)檢測16個生物樣本，操作簡便、節(jié)省樣本和時(shí)間，可自動進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，并生成各自身抗體信號強(qiáng)度的圖表。


圖1為本發(fā)明中玻片的結(jié)構(gòu)示意圖，圖2為本發(fā)明中處理后玻片的結(jié)構(gòu)示意圖，圖3為本發(fā)明中橡膠分隔片的結(jié)構(gòu)示意圖，圖4為本發(fā)明中金屬固定夾的結(jié)構(gòu)示意圖，圖5為本發(fā)明檢測裝置的裝配結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式參照圖1-5，本具體實(shí)施方式
采用以下技術(shù)方案它的檢測裝置是由玻片1、橡膠分隔片2和金屬固定夾3組成，橡膠分隔片2設(shè)置在玻片1上方，兩側(cè)分別插入金屬固定夾 3的凹槽中，將玻片1和橡膠分隔片2固定在一起。它的檢測方法為1、玻片表面硝酸纖維素膜的活化將玻片浸泡在一定濃度的親合素(Sti^ptavidin)溶液中，室溫放置30min，取出后用PBS溶液洗一次，離心干燥，放4°C 冰箱備用。2、抗原蛋白與生物素交聯(lián)增加抗原的結(jié)合強(qiáng)度和靈活度。用Solulink ChromaLink試劑盒進(jìn)行抗原蛋白和生物素分子的交聯(lián)，將100 μ g抗原蛋白在交聯(lián)液透析平衡，然后加入試劑Chromalin-biotin進(jìn)行標(biāo)記反應(yīng)(室溫90min)，將標(biāo)記物過柱，去除游離的Chromalin-biotin，收集標(biāo)記后的蛋白，進(jìn)行蛋白定量并測定交聯(lián)效率。3、抗原芯片的制備將抗原用抗原稀釋劑稀釋為lmg/mL，并轉(zhuǎn)入384孔板中。用噴射式微陣列點(diǎn)樣儀將抗原打印在玻片表面的NC膜上。每張玻片上點(diǎn)制16個膜塊，每個膜塊都含有80個抗原和8個對照蛋白，每個蛋白在每個膜塊上重復(fù)兩次。點(diǎn)樣時(shí)濕度保持在75%。完成后室溫放置濁，然后真空包裝，4°C可保存兩年。4、利用抗原芯片檢測微量血液標(biāo)本中多種自身抗體檢測時(shí)，首先將芯片恢復(fù)至室溫，然后將橡膠分隔片放置于玻片表面，使帶有抗原的NC膜塊位于分隔片的孔中。用固定夾將玻片和橡膠分隔片固定在一起。加入50 μ L封閉液于每孔中，室溫封閉30min后吸去封閉液，將1 μ L樣本與50 μ L樣本稀釋劑混合后，加入孔中進(jìn)行反應(yīng)，60min后吸去反應(yīng)液， 加入100 μ L洗滌液，振蕩洗滌3次，每次5min。然后加入熒光素Cy3標(biāo)記的親合素和熒光素 Cy5標(biāo)記的羊抗人IgG抗體(1 1000稀釋)，室溫反應(yīng)60min，吸去反應(yīng)液，加入洗滌液洗 3次，除去固定夾和分隔墊片，將玻片浸入PBS緩沖液中漂洗30s，低速離心(500rpm);3min， 使玻片干燥。用激光掃描儀掃描玻片，掃描波長為535nm(Cy3)和632nm(Cy5)，圖像用 Genepix6. 0軟件分析，得出各點(diǎn)Cy3和Cy5的熒光強(qiáng)度。5、數(shù)據(jù)分析用自身抗原芯片分析軟件進(jìn)行分析。首先每個抗原點(diǎn)熒光強(qiáng)度 (Cy5)用內(nèi)參(Cy!3)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，然后每個抗原取平均值，即為抗原所對應(yīng)抗體的表達(dá)強(qiáng)度。所述的玻片上有16個硝酸纖維素膜包被的區(qū)域，玻片用親合素溶液浸泡處理，用蛋白點(diǎn)樣儀將80種自身抗原和6種對照蛋白打印在親合素處理后的玻片上制作成自身抗原芯片，每張芯片上含有16個蛋白微陣列區(qū)。所述的橡膠分隔片厚度約1mm，大小和玻片一致，分隔片上有16個孔，孔的位置與孔徑與抗原打印區(qū)相當(dāng)，將橡膠分隔片覆蓋在芯片表面，抗原打印區(qū)位于各個孔的正中位置。本具體實(shí)施方式
可同時(shí)檢測80種自身抗體，用生物素標(biāo)記抗原為內(nèi)參，利用橡膠分隔片和玻片固定夾，可在一張芯片上同時(shí)檢測16個生物樣本，操作簡便、節(jié)省樣本和時(shí)間，可自動進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，并生成各自身抗體信號強(qiáng)度的圖表。
權(quán)利要求
1.可同時(shí)檢測80種自身抗體的蛋白質(zhì)芯片和方法，其特征在于它的檢測裝置是由玻片(1)、橡膠分隔片( 和金屬固定夾C3)組成，橡膠分隔片( 設(shè)置在玻片(1)上方，兩側(cè)分別插入金屬固定夾(3)的凹槽中，將玻片(1)和橡膠分隔片O)固定在一起。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可同時(shí)檢測80種自身抗體的蛋白質(zhì)芯片和方法，其特征在于它的檢測方法為1、玻片表面硝酸纖維素膜的活化將玻片浸泡在一定濃度的親合素溶液中，室溫放置30min，取出后用PBS溶液洗一次，離心干燥，放4°C冰箱備用；2、抗原蛋白與生物素交聯(lián)增加抗原的結(jié)合強(qiáng)度和靈活度；3、制備抗原芯片將抗原用抗原稀釋液稀釋為lmg/mL，并轉(zhuǎn)入384孔板中，用噴射式微陣列點(diǎn)樣儀將抗原點(diǎn)在玻片表面的NC膜上，每張玻片上分為16個膜塊，每個膜塊都含有80個抗原和8個對照蛋白，每個蛋白在每個膜塊上重復(fù)點(diǎn)樣兩次，點(diǎn)樣時(shí)濕度保持在75%，點(diǎn)樣完畢后室溫放置2h，然后真空包裝；4、利用抗原芯片檢測微量血液標(biāo)本中多種自身抗體；5、數(shù)據(jù)分析用自身抗原芯片分析軟件進(jìn)行分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可同時(shí)檢測80種自身抗體的蛋白質(zhì)芯片和方法，其特征在于所述的玻片上有16個硝酸纖維素膜包被的區(qū)域，玻片用親合素溶液浸泡處理，用蛋白點(diǎn)樣儀將80種自身抗原和6種對照蛋白點(diǎn)樣在親合素處理后的玻片上制作成自身抗原芯片，每張芯片上含有16個蛋白微陣列區(qū)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可同時(shí)檢測80種自身抗體的蛋白質(zhì)芯片和方法，其特征在于所述的橡膠分隔片厚度約1mm，大小和玻片一致，分隔片上有16個孔，孔的位置和孔徑與抗原點(diǎn)樣區(qū)相當(dāng)，將橡膠分隔片覆蓋在芯片表面，抗原點(diǎn)樣區(qū)位于各個孔的正中位置。
全文摘要
可同時(shí)檢測80種自身抗體的蛋白質(zhì)芯片和方法，它涉及一種檢測自身抗體的芯片和檢測方法。它的檢測裝置是由玻片、橡膠分隔片和金屬固定夾組成，橡膠分隔片設(shè)置在玻片上方，兩側(cè)分別插入金屬固定夾的凹槽中，將芯片和橡膠分隔片固定在一起。它的檢測方法為1、玻片表面硝酸纖維素膜的活化；2、抗原蛋白與生物素交聯(lián)增加抗原的結(jié)合強(qiáng)度和靈活度；3、制備抗原芯片；4、利用抗原芯片檢測微量血液標(biāo)本中多種自身抗體；5、數(shù)據(jù)分析。它可同時(shí)檢測80種自身抗體，操作簡便，可自動進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校正，并生成各自身抗體信號強(qiáng)度的圖表。
文檔編號G01N33/543GK102539740SQ20101061014
公開日2012年7月4日 申請日期2010年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月29日
發(fā)明者李全貞 申請人:河北省健海生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司