專利名稱：一步檢測i型鴨病毒性肝炎病毒的試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種一步檢測I型鴨病毒性肝炎病毒的試紙條。
背景技術(shù)：
鴨病毒性肝炎(Duck virus hepatitis,DVH)簡稱鴨肝炎，是由鴨病毒性肝炎病毒 引起的一種急性接觸傳染性疾病，以急性發(fā)病、病程短和高死亡率為特征。該病在我國多個(gè) 地區(qū)已多次爆發(fā)，且發(fā)病嚴(yán)重，流行區(qū)域廣，損失巨大，嚴(yán)重威脅著我國的養(yǎng)鴨業(yè)。鴨肝炎可 由三種不同類型的病毒引起，稱為I型、II型和III型鴨肝炎病毒。在我國據(jù)一些研究單 位報(bào)道，國內(nèi)流行的鴨肝炎病原主要為I型鴨病毒性肝炎病毒，因此，建立I型鴨病毒性肝 炎病毒的試紙條有現(xiàn)實(shí)意義。膠體金免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，具有簡便、快速、 準(zhǔn)確、費(fèi)用低的特點(diǎn)，且由于為干試條形式，無需低溫保存，儲運(yùn)也方便，但是目前尚未見有 檢測I型鴨病毒性肝炎病毒的試紙條。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種一步檢測I型鴨病毒性肝炎病毒的試紙條，它能滿 足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。一種一步檢測I型鴨病毒性肝炎病毒的試紙條，其特征在于有一底襯、該底襯上 面的中部粘帖一包被膜，該包被膜中部有一條包被鴨病毒性肝炎病毒VPl蛋白抗體的檢測 線和一條包被抗鼠IgG抗體的控制線，包被膜的上面左右分別粘帖一涂覆金標(biāo)抗體的玻璃 纖維膜和吸水紙；涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜上面粘貼一樣品墊。本實(shí)用新型利用現(xiàn)代國際最先進(jìn)的膠體金免疫層析技術(shù)，提供一種現(xiàn)地農(nóng)戶、基 層自測等用的檢測鴨病毒性肝炎病毒的膠體金試紙條，該試紙條具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、 檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，且不需使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作簡便。

附圖為本實(shí)用新型的縱剖結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型一步檢測I型鴨病毒性肝炎病毒的試紙條，如圖所示，有一底襯1，該 底襯1上面的中部粘帖一包被膜4，該包被膜4中部有一條包被鴨病毒性肝炎病毒vpl蛋白 抗體的檢測線6和一條包被抗鼠IgG抗體的控制線7，包被膜4的上面左右分別粘帖一涂覆 金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜3和吸水紙5 ；涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜3上面粘貼一樣品墊2。制造本實(shí)用新型的步驟如下根據(jù)I型鴨病毒性肝炎病毒vpl序列構(gòu)建表達(dá)載體，誘導(dǎo)產(chǎn)生vpl蛋白的包涵 體，破碎純化，獲得高純度的鴨病毒性肝炎病毒vpl蛋白，免疫BALB/C小鼠，取其脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合建立瘤細(xì)胞株，進(jìn)行篩選，取瘤細(xì)胞注射于BALB/C小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹 水。提取小鼠腹水進(jìn)行純化篩選，獲得能與產(chǎn)生中和反應(yīng)的單克隆抗體用于膠體金標(biāo)記。制備包被膜4時(shí)，將0. 05M、pH9. 6的碳酸鹽緩沖液(PBS)用0. 22u膜過濾，制成 包被緩沖液。另將20g牛血清白蛋白(BSA)和20g脫脂奶溶于IOOOmlO. 01Μ、ρΗ7· 0的PBS 用0. 22u膜過濾，制成封閉工作液。調(diào)試噴膜機(jī)，用上述包被緩沖液稀釋鴨病毒性肝炎病 毒vpl蛋白的單克隆抗體和抗鼠IgG多克隆抗體，分別在硝酸纖維膜中部上劃線，兩線間隔 5mm，應(yīng)細(xì)致均勻，室溫晾干20分鐘，該兩線用的液體分別滲入硝酸纖維膜中，即分別為檢 測線6和控制線7。用上述封閉工作液將硝酸纖維膜于37°C封閉60分鐘，取出后置于37°C 烘干處理兩小時(shí)，制成包被膜4。制造涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜3時(shí)，將IOg氯金酸用IOOOml雙蒸水溶解，配成 水溶液；將IOg檸檬酸三鈉用IOOOml雙蒸水溶解，配成水溶液；將13. 8g碳酸鉀溶于IOOOml 雙蒸水，用0. 22u膜過濾，配制成碳酸鉀水溶液；將20g BSA溶于IOOOml 0. 01M、pH7. 0的 PBS中，用0. 22u膜過濾配成標(biāo)記洗滌液；將IOg BSA、5g脫脂奶粉、0. 5g疊氮鈉(NaN3)和 Iml 吐溫-20 (Tween-20)在 IOOOml 0. 01M、pH 7. OPBS 中溶解，用 0. 22u 膜濾過，配成金標(biāo) 抗體保存液。用雙蒸水將1 %氯金酸稀釋成0. 01 %，置電爐煮沸，按每100毫升0. 01 %氯金 酸加入4毫升檸檬酸三納，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ) 足失水。外觀應(yīng)純凈，透亮，無沉淀和漂浮物，即為燒制成的膠體金。用0. IM碳酸鉀水溶液 調(diào)膠體金的PH值至7. 6，按10微克抗體/毫升膠體金加入抗鴨病毒性肝炎病毒vpl蛋白的 單克隆抗體，混勻，靜置30分鐘，以12000rpm離心30分鐘，棄去上清液，將所得沉淀用標(biāo)記 洗滌液洗滌兩次，最后一次棄去上清液，將所得沉淀用十分之一初始膠體金體積的金標(biāo)抗 體保存液溶解，配制成金標(biāo)抗體。將上述標(biāo)記好的標(biāo)抗體均勻地涂敷在玻璃纖維膜上，每毫 升溶液涂敷鋪10平方厘米，干燥，制得涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜3。所述底襯1、樣品墊2和吸水紙5是本領(lǐng)域通用的材料。將上述包被膜4、涂覆金 標(biāo)抗體的玻璃纖維膜3、底襯1、樣品墊2和吸水紙5按照本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)粘貼起來，得到 試紙板，最后將該試紙板切割成不同寬度的試紙條即可。使用實(shí)用新型時(shí)，在試紙條的檢測線6和控制線7位置上各出現(xiàn)一條紫紅色條帶 為陽性結(jié)果；僅試紙條的控制線7位置上出現(xiàn)一條紫紅色條帶為陰性結(jié)果；在試紙條的檢 測線6和控制線7位置上均未出現(xiàn)紫紅色條帶為無效結(jié)果。
權(quán)利要求一種一步檢測I型鴨病毒性肝炎病毒的試紙條，其特征在于有一底襯(1)、該底襯(1)上面的中部粘帖一包被膜(4)，該包被膜(4)中部有一條包被鴨病毒性肝炎病毒vp1蛋白抗體的檢測線(6)和一條包被抗鼠Ig6抗體的控制線(7)，包被膜(4)的上面左右分別粘帖一涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜(3)和吸水紙(5)；涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜(3)上面粘貼一樣品墊(2)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步檢測I型鴨病毒性肝炎病毒的試紙條，其特征在于所述 的檢測線(6)中包被的鴨病毒性肝炎病毒vpl蛋白的抗體為高純度的抗單克隆抗體和/或 多克隆抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一步檢測I型鴨病毒性肝炎病毒的試紙條，其特征在于所述 的涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜(3)中有由膠體金顆粒標(biāo)記的抗鴨病毒性肝炎病毒vpl蛋白 的單克隆抗體。
專利摘要一種一步檢測I型鴨病毒性肝炎病毒的試紙條，其特征在于有一底襯、該底襯上面的中部粘帖一包被膜，該包被膜中部有一條包被鴨病毒性肝炎病毒vp1蛋白抗體的檢測線和一條包被抗鼠IgG抗體的控制線，包被膜的上面左右分別粘帖一涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜和吸水紙；涂覆金標(biāo)抗體的玻璃纖維膜上面粘貼一樣品墊。本實(shí)用新型利用現(xiàn)代國際最先進(jìn)的膠體金免疫層析技術(shù)，提供一種現(xiàn)地農(nóng)戶、基層自測等用的檢測鴨病毒性肝炎病毒的膠體金試紙條，該試紙條具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，且不需使用儀器設(shè)備，成本低廉，操作簡便。
文檔編號G01N33/544GK201628719SQ20102011721
公開日2010年11月10日 申請日期2010年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月12日
發(fā)明者凌紅麗, 蔣貽海, 賈德強(qiáng), 高亞東 申請人:青島康地恩藥業(yè)有限公司;青島寶依特生物制藥有限公司