專利名稱：胰島素測定法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用免疫反應的胰島素測定法和胰島素測定試劑。具體而言，本發(fā)明涉及一種抗體，該抗體與結合另一種抗-胰島素抗體的胰島素反應、但是不與未結合該抗-胰島素抗體的胰島素反應。
背景技術：
胰島素是肽激素(分子量大約5800)，其在朗格漢斯胰島(pancreatic islets of Langerhans)中的β細胞中經過前體，即胰島素原而產生。胰島素參與糖、氨基酸和脂肪代謝，其重要的生理作用是降血糖效應。糖尿病是由于β細胞減少或功能退化、或由于外周組織中胰島素作用不足導致的胰島素分泌不足。因此，測定血液胰島素濃度(其反應 β細胞的胰島素分泌功能)是診斷和理解糖尿病的臨床狀況和確定異常葡萄糖耐受性原因的有用指標。下述技術是已知的使用單克隆抗體的胰島素測定法。專利文件1公開了根據酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)定量胰島素的方法。這種測定法使用結合不溶性載體的單克隆抗體，以及不與所述抗體競爭用酶標記的表位的單克隆抗體。專利文件2公開了根據粒子凝集免疫測定法(particle agglutination immunoassay)定量胰島素的方法。這種測定法使用具有不同識別位點并且結合不溶性載體的兩種單克隆抗體。盡管兩個文件均公開了使用具有針對胰島素的不同識別位點的多個單克隆抗體測定胰島素的方法，沒有公開與胰島素原或胰島素類似物(如胰島素類似物制劑)的交叉反應性。因此，尚不知道是否能夠特異性地并且靈敏地測量胰島素?，F有技術文件專利文件專利文件1 日本公開專利公開號H01-148962專利文件2 日本公開專利公開號H03-118472發(fā)明概述本發(fā)明要解決的問題本發(fā)明提供能夠在不受胰島素原和胰島素類似物影響的條件下，靈敏地并且特異性地測定胰島素的胰島素-特異性測定法和測定試劑。解決該問題的手段發(fā)明人通過廣泛研究驚訝地發(fā)現，通過第一單克隆抗體(其與胰島素反應)和第二抗體(其與結合第一抗體的胰島素反應、但是不與未結合第一抗體的胰島素反應)的組合，能夠在不受胰島素原和胰島素類似物影響的條件下，靈敏地并且特異性地測定胰島素。 經過進一步研究，發(fā)明人發(fā)現，使用與結合抗-胰島素抗體的胰島素(胰島素-抗-胰島素抗體復合物，此后有時稱為“胰島素-抗體復合物”)反應的抗體，可以建立各種形式的此類胰島素測定法，由此完成了本發(fā)明。因此，本發(fā)明包括下述構成組成部分[1] 一種胰島素測定法，所述測定法使用與結合抗-胰島素抗體的胰島素反應、但是不與未結合抗-胰島素抗體的胰島素反應的抗體。[2]根據[1]所述的胰島素測定法，其使用兩種類型的抗體，其中1)第一抗體與胰島素反應，和2)第二抗體與結合第一抗體的胰島素反應、但是不與未結合第一抗體的胰島素反應。[3]根據[2]所述的胰島素測定法，其中第一和第二抗體兩者均為單克隆抗體。[4]根據[2]所述的胰島素測定法，其中第一抗體是多克隆抗體，并且第二抗體是單克隆抗體。[5]根據[3]所述的胰島素測定法，其中第一單克隆抗體由具有不同識別位點的兩種或多種單克隆抗體組成。[6]根據[3]至[5]中任意一項所述的胰島素測定法，其中所述單克隆抗體中的至少一種是不與胰島素原或胰島素類似物反應的抗體。[7]根據[3]至[6]中任意一項所述的胰島素測定法，其中第二單克隆抗體是不與胰島素原或胰島素類似物反應的抗體。[8]根據[3]、[5]、[6]和[7]中任意一項所述的胰島素測定法，其中第一和第二單克隆抗體固定于膠乳，并且通過膠乳免疫凝集測定法測定胰島素。[9]根據[3]、[5]、[6]和[7]中任意一項所述的胰島素測定法，其中第一單克隆抗體固定于固相，第二單克隆抗體用標記物質標記，并且通過ELISA測定胰島素。[10]根據[3]、[5]、[6]和[7]中任意一項所述的胰島素測定法，其中第一單克隆抗體用標記物質標記，第二單克隆抗體固定于固相，并且通過ELISA或免疫色譜法測定胰島素。[11] 一種胰島素測定試劑，所述胰島素測定試劑包含能夠與結合抗-胰島素抗體的胰島素反應、但是不與未結合抗-胰島素抗體的胰島素反應的抗體。[12]根據[11]所述的胰島素測定試劑，所述胰島素測定試劑包含兩種類型的抗體，其中1)第一抗體具有與胰島素反應的性質，和2)第二抗體具有與結合第一抗體的胰島素反應、但是不與未結合第一抗體的胰島素反應的性質。[13]根據[12]所述的胰島素測定試劑，其中第一和第二抗體兩者均為單克隆抗體。[14]根據[12]所述的胰島素測定試劑，其中第一抗體是多克隆抗體，并且第二抗體是單克隆抗體。[15]根據[13]所述的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體由具有相互之間不同的識別位點的兩種或多種單克隆抗體組成。[16]根據[13]至[15]中任意一項所述的胰島素測定試劑，其中所述單克隆抗體中的至少一種是不與胰島素原或胰島素類似物反應的抗體。[17]根據[13]至[16]中任意一項所述的胰島素測定試劑，其中第二單克隆抗體是不與胰島素原或胰島素類似物反應的抗體。[18]根據[13]、[15]、[16]和[17]中任意一項所述的胰島素測定試劑， 其中第一和第二單克隆抗體在膠乳中固定，并且通過膠乳免疫凝集測定法(latex immunoagglutination assay)測定姨島素。[19]根據[13]、[15]、[16]和[17]中任意一項所述的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體固定于固相，第二單克隆抗體用標記物質標記，并且通過ELISA測定胰島素。[20]根據[13]、[15]、[16]和[17]中任意一項所述的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體用標記物質標記，第二單克隆抗體固定于固相，并且通過ELISA或免疫色譜法測定胰島素。[21] 一種單克隆抗體，所述單克隆抗體具有下述性質1)不與未結合抗-胰島素抗體的胰島素反應，并且2)與結合抗-胰島素抗體的胰島素反應。[22]根據[21]所述的單克隆抗體，還具有不與胰島素原或胰島素類似物反應的性質。[23] 一種篩選單克隆抗體的方法，所述方法包括下述步驟1)選擇與胰島素反應的抗體，和2)選擇與步驟1)中選擇的抗體結合的胰島素反應、但是不與未結合所述抗體的胰島素反應的單克隆抗體。發(fā)明的效果通過本發(fā)明，可以在不受胰島素原和胰島素類似物影響的條件下，靈敏地并且特異性地測定胰島素。由于通過本發(fā)明能夠精確地監(jiān)測從β細胞分泌的胰島素，本發(fā)明還可用于提供糖尿病的臨床狀況的描述，因此非常有用。附圖簡述[

圖1]圖1是胰島素氨基酸序列的圖。在圖1中，(a)至(e)顯示考慮與本發(fā)明的抗體的反應性的各種胰島素類似物制劑的氨基酸序列的差異。圖1中圓圈中的字母符號表示由一個字符代表的氨基酸。賴脯胰島素(Insulin lispro) (a)和(b)是“K-P” 而非“P-K”。門冬胰島素(insulin aspart) (a)是“D”而非“P”。甘精胰島素(insulin glargine) (d)是“G”而非“N”并且添加“RR”到(c)的“T”。地特胰島素(insulin detemir) (c)不是“T”并且添加肉豆蔻酸(C14H28O2)到(b)的“K”。格魯辛胰島素(insulin glulisine) (b)是“E” 而非 “K” 并且(e)是“K” 而非 “N”。[圖2]圖2是使用Biacore(注冊商標)TlOO檢測66221-抗體和胰島素的反應性的測試的結果圖。[圖3]圖3是使用Biacore(注冊商標)TlOO檢測66226-抗體和胰島素的反應性的測試的結果圖。[圖4-1]圖4-1是使用Biacore(注冊商標)TlOO檢測66221-抗體和胰島素原以及各種胰島素類似物制劑的反應性的測試的結果圖。(a)、(b)和(c)分別是針對胰島素原、賴脯胰島素、和門冬胰島素的結果。[圖4-2]圖4-2與上述相同。(d)和(e)分別是針對甘精胰島素和地特胰島素的結果。
[圖5-1]圖5-1是使用Biacore(注冊商標)TlOO檢測66226-抗體和胰島素原以及各種胰島素類似物制劑的反應性的測試的結果圖。(a)、(b)和(c)分別是針對胰島素原、賴脯胰島素和門冬胰島素的結果。[圖5-2]圖5-2與上述相同。(d)和(e)分別是針對甘精胰島素和地特胰島素的結果。[圖6]圖6的圖表示ELISA測試的結果，該測試通過使用66221-抗體和66226-抗體分別作為一級抗體和二級抗體，以及一級抗體在板上固相化來檢測與胰島素、胰島素原和各種胰島素類似物制劑的反應性。[圖7]圖7的圖是ELISA測試的結果，該測試通過使用66226-抗體和66221-抗體分別作為一級抗體和二級抗體，以及一級抗體在板上固相化來檢測與胰島素、胰島素原和各種胰島素類似物制劑的反應性。[圖8]圖8是使用Biacore(注冊商標)TlOO檢測66221-抗體(a)和66226-抗體(b)與胰島素類似物制劑，即格魯辛胰島素的反應性的測試的結果圖。[圖9]圖9的圖是ELISA測試的結果，該測試通過使用66221-抗體和66226-抗體分別作為一級抗體和二級抗體，以及一級抗體在板上固相化來檢測與胰島素、胰島素原和胰島素類似物制劑格魯辛胰島素的反應性。[圖10]圖10的圖是ELISA測試的結果，該測試通過使用66226-抗體和66221-抗體分別作為一級抗體和二級抗體，以及一級抗體在板上固相化來檢測與胰島素、胰島素原和胰島素類似物制劑格魯辛胰島素的反應性。實施本發(fā)明的方式通過考慮本發(fā)明的代表性下述方面[3]為例，現在對本發(fā)明的實施方案進行描述。如下具體描述方面[3]使用兩種類型的單克隆抗體的胰島素測定法，其中(1)第一單克隆抗體與胰島素反應，和(2)第二單克隆抗體與結合第一單克隆抗體的胰島素反應、并且不與未結合第一單克隆抗體的胰島素反應。本發(fā)明的單克隆抗體包括第一和第二單克隆抗體，這些抗體聯(lián)合用于測定胰島素。第一單克隆抗體可以是任何單克隆抗體，只要它是與胰島素反應的，并且它不僅可以是完整抗體分子，也可以是與胰島素反應的功能片段，如抗體的Fab’部分。第二單克隆抗體可以是任何單克隆抗體，只要它具有如下性質1)和2)1)第二單克隆抗體不與未結合第一單克隆抗體的胰島素反應，并且2)第二單克隆抗體與結合第一單克隆抗體的胰島素反應。如果“第二單克隆抗體與結合第一單克隆抗體的胰島素反應”，如上所述，則希望第二單克隆抗體的反應位點(識別位點)識別由于與第一單克隆抗體結合而產生的胰島素的結構變化，并與具有所述變化的結構的胰島素反應。在這種情況下，“胰島素的結構變化” 代表由于形成胰島素-抗體復合物而在胰島素分子自身中獨立產生的結構變化，或者結合抗體的胰島素中抗體和胰島素分子協(xié)同構成的結構。由于希望本發(fā)明的測定法不受胰島素原和胰島素類似物的影響，需要至少一個單克隆抗體不與胰島素原和胰島素類似物反應。胰島素類似物具體包括胰島素類似物制劑如賴脯胰島素，門冬胰島素，甘精胰島素，地特胰島素和格魯辛胰島素。
本發(fā)明的一種形式的第二單克隆抗體可以是這樣的抗體，其不與這些化合物中的任何一種交叉反應，并且如果此類抗體用于胰島素測定法中，則即使在樣品中存在所述化合物的條件下，也能夠特異性地測定胰島素。如果所述單克隆抗體中的一個不與胰島素原和胰島素類似物反應，則另一個單克隆抗體可以與這些類似物反應或不與這些類似物反應。盡管在本說明書中表述“與胰島素反應”、“識別”胰島素、“結合”胰島素和“表現出與胰島素的交叉反應性/與胰島素交叉反應”同義地使用，它們必須以最廣義進行解釋而不限于這些例證?？贵w是否與抗原(化合物)如胰島素“反應”，可以通過下文描述的固相抗原ELISA、競爭性ELISA和夾心ELISA (sandwich ELISA)來確定，也可通過使用表面等離子共振(sra法)原理的方法進行鑒定。sra法可以使用名稱為Biacore(注冊商標)的商購裝置、傳感器和試劑來進行。本發(fā)明的抗體“不與化合物反應”的表述表示本發(fā)明的抗體基本上不與該化合物反應，而“基本上不與化合物反應”的表述表示，當例如基于sra法使用Biacore (注冊商標)TlOO來固定和測量本發(fā)明的抗體時，不認為本發(fā)明的抗體的反應性增強。具體而言，其意味著抗體和化合物之間的反應性與對照實驗(不添加化合物)中的反應性無顯著差異。 當然，除sra法之外還可通過本領域技術人員熟知的方法驗證抗體“基本上不與化合物反應”。本發(fā)明的抗體可識別作為抗原的整個胰島素分子或一部分。可將由雜交瘤(FERM BP-11233)產生的單克隆抗體(66221-抗體)具體地作為“第一單克隆抗體”提及，可將由雜交瘤(FERM BP-11234)產生的另一個單克隆抗體(66226-抗體)作為“第二單克隆抗體”提及?？扇缦氯菀椎禺a生本發(fā)明的抗體將胰島素作為抗原(免疫原)溶解在溶劑(如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS))中，并施用這種溶液來免疫動物。如果需要，可在添加適當佐劑到該溶液后使用乳劑進行免疫。該佐劑可以是廣泛應用的佐劑，如油包水乳劑、水包油包水乳劑、水包油乳劑、脂質體或氫氧化鋁凝膠以及源自生物來源組分的蛋白或肽物質。例如弗氏 (Freund)不完全或完全佐劑可以優(yōu)選的方式使用。盡管不被特別限制，希望適當選擇佐劑的施用途徑、施用劑量和施用時間從而可在將要通過抗原免疫的動物中增強期望的免疫應答。盡管用于免疫的動物的選擇不受特別限制，但是優(yōu)選地是哺乳動物，可以是小鼠、 大鼠、牛、兔、山羊和綿羊，盡管小鼠是更優(yōu)選的。動物可以根據常規(guī)技術進行免疫，例如，可通過皮下、皮內、靜脈內或腹膜內向動物注射抗原溶液，優(yōu)選與佐劑的混合物來完成免疫。 由于免疫應答一般根據待免疫的動物的類型和品系而不同，希望根據將要使用的動物適當設定免疫方案。優(yōu)選地，在初次免疫后，重復數次施用抗原。產生單克隆抗體本身的方法可根據，例如，在Antibodies，A Laboratory Manual (抗體，實驗室手冊)(Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988))中描述的方法進行。然而進行下述操作以獲得單克隆抗體，但是這些操作不是限制性的。在最后的免疫后，可如下產生雜交瘤從免疫的動物提取脾或淋巴結細胞(其是產生抗體的細胞)，并將這些細胞與增殖性骨髓瘤細胞融合。優(yōu)選地，具有高的產生抗體能力(數量上和質量上)的細胞用于細胞融合，并且骨髓瘤細胞與將要用于融合的產生抗體的細胞所來源的動物是相容的。細胞融合可根據本領域熟知的方法進行，可以使用聚乙二醇法、使用仙臺病毒的方法或使用電流的方法。獲得的雜交瘤可根據已知的方法增殖，在鑒定所產生抗體的性質的同時可以選擇所需的雜交瘤。雜交瘤可通過已知的方法如有限稀釋或軟瓊脂法克隆。將描述產生第一單克隆抗體的雜交瘤的選擇。考慮所產生的抗體在測定中實際使用的條件，可在選擇階段有效選擇雜交瘤。例如可通過ELISA或RIA選擇產生與胰島素反應的抗體的雜交瘤來獲得雜交瘤。具體而言，首先，將固相抗原ELISA用于選擇產生與胰島素高度反應的單克隆抗體的雜交瘤，所述固相抗原ELISA使培養(yǎng)物上清液中的單克隆抗體與固相化的胰島素反應，然后使標記的抗-IgG 抗體與固相化的胰島素反應?？赏ㄟ^大量培養(yǎng)以這種方法選擇的雜交瘤產生具有期望性質的單克隆抗體。大量培養(yǎng)的方法不是特別限定的，可包括例如通過在適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)雜交瘤從而在培養(yǎng)基中產生單克隆抗體的方法，以及通過將雜交瘤注射到哺乳動物的腹腔中以用于增殖從而在腹水中產生抗體的方法?？赏ㄟ^適當組合陰離子交換色譜法、親和色譜法、硫酸銨分級分離法、PEG分級分離法和乙醇分級分離法來純化單克隆抗體?？赏ㄟ^適當組合下述方法選擇產生第二單克隆抗體的雜交瘤使用結合第一單克隆抗體的胰島素替換在選擇產生第一單克隆抗體的雜交瘤的情況中使用的固相化的胰島素的選擇法(其中胰島素結合第一固相化的單克隆抗體從而觀察與第二單克隆抗體候選物的夾心的形成的方法)，其中第二單克隆抗體的候選物被固相化從而觀察與通過預先溫育第一單克隆抗體和胰島素而形成的胰島素-抗體復合物的反應性的選擇法，或其中使用 Biacore (注冊商標)TlOO鑒定來選擇顯示與胰島素沒有反應性的抗體的方法。本發(fā)明相關的抗體可以是完整抗體分子和具有抗原-抗體反應活性的功能片段。 抗體可以是通過免疫動物、通過基因重組技術獲得的那些或嵌合抗體?？贵w的功能片段包括F(ab' ，這些功能片段可通過用蛋白水解酶(例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶) 加工上述獲得的抗體來產生。本發(fā)明的第一和第二單克隆抗體之一或二者可以固定在不溶性載體上或用熟知和常用的標記物質進行標記，我們將在下文對其進行描述。我們可以將它們分別稱作“固定 (固相)的抗體”和標記的抗體。此類固定的或標記的抗體包括在本發(fā)明的范圍中。例如， 固定的抗體可通過使不溶性載體物理吸附或化學結合單克隆抗體(在它們中間可存在適當的間隔物)來產生。不溶性載體可由聚合物基質材料，如聚苯乙烯樹脂，無機基質材料， 如玻璃，多糖基質材料，如纖維素和瓊脂糖制成，形狀不受特別限制并可任意選擇。例如，不溶性載體可以是板形(例如微量培養(yǎng)板和膜)、珠子、粒子(例如膠乳粒子和膠體金粒子) 或筒狀(例如試管)。樣品中胰島素的量可以使用標記的抗體，如標記的蛋白質A或G來確定，其可結合本發(fā)明的第二單克隆抗體?？贵w的標記物質包括酶、熒光材料、化學發(fā)光材料、生物素、抗生物素蛋白、放射性同位素、膠體金粒子和有色膠乳。標記物質可通過常規(guī)方法，如戊二醛、馬來酰亞胺、二硫吡啶(pyridyl disulfide)或高碘酸法結合抗體。然而，固定的或標記的抗體的類型和產生方法不限于上述那些。例如，當酶如過氧化物酶或堿性磷酸酶用作標記物質時，可使用酶的特異性底物測定酶活性，所述特異性底物例如關于辣根過氧化物酶(HRP)為鄰苯二胺(OPD)或3，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，關于ALP為磷酸對硝基苯酯。當生物素用作標記物質時，至少抗生物素蛋白或酶修飾的抗生物素蛋白通常用在該反應中。在本說明書中，“不溶性載體”可以表示為“固相”，用不溶性載體物理或化學支持抗原或抗體或該支持狀態(tài)可表示為“固定”、“固定的”、“固相”、“敏化”或“吸附”。術語“檢測”或“測量”必須以最廣義解釋，包括胰島素存在性證明和/或定量。“樣品”，其含有在使用本發(fā)明的抗體的測定法中待檢測的分析物，可以主要是從活體(生物體)獲得的體液。體液可具體包括但不限于血液(全血)、血清、血漿、尿、唾液、 痰、胰腺提取物、淚液、耳液溢和前列腺液。本發(fā)明提供的測定試劑(試劑盒)的形式不受特別限制，只要該試劑能夠測定胰島素。代表性標記免疫測定法即，ELISA和免疫色譜法，和代表性粒子凝集免疫測定法，即膠乳免疫凝集測定法(LITA)將被考慮作為實例并進行描述。標記聯(lián)合(Label-linked)免疫測定=ELISA檢測存在于樣品中的胰島素的測定試劑(試劑盒)的形式可包括下述組成部分(a)固定有第一單克隆抗體的固相(如板)，和(b)用標記物質標記的第二單克隆抗體。固定有第一單克隆抗體的固相(如板)捕獲樣品中的胰島素以形成胰島素-抗體復合物。用標記物質標記的第二單克隆抗體與胰島素-抗體復合物反應從而形成夾心，樣品中的胰島素可通過測量標記物質的量(其通過適合用于該標記物質的方法來測量)來測定。關于配置測定試劑(試劑盒)的具體方法，如用于固定第一單克隆抗體至固相的方法和用于通過標記物質標記第二單克隆抗體的方法，除了本文描述的那些之外還可以在不受限制的條件下使用熟知的技術。盡管這種配置可作為均質測定系統(tǒng)而形成，但是優(yōu)選地，該配置作為異質測定系統(tǒng)而形成。方面[19](根據方面[13]、[15]、[16]和[17]中任意一項所述的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體固定于固相，第二單克隆抗體用標記物質標記，并且通過ELISA測定胰島素)可推薦為特別優(yōu)選的形式?？紤]到測定試劑的靈敏性和特異性，與上述相反的配置可如下使用(a)用標記物質標記的第一單克隆抗體，和(b)固定有第二單克隆抗體的固相(如板)。在這種配置中，測試樣品優(yōu)選與含有用標記物質標記的第一單克隆抗體的溶液混合從而在溶液中預先形成胰島素-抗體復合物，和將胰島素-抗體復合物添加到固定有第二單克隆抗體的固相。在這種配置中，為了增強靈敏性的目的，具有不同識別位點的兩種或多種單克隆抗體可以優(yōu)選的方式用作用標記物質標記的第一單克隆抗體，即方面[15](根據方面[13]所述的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體由具有不同的識別位點的兩種或多種單克隆抗體組成)。方面[20]可推薦為特別優(yōu)選的形式(根據方面[13]、[15]、[16]和[17]中任意一項所述的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體用標記物質標記，第二單克隆抗體固定于固相，并且通過ELISA測定胰島素)。標記聯(lián)合免疫測定免疫色譜法典型的免疫色譜法按照在片狀固相支持物(如膜)上在縱向上與邊緣的距離的順序如下配置測試樣品溶液由于毛細管作用(毛細管現象)連續(xù)移動經過“1.樣品加載位點，” “2.標記的試劑位點，其在膜上以可擴散的方式保持含有第一單克隆抗體的標記的試劑(第一單克隆抗體用標記物質如膠體金粒子標記)，”和“3.固定有第二單克隆抗體的捕獲試劑位點，其用于捕獲用標記物質標記的第一單克隆抗體和胰島素的復合物”。具體而言，當預定量的含有胰島素的測試樣品添加到樣品加載位點時，樣品在固相支持物上擴散和移動的過程中滲入標記的試劑位點，胰島素結合標記的試劑(含有第一單克隆抗體)以形成標記的試劑-胰島素復合物(胰島素-標記的試劑復合物)。標記的試劑-胰島素復合物繼續(xù)在膜上擴散和移動，當滲入膜上的捕獲試劑位點(其含有第二單克隆抗體)時，該復合物被固定于固相支持物上的捕獲試劑捕獲從而在該位點形成捕獲試劑(第二單克隆抗體)_胰島素-標記的試劑(第一單克隆抗體)復合物。分析物的存在可通過檢測標記的試劑來確定，該檢測通過人們選擇的方法，例如在可見膠體金粒子的情況下檢測凝集作用的外觀(凝集圖像/圖片)和在酶的情況下由于添加底物來檢測顯色反應。盡管對于“1.樣品加載位點，”和“2.標記的試劑位點，其在膜上以可擴散的方式保持含有第一單克隆抗體的標記的試劑(第一單克隆抗體用標記物質如膠體金粒子標記)”以測試樣品移動方向的順序為了便于理解而進行了分別的描述，但是顯然本領域技術人員能理解可使用熟知的形式/配置，如處于從上端“1”和“2”的順序的堆疊結構(stacked structure)。在免疫色譜法中，在測試樣品通過“2.標記的試劑位點，其在膜上以可擴散的方式保持含有第一單克隆抗體的標記的試劑(第一單克隆抗體用標記物質如膠體金粒子標記)”時形成胰島素-抗體復合物，因此，為了增強靈敏性，如在ELISA的情況中，具有不同識別位點的兩種或多種單克隆抗體可以優(yōu)選的方式用作用標記物質標記的第一單克隆抗體， 即方面[15](根據方面[13]所述的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體由具有不同的識別位點的兩種或多種單克隆抗體組成)。方面[20]可推薦為特別優(yōu)選的形式(根據方面[13]、[15]、[16]和[17]中任意一項所述的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體用標記物質標記，第二單克隆抗體固定于固相，并且通過免疫色譜法測定胰島素)。比濁免疫測定法LTIA用于檢測樣品中存在的胰島素的測定試劑(試劑盒)的四種實施方案，A至D可包括下述各項A. (a)固定有第一單克隆抗體的膠乳粒子和(b)固定有第二單克隆抗體的膠乳粒子；B. (a)固定有第一單克隆抗體的膠乳粒子和(b)第二單克隆抗體；C. (a)第一單克隆抗體和(b)固定有第二單克隆抗體的膠乳粒子；和D. (a)固定有第一和第二單克隆抗體兩者的膠乳粒子。這些測定試劑(試劑盒)可以優(yōu)選的方式用于LTIA中。為了獲得期望的能力，如增強的靈敏性，A至D中使用的膠乳粒子可根據粒徑和類型適當選擇。膠乳粒子可以是適合用于裝載抗原或抗體的那些。例如，膠乳粒子可以是聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸(磺酸酯) 共聚物、苯乙烯-異丁烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物或乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物。盡管膠乳粒子的形狀不受特別限制，但是優(yōu)選地，平均粒徑如此限定，以使得所產生的凝聚物(作為膠乳粒子表面上的抗體(或抗原)與分析物之間凝集反應的結果)具有足夠通過視覺或光學檢測的大小。平均粒徑優(yōu)選為0.02至 1. 6 μ m，特別是0. 03至0. 5 μ m。替代膠乳粒子，可以使用由金屬膠體、明膠、脂質體、微膠囊、二氧化硅、氧化鋁、炭黑、金屬化合物、金屬、陶瓷或磁性材料制造的粒子。例如，臨床檢查中使用的LTIA試劑通常以第一和第二試劑溶液的形式提供，它們與所用測試樣品順次混合。A至D每種形式中(a)和(b)之一或兩者可包含于第一或第二試劑溶液中。包含(a)和(b)的方法可適當根據用于臨床檢查的測量裝置的細節(jié)和測定試劑的設計(如能力和可用性)進行選擇。盡管優(yōu)選地，形式A中的(a)和(b)兩者均包含于第二試劑中，形式A中的(a)和(b)也可以優(yōu)選方式分別包含于第一和第二試劑中。方面[18]可推薦為特別優(yōu)選的形式(根據方面[13]、[15]、[16]和[17]中任意一方面所述的胰島素測定試劑，其中第一和第二單克隆抗體固定于膠乳，并且通過膠乳免疫凝集測定法測定胰島素)。盡管考慮方面[3]描述了本發(fā)明的實施方案，其作為實例是本發(fā)明的代表性形式，顯然本領域技術人員能夠理解本發(fā)明可以多種形式實施，例如對于第一抗體使用多克隆抗體，如在方面W]中，和對于第一抗體使用具有不同識別位點的兩種或多種單克隆抗體，如在方面[5]中，條件是使用關于“胰島素-抗體復合物”的抗體。盡管參考實施例將更詳細的描述本發(fā)明，本發(fā)明不限于這些實施例。
實施例[第一測試實施例]生成本發(fā)明的單克隆抗體的方法1.制備免疫抗原在人胰島素(FitzgeraldIndustries hternational，30-AI51)與完全弗氏佐劑 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) 1 1混合后，使用連接注射器來生成將要用作免疫抗原的乳劑。2.雜交瘤的產生免疫抗原皮下注射到雌性BALB/c小鼠(20至50 μ g/小鼠)背側區(qū)。免疫每周重復兩次。在免疫開始三周后，從在血樣中具有高抗體滴度的小鼠中提取脾，通過常規(guī)程序使用50% PEG 1450 (Sigma)進行細胞融合。使用SP2/0骨髓瘤細胞。將獲得的融合細胞以2. 5X 106/mL(作為脾細胞)懸浮在含有HAT，15%胎牛血清和10% BM-Condimed Hl Hybridoma Cloning Supplement (BM-調節(jié) Hl 雜交瘤克隆添力口物)(Roche Diagnostics K. K.)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，以0. 2-mL等份地分配在96-孔培養(yǎng)板中。融合細胞在37°C 于5% CO2的保溫箱中培養(yǎng)。3.篩選產生第一單克隆抗體的雜交瘤從細胞融合開始七天后，培養(yǎng)上清液用于進行固相抗原ELISA(下文描述)作為初次篩選用于選擇對胰島素顯示高反應性的孔作為初次陽性孔。初次陽性孔中的細胞在 24-孔板中連續(xù)傳代。連續(xù)培養(yǎng)兩天后，培養(yǎng)上清液用于進行競爭性ELISA(下文描述)作為二次篩選來選擇對胰島素表現出高反應性的孔作為二次陽性孔。3-1.產生固相抗原ELISA板
使用含有150mM氯化鈉的IOmM PBS (pH 7. 2)以1 μ g/mL的濃度制備的胰島素在 96-孔板上以50 μ L/孔固相化作為篩選抗原并允許在4°C放置過夜。用400 μ L/孔的PBS 溶液(含有0. 05%吐溫(注冊商標)20和0. ProClin 300) (Supelco ；PBST)洗滌三次后，含有BSA的PBST (BSA-PBST)以100 μ L/孔分配并允許在室溫放置一小時用于封閉從而產生ELISA板。ELISA板用PBST洗滌三次并通過添加試劑用于實施例中描述的ELISA 測試。3-2.固相抗原 ELISA(i)用BSA-PBST逐步稀釋的小鼠抗血清或融合細胞的培養(yǎng)上清液在固相抗原 ELISA板上以50 μ L/孔分配并允許在室溫放置一小時。(ii)用 PBST 洗滌三次后，用 BSA-PBST 5000 倍稀釋的 HRP-Gt F(ab' )2-抗-小鼠Ig' s (BioSource, AMI4404)溶液以50 μ L/孔分配并允許在室溫放置一小時。(iii)用 PBST洗滌三次后，OPD CTokyo Chemical Industry Co. , Ltd.(東京化學工業(yè)有限公司))以ang/mL溶解在含有0.02%過氧化氫/水的0.2M檸檬酸鹽緩沖溶液(下文稱為底物溶解溶液)中，以50 μ L/孔添加，并允許在室溫放置一小時。(iv)另外，含有ImM EDTA的1. 5N硫酸(下文稱為反應終止液)以50 μ L/孔添加，使用 Titertek(注冊商標)Multiskan Plus MK II (Flow Laboratories he)在波長 492nm測量吸光度。3-3.競爭性 ELISA⑴用 BSA-PBST 以 0，2.5，5 和 10 μ g/mL 稀釋的人胰島素(Fitzgerald Industries International, 30-AI51)溶液在固相抗原 ELISA 板上以 25 μ L/孔分配。(ii)用BSA-PBST稀釋5和25倍的融合細胞培養(yǎng)物上清液或其未稀釋的溶液然后以25 μ L/孔分配并允許在室溫放置一小時。(iii)以與如上文描述的“3-2.固相抗原ELISA”中的步驟(ii)至(iv)相同的方式進行后繼操作。4.篩選產生第二單克隆抗體的雜交瘤從細胞融合開始七天后，培養(yǎng)物上清用于進行夾心ELISA (下文描述)從而選擇對結合第一 F(ab' )2單克隆抗體的胰島素表現高反應性的孔，所述第一 F (ab' )2單克隆抗體預先通過克隆和單克隆抗體收集(下文描述)來收集。4-1.夾心 ELISA(i)使用 Immuno Pure (注冊商標)F (ab ‘ )2 制備試劑盒(Pierce，prod#44888)處理第一單克隆抗體(在本例中為66221-抗體)以制備F(ab' )2。(ii)用PBS溶液以2 μ g/mL的濃度制備的第一F(ab‘ )2單克隆抗體在96-孔板上以50 μ L/孔進行固相化，并允許在4°C放置過夜。用400 μ L/孔PBST洗滌三次后，BSA-PBST 以100 μ L/孔進行分配并允許在室溫放置一小時用于封閉從而產生ELISA板。(iii)用 BSA-PBST 以 0. 5 μ g/mL 稀釋的人胰島素(Fitzgerald Industries International, 30-AI51)溶液在ELISA板上以50 μ L/孔分配并允許在室溫放置一小時。(iv)用PBST洗滌三次后，用BSA-PBST逐步稀釋的融合細胞的培養(yǎng)物上清液以 50 μ L/孔分配并允許在室溫放置一小時。(ν)用PBST洗滌三次后，用BSA-PBST稀釋10000倍的HRP-Gt-抗-小鼠IgG-Fc (Bethyl Laboratories, A90-131P)溶液以50 μ L/孔分配并允許在室溫放置一小時。(vi)用 PBST 洗滌三次后，OPD(Tokyo Chemical Industry.(東京化學工業(yè)))以 2mg/mL在底物溶解溶液中溶解，以50 μ L/孔添加并允許在室溫放置一小時。(vii)反應終止液以50 μ L/孔添加，使用Titertek(注冊商標)Multiskan Plus MK II (Flow Laboratories)測量 492nm 的吸光度。5.克隆和單克隆抗體收集通過上文描述的3和4的篩選選擇的雜交瘤通過有限稀釋法進行克隆從而分別獲得雜交瘤66221和66226。為收集雜交瘤產生的單克隆抗體，以對應于0. 5X IO6細胞的量向12-周齡雌性BALB/c小鼠腹膜內施用雜交瘤，該小鼠兩周前用0. 5mL的降植烷腹膜內注射。14天后收集腹水，通過離心獲得上清液。上清液與等量的吸附緩沖液(3mol/L NaCl, 1.5mol/L甘氨酸-NaOH緩沖液，pH 8. 混合，然后過濾。濾出液通過用吸附緩沖液平衡的蛋白質A瓊脂糖柱以使用該柱吸附濾出液中的抗體，該抗體用0. lmol/L檸檬酸鹽緩沖液 (pH 3.0)洗脫。洗脫液用lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中和后，用PBS透析以收集抗體。該抗體，稱為66221-抗體和66226-抗體，隨后用于測試中。產生66221-抗體和66226-抗體的雜交瘤于2009年4月8日分別以保藏號 FERM P-21800和FERM P-21801通過國際專利生物保藏中心，日本產業(yè)技術總合研究所(International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(地 tit Tsukuba Central 6，1—1—1 Higashi, Tsukuba, rtaraki，日本)進行保藏。隨后，在2010年2月17日，基于最初保藏，分別以保藏號FERM BP-11233和FERM BP_112;M轉移至布達佩斯條約。[第二測試實施例]本發(fā)明的單克隆抗體與胰島素原和胰島素類似物的交叉反應性使用Biacore (注冊商標)T100對于66221-抗體和66226-抗體與胰島素原和胰島素類似物的交叉反應性進行測試。對于胰島素類似物，使用胰島素類似物制劑如賴脯胰島素、門冬胰島素、甘精胰島素和地特胰島素。1.試劑和儀器1-1.單克隆抗體(i) 66221-抗體2. 30mg/mL(ii)662^_ 抗體3. 99mg/mL1-2.分析物(i):Fitzgerald Industries International, 30-AI51(ii)胰島素原IRR胰島素原，人的，用于免疫測定；NIBSC編號84/611(iii)胰島素類似物制劑(1)賴脯胰島素，100 單位 /mL =Eli Lilly Japan K. K.(2)門冬胰島素，100 單位 /mL =Novo Nordisk Pharma Ltd.(3)甘精胰島素，100 單位 /mL :sanofi-aventis K. K.(4)地特胰島素，100 單位 /mL =Novo Nordisk Pharma Ltd.
1-3. Biacore (注冊商標)裝置和專用試劑組(Biacore 現在為GE Healthcare ； 盡管下文所述的⑴至(viii)是當時Biacore的產品和目錄編號，這些現在可從GE Healthcare 獲得)(i) Biacore (注冊商標)TlOO =Biacore, JJ-1037-02(ii) S 系列傳感器芯片 CM5 =Biacore, BR-1005-30(iii)胺偶聯(lián)試劑盒Biacore，BR-IOOO-5O(iv)乙酸鹽 5. O =Biacore, BR-1003-51(ν) α -小鼠免疫球蛋白=Biacore, BR-1005—14(vi)甘氨酸 1. 5 =Biacore, BR-1003-54(vii)甘氨酸 2. O =Biacore, BR-1003-55(viii)HBS-EP+10X (運行緩沖液)=Biacore, BR-1006_69(用 NaOH,以 pH 8· 5 制備，并在使用時用純化水稀釋10倍)2.測試方法66221-抗體或66226-抗體通過固定在傳感器芯片上的α -小鼠免疫球蛋白捕獲， 胰島素、胰島素原和多種胰島素類似物制劑作為分析物添加以評價與其的反應性。使用的具體操作程序如下。(i) α -小鼠免疫球蛋白固定在傳感器芯片CM5上(根據所附的說明書手冊)。(ii) 66221-抗體或 66226-抗體用 HBS-EP+(pH 8. 5)稀釋至 5 μ g/mL 并以流速 30 μ L/min 添力口 300 秒。(iii)各種抗原用HBS-EP+ (pH 8. 5)稀釋至10ng/mL，并以O和10ng/mL兩種濃度各添加120秒。在此情況下，對于自由運行解離時間設定為120秒。(iv)甘氨酸1.5和甘氨酸2.0以1 1混合以形成再生溶液，并且再生處理進行 180 秒。3.結果3-1.與胰島素反應的結果
對于66221-抗體和66226-抗體，與胰島素的反應性使用Biacore (注冊商標) TlOO進行檢驗。結果描述于圖2和3中。在lOng/mL的胰島素濃度時，66221-抗體顯示 8. 5RU的反應性(圖2)。相反，對于66226-抗體未檢測到反應性(圖3)?？v軸(RU)表示 Biacore (注冊商標)測定系統(tǒng)獨特的單位，表示由于傳感器表面上的反應引起的質量變化。3-2.與胰島素原和胰島素類似物制劑的反應結果對于66221-抗體和66226-抗體，與胰島素原或各種胰島素類似物制劑(賴脯胰島素、門冬胰島素、甘精胰島素和地特胰島素)的反應性使用Biacore (注冊商標)T100進行檢驗。結果描述于圖4-1、4-2、5-1和5-2中。在每種情況下，在lOng/mL的抗原濃度時， 對于66221-抗體，檢測到5. 5至13RU的反應。相反，對于66226-抗體未檢測到反應性。[實施例1]使用本發(fā)明的單克隆抗體的組合對胰島素的測定11.產生膠乳粒子裝配有攪拌機、回流冷凝器、熱傳感裝置、氮導入管和護套的玻璃反應容器(容量2L)填充IlOOg的蒸餾水，200g的苯乙烯，0. 2g的苯乙烯磺酸鈉和溶解在50g的蒸餾水中的1.5g的過硫酸鉀(potassium peroxodisulfate)水溶液，并且在容器內用氮氣置換后，在70°C攪拌下進行聚合48小時。聚合結束后，該溶液用濾紙過濾以提取膠乳粒子。透射電子顯微鏡儀器(JE0L Ltd.，型號“JEM-1010”)用于在10000倍放大率對膠乳粒子成像并分析至少100個獲得的膠乳粒子的直徑以確定平均粒徑。所獲得的平均粒徑是0. 3 μ m。2.制備抗-胰島素抗體敏化的膠乳粒子2-1.產生66221-抗體-敏化的膠乳粒子溶液向具有平均粒徑0.3μπι的1.0%膠乳溶液[在5mM Tris緩沖液(下文稱為 Tris-HCl)，pH 8. 5 中]中添加用等體積 5mM Tris-HCl (pH 8.5)稀釋至 0.60mg/mL 的66221-抗體溶液，并在4°C攪拌兩小時。隨后添加等體積的含有0. 5% BSA的5mM Tris-HCKpH 8.5)并在4°C攪拌一小時。離心溶液并去除上清液后，將沉淀重懸浮在5mM Tris-HCl (pH 8. 5)中以產生66221-抗體-敏化的膠乳粒子溶液。2-2.產生66226-抗體-敏化的膠乳粒子溶液具有平均0. 3 μ m粒徑的膠乳以與上文相同的方式用于產生66226-抗體-敏化的膠乳粒子溶液。3.制備試劑3-1.制備第一試劑含有500mM氯化鈉禾口 0. 2% BSA的五(5)毫摩爾Tris-HCl (pH 8. 5)用作第一試劑。3-2.制備第二試劑混合等體積的66221-抗體-敏化的膠乳粒子溶液和66226-抗體-敏化的膠乳粒子溶液并用5mM Tris-HCl (pH 8. 5)稀釋從而獲得波長600nm處5. OAbs的吸光度來制備第二試齊LU4.測定組合第一和第二試劑，使用Hitachi 7170自動分析儀鑒定胰島素濃度-依賴性粒子凝聚物形成。具體而言，添加150 μ L的第一試劑至IOyL的濃度為0、5、25、50、100和 200 μ U/mL的胰島素溶液中并在37°C加熱5分鐘。隨后，添加50 μ L的第二試劑，然后攪拌。 五分鐘后，與凝集形成相關的吸光度變化在570nm和亞波長SOOnm測量。[表1]
1權利要求
1.一種胰島素測定法，所述測定法使用與結合抗-胰島素抗體的胰島素反應、但是不與未結合抗-胰島素抗體的胰島素反應的抗體。
2.權利要求1的胰島素測定法，所述測定法使用兩種類型的抗體，其中1)第一抗體具有與胰島素反應的性質，和2)第二抗體與結合第一抗體的胰島素反應、但是不與未結合第一抗體的胰島素反應。
3.權利要求2的胰島素測定法，其中第一抗體和第二抗體兩者均為單克隆抗體。
4.權利要求2的胰島素測定法，其中第一抗體是多克隆抗體，并且第二抗體是單克隆抗體。
5.權利要求3的胰島素測定法，其中第一單克隆抗體由具有不同識別位點的兩種或多種單克隆抗體組成。
6.權利要求3至5中任意一項的胰島素測定法，其中所述單克隆抗體中的至少一種是不與胰島素原和胰島素類似物反應的抗體。
7.權利要求3至6中任意一項的胰島素測定法，其中第二單克隆抗體是不與胰島素原和胰島素類似物反應的抗體。
8.權利要求3、5、6和7中任意一項的胰島素測定法，其中第一單克隆抗體和第二單克隆抗體固定于膠乳，并且通過膠乳免疫凝集測定法測定胰島素。
9.權利要求3、5、6和7中任意一項的胰島素測定法，其中第一單克隆抗體固定于固相， 第二單克隆抗體用標記物質標記，并且通過ELISA測定胰島素。
10.權利要求3、5、6和7中任意一項的胰島素測定法，其中第一單克隆抗體用標記物質標記，第二單克隆抗體固定于固相，并且通過ELISA或免疫色譜法測定胰島素。
11.一種胰島素測定試劑，所述胰島素測定試劑包含與結合抗-胰島素抗體的胰島素反應、但是不與未結合抗-胰島素抗體的胰島素反應的抗體。
12.權利要求11的胰島素測定試劑，所述胰島素測定試劑包含兩種類型的抗體，其中1)第一抗體具有與胰島素反應的性質，和2)第二抗體具有與結合第一抗體的胰島素反應、但是不與未結合第一抗體的胰島素反應的性質。
13.權利要求12的胰島素測定試劑，其中第一抗體和第二抗體兩者均為單克隆抗體。
14.權利要求12的胰島素測定試劑，其中第一抗體是多克隆抗體，并且第二抗體是單克隆抗體。
15.權利要求13的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體由具有不同識別位點的兩種或多種單克隆抗體組成。
16.權利要求13至15中任意一項的胰島素測定試劑，其中所述單克隆抗體中的至少一種類型是不與胰島素原和胰島素類似物反應的抗體。
17.權利要求13至16中任意一項的胰島素測定試劑，其中第二單克隆抗體是不與胰島素原和胰島素類似物反應的抗體。
18.權利要求13、15、16和17中任意一項的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體和第二單克隆抗體固定于膠乳，并且通過膠乳免疫凝集測定法測定胰島素。
19.權利要求13、15、16和17中任意一項的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體固定于固相，第二單克隆抗體用標記物質標記，并且通過ELISA測定胰島素。
20.權利要求13、15、16和17中任意一項的胰島素測定試劑，其中第一單克隆抗體用標記物質標記，第二單克隆抗體固定于固相，并且通過ELISA或免疫色譜法測定胰島素。
21.一種單克隆抗體，所述單克隆抗體具有下述性質1)不與未結合抗-胰島素抗體的胰島素反應，并且2)與結合抗-胰島素抗體的胰島素反應。
22.權利要求21的單克隆抗體，所述單克隆抗體還具有不與胰島素原和胰島素類似物反應的性質。
23.—種篩選單克隆抗體的方法，所述方法包括下述步驟1)選擇與胰島素反應的抗體，和2)選擇與步驟1)中選擇的抗體結合的胰島素反應、但是不與未結合所述抗體的胰島素反應的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供在不受胰島素原和胰島素類似物的影響下，使用具有與結合抗-胰島素抗體的胰島素反應，但不與未結合抗-胰島素抗體的胰島素反應的性質的抗體，能夠靈敏地并且特異性地測定胰島素的胰島素-特異性測定法和測定試劑。
文檔編號G01N33/543GK102246039SQ201080003521
公開日2011年11月16日 申請日期2010年7月21日 優(yōu)先權日2009年7月21日
發(fā)明者中村靖, 山本光章, 清水知, 近藤純一 申請人:積水醫(yī)療株式會社