專利名稱：用于分離胎盤來源微粒的方法和試劑盒以及它們用于診斷胎兒疾病的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
在一些實施方式中，本發(fā)明涉及從母體血液樣品中分離胎盤來源微粒的方法和試劑盒以及它們用于描繪胎兒特征的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在懷孕期間通常要進(jìn)行產(chǎn)前篩查以檢測潛在的先天缺陷(如唐氏綜合征、染色體異常、遺傳病和其它狀況)。優(yōu)選地在懷孕的早期進(jìn)行篩查。由多余的或缺失的染色體(非整倍體)引起的綜合征是人類最廣泛被識別的遺傳病并且目前可以使用如羊膜穿刺術(shù)和絨毛膜絨毛取樣(CVS)的方法進(jìn)行檢查。但是，盡管能預(yù)測染色體畸變，所述羊膜穿刺術(shù)或 CVS方法分別帶來了 0. 5-1%或2-4%的方法相關(guān)的流產(chǎn)風(fēng)險。微囊泡(MV)包括微粒和外來體，其在正常生理狀況的血液循環(huán)中出現(xiàn)并在多種疾病中增加。微粒(MP)是從多種細(xì)胞表面脫落的膜囊并包含少量的細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)。細(xì)胞微粒由細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重排形成，其尺寸多樣化(大約0. 1至Ιμπι)并且在磷脂和蛋白組合物中有差異。MP 包含 DNA 和 RNA(Reich CF 等 Exp Cell Res. (2009) 10 ；315 760-8)并且暴露特異于它們源于的細(xì)胞的膜抗原(Diamant等，Eur J Clin Invest (2004) 34 :392_401)。 例如，在循環(huán)中，有脫落自血小板、內(nèi)皮細(xì)胞或白細(xì)胞的MP。在癌癥患者中，可以檢測到腫瘤細(xì)胞來源MP，在孕婦中可以發(fā)現(xiàn)胎盤來源MP。在暴露于細(xì)胞因子或毒素之后及在多種病理學(xué)(如炎癥、癌癥、糖尿病和其它血管疾病)中，有兩種導(dǎo)致微粒形成的機制——細(xì)胞凋亡或激活。在血液中，MP看來似乎是具有膜結(jié)構(gòu)的RNA的主要來源，所述膜結(jié)構(gòu)保護(hù)核酸不被血液核酸酶消化。此外，循環(huán)的微粒通過在細(xì)胞間轉(zhuǎn)移蛋白和RNA(如微小RNA)調(diào)節(jié)靶細(xì)胞及促進(jìn)細(xì)胞與細(xì)胞的交互作用， 因此提高靶細(xì)胞膜上的蛋白表達(dá)并誘導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。循環(huán)的核酸可以提供診斷和預(yù)后意義的標(biāo)記物。血液中的MP可以包含來自它們起源細(xì)胞(如腫瘤)的mRNA，所述mRNA的形式是可以被基因組技術(shù)分析的形式。在妊娠中，細(xì)胞外mRNA提供了用于評估胎兒基因表達(dá)的材料來源(Ng EK等，Proc Natl Acad Sci USA. (2003) 15 ； 100)。滋養(yǎng)層細(xì)胞起始是作為早期胎兒胚細(xì)胞的外部覆蓋層，其提供了母體子宮內(nèi)膜和發(fā)育胚胎之間的營養(yǎng)途徑。覆蓋胎盤絨毛(vili)的人類絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(HVT)提供了用于與母體循環(huán)交換氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的表面并且它們是暴露于母體循環(huán)的具有胚胎表型的唯一細(xì)胞。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞分化通過細(xì)胞凋亡完成并且導(dǎo)致了合體滋養(yǎng)層細(xì)胞MP釋放至母體循環(huán)中。所述合體滋養(yǎng)層細(xì)胞來源MP與體外循環(huán)的胎兒核酸相關(guān)[DNA and mRNA, Gupta AK等，Clinical Chemistry (2004) 50 =2187-2190] 合體滋養(yǎng)層細(xì)胞來源MP可以在起始于懷孕中期的母體循環(huán)中被檢測(即，使用ELISA和抗ND0G2抗體)，它們的數(shù)量在懷孕末期時增加且它們參與正?；蛳日鬃影B懷孕中的系統(tǒng)炎癥反應(yīng)[Germain SJ等，J Immunol.(2007) 178 =5949-56]。用抗NDOGl抗體標(biāo)記胎盤來源MP并用流式細(xì)胞術(shù)評估[Aharon A 等· J Thromb Haemost. 2009 Mar 13]。之前的研究描述了通過從母體血液中分離胎兒有核細(xì)胞(如紅細(xì)胞)并將它們用于遺傳分析來進(jìn)行胎兒分析(見如美國專利號5，750，339)。美國專利申請?zhí)?0080261822描述了通過滋養(yǎng)層細(xì)胞的原位染色用于產(chǎn)前診斷的方法。根據(jù)它們的技術(shù)，從懷孕個體收集經(jīng)子宮的標(biāo)本并將所述標(biāo)本進(jìn)行滋養(yǎng)層細(xì)胞特異的免疫染色，隨后進(jìn)行基于原位DNA的遺傳分析以測定胎兒性別和/或鑒定胎兒中染色體和/或DNA的異常。其它的文獻(xiàn)包括 Orozco AF 等，American Journal of Pathology(2008) 173 1595-1608。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一個方面，提供一種產(chǎn)前分析胎兒的方法，所述方法包括(a)分離胎盤來源微粒；和(b)分析胎盤來源微粒的內(nèi)含物的至少一種成分，其中所述至少一種成分是胎兒特征的指示。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一個方面，提供一種從懷孕個體獲得的血液樣品中分離胎盤來源微粒的方法，所述方法包括(a)在使得至少一種試劑與胎盤來源微粒結(jié)合的條件下，用至少一種試劑接觸所述血液樣品，其中所述至少一種試劑與胎盤來源微粒特異結(jié)合而不與母體微粒結(jié)合；和(b)分離所述胎盤來源微粒，從而從血液樣品中分離胎盤來源微粒。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一個方面，提供一種包含至少80 ％胎盤來源微粒的分離微粒群，所述胎盤來源微粒根據(jù)權(quán)利要求3的方法獲得。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式的一個方面，提供一種用于產(chǎn)前分析胎兒的試劑盒， 所述試劑盒包括一種包裹材料和使用說明書，其中所述包裹材料包裹能夠特異結(jié)合胎盤來源微粒的第一種試劑和用于分析所述胎盤來源微粒的內(nèi)含物的至少一種成分的第二種試劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述方法進(jìn)一步包括在步驟(a)之后和步驟(b)之前，從所述胎盤來源微粒中分離所述成分。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述分離不通過FACS實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述分離通過免疫沉淀實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述方法進(jìn)一步包括在所述接觸之前離心所述血液樣品以獲得貧血小板血漿(PPP)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述試劑包括抗體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述抗體結(jié)合胎盤來源微粒的膜多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述抗體包括抗ND0G1抗體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述試劑結(jié)合多肽，所述多肽選自人絨毛膜促性腺激素(HCG)、人胎盤催乳激素(hPL)、ND0G1、ND0G2、ND0G5、Trop-I 和 Trop-2。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述分離根據(jù)權(quán)利要求3的方法實現(xiàn)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述至少一種成分包括核酸。
根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述至少一種成分包括多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述特征是胎兒疾病。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述胎兒疾病包括胎兒染色體畸變。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述染色體畸變包括非整倍體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述胎兒疾病包括胎兒遺傳突變。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述遺傳突變包括5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶 (MTHFR)基因的多態(tài)性。 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述特征是胎兒性別。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述胎盤來源微粒是在從懷孕個體獲得的血液樣品中。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述第一種試劑包括抗體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述抗體包括抗NDOGl抗體。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述至少一種成分選自核酸和多肽。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述試劑盒進(jìn)一步包括至少一種用于從胎盤來源微粒中分離核酸的試劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述試劑盒進(jìn)一步包括至少一種用于從胎盤來源微粒中分離多肽的試劑。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述第二種試劑選自寡核苷酸、探針、抗體和染料。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，所述血液樣品選自全血、分餾的全血、稀釋的血液樣品、未稀釋的血液樣品、血漿、血清和微粒。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。示例性的方法和/或材料在下文中描述，但是與本文描述的那些相似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡梢杂迷诒景l(fā)明實施方式的實踐和測試中。如果有沖突，將以本發(fā)明的說明書，包括定義為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實施例僅是示例性的，并不意味著必要的限定。


僅出于舉例的目的，參考附圖在本文中描述本發(fā)明的一些實施方式?，F(xiàn)在詳細(xì)參考附圖，應(yīng)當(dāng)強調(diào)的是示出的具體內(nèi)容是為了舉例并出于例證性討論本發(fā)明實施方式的目的。在這方面，與附圖一起呈現(xiàn)的描述內(nèi)容使本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚地知道如何實施本發(fā)明的實施方式。在圖中圖IA-B顯示了滋養(yǎng)層細(xì)胞特異抗體NDOGl的特異性。從24周的孕婦獲得胎盤的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(HVT)，用同種型對照IgG-PE或抗NDOGl-PE標(biāo)記，并通過FACS分析。 圖IA例示了用同種型對照IgG-PE標(biāo)記的HVT ；圖IB例示了用抗NDOGl-PE標(biāo)記的HVT。圖2顯示了胎盤來源微粒(MP)。用抗NDOGl標(biāo)記從未懷孕的女性(NP)、健康的孕婦(HP)和患有妊娠血管并發(fā)癥(GVC)的女性的貧血小板血漿中分離的MP，并通過FACS評估。圖3A-E顯示了在懷孕早期胎盤MP水平的評估。從未懷孕女性(NP)和懷孕不同階段(懷孕11、13、15和19周)的健康孕婦的貧血小板血漿(PPP)分離MP。紅色區(qū)域代表陰性對照IgG。黑色曲線代表用胎盤標(biāo)記物抗NDOGl標(biāo)記的MP的百分比。圖4A-D顯示了從總MP分離胎盤MP。在免疫分離之前(圖4A-B)和分離之后(圖 4C-D)用胎盤標(biāo)記物NDOGl或母體胎盤標(biāo)記物⑶41標(biāo)記15周孕婦的MP。圖5描述了微粒來源DNA濃度和質(zhì)量。通過超速離心從19周孕婦的貧血小板血漿(PPP)分離MP。用純化試劑盒提取DNA并通過Nanodrop評估DNA濃度和質(zhì)量。圖6描述了使用QF-PCR的滋養(yǎng)層細(xì)胞來源微粒的遺傳圖解。滋養(yǎng)層細(xì)胞在體外生長，饑餓48小時并收集上清液。通過系列離心從上清液分離滋養(yǎng)層細(xì)胞MP。從滋養(yǎng)層細(xì)胞MP提取DNA并使用QF-PCR分析對13、18、21、X和Y染色體進(jìn)行分子分析。圖7描述了通過Rotor-gene PCR評估的胎盤來源微粒中亞甲基四氫葉酸還原酶 (MTHFR)多態(tài)性的遺傳圖解，所述胎盤來源微粒分離自三個不同孕婦的血漿。線1 (藍(lán)色線) 是具有正常MTHFR基因表達(dá)的對照DNA樣品；線2 (黃色線)是具有MTHFR(C677T)突變的 DNA樣品-雜合子；線3 (紫色線)是從1號孕婦的胎盤來源MP獲得的DNA樣品(懷孕21 周)_發(fā)現(xiàn)所述胎兒的MTHFR基因表達(dá)是正常的；線4(蘭綠色線)是從2號孕婦的胎盤來源MP獲得的DNA樣品(懷孕20周)-發(fā)現(xiàn)所述胎兒隱藏MTHFR突變(雜合子)；線5 (黑色線)是從3號孕婦的胎盤來源MP獲得的DNA樣品(懷孕20周)-發(fā)現(xiàn)所述胎兒隱藏MTHFR 突變(純合子)；線6(紅色線)是H2O樣品。圖8是總結(jié)了胎兒基因診斷(如檢測胎兒染色體非整倍性)的流程圖。
具體實施例方式在一些實施方式中，本發(fā)明涉及從母體血液樣品中分離胎盤來源微粒的方法和試劑盒以及它們用于描繪胎兒特征的應(yīng)用。參考附圖和補充的描述將更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個實施方式之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明并非必要地限制在該申請下述描述或由實施例所例舉的詳細(xì)內(nèi)容中。本發(fā)明的能夠進(jìn)行其它實施方式或由多種方式實踐或?qū)崿F(xiàn)。同樣，應(yīng)當(dāng)理解，本文中使用的措辭和術(shù)語是出于描述的目的，不應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是限定。已知合體滋養(yǎng)層細(xì)胞來源微粒(MP)與體外循環(huán)的胎兒核酸相關(guān)[DNA and mRNA, Gupta AK 等，Clinical Chemistry (2004) 50 :2187_2190]。但是，到目前為止，仍不知道胎盤來源微?？赡芤院畏N方式從母體血液中分離，使得微?？梢杂糜谔旱倪z傳評估。如在下文和隨后的實施例部分所顯示的，本發(fā)明人已經(jīng)揭示使用特異結(jié)合滋養(yǎng)層細(xì)胞特異蛋白，NDOGl的抗體可以從母體血液樣品中分離胎盤來源微粒(見實施例4)。 所述胎盤來源微粒然后可以用于從其中提取核酸(見實施例5)和表現(xiàn)胎兒的遺傳特征，所述遺傳特征包括染色體畸變(見實施例6)和遺傳突變(見實施例7)。此外，本發(fā)明人已經(jīng)顯示胎盤來源微粒在懷孕早期(如，從至少妊娠11周，見實施例3)的母體血液中是明顯的，并因此可以用于懷孕早期的胎兒診斷。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種產(chǎn)前分析胎兒的方法，所述方法包括(a) 分離胎盤來源微粒；和(b)分析胎盤來源微粒的內(nèi)含物的至少一種成分，其中所述至少一種成分是胎兒特征的指示。
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本文使用的術(shù)語“產(chǎn)前”指出現(xiàn)懷孕或在孩子出生前存在的任何時期。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)，所述懷孕個體是人類女性。本文中使用的術(shù)語“胎兒”指處于從受精開始直到出生的孕期的任何時期的未出生的孩子，包括胚胎或胎兒。所述分析可以在懷孕的任何時期實現(xiàn)。根據(jù)一種實施方式，所述分析在妊娠的10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 周或之后實現(xiàn)。應(yīng)當(dāng)意識到，婦科學(xué)和產(chǎn)科學(xué)的普通技術(shù)人員完全能夠確定準(zhǔn)確的懷孕周數(shù)。本文使用的術(shù)語胎兒指健康胎兒或患病胎兒(如，患有遺傳病或遺傳突變)。本文使用的短語“胎盤來源微?！敝赴ケP物質(zhì)的非細(xì)胞微粒，所述微粒的直徑是大約IOOnm至大約10 μ M或大約IOOnm至大約1. 5 μ Μ。根據(jù)一種實施方式，所述微粒源自合體滋養(yǎng)層細(xì)胞(見 Rusterholz 等，F(xiàn)etal Diagn Ther. (2007)22(4) :313_7· Epub 2007Mar 15)，或凋亡小體(見 Hasselmann 等，Clin Chem(2001) 47 :1488_1489)。這些微粒通常是作為胎兒胎盤的脫離(如在細(xì)胞活化、補體活性之后)和/或細(xì)胞溶解(如由細(xì)胞凋亡產(chǎn)生)的結(jié)果而形成。為了分析胎兒，首先從母體血液樣品中分離胎盤來源微粒。所述血液樣品可以包括全血、分餾的全血、稀釋的血液樣品、未稀釋的血液樣品、血漿、血清或微粒。本文中使用的術(shù)語“分離”指從血液樣品中物理分離胎盤來源微粒。本領(lǐng)域已知的任何分離方法可以用于分離胎盤來源微粒，所述方法在下文中進(jìn)一步詳細(xì)描述。根據(jù)一種實施方式，實施所述分離以使得含有所述微粒的樣品中不存在完整細(xì)胞。根據(jù)一種實施方式，在分離之前，使用方法以富集血液中的胎盤來源微粒。例如， 可以處理血液以移除血小板和其它細(xì)胞以獲得貧血小板血漿(PPP)。這可以使用如高旋轉(zhuǎn)離心的技術(shù)實現(xiàn)，所述技術(shù)在下面的材料和方法部分詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)意識到，母體微粒(如，血小板來源微粒、內(nèi)皮細(xì)胞來源微粒、白細(xì)胞來源微粒和紅細(xì)胞來源微粒)同樣存在于血液樣品中，因此，應(yīng)當(dāng)使用能夠區(qū)分兩者的試劑分離胎盤來源微粒。這樣的試劑可以包括與在所述胎盤來源微粒的外部膜上表達(dá)的多肽特異結(jié)合的抗體?？蛇x地，所述試劑可以包括小的可滲透劑(如抗體)，所述可滲透劑穿過微粒膜并與在胎盤來源微粒的內(nèi)部表達(dá)的多肽結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑與胎盤來源微粒結(jié)合的親和力是與母體微粒結(jié)合的親和力的至少2. 5倍，更優(yōu)選地至少5倍，更優(yōu)選地至少10 倍。因此，所述抗體可以結(jié)合存在于所述胎盤來源微粒的表面或內(nèi)部的胎盤或滋養(yǎng)層細(xì)胞特異的抗原標(biāo)記物，如Trop-1、Trop-2、NDOGU ND0G2、ND0G5、人絨毛膜促性腺激素 (HCG)、人胎盤催乳激素(hPL)。根據(jù)本發(fā)明的一種具體實施方式
，所述抗體是抗NDOGl抗體(例如，可購自 Serotec，Abeam，GenWay Biotech, Inc.禾口 Lifespan Biosciences)?？梢杂糜谔禺惤Y(jié)合胎盤來源微粒的抗體的例子包括，但不限于抗滋養(yǎng)層細(xì)胞特異抗原抗體，如HLA-G抗體，其針對于部分非經(jīng)典I類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)抗原， 所述抗原特異于絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(Loke, Y. W.等，1997. Tissue Antigens 50 135-146)； 特異于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和/或細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的抗人胎盤堿性磷酸酶(PLAP)抗體 (Leitner, K.等，2001，J. Histochemistry and Cytochemistry, 49 1155-1164)；抗黑色素瘤細(xì)胞粘附分子(MCAM)的 CHLl (CD146)抗體(Higuchi T.，等，2003，Mol. Hum. R印rod. 9 359-366)；抗Iaeverin的CHL2抗體，所述Iaeverin是一種新的蛋白，它屬于膜結(jié)合的谷氨酸鋅化金屬肽酶并在滋養(yǎng)層細(xì)胞上表達(dá)(Fujiwara H.，等，2004，Biochem. Biophys. Res. 313 962-968)；與胎兒細(xì)胞表面上存在的人滋養(yǎng)層細(xì)胞膜糖蛋白相互作用的H315抗體(Covone A E 和 Johnson P Μ, 1986, Hum. Genet. 72 172-173)；特異于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的 FTl. 41. 1 抗體和 103 抗體(Rodeck, C,等，1995. Prenat. Diag. 15 :933_942)；特異于絨毛外細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的ND0G5抗體(Miller D.，等1999，同上)；BCl抗體(Bulmer，J. N.等， Prenat. Diagn. 1995，15 :1143_1153)；分別特異于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞或合體滋養(yǎng)層細(xì)胞的 AB-154 抗體或 AB-340 抗體(Durrani L 等，1994，Prenat. Diagn. 14 131-140)；在孕期的第10周和12周特異于合體滋養(yǎng)層細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(Glut)-12抗體(Gude N M等，2003. Placenta 24:566-570)；抗由絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)的人胎盤催乳激素(hPLH)的 Mab FD0202N(Latham S E，等，Prenat Diagn. 1996 ； 16(9) :813-21)。抗其它蛋白抗體也可以與本發(fā)明一起使用，所述其它蛋白在滋養(yǎng)層細(xì)胞上表達(dá)。 例子包括，但不限于在正常滋養(yǎng)層細(xì)胞表面上表達(dá)的HLA-C(KingA，等，2000，Placenta 21 376-87 ；Hammer Α,等，1997，Am. J. R印rod. Immunol. 37 :161_71)，在絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞上表達(dá)的JunD和Fra2蛋白(API轉(zhuǎn)錄因子的成員)(BambergerAM，等，2004，Mol. Hum. R印rod. 10 223-8)，由nm23-Hl基因編碼并在懷孕初期在絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)的二磷酸核苷酸激酶 A(NDPK-A)蛋白(Okamoto T，等，2002，Arch. Gynecol. Obstet. 266 1-4)， Tapasin (Copeman J，等，2000，Biol. R印rod. 62 :1543_50)，在侵蝕性滋養(yǎng)層細(xì)胞或絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)但不在絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)的CAR蛋白(柯薩奇病毒和腺病毒受體)(Koi H，等，2001，Biol. R印rod. 64 1001-9)，在絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)的人無剛毛盾片類似物(Achaete Scute Homologue)-2 (HASH2)蛋白(Alders M，等，1997，Hum. MoI. Genet. 6 :859_67 ；Guillemot F,等，1995，Nat. Genet. 9 :235_42)，在滋養(yǎng)層細(xì)胞中表達(dá)的人絨毛膜促性腺激素 α (α-HCG) (Schueler PA，等，2001，Placenta 22 :702_15)，胰島素樣生長因子II (IGF-II)，與組織因子途徑抑制劑2 (TFPI-2)相同并由細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)的胎盤蛋白5 (PP5) (Hube F等，Biol Reprod. 2003 ；68 =1888-94)，以及僅由滋養(yǎng)層細(xì)胞系的細(xì)胞表達(dá)的胎盤特異基因(PLAC1、PLAC8 和 PLAC9) (Fant M 等，Mol Reprod Dev. 2002 ；63 430-6 ；Galaviz-Hernandez C 2003,Gene 309 81-9 ；Cocchia M 2000,Genomics 68 305-12)。在試劑與胎盤來源微粒結(jié)合之后，可以使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方法將所述粒子從血液樣品和/或其它微粒中分離，如通過免疫沉淀反應(yīng)、通過磁珠(如 Bioadamt珠)或通過熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)。FACS分析能夠檢測在細(xì)胞或微粒膜上存在的抗原，如ND0G1。簡要地，抗原特異抗體(如抗ND0G1抗體)與熒光團(tuán)連接，并通過細(xì)胞分選儀進(jìn)行檢測，所述細(xì)胞分選儀讀出每個細(xì)胞或微粒在穿過光束時發(fā)出的光的波長。所述方法可以同時使用兩種或更多種抗體。 所述FACS儀同樣能夠分選出與特異抗體特異結(jié)合的細(xì)胞或微粒。多數(shù)的流式細(xì)胞儀可以商業(yè)購得，包括如Becton Dickinson FACScan和 FACScalibur (BD Biosciences, Mountain View, CA)?？梢杂糜?FACS 分析的抗體在
9V. New York :0xford University Press ； 1995]中有說明，并可以廣泛地商業(yè)購得。免疫沉淀反應(yīng)(IP)能夠檢測在細(xì)胞或微粒膜上存在的抗原，如NDOGl。簡要地，所述抗體(如抗NDOGl抗體)可以直接與樣品(如血液樣品、血漿樣品等)相互作用，使用連接至珠子的二抗進(jìn)一步檢測形成的復(fù)合物(如，如果所述抗NDOGl抗體是鼠單克隆抗體，則二抗可以是連接至如瓊脂糖珠或磁珠(如Bioadamt珠)的抗鼠抗體)。然后可以通過離心 (對于瓊脂糖株)將珠子沉淀并使用磁性柱(對于磁珠)或使用洗提液將珠子從所述樣品中分離。根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式，所述分離的微粒群包括至少大約10 %、20 %、30 %、 40%,50%,60%,70%,80%,90%,95%^； 100% 的胎盤來源微粒。為了確定胎兒的特征，分析所述分離的胎盤來源微粒的內(nèi)含物。所述內(nèi)含物的具體成分包括例如胎兒染色體、核酸、多肽、內(nèi)體和外來體。在本文中使用的術(shù)語“分析”指劃分特征、疾病、紊亂或癥狀，確定疾病或綜合征的傾向或疾病或綜合征的嚴(yán)重度，或預(yù)測疾病或綜合征的結(jié)果和/或恢復(fù)前景。術(shù)語“檢測” 同樣可選地包括以上任意一種。本文中使用的術(shù)語“特征”指胎兒的任何獨特的性狀，包括如性別、毛色、膚色、目艮睛顏色或可以通過胎兒遺傳檢測確定的任何其它遺傳性狀。此外，術(shù)語特征也可以指胎兒的父本檢測以確定它的生物學(xué)雙親。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可以實施胎兒分析以確定胎兒是否患有遺傳病或遺傳突變以及有先天缺陷的可能性?？梢杂筛鶕?jù)本發(fā)明的教導(dǎo)分析的先天缺陷包括但不限于神經(jīng)管缺陷、脊柱裂、顎裂、代謝疾病、神經(jīng)管缺陷、鐮狀細(xì)胞性貧血、血友病、地中海貧血病(如，
地中海貧血病)、包括如常見易位(如羅伯遜易位)的染色體異常或畸變、染色體缺失和/或微缺失(如，天使綜合征、迪喬治綜合征)、染色體非整倍體(如，唐氏綜合征)、單基因病(如，囊腫型纖維化、泰-薩二氏病、海綿狀腦白質(zhì)營養(yǎng)不良癥、戈謝病、家族性自主神經(jīng)機能異常、尼曼_匹克氏病、范科尼貧血、共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)管擴(kuò)張、布魯姆綜合征、家族性地中海熱(FMF)、X-連鎖遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良、因子XI、DNA-甲基化相關(guān)的疾病[如， 印記疾病如天使綜合征、帕_魏二氏綜合征、貝_威綜合征、肌陣攣_肌張力障礙綜合征 (MDS)]、以及由下文進(jìn)一步詳細(xì)描述的小染色體畸變引起的疾病(如，小三體鑲嵌性、重復(fù)亞端粒區(qū)、間質(zhì)缺失或重復(fù))。將意識到，本發(fā)明能夠以非侵入方式分析胎兒。但是，本發(fā)明的教導(dǎo)可以與其它產(chǎn)前檢查方法結(jié)合，所述其它產(chǎn)前方法包括羊膜穿刺術(shù)、絨毛膜絨毛取樣、超聲波檢查(如頸部半透明層超聲)、血清標(biāo)志物檢查或遺傳篩選。根據(jù)本發(fā)明分析胎兒特征可以通過確定包含在胎盤來源微粒內(nèi)部的成分的水平 (量)而實現(xiàn)，其中所述水平與特征或疾病的傾向、存在或不存在，疾病分期等相關(guān)。與在從健康胎兒獲得的相似樣品中發(fā)現(xiàn)的那些(即，對照數(shù)據(jù))相比，這些成分的水平可以是上調(diào)或下調(diào)的。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，在一種成分中(如，在一種染色體中)的變化可能是胎兒特征 (如，遺傳病)的指示。因此，染色體異常或畸變可以指染色體數(shù)量異常(如21三體、X單染色體癥)或指染色體結(jié)構(gòu)異常(如缺失、易位等)。
例如，5號染色體短臂的部分缺失是貓叫綜合征的指示；多一條21號染色體(21 三體)是唐氏綜合征的指示；18號染色體三體是愛德華茲綜合征的指示；多15號染色體的遺傳物質(zhì)是具同形雙著絲粒15(也被稱為IDIC(15)、15號染色體倒轉(zhuǎn)復(fù)制、特別標(biāo)記、Irw dup 15、15號染色體部分三體)的指示；4號染色體短臂的部分缺失是沃-赫綜合征的指示；Ilq末端缺失是雅克布遜綜合征的指示；男性胎兒多一條X染色體(XXY)是克萊恩費爾特氏綜合征的指示；女性胎兒多一條X染色體是三X綜合征(XXX)的指示；13號染色體三體是帕陶氏綜合征(也稱為D綜合征或13三體)的指示；缺失性染色體(X取代XX或XY)是特納綜合征的指示；男性胎兒多一條Y染色體是(XXY綜合征)的指示；多出第47條常染色體導(dǎo)致多余的遺傳物質(zhì)(稱為微小額外標(biāo)記染色體(sSMC))可以是貓眼綜合征、Idicl5(如上所述)和帕_克綜合征的指示，所述第47條常染色體來源于24種不同的人染色體中的任何一種根據(jù)另一種實施方式，根據(jù)本發(fā)明分析胎兒特征可以通過分析包含在胎盤來源微粒中的多核苷酸或多肽序列而實現(xiàn)，所述胎盤來源微粒從母體血液樣品中獲得，其中所述序列與特征或疾病的傾向、存在或不存在，疾病分期等相關(guān)。例如，通過對β -葡糖苷酶基因測序或通過分析引起高雪氏病的突變可以在胎兒中診斷高雪氏病，所述突變?nèi)鏘型(N370S純合子)、11型(1或2個等位基因L444P)和III 型(1-2個拷貝的L444P)；通過對11號染色體上的HBB基因測序可以在胎兒中診斷β-地中海貧血；通過對BLM基因中的突變進(jìn)行測序可以在胎兒中診斷布盧姆綜合征(BLM，也被認(rèn)為是Bloom-Torre-Machacek綜合征)；通過對17號染色體的BRCAl基因和13號染色體上的BRCA2基因兩者之一進(jìn)行測序可以在胎兒中診斷乳癌增加的傾向；通過檢測天冬氨酸?；饷溉狈虬被；?缺乏在胎兒中診斷卡納瓦病，也被稱為Canavan-Van Bogaert-Bertrand病；通過分析(在第7號染色體上的)CFTR基因突變可以在胎兒中診斷囊腫性纖維化(也被認(rèn)為是CF)；通過分析GLA基因的突變可以在胎兒中診斷法布瑞病 (也被認(rèn)為是法布瑞氏病、安德森_法布瑞氏病、彌漫性體部血管角皮瘤和α “半乳糖苷酶 A缺乏)；通過分析以下基因的突變可以在胎兒中診斷范可尼貧血FANCA、FANCB, FANCC、 FANCDl、FANCD2、FANCE、FANCF, FANCG, FANCI、FANCJ, FANCL, FANCM 和 FANCN ；通過分析第 9 號染色體上的IKBKAP基因的突變可以在胎兒中診斷家族性植物神經(jīng)功能障礙癥(FD，也被稱為戴_賴二氏綜合征)；通過分析定位在第16號染色體短臂(16pl3)上的MEFV基因的突變可以在胎兒中診斷家族性地中海熱(FMF)；通過分析X染色體的Xq28帶上的突變可以在胎兒中診斷葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏；通過分析以下基因中的突變可以在胎兒中診斷楓糖尿病BCKDHA、BCKDHB, DBT和DLD ；通過分析MCOLNl基因中的突變可以在胎兒中診斷 IV型粘多糖癥(ML IV)；通過分析SMPDl基因中的突變(診斷為A型和B型尼曼-匹克氏病)和NPCl和NPC2中的突變(診斷為C型尼曼-匹克氏病(NPC))可以在胎兒中診斷尼曼-匹克氏??；通過分析第15號染色體上的HEXA基因的遺傳突變可以在胎兒中診斷泰-薩二氏病以及通過分析編碼葉酸依賴酶5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因中C677T 多態(tài)性的T等位基因的純合性，可以在胎兒中診斷神經(jīng)管缺陷?？梢詮奈墨I(xiàn)或通過分析已知是健康胎兒(使用其它診斷技術(shù)，如上文所述的那些確定)的胎盤微粒獲得對照數(shù)據(jù)，因此，根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，實現(xiàn)分析胎盤來源微粒的內(nèi)含物首先需要從微粒中分離所述內(nèi)含物。分離DNA或RNA的方法是本領(lǐng)域已知的，如在下文所描述的那些。例如，通過包括以下方法實現(xiàn)DNA純化細(xì)胞溶解、蛋白提取、使用2-3倍體積的100%乙醇沉淀DNA、用70%乙醇清洗、粒化、干燥并在水或其它任何合適溶液(如 Tris-EDTA)中懸浮。優(yōu)選地，之后進(jìn)行一種方法以確定DNA濃度，如通過測量樣品在260nm 處的光學(xué)密度(OD)(其中1單位OD = 50 μ g/mlDNA)?？蛇x地，可以通過加入蛋白消化酶 (如，蛋白酶K)，然后變性(如在95°C時加熱5-10分鐘)以獲得DNA?？梢酝ㄟ^例如使用TRI試劑、TRIzol或Trisure (可購自如Sigma-Aldrich, Invitrogen或Bioline)的苯酚-氯仿提取法純化RNA。同樣可以純化短RNA(少于200個核苷酸)種類(如siRNA、miRNA和tRNA)以用于胎兒分析。將意識到，本發(fā)明教導(dǎo)預(yù)期純化和分析成片段的核酸序列或完整的核酸序列?？梢允褂梅蛛x的多核苷酸(如，多核苷酸探針、寡核苷酸探針/引物)來確定具體核酸序列的存在和/或水平，所述多核苷酸能與胎兒核酸序列或其一部分雜交。這樣的多核苷酸可以是任何大小，如短多核苷酸(如15-200個堿基)和中間的多核苷酸(如 200-2000個堿基)或大于2000個堿基的長多核苷酸。本發(fā)明使用的分離的多核苷酸探針可以是特異于本發(fā)明胎兒轉(zhuǎn)錄本的任何直接或間接標(biāo)記的RNA分子(如，RNA寡核苷酸，一種體外轉(zhuǎn)錄的RNA分子)、DNA分子(如，寡核苷酸、cDNA分子、基因組分子)和/或它們的類似物(如肽核酸(PNA))。術(shù)語“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的單鏈或雙鏈寡聚物或多聚物或其類似物。該術(shù)語包括由天然存在的堿基、糖和核苷內(nèi)共價連接鍵(如，骨架) 組成的寡核苷酸，以及具有非天然存在部分的寡核苷酸，所述非天然存在部分與各自天然存在部分的功能相似。根據(jù)本發(fā)明教導(dǎo)設(shè)計的寡核苷酸可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的任何寡核苷酸合成方法(如酶催化合成法或固相合成法)產(chǎn)生。用于完成固相合成法的儀器和試劑可購自如 Applied Biosystems0同樣可以使用用于這種合成的任何其它方法；本領(lǐng)域技術(shù)人員完全能夠?qū)崿F(xiàn)寡核苷酸的實際合成，并且使用固相化學(xué)如氰乙基亞磷酰胺，接著脫保護(hù)、脫鹽和通過如自動的trityl-on方法或HPLC的純化，通過以下具體描述的確定方法學(xué)完成 "Molecular Cloning :A laboratory Manual" Sambrook (1989) ；"Current Protocols in Molecular Biology" ^ I-III Ausubel, R. Μ. , ed. (1994) ；Ausubel ^,"Current Protocols in Molecular Biology，，，John Wiley 禾口 Sons, Baltimore, Maryland(1989)； Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning，，, John Wiley&Sons,New York(1988) 以及 “Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J. , ed. (1984)。本發(fā)明的寡核苷酸有至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少22個、至少25個、至少30個或至少40個堿基與上文描述的序列變化特異雜交。本發(fā)明使用的分離的多核苷酸可以使用標(biāo)簽或標(biāo)記分子直接或間接地標(biāo)記。這樣的標(biāo)記可以是如熒光素分子(如熒光素或德克薩斯紅)、放射性分子(如32P- Y -ATP或 32P- α -ATP)和顯色底物(如堅固紅、BCIP/INT，購自(ABCAM，劍橋，MA)。直接標(biāo)記可以通過將標(biāo)記分子與多核苷酸共價連接(如，使用固相合成)或通過聚合合并(如，使用體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或隨機引物標(biāo)記)而完成。間接標(biāo)記可以通過將多核苷酸與非標(biāo)記的標(biāo)簽分子(如異羥基洋地黃毒甙元或生物素)共價連接或合并，隨后將所述多核苷酸與標(biāo)記的分子(如抗異羥基洋地黃毒甙元抗體或鏈霉親和素)作用而完成，所述標(biāo)記的分子能夠特異識別非標(biāo)記的標(biāo)簽。上述的多核苷酸可以用在多種RNA檢測方法中，如RNA印跡分析、反轉(zhuǎn)錄 PCR(RT-PCR)(如，使用如 Light Cycler (Roche)的半定量 RT-PCR、定量 RT-PCR)、 RNA 原位雜交(RNA-ISH)、原位 RT-PCR 染色(如在 Nuovo GJ,等 1993，Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA. Am J Surg Pathol. 17 :683_90，禾口 Komminoth P，等.1994，Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ RT-PCR. Pathol Res Pract.，190 :1017-25 中所描述的)，和寡核苷酸微陣列分析(如，使用Affymetrix微陣列(Affymetrix Santa Clara, CA))。對于檢測基因擴(kuò)增，本發(fā)明可以使用多種DNA檢測方法，如DNA印跡分析、PCR、定量PCR、實時PCR、QS-PCR和限制性片段長度多態(tài)性(RELP)。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，使用多種適于鑒定序列變化的方法同樣可以在胎盤來源微粒中鑒定單核苷酸多態(tài)性(SNP)。一種選擇是確定PCR反應(yīng)產(chǎn)物的全部基因序列?？蛇x地，可以在幾個其它水平上描述給出的核酸片段。在最低分辨率中，可以通過與已知的標(biāo)準(zhǔn)物在同一塊凝膠上進(jìn)行電泳比較以確定所述分子的大小。在電泳之前用限制性酶組合物進(jìn)行分解以構(gòu)建規(guī)整的圖譜，從而獲得所述分子的更詳細(xì)的圖片。通過與標(biāo)記的探針雜交可以檢測所述片段內(nèi)特異序列的存在，或者通過部分化學(xué)降解或存在鏈末端核苷類似物時通過引物延伸以確定精確的核苷酸序列。使用涉及寡核苷酸應(yīng)用的方法代表性地確定胎兒基因中序列變化(如SNP)的存在，所述寡核苷酸與如上文所述的那些胎兒基因中的核酸序列變化特異雜交。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，可以使用任何已知的SNP檢測方法，如限制性片段長度多態(tài)性(RELP)、測序分析、微量測序分析、固相微量測序、MALDI-T0F質(zhì)譜法、基于聚合酶和連接酶的錯配檢測分析、LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、Gap LCR(GLCR)、連接酶/聚合酶介導(dǎo)的遺傳分析 、雜交分析方法、與寡核苷酸陣列雜交、等位基因特異的寡核苷酸(ASO)、變性/溫度梯度凝膠電泳(DGGE/TGGE)、溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、雙脫氧指紋法(ddF)、焦磷酸測序 分析、Acycloprime 分析和反向斑點印跡技術(shù)。此外，整合的系統(tǒng) (如多成分整合的系統(tǒng))和微流體系統(tǒng)可以用于分析序列變化。美國專利號5，451，503提供幾個能夠用于檢測模板DNA或RNA中SNP的寡核苷酸結(jié)構(gòu)的例子。如上所述，同樣可以通過測量胎盤來源微粒中多肽的水平來實現(xiàn)胎兒特征的分析。因此，一旦分離了胎盤來源微粒，使用本領(lǐng)域公知的方法(如，細(xì)胞溶解技術(shù))提取多肽，使用例如特異抗體通過免疫復(fù)合物(即，在胎盤來源微粒中存在的胎兒氨基酸序列和所述抗體之間形成的復(fù)合物)的形成確定具體多肽的存在和/或水平。本發(fā)明的免疫復(fù)合物可以在多種溫度、鹽濃度和pH值下形成，且本領(lǐng)域技術(shù)人員
13能夠調(diào)整適于每一種免疫復(fù)合物形成的條件。在本發(fā)明中使用的術(shù)語“抗體”包括完整分子以及它們的功能性片段，如Fab、 F(ab' )2、Fv或抗一種抗原表位的單域分子如VH和VL。這些功能性抗體片段定義如下 (l)Fab，包含抗體分子的單價抗原結(jié)合片段的片段，可以由用木瓜蛋白酶消化完整抗體以形成完整的輕鏈和部分重鏈而產(chǎn)生；(2)Fab’，抗體分子的片段，通過用胃蛋白酶處理完整抗體，然后還原，以產(chǎn)生完整輕鏈和部分重鏈而獲得；每個抗體分子可以獲得兩個Fab’片段；(3) (Fab’)2，抗體的片段，通過用胃蛋白酶處理完整抗體但沒有后續(xù)的還原步驟而獲得；F(ab' )2是兩個Fab’片段通過兩個二硫鍵連接的二聚物；(4)Fv，被定義為表達(dá)成兩條鏈的包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程片段；(5)單鏈抗體(“SCA”)，包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的基因工程分子，通過合適的多肽連接物連接成基因融合的單鏈分子；和 (6)由單一 VH或多個VL域組成的單域抗體，其表現(xiàn)出對抗原充分的親和力。生產(chǎn)多克隆和單克隆抗體以及其片段的方法是本領(lǐng)域公知的(見，例如，Harlow 禾口Lane，Antibodies :A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory,New York， 1988，通過引用的方式結(jié)合至本文)。根據(jù)本發(fā)明該方面所述的方法，免疫復(fù)合物的檢測是胎盤來源微粒中存在多肽的指示。這樣的多肽的存在可能是胎兒特征或遺傳突變的暗示，可選地，缺少這樣的多肽可能暗示胎兒特征或遺傳突變?？梢允褂枚喾N方法檢測本發(fā)明的免疫復(fù)合物的形成，且本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定哪種方法適于分析(在下文中詳細(xì)描述)。可以使用本領(lǐng)域已知的方法標(biāo)記本發(fā)明的免疫復(fù)合物中使用的抗體。將意識到， 所述標(biāo)記的抗體可以是一抗(與特異多肽結(jié)合)或與一抗結(jié)合的二抗(如，標(biāo)記的山羊抗兔抗體、標(biāo)記的鼠抗人抗體)。所述抗體可直接與標(biāo)記物連接，或可以與酶連接。本發(fā)明的抗體可以是熒光素標(biāo)記的(使用與抗體連接的熒光素染料)、放射性標(biāo)記的(使用如125I放射性標(biāo)記的抗體)，或與酶(如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)連接并與顯色底物一起使用以產(chǎn)生比色反應(yīng)。本發(fā)明的酶連接的抗體使用的顯色底物包括，但不限于用于堿性磷酸酶的AEC、堅固紅、ELF-97底物[2_(5'-氯_2_磷?；u苯基)-6-氯-4 (3H)-喹唑啉酮]、對硝基苯基磷酸酯(PNPP)、酚酞二磷酸、和ELF 39-磷酸酯、BCIP/INT、Vector 紅(VR)、鮭魚和洋紅磷酸鹽(Avivi C 等，1994，J Histochem. Cytochem. 1994 ；42 :551_4)，和用于過氧化物酶的Nova紅、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、Vector (R) SG底物、基于發(fā)光氯的化學(xué)發(fā)光底物。這些酶底物可購自Sigma (St Louis，M0，美國)、 Molecular Probes Inc. (Eugene, OR,美國)、Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA, 美國)、Zymed Laboratories Inc. (San Francisco，CA，美國)、Dako Cytomation (丹麥)?？梢允褂脽晒饧せ畹募?xì)胞分選(FACS)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、蛋白質(zhì)印記和放射免疫測定(RIA)分析、免疫沉淀(IP)或基于分子量的方法檢測免疫復(fù)合物。本發(fā)明也可以被用于在蛋白水平分析序列變化。簡要地，從胎盤來源微粒中提取蛋白(如上文所述)并檢測所述蛋白具體多晶型的存在。雖然色譜法和電泳法是用于檢測分子量大的變化(如檢測由序列變化產(chǎn)生的截短的蛋白)的優(yōu)選方法，但是使用特異于序列變化的抗體而實現(xiàn)的免疫檢測方法如ELISA和蛋白質(zhì)印記分析、免疫組織化學(xué)法等優(yōu)選用于檢測點突變和分子量的微妙變化。如所提到的，可以對分離自胎盤來源微粒的遺傳物質(zhì)進(jìn)行胎兒染色體畸變的分析。因此，本發(fā)明的教導(dǎo)可以用于檢測染色體異常，如染色體非整倍體(即，完全的和/或部分的三體和/或單體)，以及染色體易位、亞端粒重排、缺失、微缺失、倒位和/或重復(fù)(即， 完全的和/或部分的染色體重復(fù))。根據(jù)一種具體實施方式
，所述染色體包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、X或Y染色體，或其部分序列?？梢匀缟衔拿枋龅貜奶ケP來源微粒分離染色體，所述染色體可以包括成片段的染色體或完整的染色體?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的方法分析胎兒染色體，例如，通過熒光素原位雜交(FISH)、弓丨物原位標(biāo)記(PRINS)、定量FISH(Q-FISH)、多色帶(MCB)、染色體染料如地衣紅或單熒光素染料(如之前在美國專利號5418169中所描述的)、QF-PCR (如使用購自Elucigene的QST*R plus試劑盒)和/或PCR(如實時PCR)。根據(jù)本發(fā)明的一種具體實施方式
，本發(fā)明方法可以用于使用特異于所述突變的引物或探針(如特異于缺失的FISH探針)檢測具體基因突變。因此，本發(fā)明教導(dǎo)可以用于檢測染色體三體?？梢酝ㄟ^本發(fā)明檢測的染色體三體的例子包括但不限于21三體(使用如LSI 21q22橙色標(biāo)記的探針(Abbott目錄號5J13-02))，18三體(使用如CEP 18綠色標(biāo)記的探針(Abbott目錄號5J10-18)、CEP. RTM. 18(D18Z1, α -衛(wèi)星)Spectrum Orange TM 探針(Abbott 目錄號 5J08-18))，16 三體(使用如 CEP16 探針(Abbott 目錄號 6J37-17))，13 三體(使用如 LSI. RTM 13SpectrumGreen. TM探針(Abbott目錄號5J14-18))和可以使用如CEP X綠色和Y橙色探針(Abbott目錄號 5J10-51)和 / 或 CEP. RTM. X SpectrumGreen. TM. /CEP. RTM. Y ( μ 衛(wèi)星)SpectrumOrange. TM 探針(Abbott目錄號5J10-51)檢測的XXY、XYY或XXX三體。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)可以在胎盤來源微粒中檢測多種其它三體和部分三體。這些包括，但不限于部分三體 lq32-44(Kimya Y 等，Prenat Diagn. 2002，22 :957_61)，9p 三體和 IOp 三體(Hengstschlager M 等，F(xiàn)etal Diagn Ther. 2002,17 :243_6)，三體 4 嵌合性(Zaslav A L 等，Am J Med Genet. 2000，95 :381_4)，三體 17p (De Pater J M 等， Genet Couns. 2000，11 :241_7)，部分三體 4q26_qter (Petek E 等，Prenat Diagn. 2000， 20 349-52)，9 三體(Van den Berg C 等，Prenat. Diagn. 1997，17 933-40)，部分 2p 三體 (Siffroi J P 等，Prenat Diagn. 1994，14 1097-9)，部分三體 Iq (DuPont B R 等，Am J Med Genet. 1994,50 21~7)和 / 或部分三體 6p/單體性 6q(Wauters J G 等，Clin Genet. 1993， 44 262-9)。本發(fā)明的教導(dǎo)可以用于檢測幾種染色體單體性，如X單體、21單體、22單體(使用如 LSI 22 (BCR)探針(Abbott,目錄號 5J17-24))、16 單體(使用如 CEP 16 (D16Z3) Abbott, 目錄號6J36-17)和15單體(使用如CEP 15(D15Z4)探針(Abbott,目錄號6J36-15))。本發(fā)明同樣可以用于檢測當(dāng)父母一方已知攜帶有某種異常時的染色體異常。本發(fā)明同樣可以用于檢測在攜帶的親本中無癥狀而能夠引起后代重大遺傳病的染色體異常 (如易位和微缺失)。這些包括，但不限于微小額外標(biāo)記染色體(SMC)的鑲嵌(Giardino D 等，Am J Med Genet. 2002, 111 319-23), t(ll ；14) (pl5 ；pl3)易位(Benzacken B 等，Prenat Diagn. 2001,21 :96_8)，不平衡易位 t(8 ;11) (ρ23· 2 ；ρ15· 5) (Fert-Ferrer S 等，Prenat Diagn. 2000，20 :511_5)，llq23 微缺失(Matsubara K, Yura K. RinshoKetsueki. 2004,45 :61_5)，史密斯-馬吉利癥候群 17pll. 2 缺失(Potocki L 等，Genet Med. 2003，5 :430_4)，22ql3. 3 缺失(Chen C P 等，Prenat Diagn. 2003，23 504-8)，Χρ22· 3 微缺失(Enright F 等，Pediatr Dermatol. 2003，20 153-7)，10ρ14 缺失(Bartsch 0，等， Am J Med Genet. 2003，117A 1-5)，20p 微缺失(Laufer-Cahana A, Am J Med Genet. 2002， 112 190-3.)，迪喬治綜合征(del (22) (qll. 2ql 1. 23))，威廉斯綜合征(7ql 1. 23 和 7q36 缺失，Wouters C H，等，Am J Med Genet. 2001，102 :261_5·)，1ρ36 缺失(Zenker M，等，Clin Dysmorphol. 2002，11 :43-8)，2p 微缺失(Dee S L 等，J Med Genet. 2001，38 :E32)，1 型神經(jīng)纖維瘤(17qll.2 微缺失，Jenne D E，等，Am J Hum Genet. 2001，69 :516_27)，Yq 缺失 (Toth A，等，Prenat Diagn. 2001,21 :253_5)，沃-赫綜合征(WHS，4ρ16· 3 微缺失，Rauch A 等，Am J Med Genet. 2001,99 :338_42)，1ρ36· 2微缺失(Finelli P,Am J Med Genet. 2001， 99 :308-13)，llql4 缺失(Coupry I 等，J Med Genet. 2001，38 :35_8)，19ql3. 2 微缺失 (Tentler D 等，J Med Genet. 2000，37 128-31)，Rubinstein-Taybi 綜合征(16ρ13· 3 微缺失，Blough R I，等，Am J Med Genet. 2000,90 29-34)，7p21 微缺失(Johnson D等，Am J Hum Genet. 1998,63 1282-93)，Miller-Dieker 綜合征(17ρ13· 3)，17ρ11· 2缺失(Juyal R C等， Am J Hum Genet. 1996,58 :998_1007)，2q37微缺失(Wilson L C等，Am J Hum Genet. 1995， 56 400-7)。本發(fā)明同樣可以用于檢測倒位(如反向染色體X(L印retre，F(xiàn).等，Cytogenet. Genome Res. 2003. 101 124-129 ；Xu, W.等，Am. J. Med. Genet. 2003. 120A :434_436)，反向染色體 10 (Helszer, Z.，等，2003. J. Appl. Genet. 44 :225_229))，隱藏的亞端粒區(qū)染色體重排(Engels，H.，等，2003. Eur. J. Hum. Genet. 11 :643_651 ；Bocian, E.，等，2004. Med. Sci. Monit. 10 :CR143-CR151)和 / 或重復(fù)(Soler, A.，等，Prenat. Diagn. 2003. 23 :319_322))。上文描述的本發(fā)明的試劑可以優(yōu)選地與合適的使用說明和表明FDA批準(zhǔn)用于胎兒的產(chǎn)前檢查的標(biāo)簽一起包括在診斷試劑盒中。因此，所述試劑盒可以包括能夠特異結(jié)合胎盤來源微粒的第一種試劑(如，抗體，如抗ND0G1抗體)和用于分析所述胎盤來源微粒的內(nèi)含物的至少一種成分(如，多核苷酸、染色體或多肽)的另一種試劑(如寡核苷酸、探針、 染料或抗體)?？蛇x地，所述試劑盒還可以包括用于從胎盤來源微粒中分離核酸或多肽的其它試劑。所述試劑盒還可以包括合適的緩沖液和用于提高試劑盒保存期的防腐劑。本文使用的術(shù)語“大約”表示士 10%。術(shù)語“包括”、“包含”、“含有”、“具有”及其變化形式表示“包括但不限于”。術(shù)語“由……組成”表示“包括但不限于”。術(shù)語“基本由……組成”表示所述組合物、方法或結(jié)構(gòu)可能包括其它成分、步驟和/ 或部分，但這僅限于其它成分、步驟和/或部分沒有實質(zhì)上改變要求保護(hù)的組合物、方法或結(jié)構(gòu)的基本的和新的特征。如在本文中所使用的，除非上下文有清楚的說明，單數(shù)形式的“一個”、“一種”和 “所述，，包括復(fù)數(shù)形式。例如，術(shù)語“ 一種化合物，，或“至少一種化合物，，可以包括多數(shù)化合物，包括它們的混合物。貫穿本申請，本發(fā)明的多種實施方式可以以范圍的形式表述。應(yīng)當(dāng)理解，以范圍形式的描述僅是為了方便和簡潔，不應(yīng)當(dāng)被解釋為對本發(fā)明范圍的機械限定。因此，范圍的描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是具有具體公開的所有可能的子范圍以及范圍內(nèi)的個別數(shù)值。例如，從1至6的范圍描述應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是具有具體公開的子范圍，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3 至6等等，以及所述范圍內(nèi)的個別數(shù)值，如1、2、3、4、5和6。這個應(yīng)用不考慮所述范圍的寬度。當(dāng)本文中顯示數(shù)字范圍時，它意味著包括所述顯示范圍內(nèi)的任何引用的數(shù)字(分?jǐn)?shù)或整數(shù))。短語在第一個顯示數(shù)字和第二個顯示數(shù)字“之間的范圍”和從第一個顯示數(shù)字 “至”第二個顯示數(shù)字的“范圍”在本文可互換使用，意思是包括第一個和第二個顯示的數(shù)字和它們之間所有的分?jǐn)?shù)和整數(shù)。本文使用的術(shù)語“方法”指用于完成給定任務(wù)的方式、手段、技術(shù)和程序，包括但不限于化學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的那些方式、手段、技術(shù)和程序或從已知的方式、手段、技術(shù)和程序容易地開發(fā)的那些方式、手段、技術(shù)和程序。應(yīng)當(dāng)意識到，出于清楚目的在分開的實施方式中描述的本發(fā)明一些特征可以在單一實施方式中組合提供。相反地，出于簡潔目的在單一實施方式中描述的本發(fā)明不同實施方式也可以單獨地或以任何合適的子組合或適于本發(fā)明任何其它已描述的實施方式的形式提供。在不同實施方式中描述的一些特征不能被認(rèn)為是那些實施方式的必要特征，除非沒有那些元素時所述實施方式?jīng)]有效力。下面的實施例為上文所描述的以及下面權(quán)利要求部分所要求保護(hù)的本發(fā)明的多個實施方式和方面提供實驗支持。實施例現(xiàn)在參考下述實施例，所述實施例與上面的描述共同以無限制的方式闡述本發(fā)明。一般地，本文使用的術(shù)語和本發(fā)明使用的實驗方法包括分子、生物化學(xué)、微生物和重組DNA技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中徹底解釋。見，如“Molecular Cloning =A laboratory Manual" Sambrook φ, (1989) ；"Current Protocols in Molecular Biology" ^ I-III Ausubel, R. Μ. , ed. (1994) ；Ausubel 等，“Current Protocols in Molecular Biology，，， John Wiley 禾口 Sons, Baltimore, Maryland(1989) ；Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning，，，John Wiley & Sons, New York (1988) ；Watson 等，"Recombinant DNA", Scientific American Books, New York ；Birren 等.(eds) "Genome Analysis A Laboratory Manual Series，，，卷 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998)；在美國專利號 4，666，828,4, 683，202,4, 801，531,5, 192，659 和 5，272，057 中所列出的方法；“Cell Biology :A Laboratory Handbook”，卷 I-III Cellis, J. Ε., ed. (1994) ；"Current Protocols in Immunology”卷 I—III Coligan J. Ε. , ed. (1994)； Stites 等(eds), "Basic and Clinical Immunology"(第 8 版)，Appleton & Lange, Norwalk, CT(1994) ；Mishell 禾口 Shiigi(eds)，"Selected Methods in Cellular Immunology”，W. H. Freeman和Co.，New York(1980)；在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中廣泛描述的可利用的免疫測定，見，如美國專利號3，791,932 ；3, 839, 153,3,850, 752,3,850, 578、 3，853，987,3，867，517,3，879，262,3，901，654,3，935，074,3，984，533,3，996，345, 4，034，074,4, 098，876,4, 879，219,5, 011，771 禾口 5，281，521 !"Oligonucleotide Synthesis”Gait，Μ. J.，ed. (1984) ；"Nucleic Acid Hybridization”Hames，B. D.，禾口 Higgins S. J. , eds. (1985) ；"Transcription and Translation，，Hames, B. D.,禾口 HigginsS. J. , Eds. (1984) ；"Animal Cell Culture"Freshney, R. L, ed. (1986) ；"Immobilized Cells and Enzymes，，IRL Press, (1986) ；"A Practical Guide to Molecular Cloning，，Perbal，B. ， (1984)禾口 "Methods in Enzymology，，卷 1—317，Academic Press ； "PCR Protocols :A Guide To Methods And Applications，，，Academic Press, San Diego, CA (1990) ；Marshak^,“Strategies for Protein Purification and Characterization-Α Laboratory Course Manual ”CSHL Press (1996)；全部通過引用的方式結(jié)合至本文，一如在本文中完全闡述。其它常規(guī)參考文獻(xiàn)貫穿該文件提供。那其中的方法被認(rèn)為是本領(lǐng)域公知的并出于方便性提供給讀者。其中所包含的信息都通過引用的方式結(jié)合至本文。常規(guī)材料和方法血液收集和準(zhǔn)備從孕婦收集血液樣品(20ml)并放置在含有檸檬酸鈉(1 10)的血液收集管中。 將所述管子在1500Xg下離心15分鐘，兩次，以獲得貧血小板血漿(PPP)。人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(HVT)表征使用鼠抗人滋養(yǎng)層細(xì)胞膜ND0G1 (其代表胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞(Serotec，NC，美國))抗體標(biāo)記人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(HVT)。室溫下孵育樣品30分鐘，清洗，用二抗(PE抗鼠抗體， Jackson ImmunoResearch Europe)標(biāo)記30分鐘并再次清洗。通過FACS分析樣品。胎盤微粒(MP)表征從懷孕25周的孕婦獲得血液樣品。通過離心從血漿分離血細(xì)胞。為特異標(biāo)記所述胎盤微粒(滋養(yǎng)層細(xì)胞微粒)，通過在室溫孵育30分鐘用 ND0G1-PE或PE鼠IgG同種型對照(Serotec，NC，美國)標(biāo)記PPP。通過熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)分析標(biāo)記的MP。使用標(biāo)準(zhǔn)的0.75 μ m珠(BD Biosciences)校準(zhǔn)MP尺寸。胎盤微粒的分離通過高速離心從PPP (大約IOml樣品)分離總微粒(MP)。然后，通過免疫沉淀從總MP小球中分離胎盤特異MP。首先，用抗ND0G1抗體標(biāo)記MP，然后用抗鼠磁珠(Bioadamt 珠)分離ND0G1-MP復(fù)合物。所述胎盤MP球然后用于DNA、miRNA或mRNA純化。MP核酸提取 根據(jù)使用者指南使用DNA純化試劑盒(EPICENTER)分離DNA。通過Nanodrop定性和定量DNA。體外滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)和/MP分離從懷孕20-24周的孕婦中獲得的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(HVT)購自 ScienCelKCarlsbad, CA，美國)。在改良的培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)細(xì)胞，所述培養(yǎng)基中包含 50%的含有補充物的滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基(由ScienCell提供)、22%的DMEM、22%的F12、 4%的胎牛血清(FCS)、1%的抗生素(10，000單位/ml的青霉素、10mg/ml的鏈霉素、250單位/ml的制霉菌素)、0. 0001%的兩性霉素B、3. 5U/ml的肝磷脂。細(xì)胞放置在Nonclone培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，在37°C、5% CO2下孵育，并在4-15代用于實驗。為獲取微粒，使細(xì)胞饑餓48小時(所述細(xì)胞在不含有血清的M-199培養(yǎng)基中生長)并收集細(xì)胞上清液。通過系列離心從上清液分離胎盤MP。通過DNA純化試劑盒 (EPICENTER)從胎盤 MP 提取 DNA。分子QF-PCR分析
使用QST*R plus試劑盒(Elucigene)進(jìn)行分子分析，這是一種基于熒光素的高多重DNA測定。該測定包含用于13、18、21、X和Y染色體的標(biāo)記物并同時在單一管子中檢測最常見的常染色體三體性和性染色體非整倍體。分子基因表達(dá)-PCR分析檢測編碼葉酸依賴酶5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的基因中C677T多態(tài)性的T等位基因純合性。該突變是神經(jīng)管缺陷的已知風(fēng)險因素(如之前在BMJ 2004 ；328 1535-1536中所描述的)。通過實時PCR(Rotore-gene)檢測從20周孕婦的胎盤MP獲得的DNA中MTHFR基因上的677C—> T突變。實施例1抗體NDOGl特異結(jié)合滋養(yǎng)層細(xì)胞為了證明NDOGl與滋養(yǎng)層細(xì)胞的特異性，從24周孕婦獲得血液樣品并使用抗 NDOGl-PE特異標(biāo)記存在于樣品中的胎盤的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞(HVT)。如在圖IA-B中所顯示的，大約90 %的HVT表達(dá)NDOGl抗原。實施例2孕婦中NDOGl特異微粒的檢測用抗NDOGl分別標(biāo)記從未懷孕的女性(NP)、健康的孕婦和患有妊娠血管并發(fā)癥 (GVC)的女性的貧血小板血漿中分離的微粒，并通過FACS評估。如在圖2中所例示的，與未懷孕組的女性相比，兩組懷孕組均具有可檢測水平的胎盤MP (ρ < 0. 0038)。實施例3胎盤MP水平在懷孕早期的提高從未懷孕女性(NP)和孕期不同周(懷孕11、13、15和19周)的健康孕婦的貧血小板血漿分離MP。如在圖3中所例示的，隨著懷孕進(jìn)行，在健康孕婦的樣品中顯現(xiàn)更多的胎盤來源MP。實施例4從總MP有效分離胎盤MP使用NDOGl標(biāo)記和免疫沉淀反應(yīng)(如在上文進(jìn)一步詳細(xì)描述的)從總MP有效分離15周孕婦的胎盤MP。如在圖4A-D中所例示的，在分離之前，總MP包括胎盤特異MP (用抗NDOGl標(biāo)記，圖4A)和母體MP (用抗血小板標(biāo)記物⑶41標(biāo)記，圖4B)，但是分離胎盤MP之后，所述MP樣品僅由胎盤MP組成(圖4C)，并沒有MP由母體血小板標(biāo)記物抗⑶-41標(biāo)記 (圖 4D)。實施例5測定微粒來源DNA濃度和質(zhì)量從懷孕19周的女性的貧血小板血漿(PPP)分離胎盤MP(如上文詳細(xì)說明的)。然后，使用純化試劑盒(EPICENTER)提取DNA并評估濃度和質(zhì)量。如圖5中所例示的，從(來自于大約6ml PPP的)微粒中獲得大約24ng/ μ 1 DNA。實施例6使用QF-PCR的滋養(yǎng)層細(xì)胞來源微粒的遺傳圖解從體外生長的滋養(yǎng)層細(xì)胞的上清液分離滋養(yǎng)層細(xì)胞微粒(如在上文詳細(xì)說明的)。從滋養(yǎng)層細(xì)胞提取DNA并進(jìn)行遺傳圖解。如在圖6中所例示的，檢測13、18、21、X和 Y染色體。實施例7從孕婦的貧血小板血漿(PPP)分離胎盤來源微粒。從胎盤MP提取DNA并對5， 10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)多態(tài)性進(jìn)行遺傳圖解。如在圖7中所例示的，檢測 MTHFR突變(在2號女性的胎盤MP中是雜合子，在3號女性的胎盤MP中是純合子)以及 MTHFR正常基因表達(dá)(在1號女性的胎盤MP中)。綜合考慮，該結(jié)果證明了胎盤MP可以特異地分離自母體血液，分離自MP的DNA具有良好的質(zhì)量和數(shù)量且可以進(jìn)一步用于遺傳評估，如通過PCR (對本發(fā)明的概要見圖8)。盡管已經(jīng)結(jié)合具體實施方式
描述了本發(fā)明，顯然地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行許多選擇、修飾和變化。因此，將包含落入所附權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)的所有這樣的選擇、 修飾和變化。在本說明書中提及的所有公開物、專利和專利申請通過引用的方式全文結(jié)合至本文，如同每一個單獨的公開物、專利或?qū)＠暾執(zhí)禺惖厍覇为毜赝ㄟ^引用的方式結(jié)合至本文。此外，在該說明書中的任何參考文獻(xiàn)的引用或鑒定不應(yīng)當(dāng)被解釋為承認(rèn)該參考文獻(xiàn)可作為本發(fā)明現(xiàn)有技術(shù)。在使用段落標(biāo)題方面，它們不應(yīng)當(dāng)被解釋為必要限定。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)前分析胎兒的方法，所述方法包括(a)分離胎盤來源微粒；和(b)分析所述胎盤來源微粒的內(nèi)含物的至少一種成分，其中所述至少一種成分是胎兒特征的指示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括在步驟(a)之后和步驟(b)之前從所述胎盤來源微粒中分離所述成分。
3.一種從懷孕個體獲得的血液樣品中分離胎盤來源微粒的方法，所述方法包括(a)在使得至少一種試劑與胎盤來源微粒結(jié)合的條件下，用至少一種試劑接觸所述血液樣品，其中所述至少一種試劑與胎盤來源微粒特異結(jié)合而不與母體微粒結(jié)合；和(b)分離所述胎盤來源微粒，從而從血液樣品中分離胎盤來源微粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述分離不通過FACS實現(xiàn)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述分離通過免疫沉淀實現(xiàn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，進(jìn)一步包括在所述接觸之前，離心所述血液樣品以獲得貧血小板血漿(PPP)。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述試劑包括抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述抗體與所述胎盤來源微粒的膜多肽纟口口。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述抗體包括抗NDOGl抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述試劑與選自人絨毛膜促性腺激素 (HCG)、人胎盤催乳激素(hPL)、ND0G1、ND0G2、ND0G5、Trop-I 和 Trop-2 的多肽結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法實現(xiàn)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一種成分包括核酸。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少一種成分包括多肽。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征是胎兒疾病。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述胎兒疾病包括胎兒染色體畸變。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述染色體畸變包括非整倍體。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述胎兒疾病包括胎兒遺傳突變。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述遺傳突變包括5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因的多態(tài)性。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征是胎兒性別。
20.一種分離的微粒群，包括至少80%的胎盤來源微粒，所述胎盤來源微粒根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法獲得。
21.一種用于產(chǎn)前分析胎兒的試劑盒，所述試劑盒包括一種包裹材料和使用說明書，其中所述包裹材料包裹能夠特異結(jié)合胎盤來源微粒的第一種試劑和用于分析所述胎盤來源微粒的內(nèi)含物的至少一種成分的第二種試劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于，所述胎盤來源微粒在從懷孕個體獲得的血液樣品中。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于，所述第一種試劑包括抗體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體包括抗NDOGl抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于，所述至少一種成分選自核酸和多肽。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，進(jìn)一步包括至少一種用于從所述胎盤來源微粒分離核酸的試劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，進(jìn)一步包括至少一種用于從所述胎盤來源微粒分離多肽的試劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于，所述第二種試劑選自寡核苷酸、探針、抗體和染料。
29.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法或權(quán)利要求22所述的試劑盒，其特征在于，所述血液樣品選自全血、分餾的全血、稀釋的血液樣品、未稀釋的血液樣品、血漿、血清和微粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)前分析胎兒的方法。所述方法包括(a)分離胎盤來源微粒；和(b)分析所述胎盤來源微粒的內(nèi)含物的至少一種成分，其中所述至少一種成分是胎兒特征的指示。
文檔編號G01N33/68GK102483406SQ201080037927
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日
發(fā)明者本亞明·布倫納, 阿納·阿哈龍 申請人:健康公司-拉姆巴姆, 拉帕波特家族醫(yī)學(xué)研究院