專利名稱：癌癥生物標志物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及診斷或預后生物標志物或用于篩檢或檢測胃癌的生物標志物。
背景技術：
胃癌(gastric cancer或stomach cancer)是指在食管下部、胃內(nèi)或小腸最上部產(chǎn)生的腫瘤。胃癌是在世界范圍內(nèi)與癌癥相關的死亡的主要原因，其中毎年有近一百萬新病例被確診(Lam, K. ff.，Lo, S. C.，Proteomics Clin. Appl. 2008，2，219—228)。全球的五 年存活率為 20%左右，除了日本是近 60% (Kamangar F，et al. J Clin Oncol 2006 ；24 2137-50)。已報道西方和東方人群在該疾病的早期檢測和預后的次數(shù)上存在有趣的差異，這可能是由在胃癌的流行病學、分期系統(tǒng)和治療上的不同造成的(Davis，P. A.，Japanesejournal of clinical oncology 2000,30,463-464)。早期檢測被認為是治療胃癌的核心支柱。在日本和其他東方國家使用的通過內(nèi)鏡進行的人群篩檢使得近70%的胃癌在早期被確診，而相比之下，在篩檢仍然難以進行的西方國家，只有15%的胃癌在早期被確診(Cunningham and Chua, The New England journal of medicine 2007,357,1863-1865)。然而在除了日本和韓國的其他國家中，人群篩檢的花費收益還不確定。對高風險對象的篩檢可能是一個可行的選擇(Yeoh, K. G. , Journal of gastroenterology and hepatology2007, 22,970-972. Leung,ff. K. , et al. , The lancet oncology 2008,9, 279-287)。然而，目前還沒有特異性的可臨床用于胃癌的篩檢和診斷的生物標志物，常用的標志物如CA19-9、胎蛋白抗原、胃蛋白酶原1/11、癌胚抗原(CEA)等則不靈敏(Lam and Lo 2008)。顯然有發(fā)現(xiàn)更好的分子標志物的需求。傳統(tǒng)的腫瘤標志物如CA19-9、CA72-4和CEA都不夠靈敏且/或不具有對胃癌檢測的特異性。ー份最近的評論總結了腫瘤標志物在胃癌檢測中的靈敏度，包括CEA在16%到 63% 間，CA19-9 在 20% 到 56% 間，和 CA72-4 在 18% 到 51% 間(Ebert, Μ· P.，Rocken,C. , European journal of gastroenterology & hepatology 2006,18,847-853.;)這些標志物的特異性則不確定。M2丙酮酸激酶被描述為與腫瘤相關的代謝標志物，也在胃癌檢測中被評估，其靈敏度和特異性分別在57%到67%和89%到95%的范圍內(nèi)(Kumar，Y. , et al. European journal of gastroenterology & hepatology 2007,19,265—27(3」Hardt, P.D., et al. Anticancer research 2000,20,4565-4568. ；Cervenka, H. , et al.,Anticancer research 1999,19,849-851。大體上可從以上報告中得出兩點結論i)目前備選的腫瘤標志物對胃癌的靈敏度低于67%，和ii)它們中的多數(shù)都不具有對任意癌癥類型的特異性。胃癌的分類通常是基于勞倫分類。這可能是目前最成功和廣泛使用的分類(Vauhkohen,M. , et al. Best practice & research 2006, 20,651-674)。根據(jù)勞倫分類，胃癌可被分為兩種主要的癌癥發(fā)病機制_(i)腸亞型(IGCA)和(ii)彌漫亞型(DGCA)。這兩種亞型在流行病學和預后特征上具有顯著的差異，這使得臨床醫(yī)生和腫瘤醫(yī)生去進ー步理解該分類基礎(Kountouras, J. , et al. Hepatogastroenterology 2005, 52,1305-1312)。腸型(IGCA)的比例約占50%，彌漫型(DGCA)為35%，剩下的15%被定義為“未分類”或混合型癌癥。腸型(IGCA)的特征為粘合的贅生細胞形成腺體樣管狀結構的，而在彌漫型(DGCA)細胞中不存在粘合，使得獨立的細胞滲透或增厚胃壁而不形成分散的塊。這種微觀生長模式上的差異也反映在這兩種組織學亞型的不同宏觀外觀上。在腸型(IGCA)中，其宏觀邊緣大致與其宏觀擴散相對應，而彌散型(DGCA)作為ー種低分化癌可在粘膜下延伸至遠超出其宏觀邊緣。這兩種勞倫分類類型在腫瘤擴散上的差異在確定適當?shù)闹委煼桨阜矫婢哂信R床意義。腸型(IGCA)主要占據(jù)高風險區(qū)域，更經(jīng)常發(fā)生在遠端胃，且經(jīng)常在之前有長期的癌前階段，而彌漫型(DGCA)腫瘤主要發(fā)生在年輕患者和女性中，且遺傳因素在其誘因中比例較高。根據(jù)勞倫分類對胃癌進行的分類需要侵入性取樣方法。分析工具和質譜分析平臺的發(fā)展刺激了生物標志物的發(fā)現(xiàn)。用于發(fā)現(xiàn)生物標志物的蛋白質組學方法在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌上取得了成功，在胃癌上取得了較 小程度的成功，其中通過腫瘤組織(He，Q. Y.，et al.，Proteomics 2004，4，3276-3287)和細胞系(Takikawa, Μ.，et al.，Oncology reports 2006，16，705-711)確定了潛在的備選物。例如，ー項研究使用ニ維凝膠電泳(2-DE)的方法來描述胃液中的疾病特異性蛋白的表達(Lee, K. , et al.，Proteomics 2004，4，3343-3352)。另ー種 2-DE 方法進ー步確定了 14種在胃癌和正常組織中差異表達的蛋白(Ryu, J. ff. , et al. , Journal of Korean medicalscience 2003，18,505-509)。盡管對于腫瘤和胃液的研究為該疾病提供了深入的理解，但基于這些方法的生物標志物的發(fā)現(xiàn)需要侵入性取樣方法，從臨床角度看不夠理想?！┬〗M使用蛋白質芯片(ProteinChip)系統(tǒng)研究用血樣挖掘生物標記物,該系統(tǒng)是基于表面增強激光解吸/電離(SELDI)方法(Liang, Y. , et al. , Experimental andmolecular pathology 2006,81,176-180) ； (Ebert, M. P. , et al. , Journal of proteomeresearch 2004,3,1261-1266) ； (Poon, T. C. , et al. , Gastroenterology 2006,130，1858-1864)。盡管在肽質量指紋譜中發(fā)現(xiàn)了差異，該信息卻由于不能確定蛋白質的身份而不完整。盡管最近的一篇論文成功地開發(fā)了ー種使用蛋白質芯片和串聯(lián)質譜聯(lián)合鑒定SELDI 譜峰的方法(Peng, J. , et al. ,Proteomics 2009,9,492-498),但需要注意，由于各種內(nèi)在的和外在的因素，使用SELDI重現(xiàn)血清譜可能會比較困難。另ー方面，ー項研究使用傳統(tǒng)的2-DE凝膠聯(lián)合質譜分析并掲示了在胃癌患者的血清中的組織蛋白酶B的上調可用作預后標志物，但不能用于早期診斷(Ebert,M. P. , et al. ,Proteomics 2005，5，1693-1704)。然而2-DE方法的靈敏度仍然是個問題，而低豐度蛋白的檢測仍具有挑戰(zhàn)性。而由于血液中的蛋白具有涵蓋了 10個數(shù)量級的較寬的蛋白質動力學范圍，該問題就更加嚴重。C9通常作用在先天免疫系統(tǒng)中，該系統(tǒng)是宿主對抗外來物的防御系統(tǒng)之一。C9是補體系統(tǒng)的末端途徑的一部分，并與C5b、C6、C7和C8 —起用于導致細胞溶解的膜攻擊復合物的組裝
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明致カ于提供新型的胃癌檢測或篩檢方法以改善一些上述困難，并對現(xiàn)有的胃癌的檢測或篩檢方法進行補正。本發(fā)明還致カ于提供用于檢測或篩檢胃癌的試劑盒。我們發(fā)現(xiàn)，相對于不具有胃癌癥狀的正常患者的體液中的蛋白質表達，補體蛋白C9和/或其它蛋白在胃癌患者的體液中過表達。因此，本發(fā)明的ー個方面提供了ー種用于檢測疑似患有癌癥或處于患癌癥風險的個體內(nèi)癌癥存在的方法，該方法包含以下步驟(a)測定補體組分C9蛋白在獲得自所述個體的合適的流體樣品中補體組分C9蛋白的濃度，和(b)將步驟(a)中測得的濃度與健康個體的補體組分C9蛋白濃度的標準數(shù)值范圍相比較，其中當所述個體的補體組分C9蛋白濃度與健康個體的補體組分C9蛋白濃度的標準數(shù)值范圍相比升高時，表明可能存在癌癥。本發(fā)明的另一方面提供了一種檢測疑似患有胃癌或處于患胃癌風險的個體內(nèi)胃癌存在的方法，該方法包含以下步驟(a)測定獲得自所述個體的合適的流體樣品中補體組分C9蛋白的濃度，和(b)將步驟(a)中測得的濃度與健康個體的補體組分C9蛋白濃度 的標準數(shù)值范圍相比較，其中當所述個體的補體組分C9蛋白濃度與健康個體的補體組分C9蛋白濃度的標準數(shù)值范圍相比升高時，表明可能存在胃癌。本發(fā)明的另一方面提供了ー種在合適的流體樣品中檢測潛在胃癌的試劑盒，其包含能夠選擇性結合補體組分C9蛋白的抗體和用于檢測所述抗體與補體組分C9蛋白形成的復合物的試劑。本發(fā)明的另一方面提供了合適的流體樣品中的補體組分C9蛋白的濃度作為胃癌生物標志物的用途。本發(fā)明的另一方面提供了能夠選擇性結合補體組分C9蛋白的分離的抗體，其用于通過測定合適的流體樣品中的補體組分C9蛋白的濃度來檢測胃癌。本發(fā)明的另一方面提供了能夠選擇性結合補體組分C9蛋白的適體，其用于通過測定合適的流體樣品中的補體組分C9蛋白的濃度來檢測胃癌。


圖I(A)本研究的工作流程和實驗設計的概述，包括收集血液、制備血漿樣品和所使用的蛋白質組學方法。獨立進行了三個iTRAQ實驗。(B)根據(jù)C9免疫印跡對血漿樣品進行(I)驗證和(2)盲試研究的方案的示意圖。將驗證研究的樣品之一(在圖中用黒點表示)加入用于盲試的凝膠中以作為內(nèi)部標準。該內(nèi)部標準用于⑴在測試印跡間和(ii)在測試印跡和驗證印跡間進行歸ー化。每個驗證和測試印跡都各進行三個印跡。圖2⑷由iTRAQ實驗III產(chǎn)生的代表性MS/MS譜，表示了 ISEGLPALEFPNE的iTRAQ報告離子的相對豐度，該多肽是雙電荷的肽，前體質量為780. 4158，屬于補體成分C9前體。iTRAQ標記與樣品性質的關系如下114-正常，115-早期胃癌，和116-晚期胃癌。(B) iTRAQ結果和C9蛋白的代表性驗證印跡。備注*由3個iTRAQ實驗得到的平均比例(其比例為1.34、1.74和1.84)用于表示晩期胃癌的趨勢?？s寫⑴早期GC-早期胃癌(Ι-II期)，
(ii)晩期GC-晩期胃癌(I II-IV期)和(iii)LC-肺癌。(C)條形圖，表示在早期胃癌、晚期胃癌和肺癌的血漿樣品的三份驗證印跡中C9蛋白條帶的密度計量讀數(shù)，該讀數(shù)根據(jù)正常對照進行歸ー化。(D)正常對照、早期和晚期胃癌對象及肺癌對象的混合血漿樣品中的總蛋白譜。使用SYPRO Ruby對凝膠染色以便在分析時保證相同的上樣量。
圖3 (A)三重驗證印跡之ー表示iTRAQ實驗中的患者個體中的C9表達。在驗證中包含了另外11個肺癌樣品以將樣本大小由原先的5個增加到16個。對每個樣品的三重C9驗證印跡的平均密度讀數(shù)進行評估。(B)根據(jù)樣品的性質，即正常、早期胃癌(Ι-II期)、晚期胃癌(III-IV期)和肺癌組，將這些平均讀數(shù)以條形圖的形式繪制出來。在圖中計算并列舉出每個樣品種類的平均C9密度計量讀數(shù)。(C)表示C9表達在每個樣品種類中的分布的箱形圖。使用每個樣品種類的平均C9密度計量讀數(shù)進行方差分析(ANOVA)。在正常與癌癥組(早期、晩期胃癌和肺癌)間發(fā)現(xiàn)了 C9表達水平的顯著差異(P值< O. 05)?？s寫GC=胃癌和LC =肺癌。圖4由Tan Tock Seng醫(yī)院(TTSH)組取得的血漿樣品的三重盲試的代表性圖像。對總共55個盲樣進行C9表達檢測。將驗證研究中的一個樣品加入分析凝膠中以作為用于在(i)三重盲試印跡之間和(ii)驗證印跡和盲試印記間進行歸ー化的內(nèi)部標準。
圖5用于該研究(驗證+盲試)的所有単獨血漿樣品中的C9表達。條形圖表示在對經(jīng)過驗證和盲試印跡分析的血漿樣品進行免疫印跡后C9蛋白條帶的密度計量讀數(shù)，血漿樣品來自㈧所有胃癌樣品(早期和晩期，即I-IV期)，⑶早期胃癌(Ι-II期)，(C)晩期胃癌(III-IV期)和⑶肺癌樣品。(E)點狀圖表示患者的血漿樣品中的C9表達水平，該類患者的癌癥被分為彌漫型、腸型或混合型胃癌。虛線表示在正常対照的血漿中C9印跡表達的平均值。圖6在胃癌細胞系中增加的C9表達。(A)胃癌細胞系裂解物的C9免疫印跡。(B)正常與胃癌細胞系裂解物的C9表達密度圖。(C)在條件培養(yǎng)基中的正常和胃癌細胞系分泌的C9表達的密度圖。HFE145為正常的胃上皮細胞系。將肌動蛋白的免疫印跡作為上樣對照。
具體實施例方式描述了ー種用于檢測、診斷或預后癌癥的方法，該方法包括(a)測定合適的流體樣品中補體組分C9蛋白(C9)的濃度，該流體樣品包括體液樣品，如從個體取得的血液、血漿或血清樣品，和(b)將步驟(a)中測得的濃度與健康個體的合適流體樣品中的補體組分C9蛋白濃度的標準值相比較，其中當補體組分C9蛋白濃度與健康個體的補體組分C9蛋白濃度的標準值相比升高時，表明可能存在癌癥。所述癌癥可以是肺癌、胃癌或其它類型的癌癥，如膀胱、大腦、乳腺、血液、鼻咽、子宮、宮頸、結腸、直腸、食管、口腔、頭部、皮膚、腎臟、肺、卵巣、頸部、胰腺、前列腺、睪丸、肝臟和腹腔內(nèi)的腫瘤，然而優(yōu)選所述癌癥為胃癌。與健康個體的C9蛋白濃度的標準值相比，優(yōu)選步驟(a)中測定的C9蛋白濃度的升高是至少3倍的升高?；加性缙谖赴┑膫€體的體液中C9蛋白的濃度的升高可能是約3倍的升高，而患有晩期胃癌或肺癌的個體的體液中的C9蛋白的濃度的升高可能是約3倍到45倍或更多的升高。合適的流體樣品可包括體液樣品，如血漿、胃液、尿液等。流體樣品可被緩沖液或其它試劑如檢測試劑稀釋。個體可以是任何動物，但優(yōu)選人類。該方法還可進一歩包含鑒定腸型胃癌，其中與健康個體的合適流體樣品中的補體組分C9蛋白濃度的標準值相比，補體組分C9蛋白的濃度3到4倍的升高表明存在腸型胃癌。由此可進行腸型胃癌的預后。該方法還可進一歩包含鑒定彌漫型胃癌，其中與健康個體的血液、血漿或血清中的補體組分C9蛋白濃度的標準值相比，補體組分C9蛋白的濃度4到45倍的升高表明存在彌漫型胃癌。由此可以進行彌漫型胃癌的預后。以上鑒定方法具有可以快速并有效地判斷胃癌類型的優(yōu)點。由于腸型和彌漫型胃癌的預后不同，可以想到對于這兩種不同類型而言此后的治療手段也會有所不同。因此使用C9表達水平來區(qū)分這兩種類型的胃癌的方法在無需進行重復和過量的侵入性試驗的情況下可有效地確定使用哪種治療手段更為有效并在治療過程中監(jiān)測治療是否成功。該方法可進ー步包括以下步驟(C)測定獲得自所述個體的合適的流體樣品中的癌胚抗原(CEA)蛋白的濃度，和(d)將步驟(c)中測得的濃度與健康個體的癌胚抗原濃度的標準值相比較，其中癌胚抗原濃度與健康個體的癌胚抗原濃度的標準值相比的升高表明可能存在胃癌。C9在合適流體樣品如血液、血漿或血清樣品中的存在可通過使用本領域中已知方法檢測C9蛋白來確定。本發(fā)明不限制用于測定C9或C9活性的測試的類型。例如，可通過 使用C9特異性抗體的免疫測試來檢測C9。該抗體可選擇性結合補體組分C9蛋白和/或CEA。該抗體可用于，例如，一維或ニ維凝膠的蛋白質印跡、高通量方法如酶聯(lián)免疫測試和/或細胞總蛋白或部分純化蛋白的點印跡(抗體夾心)測試中。合適流體中的C9濃度可通過本領域中已知方式使用ELISA來測定。酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)是廣泛使用的體外方法。在ー個測試實例中，血清樣品被稀釋400倍，并被施加到連接有來自ー種動物來源的補體組分C9蛋白(C9)抗體(一杭)的板上。如果血清中存在足量的C9，則C9可結合這些C9抗體。之后將板進行清洗以除去血清中所有其它組分。將ー種特別制備的“ニ杭”(其動物來源與ー抗不同，是ー種與一抗結合的抗體)加到板上，之后進行再一次清洗。ニ抗預先與酶化學連接。因此，板上所含有的酶與結合到板上的ニ抗的量成正比。加入這種酶的底物，在該酶的催化下會導致顏色或熒光的變化。以數(shù)值報道ELISA的結果；陽性結果和陰性結果間的“截斷”點可通過將其與已知標準比較得到。所產(chǎn)生的信號強于已知非癌樣品的樣品為“陽性”。所產(chǎn)生的信號弱于已知非癌樣品的樣品為“陰性”。另外，可使用測譜方法如LC-MS/MS質譜、GSMS質譜、SDS PAGE方法(之后通過密度計量或質譜方法定量)或其它本領域已知的類似的對蛋白質定量的方法來檢測C9蛋白，從而確定合適流體中補體組分C9蛋白的濃度。抗體本發(fā)明還提供了對本發(fā)明中的C9多肽具有特異性的標記和未標記的單克隆和多克隆抗體，及產(chǎn)生本發(fā)明中的單克隆抗體的永生化細胞系。優(yōu)選的抗體可選擇性結合補體組分C9蛋白以通過測定血液、血漿或血清中補體組分C9蛋白的濃度來檢測胃癌。根據(jù)本發(fā)明的抗體制備包括(a)將C9多肽與載體蛋白綴合；(b)用與佐劑混合的步驟(a)中的C9多肽片段-載體蛋白綴合物免疫宿主動物；和(c)從免疫的宿主動物獲得抗體。根據(jù)本發(fā)明，通過重組或化學合成產(chǎn)生的C9多肽，及其片段或其它衍生物或類似物，包括融合蛋白，可用作免疫原以產(chǎn)生可識別C9多肽的抗體。這樣的抗體包括但不局限于多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫。因此，本發(fā)明還提供了多克隆和/或單克隆抗體及其片段，和其免疫結合等效物，它們可以特異性結合C9多肽及其片段，或結合來自C9多肽如ISEGLPALEFPNE多肽(SEQ IDNO :1)，特別是來自C9基因序列或其一部分的核苷酸序列。因此這樣的抗體包括但不局限于，例如，多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、Fab片段和Fab表達文庫。C9多肽或其片段的特異性抗體的產(chǎn)生將在下文進行描述。當分子可與免疫系統(tǒng)中的抗原識別分子(如免疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體)特異性相互作用時，其是“抗原”分子。抗原多肽含有至少約5個，優(yōu)選至少約10個氨基酸。分子的抗原部分可為對抗體或T細胞受體識別為免疫顯性的部分，也可以為通過將所述抗原部分與用于免疫的載體分子綴合來產(chǎn)生所述分子的抗體的部分?？乖肿颖旧聿恍枰敲庖咴缘?即能夠不需載體而引起免疫應答)?！翱贵w”為任何結合特異性表位的免疫球蛋白，包括抗體及其片段。該術語包括多克隆、單克隆和嵌合抗體(后者在美國專利號4，816，397和4，816，567中被進ー步詳細描述)，以及抗體的抗原結合部分，包括Fab、F(ab’)2和F(v)(包括單鏈抗體)。因此，文中所用的各種語法形式的短語“抗體分子”包括完整的免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的含有抗體結合位點的免疫活性部分?！翱贵w結合位點”是包含可特異性結合抗原的重、輕鏈可變區(qū)和高變區(qū)的抗體分子的結構部分。 示例性的抗體分子為完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子含有互補位的部分，包括本領域已知的如Fab、Fab’、F(ab’)2和F(V)的部分，所述部分優(yōu)選用于文中所述的診斷、預后和篩檢的方法。抗體分子的Fab和F(ab’)2部分分別使用已知方法通過木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在基本完整的抗體分子上的蛋白水解反應制備。例如參見美國專利4，342，566號。Fab'抗體分子部分也是已知的，并可從F(ab’)2部分產(chǎn)生，如使用巰基こ醇還原連接兩個重鏈部分的雙硫鍵，接著使用如碘代こ酰胺的試劑對所得蛋白質硫醇進行烷基化。本文優(yōu)選含有完整抗體分子的抗體。以多種語法形式出現(xiàn)的術語“單克隆抗體”是指只具有一種能夠與特定抗原進行免疫反應的抗體結合位點的抗體。因此單克隆抗體通常顯示對與其進行免疫反應的任何抗原的単一結合親和力。因此單克隆抗體可含有具有多個抗體結合位點的抗體分子，其中每一位點對不同的抗原具有免疫特異性；如，雙特異性(嵌合)單克隆抗體。術語“佐劑”是指增強對抗原的免疫應答的化合物或混合物。佐劑可作為緩慢釋放抗原的組織倉庫，也可作為非特異性增強免疫應答的淋巴系統(tǒng)激活劑。沒有佐劑而只有抗原自身的一級攻擊通常不會引發(fā)體液或細胞免疫應答。佐劑包括，但不局限于，弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、皂苷、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、復合多元醇、聚陰離子、肽、油或乳化烴、鑰孔血藍蛋白、ニ硝基苯酚、和可能有用的人類佐劑如BCG(卡介苗(bacilli Calmette-Guerin))和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum.)。優(yōu)選地，所述佐劑為藥物學可接受的。C9多肽、或其片段、衍生物或類似物的多克隆抗體可通過多種本領域中已知的方法制備。可注射C9多肽或其衍生物(如片段或融合蛋白)以使多種宿主動物免疫，從而產(chǎn)生抗體，宿主動物包括但不局限于兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一個實施方式中，C9多肽或其片段可綴合于免疫原性載體，如牛血清白蛋白(BSA)或鑰孔血藍蛋白(KLH)。根據(jù)宿主物種，可使用多種佐劑以增強免疫應答，所述佐劑包括但不局限于弗氏佐劑(完全或不完全)、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、復合多元醇、聚陰離子、肽、油乳液、鑰孔血藍蛋白、ニ硝基苯酚、和可能有用的人類佐劑如BCG(卡介苗)和短小棒狀桿菌。任何通過培養(yǎng)連續(xù)細胞系來生產(chǎn)抗體分子的技術都可被用于制備針對C9多肽或其片段、類似物或衍生物的單克隆抗體。這包括但不局限于首先由Kohler et al.，Nature, 256 :495-497(1975)開發(fā)的雜交瘤技術、三源雜交瘤技術、人類B細胞雜交瘤技術[Kozbor et al. , Immunology Today, 4 :72 (1983)]和產(chǎn)生人類單克隆抗體的 EBV-雜父瘤技術[Cole et al. , in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96,Alan R. Liss, Inc. , (1985)]。永生化的產(chǎn)生抗體的細胞系也可通過融合以外的技術產(chǎn)生，如將致癌DNA直接轉化B淋巴細胞,或用Epstein-Barr病毒轉染。參見，如，M. Schreieret al. ,“ Hybridoma Techniques”(1980) ； Hammer ling et al., Monoclonal Antibodiesand T-cell Hybridomas”(1981) ；Kennett et al. , “Monoclonal Antibodies”(1980);還參見美國專利 4，341，761 號；4，399，121 號；4，427，783 號；4，444，887 號；4，451，570 號；4，466，917 號；4，472，500 號；4，491，632 號；和 4，493，890 號。 在本發(fā)明的另ー個實施方式中，可使用最近的技術從無菌動物體內(nèi)生產(chǎn)單克隆抗體(PCT/US90/02545)。根據(jù)本發(fā)明，可使用人類抗體，其可通過人雜交瘤[Cote et al.，Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 80 :2026-2030 (1983)]或通過在體外用EBV病毒轉化人類B細胞而獲得(Cole et al. , 1985, supra)。事實上,根據(jù)本發(fā)明，可使用通過將來自小鼠C9多肽特異性抗體分子的基因與來自具有適當?shù)纳锘钚缘娜祟惪贵w分子的基因剪接在一起以獲得“嵌合抗體”的技術[Morrison et al. , J. Bacteriol. , 159-870 (1984) ；Neuberger etal.，Nature, 312 :604-608(1984) ；Takeda et al.，Nature, 314 :452-454(1985)];這樣的抗體在本發(fā)明的范圍內(nèi)。由于人抗體或人源化抗體自身不像異種抗體那樣容易弓I發(fā)免疫應答，特別是過敏反應，所述人抗體或人源化嵌合抗體優(yōu)選用于治療人類的疾病或紊亂(將會在以下描述)。根據(jù)本發(fā)明，可使用用于產(chǎn)生單鏈抗體(美國專利4，946，778號)的技術來產(chǎn)生C9多肽特異性單鏈抗體。本發(fā)明的另ー個實施方式使用用于構建Fab表達文庫的技術[Huse et al.，Science，246 :1275-1281 (1989)]來快速簡便地鑒定對C9多肽或其衍生物或類似物具有所需特異性的單克隆Fab片段?？墒褂靡阎夹g來產(chǎn)生含有抗體分子的獨特型的抗體片段。例如，該片段包括但不局限于可通過胃蛋白酶消化抗體分子制備的F(ab’ )2片段；可通過還原F(ab’)2片段中的ニ硫鍵制備的Fab’片段，和可通過用木瓜蛋白酶和還原劑處理抗體分子制備的Fab片段。在制備抗體時，可使用本領域已知的技術篩選所需抗體，如放射免疫測試、ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測試)、夾心免疫測試、免疫放射測試、凝膠擴散沉淀反應、免疫擴散測試、原位免疫測試(使用例如膠體金、酶或放射性同位素標記)、蛋白質印跡、沉淀反應、凝集測試(如凝膠凝集測試、血凝測試)、補體結合測試、免疫熒光測試、蛋白A測試和免疫電泳測試等。在一個實施方式中，通過檢測ー抗上的標記來檢測抗體的結合。在另ー個實施方式中，通過檢測ニ抗或試劑與ー抗的結合來檢測ー抗。在另一個實施方式中，ニ抗被標記。本領域中有很多已知方法用來檢測免疫測試中的結合，并都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，為了選擇識別C9多肽的特異性表位的抗體，可測試所產(chǎn)生的雜交瘤，測定其與含有所述表位的C9多肽片段結合的產(chǎn)物。
示例性抗體可包括親和純化的兔抗肽LQYENVDEDSSDSDA抗體。以上抗體可用于涉及C9多肽的定位和活性的本領域中已知方法中，如蛋白質印跡、C9多肽的原位成像、測定其在合適的生理樣品中的含量等。在ー個具體的實施方式中，使用根據(jù)蛋白質序列合成的肽或通過細菌表達載體制備的重組蛋白來使兔免疫以產(chǎn)生抗體。合成多肽的選擇是在根據(jù)上文所述對所預測的蛋白結構進行仔細分析后做出的。具體地，選擇在假定裂解位點間的多肽序列。使用碳ニ亞胺將合成多肽綴合至到載體，如KLH血藍蛋白或BSA，并將其用于弗氏佐劑中使兔免疫。為了制備重組蛋白，可使用載體來表達C9多肽?；蛘呖梢灾皇褂糜H水結構域來生成融合蛋白。所表達的蛋白會被大量制備并與弗氏佐劑一起使兔免疫。在另ー個實施方式中，使用重組C9多肽使兔免疫，并在進一歩使用前對多克隆抗體進行免疫純化。純化的抗體在半定量測試中特別有用，特別是用于檢測C9多肽的存在。優(yōu)選地,用于本發(fā)明中的診斷、預后和篩檢方法的抗調節(jié)劑(anti-modulator)抗體是親和純化的多克隆抗體。更優(yōu)選地，所述抗體是單克隆抗體(mAb)。另外，本文所用的抗調節(jié)劑抗體分子優(yōu)選以完整抗體分子的Fab、Fab’、F(ab’)2或F(V)部分的形式存在。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方式中，抗體會將C9蛋白從溶液中免疫沉淀出來，也會在聚丙烯酰胺凝膠的Western印跡或免疫印跡上與C9蛋白反應。優(yōu)選的實施方式涉及到檢測C9蛋白或其變體的方法，包括酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)、放射免疫測試(RIA)、免疫放射測試(IRMA)和免疫酶促測試(IEMA)，包括使用單克隆和/或多克隆抗體的夾心測試。根據(jù)本發(fā)明，提供了一種診斷或預后生物標志物，C9，其可以區(qū)分胃癌個體和不患有癌癥的健康個體。優(yōu)選的C9核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO :2。優(yōu)選的C9多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :3。在一個優(yōu)選的實施方式中，將所提取的血液、血漿或血清中的補體組分C9蛋白濃度用作胃癌的生物標志物。補體組分C9蛋白可以是胃癌的血液、血漿或血清生物標志物。適體本發(fā)明還提供了本發(fā)明中的C9多肽的特異性適體。優(yōu)選的適體可選擇性結合補體組分C9蛋白，用于通過測定補體組分C9蛋白的血液、血漿或血清濃度來檢測胃癌。根據(jù)本發(fā)明，通過重組或化學合成制備的C9多肽及其片段或衍生物或類似物，包括融合蛋白，可以用作免疫原以生成識別所述C9多肽的適體。因此，本發(fā)明還提供了適體及其片段和其免疫結合等效物，它們可特異性結合C9多肽和其片段，或結合來自C9多肽如ISEGLPALEFPNE肽(SEQ ID NO 1)的核苷酸序列(特別是來自于C9基因序列或其部分)。下文將會描述C9多肽或其片段的特異性適體的制備。術語“適體”是指與靶化合物(如特異性抗原、治療藥物標記物或替代標記物)具有特異性作用的非天然存在的寡核苷酸鏈或肽分子。特異性作用包括但不局限干，結合靶化合物、催化改變靶化合物、和以改性/改變靶化合物或靶化合物的功能活性的形式與靶化合物反應。由于其分子識別特性，適體可用于很多應用中，如癌癥診斷和治療。癌癥細胞需要與不同類型的分子進行物理相互作用以生長、復制和擴散。在診斷領域中，對那些在癌癥早期階段呈現(xiàn)異常的蛋白質具有高度特異性的適體可作為癌癥的早期檢測工具。適體也可能比抗體的免疫原性低。因此，它們也不太可能引起并發(fā)癥如宿主排異?？赏ㄟ^重復的多輪體外選擇或SELEX (通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化)改造適體以結合不同的分子靶如小分子。盡管存在修改，但適體的制備/合成及選擇方法與以下論文中所述大體相同Elington, A. D.，Szostak, J. ff. , 1990. in vitro selection ofRNA molecules that bind specific ligands. Nature 346,818-822 ;Tuerk,C., Gold, L.,1990. Systematic evolution of ligandsby exponential enrichment RNA ligands tobacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249,505-510.“SELEX ”方法包括將選擇核酸配體與所選核酸的擴增相結合，其中所述配體與特異性表位以所需形式相互作用，如與蛋白結合。這種選擇/擴增步驟的任選的迭代循環(huán)可以從含有大量核酸的庫(pool)中選擇ー種或少量與特異性表位相互作用最強的核酸。繼續(xù)該篩選/擴增循環(huán)過程，直到達到所選定目標。SELEX方法在以下美國專利和專利申請中被描述美國專利序列號07/536，428和美國專利號5，475，096和5，270, 163。 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，適體會將C9蛋白從溶液中免疫沉淀出來，也會在聚丙烯酰胺凝膠的Western或免疫印跡上與C9蛋白反應。涉及到檢測C9蛋白或其變體的方法的優(yōu)選的實施方式包括但不局限于酶聯(lián)免疫吸附測試(ELISA)，這是由于其高通量的特性和易于設置和操作。診斷試劑盒檢測試劑盒可含有抗體、擴增系統(tǒng)、檢測試劑(發(fā)色劑、熒光團等)、稀釋緩沖液、洗滌溶液、復染劑或其任意組合。試劑盒組分可被包裝用于手動或部分或全部地自動化實施前述方法。在另ー個涉及到試劑盒的實施方式中，本發(fā)明考慮了試劑盒，其包含本發(fā)明中的組合物以及任選的關于其使用的說明書。該試劑盒具有多種用途，包括，例如，對患者人群分類、診斷、預后、指導治療性治療決策及其它應用。優(yōu)選的用于在合適的流體如血液、血漿或血清樣品中檢測可能的胃癌的試劑盒包含可選擇性結合補體組分C9蛋白和用于檢測所述抗體與補體組分C9蛋白形成的復合物的試劑的抗體。該試劑盒還可包含可選擇性結合癌胚抗原和用于檢測所述抗體與CEA形成的復合物的試劑的抗體。該試劑盒還可包含ELISA試劑和板。假設腫瘤特異性標志物由癌組織釋放到體液如血液、血漿、血清和尿液中。這些體液任何一種都是用于發(fā)現(xiàn)生物標記物的理想基質，因為其獲取過程具有最小的侵入性并可重復進行而不會產(chǎn)生不良后果。不局限于任何理論，可以預期人體免疫系統(tǒng)對癌細胞發(fā)出反應，而這會導致提高血液中C9蛋白的產(chǎn)生。還可以預期在癌癥患者的血漿內(nèi)檢測到升高的C9量是由于胃癌細胞相對于正常細胞分泌較多的C9(圖6)。優(yōu)選實施方式的實施例胃癌是在世界范圍內(nèi)與癌癥相關的死亡的主要原因。目前還沒有特異性標志物可臨床用于胃癌的篩檢和診斷。通過使用基于抗體的消除、用于相對和絕對定量的同位素標簽(iTRAQ)和串聯(lián)質譜的組合獲得取自正常對象、早期(I-II)和晩期(III-IV)胃癌患者的臨床血漿樣品中的蛋白質表達水平譜，本研究嘗試發(fā)現(xiàn)用于胃癌的潛在標志物。使用三個獨立的iTRAQ實驗分析取自總共25個正常對象和36個胃癌對象的樣品。
在該研究中，我們使用了血漿蛋白質組學的方法來發(fā)現(xiàn)胃癌的潛在生物標志物。由于其在取樣過程中的簡易性，對血漿/血清中的標志物進行分析是最具吸引力的方法之一。我們的工作驗證了相對于正常對照而言，C9蛋白在多數(shù)胃癌患者的血漿中高度表達。至今還沒有報道過C9表達的升高與胃癌相關。本研究使用了用于相對和絕對定量同位素標簽(iTRAQ)來獲得早期和晩期胃癌階段相對于正常対照的血漿中的蛋白質表達水平譜。本研究的目的為(i)使用蛋白質組學的方法鑒定和驗證還未顯示與胃癌相關的蛋白質，和(ii)檢驗這些備選物相對于CEA在用于胃癌診斷中的特異性和靈敏度。血液采集和血漿樣品的制備自2006年I月以來，在新加坡的國立大學醫(yī)院和Tan Tock Seng醫(yī)院被新近診斷出胃癌的患者在知情同意的情況下預先加入到研究(胃癌生物標記物的發(fā)現(xiàn)II，GASCAD II)，收集其血液、配對的正常和腫瘤組織及胃液樣品以及臨床和病理注釋。在手術或化療前獲得血樣。通過組織病理學結合所有臨床信息確定分期信息。不存在其它惡性腫瘤的跡象。使用了美國癌癥聯(lián)合協(xié)會(AJCC)的胃癌分期系統(tǒng)和胃癌性質的勞倫分類。從各機構的審查委員會取得了倫理批準。從在臨床研究中經(jīng)過上消化道內(nèi)鏡篩檢被排除患有胃癌的對象中獲得非癌對照。使用同樣的血液采集方案。對象已知情同意且研究方案取得了各機構的審查委員會的批準。本研究中各中心使用的血液采集和血漿制備的標準方案參照血漿蛋白組計劃(PPP)中的報道(Omenn，G. S.，et al.，Proteomics 2005，5，3226-3245)。通過靜脈穿刺從每個患者體內(nèi)取出約5mL的血液并轉移到涂有K2EDTA(cat#362788，真空采血管；BD，美國)的真空采集管中。之后將管輕輕倒轉8次，之后在室溫下靜置30分鐘。將裝有血樣的管保存在冰上并轉移到實驗室中。接著以1，IOOx g的速度在4°C下離心10分鐘將血漿與紅細胞分離，向血衆(zhòng)樣品中加入蛋白抑制劑并使用O. 22m的過濾單元(MiIlipore,MA,美國)凈化。將ImL等份的血漿樣品儲存在-80°C下等待進ー步分析。為了保證血漿制備的一致性，需要進行質量控制測試，其中所有的血樣需要在臨床采集血液后一小時內(nèi)(包括在室溫下30分鐘的培養(yǎng))在實驗室中被處理為血漿。進行ID SDS PAGE并使用SyproRuby熒光染料染色來檢測可能存在的大規(guī)模蛋白質降解或樣品惡化以進ー步驗證各血漿樣品的完整性。不滿足這些特定的時間范圍或完整性檢測的樣品會被儲存起來但不會被用于該研究。三個實驗中共同的37種蛋白的表達被驗證為在正常對象和癌癥對象的血漿中存在ー貫性差異。通過使用免疫印跡，驗證了胃癌患者血漿中的補體組分C9蛋白的表達顯著高于正常対象。該觀察結果并不是由于患者間的差異，且不受到患者的胃炎和幽門螺桿菌(H. pylori)狀況的影響。我們還觀測到患有腸型和彌漫型癌癥的患者間存在C9蛋白表達水平的統(tǒng)計學顯著差異(P<0. 04)。在取自兩個不同醫(yī)院的總共119個血漿樣品上進行的兩個各自獨立的關于C9表達的盲試研究顯示其靈敏度為78%到89%，且其特異性為69%到78%。血清中的C9表達相對于CEA來說更為靈敏(CEA在7%到29%的范圍內(nèi))。這表明由于其對胃癌是靈敏的和特異的，C9可作為人群篩檢或診斷的癌癥標記物。免疫檢測試劑從Abcam(Cambridge,英國)購得小鼠單克隆C9抗體。增強化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購自通用 General Electric Healthcare,Bio-sciences (Uppsala,瑞典)；預染色的分子量標記物和丙烯酰胺/雙丙烯酰胺29 I來自Bio-Rad (Hercules，CA)，蛋白酶抑制劑混合物來自Roche (Mannheim,德國)。原I凡酸鈉和TEMED電泳試劑購自SigmaAldrich (StLouis,MO) ο BCA 蛋白質測試試劑盒來自 Pierce (Thermo Fisher Scientific,美國)，用于Hu-7消除(depletion)的緩沖液A和B購自Agilent Technologies (CA,美國)。測序級胰蛋白酶購自Promega (WI,美國)。本研究中的分組(cohort)樣本的表征我們通過3個iTRAQ實驗研究了 15個早期胃癌患者和8到22個晚期胃癌患者，如表I中所示。這里我們將那些根據(jù)美國癌癥聯(lián)合協(xié)會(AJCC)的分期系統(tǒng)診斷為I期和II期的胃癌定義為早期胃癌，而晚期胃癌為III期和IV期的胃癌。進行三個相對獨立的定量研究以保證所得結果的可靠性。由于該課題在早期階段樣品的限制，從第一個到第三個實驗所用的樣品量逐漸增加。増加的樣品量應會產(chǎn)生更具代表性的數(shù)據(jù)，并減少患者間的潛在偏差和差異。在每個實驗中，用作対照的取自正常/健康對象的血漿樣品的數(shù)量與所用的實驗血漿樣品(胃癌樣品)相同。將對照和測試樣品按照年齡和性別配對。正常血漿樣品采自健康個體，他們沒有癌癥，但由于其家族胃癌病史被歸類為胃癌高風險人群。在基于iTRAQ的質譜分析中還包括采自5個新近被診斷為肺癌的患者的血漿樣品，以作對比。用于iTRAQ實驗的樣品的詳細臨床數(shù)據(jù)如表I所示。 表I.用于3個iTRAQ實驗的樣品的表征和臨床數(shù)據(jù)
權利要求
1.一種檢測疑似患有癌癥或處于患癌癥風險的個體中的癌癥存在的方法，其包含 (a)測量獲得自所述個體的合適的流體樣品中的補體組分C9蛋白濃度，和 (b)將步驟(a)中測得的濃度與健康個體的補體組分C9蛋白濃度的標準數(shù)值范圍相比較， 其中當獲得自所述個體的補體組分C9蛋白濃度與健康個體的補體組分C9蛋白濃度的標準數(shù)值范圍相比升高時，表明可能存在癌癥。
2.一種檢測疑似患有胃癌或處于患胃癌風險的個體中的胃癌存在的方法，其包含 (a)測量獲得自所述個體的合適的流體樣品中的補體組分C9蛋白濃度，和 (b)將步驟(a)中測得的濃度與健康個體的補體組分C9蛋白濃度的標準數(shù)值范圍相比較， 其中當獲得自所述個體的補體組分C9蛋白的濃度與健康個體的補體組分C9蛋白濃度的標準數(shù)值范圍相比升高時，表明可能存在胃癌。
3.權利要求I或2的方法，其中與健康個體的補體組分C9蛋白濃度的標準數(shù)值范圍相t匕，所述補體C9蛋白的濃度的升高是至少三倍的升高。
4.權利要求2的方法，進一步包含以下步驟 (c)測量獲得自所述個體的合適的流體樣品中的癌胚抗原蛋白濃度，和 (d)將步驟(C)中測得的濃度與健康個體中的癌胚抗原蛋白濃度的標準數(shù)值范圍相比較， 其中當獲得自所述個體的癌胚抗原蛋白的濃度與健康個體的癌胚抗原蛋白濃度的標準數(shù)值范圍相比升高時，表明可能存在胃癌。
5.權利要求I或4的方法，其中使用能夠選擇性結合補體組分C9蛋白和/或癌胚抗原的抗體測量所述補體組分C9蛋白和/或癌胚抗原的濃度。
6.權利要求5的方法，其中通過ELISA測量所述補體組分C9蛋白的濃度。
7.權利要求5或6的方法，其中所述抗體能夠選擇性結合包含SEQIDNo 1或SEQ IDNo 3的補體組分C9蛋白抗原。
8.權利要求I或4的方法，其中使用分光光度法測量所述補體組分C9蛋白和/或癌胚抗原的濃度。
9.權利要求2的方法，進一步包含表征腸型胃癌，其中與健康個體的合適的流體樣品中的補體組分C9蛋白濃度的標準值相比，補體組分C9蛋白的濃度3到4倍的升高表明存在腸型胃癌。
10.權利要求2的方法，進一步包含表征彌漫型胃癌，其中與健康個體的血液、血漿或血清中的補體組分C9蛋白濃度的標準值相比，補體組分C9蛋白的濃度4到45倍的升高表明存在彌漫型胃癌。
11.一種用于在合適的流體樣品中檢測可能的胃癌的試劑盒，其包含能夠選擇性結合補體組分C9蛋白的抗體和用于檢測由所述抗體和補體組分C9蛋白形成的復合物的試劑。
12.權利要求11的試劑盒，進一步包含能夠選擇性結合癌胚抗原的抗體。
13.權利要求11或12的試劑盒，其中所述抗體能夠選擇性結合包含SEQID No :1或SEQ ID No 3的補體組分C9蛋白抗原。
14.能夠選擇性結合在合適的流體樣品中的補體組分C9蛋白的抗體作為胃癌生物標志物的用途。
15.能夠選擇性結合補體組分C9蛋白的分離的抗體，其用于通過測量合適的流體樣品中的補體組分C9蛋白濃度來檢測胃癌。
16.補體組分C9蛋白，其作為合適的流體樣品中的胃癌生物標志物。
17.能夠選擇性結合補體組分C9蛋白的適體，其用于檢測或治療胃癌。
全文摘要
胃癌是在世界范圍內(nèi)與癌癥相關的死亡的主要原因。目前還沒有可用于胃癌篩檢的特異性標志物。鑒定了37種蛋白的表達譜在正常對象和胃癌對象的血漿之間存在一貫性差異。已證實胃癌患者的血漿中的補體組分C9蛋白的表達顯著高于正常對象。而這與患者的胃炎和幽門螺桿菌狀況無關。我們還觀察到了腸型和彌漫型胃癌患者的C9表達水平間的統(tǒng)計學顯著差異(p＜0.04)。兩個獨立的盲試研究證實了胃癌檢測的高靈敏度和特異性。C9蛋白是用于篩檢胃癌的生物標志物。
文檔編號G01N33/574GK102687011SQ201080042262
公開日2012年9月19日 申請日期2010年7月23日 優(yōu)先權日2009年7月23日
發(fā)明者Y·P·林 申請人:新加坡國立大學