專利名稱：復(fù)合系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于形成基于SNARE復(fù)合體的分子支架的復(fù)合系統(tǒng)(complexingsystem)。
背景技術(shù)：
真核細(xì)胞中，囊泡(vesicle)與膜在被稱為囊泡融合的過(guò)程中融合。例如，囊泡能夠與細(xì)胞質(zhì)膜或其它細(xì)胞區(qū)室(例如內(nèi)體或溶酶體)融合。研究最深入的囊泡融合的形式是在神經(jīng)元細(xì)胞中突觸囊泡與突觸前膜的對(duì)接，以釋放神經(jīng)遞質(zhì)來(lái)引起神經(jīng)沖動(dòng)在突觸后神經(jīng)兀(post-synaptic neuron)中的傳遞。囊泡融合的過(guò)程是由SNARE蛋白(SNAREs)介導(dǎo)的，它們是一個(gè)由60多個(gè)酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的成員組成的巨大的蛋白超家族。SNARE蛋白較小，豐度較高，且多為膜結(jié)合蛋白。盡管它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和大小上非常多變，但它們?cè)诎麧{結(jié)構(gòu)域(cytosolic domain)中都具有被稱為SNARE基序的片段，SNARE基序能夠組裝成被稱為SNARE復(fù)合體的緊湊的四螺旋束。據(jù)稱，SNARE基序具有大約60-70個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度(Jahn R和Scheller RH)，但這并沒(méi)有很明確地界定。SNARE復(fù)合體有時(shí)由三種蛋白組成定位在細(xì)胞膜上的突觸融合蛋白(syntaxin)和SNAP-25 ;以及錨定在囊泡膜上的小突觸泡蛋白(synaptobrevin,也稱為囊泡相關(guān)膜蛋白或VAMP)。在神經(jīng)元胞吐作用中，突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白都通過(guò)它們的C端結(jié)構(gòu)域錨定在它們各自的細(xì)胞膜上，然而SNAP-25通過(guò)多個(gè)與半胱氨酸連接的棕櫚酰鏈被連接到質(zhì)膜上。核心SNARE復(fù)合體是一種四-α-螺旋束，其中一個(gè)α -螺旋是由突觸融合蛋白貢獻(xiàn)的，一個(gè)α -螺旋是由小突觸泡蛋白貢獻(xiàn)的，而另外兩個(gè)α -螺旋則是由SNAP-25貢獻(xiàn)的。已發(fā)現(xiàn)此SNARE復(fù)合體是非常穩(wěn)定的。囊泡融合中涉及的分子機(jī)制的示意性展示如圖I所
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發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，SNARE復(fù)合體和它的形成能用于多種用途。因此，本發(fā)明的基礎(chǔ)是一種復(fù)合系統(tǒng)，該復(fù)合系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物(homolog)的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)附著在所述多肽螺旋上的貨物部分(cargo moieties)；其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。 在本發(fā)明的各個(gè)方面，可以將進(jìn)一步的限制用于上述復(fù)合系統(tǒng)。本發(fā)明還涉及使用上述復(fù)合系統(tǒng)生產(chǎn)穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的方法，以及上述復(fù)合系統(tǒng)和得到的穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的用途。
具體實(shí)施例方式以下描述說(shuō)明了本發(fā)明的多種不同的實(shí)施方式。但是，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)的是，只要是基于上文所述的復(fù)合系統(tǒng)的，幾乎所有描述的限定、優(yōu)選的特征及變化都適用于本發(fā)明的其他實(shí)施方式。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了用于形成分子支架的復(fù)合系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋； 一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)附著在所述多肽螺旋上的貨物部分；其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，并且其中，至少兩個(gè)所述多肽螺旋的長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，該復(fù)合系統(tǒng)未必具有至少兩個(gè)長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸的多肽螺旋。本發(fā)明允許由不同的功能單元形成的穩(wěn)定的復(fù)合體的可控組裝。具有穩(wěn)定的復(fù)合體的優(yōu)勢(shì)在于它可以在相對(duì)嚴(yán)格的條件下使用，而沒(méi)有復(fù)合體解離的風(fēng)險(xiǎn)。這意味著，一個(gè)或多個(gè)貨物部分所附著的一個(gè)或多個(gè)所述螺旋仍將是復(fù)合體的一部分，確保了一個(gè)或多個(gè)貨物部分不從該復(fù)合體的其余部分上解離。如上所述，該復(fù)合系統(tǒng)基于穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的形成。因此，在一定程度上，只要它們能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，本發(fā)明的這四個(gè)多肽螺旋可以具有任意的序列。在神經(jīng)元中，所述SNARE復(fù)合體由以下蛋白形成SNAP_25 ;突觸融合蛋白；和小突觸泡蛋白。這些蛋白，以及其他的SNARE蛋白，含有SNARE基序或SNARE結(jié)構(gòu)域，它們是參與SNATE復(fù)合體形成的蛋白的組成部分。這些SNARE結(jié)構(gòu)域或基序是裝配在一起以形成SNARE復(fù)合體的螺旋。一般來(lái)說(shuō)，只有部分SNARE蛋白而非整個(gè)SNARE蛋白參與SNARE復(fù)合體的形成。例如，突觸融合蛋白具有C-末端跨膜結(jié)構(gòu)域、SNARE結(jié)構(gòu)域和N-末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域，也被稱為頭部結(jié)構(gòu)域。顯然，只有SNARE結(jié)構(gòu)域參與SNARE復(fù)合體的形成。術(shù)語(yǔ)“SNARE基序”和“SNARE結(jié)構(gòu)域”是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。此外，各種不同的SNARE蛋白的SNARE基序和SNARE結(jié)構(gòu)域也是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(Jahn R andScheller RH(2006) ；Sieber et al. (2006) ;Besteiro(2006))。本發(fā)明的所述四個(gè)多肽螺旋基于形成SNARE復(fù)合體的SNARE蛋白(即SNAP蛋白；突觸融合蛋白；和小突觸泡蛋白或其同系物)的SNARE結(jié)構(gòu)域或基序。因此，在一種實(shí)施方式中，該復(fù)合系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的SNARE基序的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的SNARE基序的多肽螺旋；和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的SNARE基序的多肽螺旋，其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。本發(fā)明的螺旋沒(méi)有必要與SNARE蛋白的SNARE基序或結(jié)構(gòu)域一樣長(zhǎng)。只要它與本發(fā)明的其它螺旋復(fù)合時(shí)仍能形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，它的長(zhǎng)度可以短于SNARE蛋白的SNARE基序或結(jié)構(gòu)域。作為兩個(gè)多肽螺旋的來(lái)源的所述SNAP蛋白可以為任何能夠形成部分SNARE復(fù)合體的SNAP蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道能夠形成部分SNARE復(fù)合體的各種SNAP蛋白。例如，所述 SNAP 蛋白可以為 SNAP-25A、SNAP-25B、SNAP_23(也被稱為 syndet)或 SNAP-29。優(yōu)選地，所述SNAP蛋白不為a -SNAP。優(yōu)選地，所述SNAP蛋白是SNAP-25，即SNAP-25A或SNAP-25B。SNAP蛋白含有兩個(gè)SNARE基序。因此，所述兩個(gè)多肽螺旋可以衍生自特定的SNAP蛋白中的兩個(gè)SNARE基序。或者，所述兩個(gè)多肽螺旋也可以衍生自不同的SNAP蛋白。優(yōu)選地，它們衍生自同一 SNAP蛋白。 作為多肽螺旋的來(lái)源的所述突觸融合蛋白可以是任何能夠形成部分SNARE復(fù)合體的突觸融合蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道能夠形成部分SNARE復(fù)合體的各種突觸融合蛋白。例如，所述突觸融合蛋白可以選自突觸融合蛋白lA(syntaxinlA)、突觸融合蛋白lB(syntaxinlB)、突觸融合蛋白2(syntaxin2,也稱為上皮形成素)、突觸融合蛋白3(syntaxin3)和突觸融合蛋白4 (syntaxin4)、突觸融合蛋白5 (syntaxin5)、突觸融合蛋白6(syntaxin6)、突觸融合蛋白7 (syntaxin7)、突觸融合蛋白8(syntaxin8)、突觸融合蛋白lO(syntaxinlO)、突觸融合蛋白11 (syntaxinll)、突觸融合蛋白13 (syntaxinl3)、突觸融合蛋白17(syntaxinl7)或突觸融合蛋白18 (syntaxinl8)。優(yōu)選地，所述突觸融合蛋白為突觸融合蛋白lA(syntaxinlA)或突觸融合蛋白3 (syntaxin3)。作為多肽螺旋的來(lái)源的所述小突觸泡蛋白或其同系物可以為任何能夠形成部分SNARE復(fù)合體的小突觸泡蛋白或同系物。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道能夠形成部分SNARE復(fù)合體的各種小突觸泡蛋白和同系物。小突觸泡蛋白是囊泡相關(guān)膜蛋白(VAMP)家族的成員。已知其他的VAMP蛋白能夠形成SNARE復(fù)合體，并且因此可以適合于提供能夠作為多肽螺旋的來(lái)源的基礎(chǔ)。在一種實(shí)施方式中，小突觸泡蛋白的同系物是能夠形成部分SNARE復(fù)合體的VAMP蛋白。這樣的VAMP蛋白是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。所述小突觸泡蛋白或其同系物可以選自小突觸泡蛋白I (synaptobrevinl)、小突觸泡蛋白2 (synaptobrevin2)、小突觸泡蛋白3 (synaptobrevin3,也稱小細(xì)胞小泡蛋白)和小突觸泡蛋白7 (synaptobrevin7,也稱ΤΙ-VAMP)。優(yōu)選地，所述多肽螺旋來(lái)自于小突觸泡蛋白。優(yōu)選地，所述小突觸泡蛋白為小突觸泡蛋白I (synaptobrevinl)、小突觸泡蛋白2 (synaptobrevin2)或小突觸泡蛋白3 (synaptobrevin3)。作為SNARE蛋白的起源的生物體可以為利用SNARE復(fù)合體的任何合適的生物體。例如，該蛋白可以起源于哺乳動(dòng)物，如人類、靈長(zhǎng)類和嚙齒類；魚(yú)；和無(wú)脊椎動(dòng)物，如蠅(flies) ο可選地，所述SNARE蛋白可以衍生自酵母(Rossi G et al. (1997))。作為SNARE蛋白的起源的生物體可以取決于所述復(fù)合系統(tǒng)的用途。例如，對(duì)于醫(yī)療應(yīng)用，所述SNARE蛋白優(yōu)選起源于人類。本發(fā)明的所述四個(gè)多肽螺旋衍生自形成SNARE復(fù)合體的SNARE蛋白。所述形成SNARE復(fù)合體的SNARE蛋白的SNARE基序或結(jié)構(gòu)域的螺旋的長(zhǎng)度通常為約60-70個(gè)氨基酸。如上所述，本發(fā)明的所述四個(gè)多肽螺旋均衍生自所述SNARE蛋白的SNARE基序或SNARE結(jié)構(gòu)域。術(shù)語(yǔ)“衍生自”是指所述多肽螺旋的序列基本上與所述SNARE結(jié)構(gòu)域/基序的序列或與它的部分序列相同，以便于能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。優(yōu)選地，所述多肽螺旋的序列與選擇的SNARE結(jié)構(gòu)域/基序或它的部分應(yīng)該具有至少約80%的序列同一性。更優(yōu)選地，所述序列同一性應(yīng)該是至少約85%，更進(jìn)一步優(yōu)選為至少約90%。在一種實(shí)施方式中，所述序列同源性可以為至少約95%，至少約98%或甚至為100%。然而，在一些實(shí)施方式中，所述多肽螺旋的序列優(yōu)選與選擇的SNARE結(jié)構(gòu)域/基序或它的部分的序列不同。就蛋白表達(dá)、蛋白純化或下游的應(yīng)用而言這可能是有益的。例如，不作為限制地，這可以包括在序列的任意一端添加組氨酸殘基以便于純化，或加入額外的賴氨酸或半胱氨酸殘基，用于該肽與表面或貨物的功能連接。兩個(gè)SNAP衍生的螺旋可以包括選自SEQ ID NOs. 1、2、5、6、24、41、48、49、50、51、64和65所示的序列。突觸融合蛋白衍生的螺旋可以包括選自SEQ ID NOs. 3、7、9、25、32、33、34、35、36、37、38、46、47、60、61、62 和 66 所示的序列。
衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的螺旋可以包括選自SEQ ID NOs. 4、8、27、28、29、30、31、42、43、44、45、52、53、67、68 和 69 所示的序列。進(jìn)一步地，衍生自SNARE蛋白的螺旋可以由上面的序列組成。此外，本發(fā)明的螺旋可以包括選自SEQ ID NOs. 1-9,12_15和18_69所示的序列或由選自于SEQ ID NOs. 1-9，12-15和18-69的序列組成。每個(gè)多肽螺旋應(yīng)該足夠長(zhǎng)，以便它可以與其他螺旋相互作用，形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。實(shí)際上，這意味著多肽螺旋必須衍生自SNARE基序/結(jié)構(gòu)域的足夠長(zhǎng)的部分，以便形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。測(cè)試多肽螺旋是否足夠長(zhǎng)以便形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體是比較簡(jiǎn)單且完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的。這可以通過(guò)以下方法完成使所述多肽螺旋與其他三個(gè)多肽螺旋復(fù)合，然后查看在不利條件下得到的SNARE復(fù)合體是否解離。不利條件是指那些通常會(huì)導(dǎo)致蛋白復(fù)合體和蛋白質(zhì)相互作用的解離的條件。這些條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。例如，這些不利的條件可以是將復(fù)合體暴露在強(qiáng)的表面活性劑或破壞性的去垢劑下。在一種實(shí)施方式中，可以在變性SDS濃度(>0.02%)下，通過(guò)SDS-PAGE來(lái)測(cè)試SNARE復(fù)合體，以確定它是否穩(wěn)定。如果復(fù)合體在凝膠中被SDS解離，使其分離為它的各組成部分，則SNARE復(fù)合體可能不太穩(wěn)定。然而，如果在SDS-PAGE凝膠中移動(dòng)時(shí)，SNARE復(fù)合體不解離，通過(guò)例如用考馬斯染色進(jìn)行檢測(cè)時(shí)仍作為獨(dú)立的整體，可以認(rèn)為它是穩(wěn)定的。因此，在一種實(shí)施方式中，如果用SDS時(shí)不解離，則認(rèn)為該SNARE復(fù)合體是穩(wěn)定的。優(yōu)選地，當(dāng)使用的是含有約2% SDS的SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液時(shí)，該SNARE復(fù)合體是穩(wěn)定的。更優(yōu)選地，當(dāng)使用的是含有約O. I % SDS的SDS-PAGE凝膠時(shí)，該SNARE復(fù)合體是穩(wěn)定的。這可以用含有約O. 1% SDS的SDS-PAGE凝膠來(lái)完成?；蛘撸琒NARE復(fù)合體的穩(wěn)定性可通過(guò)玻璃珠pull-down驗(yàn)證。如果該復(fù)合系統(tǒng)的一種組分能夠以化學(xué)計(jì)量的方式沉降與其相互作用的全部分子，則該SNARE復(fù)合體可以被認(rèn)為是穩(wěn)定的。玻璃珠pull-down是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)((Rickman C. etal. (2004))。測(cè)量蛋白質(zhì)相互作用的表面等離子體共振技術(shù)也可以應(yīng)用于此，并且，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)((KarlSSOn&Falt(1997))。當(dāng)利用表面等離子體共振技術(shù)時(shí)，如果沒(méi)有觀察到由表面等離子體共振信號(hào)降低所證明的解離，則該SNARE復(fù)合體可以被認(rèn)為是穩(wěn)定的。另一種確定SNARE復(fù)合體是否穩(wěn)定的方法是確定該復(fù)合體的解離常數(shù)。這是一個(gè)螺旋從該復(fù)合體中解離的解離常數(shù)。穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的解離常數(shù)應(yīng)小于10_7M。在某些實(shí)施方式中，所述穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的解離常數(shù)可能會(huì)小于10_8M，10_9M，IO^10M, 10_nM，IO-12M, IO-13M, IO-14M或10_15M。根據(jù)該復(fù)合系統(tǒng)應(yīng)用的用途，其具有不同的解離常數(shù)可能是有益的。因此，在一些實(shí)施方式中，解離常數(shù)可能為10_7M至10_nM或10_7M至ΙΟ,Μ?；蛘?，所述解離常數(shù)可能與抗體解離常數(shù)(6-10Χ I(T8M)相當(dāng)。
也可以通過(guò)與復(fù)蛋白(complexin)的結(jié)合來(lái)評(píng)價(jià)SNARE復(fù)合體的形成,所述復(fù)蛋白與完全形成的SNARE復(fù)合體結(jié)合(Hu et al. (2002))。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述多肽螺旋的長(zhǎng)度至少為約25個(gè)氨基酸。在溶液中使用這種螺旋可形成SNARE復(fù)合體。然而，他們未必是SDS耐受的。優(yōu)選的是，本發(fā)明的所述多肽螺旋具有至少約30或約35個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。更優(yōu)選的是，本發(fā)明的所述多肽螺旋具有至少約40個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。使用這樣的多肽螺旋形成的SNARE復(fù)合體一般是SDS耐受的。或者，所述多肽螺旋可以具有至少約45個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度在一種實(shí)施方式中，至少一個(gè)所述多肽螺旋的長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸。這樣的好處是，這些長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸的多肽螺旋更容易人工生產(chǎn)。所述小于50個(gè)氨基酸的多肽螺旋可以是任何的多肽螺旋。優(yōu)選地，至少有兩個(gè)多肽螺旋的長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，它們是衍生自突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋。在可替代的實(shí)施方式中，三個(gè)或四個(gè)所述多肽螺旋的長(zhǎng)度可能小于50個(gè)氨基酸。在這樣的實(shí)施方式中，螺旋的任何組合的長(zhǎng)度可以小于50個(gè)氨基酸。發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)每個(gè)SNARE蛋白的SNARE基序的最小的肽序列，都足以形成高親和力的穩(wěn)定的四螺旋束的SNARE復(fù)合體。這對(duì)于肽的易于生產(chǎn)是有好處的。此外，每個(gè)最小的序列可以攜帶保留功能的貨物。若所述多肽螺旋中的兩個(gè)的長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸，它們優(yōu)選是衍生自長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸的突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白或其同系物的螺旋。本發(fā)明的所述四個(gè)多肽螺旋的長(zhǎng)度可能幾乎相同或不同。例如，在一種實(shí)施方式中，它們的長(zhǎng)度可能都是約45個(gè)氨基酸?；蛘?，所述多肽螺旋的長(zhǎng)度可能不同。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，衍生自突觸融合蛋白的多肽和/或衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽，可能還含有膜附著序列，以使所述SNARE復(fù)合體固定在膜上或脂雙層上。這些膜附著序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白的天然序列含有跨膜部分，可允許蛋白附著到囊泡膜和細(xì)胞膜上(Kasai and Akagawa (2001)and Laage et al. (2000))。因此,在一種實(shí)施方式中，衍生自突觸融合蛋白的所述多肽螺旋還可以含有衍生自突觸融合蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域的膜附著序列，以使多肽螺旋固定在膜上或脂雙層上。同樣，衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋可以進(jìn)一步含有衍生自小突觸泡蛋白或其同系物跨膜結(jié)構(gòu)域的膜附著序列，以使多肽螺旋固定在膜上或脂雙層上。在通常會(huì)導(dǎo)致蛋白復(fù)合體和蛋白質(zhì)相互作用的解離的不利條件下，穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體不會(huì)解離。這可以通過(guò)以下方法測(cè)定，例如，用SDS-PAGE,玻璃珠pull-down,固定蛋白的表面等離子體共振，解離常數(shù)或復(fù)蛋白結(jié)合。上面有更詳細(xì)的討論。由于對(duì)SNARE復(fù)合體的研究很深入，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定特定蛋白是否適用于本發(fā)明，以及如何操作這些蛋白和它們的序列，以生產(chǎn)本發(fā)明的多肽螺旋，以使它們能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。所述一個(gè)或多個(gè)貨物部分可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員想要附著到多肽螺旋上的任何部分。所述一個(gè)或多個(gè)貨物部分優(yōu)選附著在所述復(fù)合系統(tǒng)中的螺旋的末端。所述貨物部分可以選自小分子，含有小分子的聚合物，多肽，蛋白，核酸或其衍生物，以及粒子或納米粒子。例如，所述貨物部分可以是I、小分子或含有小分子的聚合物，如
-親和標(biāo)簽，例如生物素；-治療的，例如毒素或藥物；
-進(jìn)一步/下游交聯(lián)、聚合以及進(jìn)一步衍生的反應(yīng)基團(tuán)，例如氨基，羧基，巰基，胍基，酚基，硫醚基，咪唑基，吲哚基等；-適于進(jìn)一步修飾的自發(fā)性反應(yīng)基團(tuán)，例如用于與SH交聯(lián)的馬來(lái)酰亞胺或其衍生物，或其他任何適于交聯(lián)的化學(xué)基團(tuán)；-直接附著在表面的分子，如用于附著到金屬表面的含巰基分子；-成像試劑，例如用于紫外光譜，可見(jiàn)光光譜，紅外光譜，拉曼光譜，核磁共振，MRI，PET, X射線或其他成像的熒光部分或可吸收部分；-生物相關(guān)的配體，例如用于受體結(jié)合/靶向；-生物相關(guān)的底物，例如磷酸化或其他的PTM位點(diǎn)；-生物相關(guān)的分子，例如脂質(zhì)或碳水化合物；-保護(hù)基團(tuán)或分子，例如聚乙二醇；-金屬螯合化合物；2、多肽或蛋白，如-結(jié)合肽，激素、毒素等；-含有功能位點(diǎn)的多肽或蛋白，如蛋白酶消化位點(diǎn)；-靶向功能的肽，例如不同細(xì)胞器靶向的，核靶向的(用于轉(zhuǎn)染)，細(xì)胞內(nèi)靶向的(用于藥物遞送)等；-肽親和標(biāo)簽，例如Flag, Myc, VSV, HA, 6XHis, 8Xhis, poly-His 等；-能夠形成蛋白質(zhì)相互作用的多肽或蛋白，例如H)Z，SH2/3；-抗體，抗體片段，抗體類似物，基于RNA的適配子或基于肽的適配子，或其他親和試劑(蛋白質(zhì)的(proteinous)或非蛋白質(zhì)的)；-酶，例如用于研究，診斷(一些應(yīng)用中所述復(fù)合系統(tǒng)可以用來(lái)固定酶)和治療用途，用于核苷酸(包括啟動(dòng)子)的合成或擴(kuò)增，聚合酶，限制性內(nèi)切酶，或其他修飾酶；3、核酸或衍生物，例如-用于檢測(cè)，固定，雜交，啟動(dòng)合成，合成和擴(kuò)增，標(biāo)記，信號(hào)檢測(cè)和信號(hào)放大，轉(zhuǎn)錄和翻譯的DNA，RNA或PNA ；4、粒子或納米粒子，例如-鐵磁顆?；蚣{米粒子(用于分離);-樹(shù)狀聚體(用于標(biāo)記)；-金屬粒子或納米粒子，例如用于染色或標(biāo)記的金或銀；-半導(dǎo)體粒子或納米粒子，例如用于標(biāo)記和檢測(cè)的量子點(diǎn)；-聚合物微米粒子或納米粒子,例如樹(shù)脂,凝膠等。-碳納米管或納米線在一種實(shí)施方式中，多個(gè)貨物部分可附著到所述多肽螺旋的末端?？梢愿街剿龆嚯穆菪┒说呢浳锊糠值臄?shù)目將取決于所述螺旋具有多少自由末端。例如，當(dāng)復(fù)合系統(tǒng)包括四個(gè)獨(dú)立的多肽螺旋時(shí)，該螺旋將有八個(gè)自由末端(每個(gè)螺旋的每個(gè)末端具有一個(gè))。因此，可以將貨物部分附著到8個(gè)自由末端的每一個(gè)上。這意味著，1，2，3，4，5，6，7或8個(gè)貨物部分可以附著到該螺旋的自由末端。一些螺旋沒(méi)有自由末端，例如，如果兩個(gè)螺旋連接在一起或一個(gè)螺旋附著于基質(zhì)，自由末端的數(shù)量就減少了。這將減少能夠附著到螺旋末端的貨物部分的數(shù)目。在一種實(shí)施方式中，兩個(gè)或兩個(gè)以上的貨物部分可附著到螺旋的末端。在一種具體實(shí)施方式
中，第一貨物部分附著到第一螺旋的末端上，第二貨物部分附著到第二螺旋的末端上。在這樣的實(shí)施方式中，所述第一貨物部分和第二貨物部分不應(yīng)一起附著在同一螺旋或含有螺旋的組分上。他們應(yīng)該附著到單獨(dú)的螺旋或含有螺旋的組分上。例如，兩個(gè)貨物部分可附著到兩個(gè)單獨(dú)的螺旋上。當(dāng)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接時(shí)(在后面詳細(xì)描述)，所述第一貨物部分和第二貨物部分不應(yīng)都附著到這個(gè)雙螺旋的組分上。取而代之的是，第一貨物部分附著到所述小突觸泡蛋白/突觸融合蛋白融合蛋白上，第二貨物部分可附著到衍生自S NAP蛋白的一個(gè)螺旋上。當(dāng)所述復(fù)合系統(tǒng)的四個(gè)多肽螺旋連接在一起形成兩個(gè)含有螺旋的組分時(shí)(稍后將詳細(xì)描述)，所述第一貨物部分應(yīng)該附著到第一含螺旋的組分上，而所述第二貨物部分應(yīng)附著到第二含螺旋的組分上。在一種實(shí)施方式中，所述第一貨物部分是酶部分或成像部分。在另一種實(shí)施方式中，所述第二貨物部分是使復(fù)合系統(tǒng)靶向特定靶標(biāo)的配體，例如，特定類型的細(xì)胞或特定的受體。優(yōu)選地，在同一實(shí)施方式中，所述第一貨物部分是酶部分或成像部分，所述第二貨物部分是使復(fù)合系統(tǒng)靶向特定靶標(biāo)的配體，例如，特定類型的細(xì)胞或特定的受體。酶試劑或成像試劑可以是任何合適的試劑。成像試劑可以是任何能夠附著到螺旋上并使所述螺旋的位置成像的試劑，例如，GFP熒光標(biāo)簽，熒光標(biāo)記肽，以及磁共振造影劑。所述酶試劑可以是任何酶或其功能部分。在一種實(shí)施方式中，所述酶試劑或成像試劑是酶試劑。在一種特定實(shí)施方式中，所述酶試劑含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分。肉毒桿菌毒素的輕鏈的功能是作為肽鏈內(nèi)切酶。因此，肉毒桿菌毒素的輕鏈的功能部分是保留了所述肽鏈內(nèi)切酶的活性的那個(gè)部分。優(yōu)選地，所述酶試劑含有肉毒桿菌毒素的輕鏈。肉毒桿菌毒素的輕鏈可以來(lái)自任何的肉毒桿菌毒素。肉毒桿菌毒素有七種不同的類型，為A，B，C，D，E，F(xiàn)和G。優(yōu)選地，所述輕鏈來(lái)自肉毒桿菌毒素A或E，更優(yōu)選地，所述輕鏈來(lái)自肉毒桿菌毒素A。優(yōu)選地，所述酶試劑含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分。所述肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分允許與它相關(guān)的輕鏈從囊泡釋放到細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)很容易了解術(shù)語(yǔ)“肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分”(也被稱為易位結(jié)構(gòu)域)的含義。所述肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分可以來(lái)自任何肉毒桿菌毒素。優(yōu)選地，所述易位部分來(lái)自肉毒桿菌毒素A或E，更優(yōu)選地，來(lái)自肉毒桿菌毒素A。所述輕鏈或其功能部分和所述易位部分可以來(lái)自相同或不同的肉毒桿菌毒素。優(yōu)選地，所述輕鏈或其功能部分和所述易位部分來(lái)自同一肉毒桿菌毒素。所述輕鏈或其功能部分以及易位部分可以以任何合適的方式連接。優(yōu)選地，它們通過(guò)二硫鍵連接，正如在天然發(fā)生的肉毒桿菌毒素中的那樣。如果肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分是通過(guò)氨基酸鏈之間的肽鍵連接的，優(yōu)選地，在肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分和肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分之間的氨基酸序列存在切割位點(diǎn)(nickingsite)，該切割位點(diǎn)可被蛋白酶識(shí)別，以引起兩部分之間的氨基酸序列的斷裂。在一種實(shí)施方式中，所述切割位點(diǎn)是凝血酶位點(diǎn)，其可被凝血酶切割。肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分和肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分可附著到衍生自SNAP蛋白的一個(gè)多肽螺旋上。
肉毒桿菌毒素的輕鏈的序列可以具有如SEQ ID NO. 70所示的序列。肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分的序列可以具有如SEQ ID NO. 71所示的序列。當(dāng)所述貨物部分是配體時(shí)，它可以是任何使復(fù)合系統(tǒng)靶向特定靶標(biāo)的合適的配體，例如，特定類型的細(xì)胞或特定的受體。這樣的配體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，該配體可能能夠結(jié)合細(xì)胞表面受體。這些配體可以包括神經(jīng)肽如P物質(zhì)，神經(jīng)肽Y和VIP，生長(zhǎng)因子如NGF和BDNF，以及激素如垂體激素(如促腎上腺皮質(zhì)激素ACTH，促甲狀腺激素TSH，泌乳素PRL，生長(zhǎng)激素GH，內(nèi)啡肽，F(xiàn)SH, LH，催產(chǎn)素，抗利尿激素ADH和AVP)，促性腺激素釋放激素GNRH和CGRP。在一種特定的實(shí)施方式中，所述配體是生長(zhǎng)抑素肽(somatostatinpeptide)或允許生長(zhǎng)抑素肽結(jié)合到生長(zhǎng)抑素受體的生長(zhǎng)抑素肽的功能部分。在其他實(shí)施方式中，所述配體可能是P物質(zhì)肽(substance P peptide)或能夠使P物質(zhì)肽結(jié)合到神經(jīng)激肽受體的P物質(zhì)肽的功能部分，或者，所述配體是AVP肽或能夠使AVP肽結(jié)合到AVP受體上的AVP肽的功能部分。在一可選擇實(shí)施方式中，所述配體可以是肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分。所述肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分負(fù)責(zé)神經(jīng)元神經(jīng)節(jié)苷脂的識(shí)別，并與突觸囊泡受體(synaptic vesicle receptor)結(jié)合，SV2C,使毒素內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分”(也被稱為受體結(jié)合域)很容易被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解。所述受體結(jié)合部分可以來(lái)自任何肉毒桿菌毒素。優(yōu)選地，所述受體結(jié)合部分來(lái)自肉毒桿菌毒素A或E，更優(yōu)選地，所述受體結(jié)合部分來(lái)自肉毒桿菌毒素A。在一種實(shí)施方式中，所述肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合域附著在衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋上。所述肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分的序列可以具有如SEQ ID NO. 72所示的序列。本發(fā)明還提供了上述復(fù)合體用于治療和/或診斷。治療和/或診斷的確切性質(zhì)將取決于配體和酶試劑/成像試劑的一致性。在一種實(shí)施方式中，其中，第一貨物部分附著到第一螺旋的末端且第二貨物部分附著到第二螺旋的末端，所述第一貨物部分是含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分和肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分的酶試劑，且所述第二貨物部分是配體，該配體是肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分。在可選擇的實(shí)施方式中，所述第一貨物部分是含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分和肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分的酶試劑，第二貨物部分是配體，該配體是生長(zhǎng)抑素肽或其功能部分。—個(gè)或多個(gè)貨物部分可直接或通過(guò)連接器(linker)連接到螺旋的末端。合適的連接器是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如可以通過(guò)化學(xué)方法完成，或者如果所述貨物部分是蛋白或多肽，可以通過(guò)重組方法完成。所述貨物部分也可通過(guò)連接器來(lái)連接。這些連接器為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。在形成SNARE復(fù)合體之前，四個(gè)多肽螺旋應(yīng)是四個(gè)單獨(dú)的螺旋，不以任何方式連接在一起。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述螺旋中的兩個(gè)可連接在一起，這樣所述復(fù)合系統(tǒng)包括三個(gè)獨(dú)立的組分(以下簡(jiǎn)稱三組分系統(tǒng))。只要這兩個(gè)螺旋能夠組裝進(jìn)同一穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體中，這兩個(gè)螺旋可以通過(guò)任何合適的方式連接在一起。所述兩個(gè)螺旋可以通過(guò)重組的方式或化學(xué)偶合連接在一起。所述兩個(gè)螺旋也可以通過(guò)連接器連接在一起。術(shù)語(yǔ)“連接”是指螺旋的線性連接(這與發(fā)生在類似于“扣緊(zippering) ”的平行定位中的螺旋的結(jié)合是截然相反的)。兩個(gè)螺旋連接在一起有助于簡(jiǎn)化復(fù)合系統(tǒng)。任何兩個(gè)螺旋可能被連接在一起。在一個(gè)實(shí)施方式中，衍生自SNAP蛋白的兩個(gè)多肽螺旋連接在一起。這樣做的好處是，可以使用全長(zhǎng)SNAP蛋白，例如，全長(zhǎng)的SNAP-25蛋白，所述全長(zhǎng)SNAP蛋白在蛋白中含有兩個(gè)多肽SNARE螺旋?；蛘?，衍生自突觸融合蛋白的螺旋多肽可與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接。在另一種實(shí)施方式中，所述螺旋中的兩個(gè)連接在一起，同時(shí)所述螺旋中的另外兩個(gè)也連接在一起。這將產(chǎn)生包括兩個(gè)獨(dú)立組 分的復(fù)合系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱雙組分系統(tǒng))，并進(jìn)一步簡(jiǎn)化了系統(tǒng)。這兩套螺旋可以通過(guò)任何合適的方式連接在一起，只要它們?nèi)匀豢梢孕纬煞€(wěn)定的SNARE復(fù)合體。例如，這兩套螺旋可通過(guò)重組的方式或化學(xué)偶合連接在一起。一套或兩套螺旋可以通過(guò)連接器連接在一起。任何螺旋的組合可連接在一起形成兩套螺旋。優(yōu)選地，衍生自SNAP蛋白的兩個(gè)多肽螺旋連接在一起，衍生自突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白或同系物的螺旋也連接在一起。這允許使用像SNAP-25 —樣的全長(zhǎng)的SNAP蛋白。在可選擇的雙組分系統(tǒng)中，所述螺旋中的三個(gè)可以連接在一起。只要它們?nèi)匀豢梢耘c第四個(gè)螺旋形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，這三個(gè)螺旋可以通過(guò)任何合適的方式連接在一起。例如，這三個(gè)螺旋可通過(guò)重組的方式或化學(xué)偶合連接在一起。這三個(gè)螺旋也可以通過(guò)其中兩個(gè)螺旋間的連接器或所有的三個(gè)螺旋間的連接器連接。任何三個(gè)螺旋都可以連接在一起。優(yōu)選地，衍生自SNAP蛋白的兩個(gè)多肽螺旋與第三個(gè)螺旋，即衍生自突觸融合蛋白的螺旋或衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的螺旋，連接在一起。在一個(gè)特定實(shí)施方式中，衍生自SNAP蛋白的兩個(gè)多肽螺旋與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接在一起。在一個(gè)可選擇的實(shí)施方式中，衍生自SNAP蛋白的兩個(gè)多肽螺旋與衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋連接在一起。在一個(gè)實(shí)施方式中，貨物部分附著到第四個(gè)單獨(dú)的螺旋上，例如，當(dāng)衍生自SNAP蛋白的兩個(gè)多肽螺旋與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接在一起時(shí)，附著到突觸融合蛋白上。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，這些雙組分系統(tǒng)是二元試劑(binary reagents),可應(yīng)用于類似抗體-抗原相互作用的親和應(yīng)用上。例如，F(xiàn)LAG表位可以附著到目標(biāo)蛋白，并被其同源抗體所識(shí)別，如同可將突觸融合蛋白衍生的標(biāo)簽添加到目標(biāo)蛋白上，并被SNAP25的三螺旋構(gòu)建體和小突觸泡蛋白螺旋所識(shí)別。三螺旋SNARE構(gòu)建體和單獨(dú)的SNARE標(biāo)簽之間的相互作用的親和力可能允許蛋白的固定，或?qū)τ谄渌麘?yīng)用是可逆的。三螺旋構(gòu)建體的生產(chǎn)比抗體更便宜，因此，這是有利的。據(jù)悉，突觸融合蛋白3的頭部結(jié)構(gòu)域保護(hù)其SNARE基序以避免進(jìn)行SNARE的組裝，但某些去垢劑和/或脂質(zhì)可以“開(kāi)啟”突觸融合蛋白用于SNARE的組裝(Darios andDavletov(2006) ；Rickman and Davletov(2005))。因此,在一種實(shí)施方式中，突觸融合蛋白衍生的螺旋具有附著其上的突觸融合蛋白的頭部結(jié)構(gòu)域，該系統(tǒng)還包括去垢劑，優(yōu)選是溫和的去垢劑，如辛基批喃葡萄糖苷(octylglucopyranoside)以開(kāi)啟突觸融合蛋白分子，以便形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。這可以控制突觸融合蛋白SNARE的基序，由此實(shí)現(xiàn)對(duì)SNARE復(fù)合體形成的調(diào)控。此外，該系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括去垢劑，無(wú)論突觸融合蛋白3的頭部結(jié)構(gòu)域是否附著到衍生自突觸融合蛋白的多肽上。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中去垢劑的存在有助于促進(jìn)SNARE復(fù)合體的組裝。優(yōu)選地，所述去垢劑是溫和的去垢劑。有些組裝體在不存在去垢劑時(shí)發(fā)生，但去垢劑的存在促使SNARE復(fù)合體更有效地組裝。優(yōu)選地，所述去垢劑的濃度高于臨界膠束濃度(CMC)，這是去垢劑開(kāi)始形成膠束的濃度。優(yōu)選地，所述去垢劑具有7-12個(gè)碳原子長(zhǎng)的碳鏈。優(yōu)選地，所述去垢劑不是Triton X-100或Thesit。合適的去垢劑可以選自由MEGA 8，C-HEGA 10，CHEGA 11，HEGA 9，庚基吡喃葡萄糖苷，辛基吡喃葡萄糖苷，壬基吡喃葡萄糖苷，zwittergent 3-08, zwittergent 3-10,和 zwittergent 3-12 組成的組。優(yōu)選地，所述去垢劑是辛基吡喃葡萄糖苷。包括去垢劑，具體為溫和去垢劑的該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)是，它允許控制和加快SNARE復(fù)合體的組裝。去垢劑的存在也可以幫助優(yōu)先形成SNARE復(fù)合體，因?yàn)槠渌牡鞍踪|(zhì)相互作用被該去垢劑破壞了。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述螺旋中的一個(gè)可被固定在基質(zhì)上。優(yōu)選地，該螺旋固定在基質(zhì)上。該螺旋可以以任何合適的方式固定，這些方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。該螺旋可通過(guò)連接器固定。所述基質(zhì)可以是任何適合固定螺旋的基質(zhì)。例如，該基質(zhì)可能是表面，基體，珠子，量子點(diǎn)，樹(shù)脂，玻璃，金屬，聚合物，顯微鏡載玻片，陣列或納米管如碳納米管。在一實(shí)施方式中，該螺旋被固定在其上未附著貨物部分的基質(zhì)上。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述復(fù)合系統(tǒng)可以進(jìn)一步包括衍生自復(fù)蛋白的多肽螺旋。所述衍生出多肽螺旋的復(fù)蛋白可以是任何能夠結(jié)合SNARE復(fù)合體的復(fù)蛋白蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道能夠與SNARE復(fù)合體結(jié)合的各種復(fù)蛋白蛋白。例如，所述復(fù)蛋白蛋白可以選自哺乳動(dòng)物的復(fù)蛋白I或復(fù)蛋白2的同工型。衍生自復(fù)蛋白蛋白的螺旋的其他優(yōu)選特點(diǎn)和屬性(如大小)與其他螺旋相同。衍生自復(fù)蛋白的螺旋可以選擇性的攜帶一個(gè)或兩個(gè)貨物部分。由于復(fù)蛋白部分只與已形成的SNARE復(fù)合體結(jié)合，它也可以用于特異性地純化組裝的復(fù)合體。衍生自復(fù)蛋白的螺旋可含有如SEQ ID NO. 63所示的序列。所述衍生自復(fù)蛋白的螺旋可以由這個(gè)序列組成。本發(fā)明的一種可選擇的實(shí)施方式涉及SNARE復(fù)合體，其中，衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接。在此實(shí)施方式中，提供了一個(gè)用于形成分子支架的復(fù)合系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)附著在所述多肽螺旋上的貨物部分；其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，并且其中，衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接。本發(fā)明的該實(shí)施方式涉及上面所描述的三組分系統(tǒng)，其中，衍生自突觸融合蛋白 的多肽螺旋與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，幾乎所有的上述說(shuō)明書(shū)描述的關(guān)于含有長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸的螺旋的復(fù)合系統(tǒng)的限定和優(yōu)選的特征，都等同適用于含有衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋和與其連接的衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋的上述系統(tǒng)中。例如，在這個(gè)系統(tǒng)中，衍生自SNAP蛋白的兩個(gè)螺旋也可能如上所述連接在一起，以生成雙組分系統(tǒng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該領(lǐng)會(huì)到，兩個(gè)螺旋的長(zhǎng)度不需要小于50個(gè)氨基酸。本發(fā)明的另一實(shí)施方式，涉及以上所述的兩個(gè)雙組分系統(tǒng)，提供了一個(gè)用于形成分子支架的復(fù)合系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋； 一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)附著在所述多肽螺旋上的貨物部分；其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，并且其中，所述多肽螺旋連接在一起，以形成兩個(gè)含有螺旋的組分。如上所述，所述雙組分系統(tǒng)可通過(guò)兩種方式形成。首先，所述螺旋中的兩個(gè)可以連接在一起，所述螺旋中的另外兩個(gè)可以連接在一起，以形成兩個(gè)組分，每一組分包括2個(gè)螺旋?；蛘撸雎菪械娜齻€(gè)可以連接在一起，得到含有三個(gè)螺旋的組分，可以與剩下的單獨(dú)的螺旋形成SNARE復(fù)合體。幾乎所有對(duì)上述含有長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸的螺旋的復(fù)合系統(tǒng)的描述，都同樣適用于上述含有兩個(gè)組分的系統(tǒng)。哪部分適用于雙組分系統(tǒng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。例如，所述雙組分系統(tǒng)不需要具有兩個(gè)長(zhǎng)度都小于50個(gè)氨基酸的螺旋。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種用于形成包括兩個(gè)貨物部分的二元復(fù)合物(binary compound)的復(fù)合系統(tǒng),該系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，第一貨物部分與第一螺旋連接，第二貨物部分與第二單獨(dú)的螺旋連接，并且其中，所述SNARE復(fù)合體的形成導(dǎo)致了所述二元復(fù)合物的形成。詞語(yǔ)“二元復(fù)合物”，是指由兩個(gè)獨(dú)立的部分(貨物部分)組成的復(fù)合物，當(dāng)兩部分結(jié)合時(shí)，該復(fù)合物能夠行使其功能。該復(fù)合物的功能將取決于復(fù)合物的兩個(gè)獨(dú)立的部分的功能或鑒定。優(yōu)選地，第一貨物部分具有第一功能，且第二貨物部分具有第二功能。如上所述，第一貨物部分可能具有酶功能或成像功能，第二貨物部分可能具有靶向功能。這使該復(fù)合物靶向到特定位置，在這個(gè)位置上，酶部分或成像部分能夠行使其功能。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述二元復(fù)合物可能是由不同單元形成的多肽。所述多肽可能是由不同單元形成的毒素。合適的毒素是肉毒桿菌毒素，白喉毒素，破傷風(fēng)毒素和蓖麻毒素。適合在本發(fā)明的系統(tǒng)中使用的肽和毒素對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的。例如所述肉毒桿菌毒素由三個(gè)不同的部分組成受體結(jié)合部分；易位部分；和酶部分。因此，酶部分和易位部分可以形成一個(gè)部分(貨物部分)，而受體結(jié)合部分可以形成第二個(gè)部分(貨物部分)，當(dāng)它們被復(fù)合系統(tǒng)聚集在一起時(shí)，功能型肉毒桿菌毒素便形成了。同樣，蓖麻毒素，破傷風(fēng)毒素和白喉毒素可分為兩個(gè)部分，這樣，當(dāng)它們聚集在一起時(shí)便形成了功能型毒素。在一種實(shí)施方式中，所述第一貨物部分具有第一功能，且所述第二貨物部分具有第二功能，當(dāng)它們聚集在一起時(shí)，形成功能齊全的肽，如毒素。由不同單元形成的并且能以上面描述的方式應(yīng)用的肽的選擇，在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。例如，US2009/0035822描述了功能蛋白由獨(dú)立部分的形成。白喉毒素，破傷風(fēng)毒素和蓖麻毒素，能用于治療，例如，治療腫瘤疾病。因此，涉及這些多肽的復(fù)合系統(tǒng)可用于腫瘤疾病的治療。它們還可以被用于治療的方法，包括將含有復(fù)合系統(tǒng)的有效量的組合物給藥至受試者。本發(fā)明還提供了一種形成SNARE復(fù)合體以形成含有兩個(gè)貨物部分的二元復(fù)合物的方法，該方法包括將兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，以及一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋結(jié)合在一起，以形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，第一貨物部分附著到第一螺旋，且第二貨物部分附著到第二單獨(dú)的螺旋，并且其中，所述SNARE復(fù)合體的形成導(dǎo)致了所述二元復(fù)合物的形成。
在另一具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種用于形成肉毒桿菌毒素的復(fù)合系統(tǒng)，該復(fù)合系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；和 一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，第一貨物部分附著到第一螺旋，且第二貨物部分附著到第二單獨(dú)的螺旋，并且其中，所述第一貨物部分含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分，且所述第二貨物部分含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分。本發(fā)明的該實(shí)施方式涉及SNARE復(fù)合體組裝的具體應(yīng)用，其中，肉毒桿菌毒素可以以單獨(dú)的部分生產(chǎn)，從而避免制造過(guò)程中的與完整毒素相關(guān)的任何風(fēng)險(xiǎn)。利用SNARE復(fù)合體的形成可使這兩部分連接起來(lái)，以形成功能型的肉毒桿菌毒素。本發(fā)明還提供上面所描述的復(fù)合系統(tǒng)的應(yīng)用。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供上面所描述的該復(fù)合系統(tǒng)在治療中的應(yīng)用，也提供在治療通過(guò)抑制神經(jīng)突觸而緩解的疾病或狀況中的應(yīng)用。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)充分了解疾病及通過(guò)抑制神經(jīng)突觸所緩解的疾病或狀況，因?yàn)槿舛緱U菌毒素A多年來(lái)已經(jīng)被廣泛用于醫(yī)療和美容中(見(jiàn)，例如，Jankovic (2004). JNeurol Neurosurg Psychiatry 75951-957)。具體地，有些通過(guò)抑制神經(jīng)突觸所緩解的疾病或狀況選自以下組成的組過(guò)度出汗(excessive sweating),過(guò)度流涎(excessivesalivation),肌張力失常(dystonias),胃腸疾病，泌尿疾病，面肌疫攣(facialspasms),斜視，大腦性癱瘓，口吃，慢性緊張性頭痛(chronic tension headaches),hyperlacrymation，多汗癥(hyperhidrosis,)，咽下縮肌疫攣(spasms of the inferiorconstrictor of the pharynx),疫攣性膀胱(spastic bladder),疼痛(pain)，偏頭痛，以及美容(如減少皺紋，抬頭紋(brow furrow)等)本發(fā)明還提供一種治療方法，該方法包括將有效量的上述復(fù)合系統(tǒng)給藥至受試者。本發(fā)明還提供了一個(gè)形成SNARE復(fù)合體以形成肉毒桿菌毒素的方法，該方法包括將兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋結(jié)合在一起，由此形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，第一貨物部分附著到第一螺旋，且第二貨物部分附著到第二單獨(dú)的螺旋，其中，所述第一貨物部分含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分，且第二貨物部分含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分。該方法會(huì)導(dǎo)致肉毒桿菌毒素的兩個(gè)部分聚集在一起，從而產(chǎn)生全功能的肉毒桿菌毒素。此外，本發(fā)明提供用于形成肉毒桿菌毒素的組分，該組分包括衍生自SNAP蛋白、突觸融合蛋白、小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，該多肽螺旋附著到含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分的貨物部分上。本發(fā)明也提供用于形成肉毒桿菌毒素的組分，該組分包括衍生自SNAP蛋白、突觸融合蛋白、小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，該多肽螺旋附著到含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分的貨物部分上。此外，本發(fā)明提供了上述組分的應(yīng)用，以及試劑盒，該試劑盒包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，第一貨物部分附著到第一螺旋，且第二貨物部分附著到第二單獨(dú)的螺旋，并且其中，所述第一貨物部分含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分，且所述第二貨物部分含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以領(lǐng)會(huì)的是，以上所描述的與肉毒桿菌毒素相關(guān)的實(shí)施方式可包括進(jìn)一步的限制，并且本文其他地方描述的與本發(fā)明其他方面和實(shí)施方式相關(guān)的限制也同樣適用于這些肉毒桿菌毒素的實(shí)施方式。在一個(gè)與去垢劑相關(guān)的具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明提供了一種用于形成分子支架的復(fù)合系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)與所述多肽螺旋附著的貨物部分，其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，并且其中，所述SNARE復(fù)合體在去垢劑的存在下形成。上述與復(fù)合系統(tǒng)相關(guān)的各種特征和限制，同樣適用于本發(fā)明的該實(shí)施方式。此前，已被證明的是，花生四烯酸允許SNARE復(fù)合體在Muncl8的存在下形成(Rickman C and Davletov B (2005)) Munc 18被認(rèn)為是SNARE復(fù)合體形成的負(fù)調(diào)節(jié)因子。發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，不存在MunclS時(shí)，去垢劑可允許更好的SNARE復(fù)合體的形成。優(yōu)選地，存在去垢劑的系統(tǒng)中，該系統(tǒng)不包括Muncl8蛋白。該系統(tǒng)是無(wú)Muncl8系統(tǒng)。本發(fā)明還提供了在無(wú)MunclS時(shí)，去垢劑用于促進(jìn)SNARE復(fù)合體組裝的用途。優(yōu)選地，所述去垢劑是溫和的去垢劑。優(yōu)選地，所述去垢劑是合成的去垢劑。在一種實(shí)施方式中，所述去垢劑具有7-12個(gè)碳原子長(zhǎng)度的碳鏈。以上所述的所有本發(fā)明的實(shí)施方式都涉及復(fù)合系統(tǒng)，其中，單一穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體由一個(gè)或多個(gè)附著到該SNARE復(fù)合體上的貨物部分生成。這在很多應(yīng)用中都是有用的，例如，診斷。該系統(tǒng)還可以應(yīng)用于標(biāo)記蛋白的親和純化的標(biāo)簽，蛋白或細(xì)胞的固定，或鑒定標(biāo)記的蛋白(ELISA，Western blot)?；|(zhì)上貨物的固定在診斷和基因芯片方面有用處。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，SNARE復(fù)合體的穩(wěn)定性對(duì)于微流體(microfluidics)或連續(xù)流(continuous flow)應(yīng)用中貨物的固定具有特別的用處,這是顯而易見(jiàn)的。進(jìn)一步的應(yīng)用介紹如下溶液應(yīng)用-重組親和試劑的組裝,包括組合組裝,聚寡聚(poly-oligomerisation),同源寡聚(homo-oligomerisation)和異質(zhì)寡聚(hetero-oIigomerisation)；-功能性貨物的靶向輸送，例如，藥物遞送(藥物為小分子，核酸，蛋白)。例如，用于靶向組裝和貨物的內(nèi)在化信號(hào)；
-蛋白分子和分子復(fù)合體的標(biāo)簽和標(biāo)記，所述分子復(fù)合體包括蛋白分子，細(xì)胞，組織，器官和含有蛋白分子的生物體；-用于二元復(fù)合物的組裝，例如功能性蛋白，酶，因子，輔因子(以及任何其他的功能性蛋白)，F(xiàn)RET標(biāo)簽，二元無(wú)機(jī)化合物和小分子，二元有機(jī)化合物；-蛋白結(jié)構(gòu)的自組裝，和含蛋白(如孢子)的更復(fù)雜組裝，-蛋白在自組裝結(jié)構(gòu)的表面上的組裝后固定。固體表面應(yīng)用-陣列，表面固定；-免疫檢測(cè)(如ELISA)的孔板表面修飾和蛋白的固定；-BIAcore和其他SPR(表面等離子體共振)儀器,表面修飾和蛋白的固定；-QCM(石英晶體微天平)的儀器表面修飾和蛋白的固定；-MALDI質(zhì)譜的板表面修飾和蛋白的固定；-微流體(microfluidic)儀器的表面修飾和蛋白的固定；-毛細(xì)管電泳的表面修飾和蛋白的固定；-層析柱和固定介質(zhì)(如珠子)的表面修飾和蛋白的固定；-掃描探針顯微鏡表面和針的修飾以及蛋白的固定；-微熱量測(cè)定儀和納熱量測(cè)定儀傳感器的表面修飾和蛋白的固定；-微粒子和納米粒子的表面修飾；-固體表面(如鍍金玻片)，薄膜，線(如納米線)和納米管的表面修飾。其他應(yīng)用-納米生物技術(shù)，例如將表面與基于可生物降解蛋白的自組裝“膠合劑(glue) ” “粘結(jié)(gluing) ” 在一起；-基于蛋白的纖維和聚合物；-組織支架和組織工程。此外，本發(fā)明提供上述復(fù)合系統(tǒng)的任何實(shí)施方式的應(yīng)用，具體地，在上述任何應(yīng)用中的應(yīng)用。例如，本發(fā)明提供了復(fù)合系統(tǒng)在診斷中的應(yīng)用，如陣列，檢測(cè)器(assay)，微流體設(shè)備，SPR儀,石英晶體微天平儀,質(zhì)譜儀(mass spectrometer),電泳儀,層析柱,掃描探針顯微鏡，或熱量測(cè)定儀(calorimetry instrument)。例如,所述復(fù)合系統(tǒng)可用于陣列中以將抗體固定在基質(zhì)上。
在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一個(gè)其上固定有穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的儀器，所述SNARE復(fù)合體包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和
一個(gè)或多個(gè)與所述多肽螺旋附著的貨物部分，其中，所述儀器選自陣列設(shè)備，檢測(cè)設(shè)備，微流體設(shè)備，SPR儀，石英晶體微天平儀器，質(zhì)譜儀，電泳儀，層析柱，掃描探針顯微鏡，和熱量測(cè)定儀。本發(fā)明還提供了一種形成攜帶一個(gè)或多個(gè)貨物部分的SNARE復(fù)合體的方法，該方法包括將兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋結(jié)合在一起，以形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，一個(gè)或多個(gè)貨物部分與所述多肽螺旋附著，并且其中(i)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接；(ii)所述多肽螺旋連接在一起，以形成兩個(gè)含螺旋的組分；或者(iii)至少有兩個(gè)多肽螺旋的長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸。有關(guān)本發(fā)明的系統(tǒng)的以上描述和限制，也同樣適用于上述方法。本發(fā)明還提供了一個(gè)組分，該組分含有與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接的、衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，并且其中，兩個(gè)連接的螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的一部分。在一種實(shí)施方式中，所述兩個(gè)螺旋連接在一起以使它們可以組裝進(jìn)同一穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體?；蛘?，所述兩個(gè)螺旋可能被連接在一起，以使它們不能組裝進(jìn)同一穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。在這種替代的實(shí)施方式中，這兩個(gè)螺旋應(yīng)可以組裝進(jìn)不同的穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。本發(fā)明的兩個(gè)螺旋組分含有衍生自突觸融合蛋白的螺旋和衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的螺旋，其可具有以下序列中的其中之一所示的序列SEQ ID NO. 12,13，14 和 73。突觸融合蛋白3(1-260)/小突觸泡蛋白2(1-84)(突觸融合蛋白具有頭部結(jié)構(gòu)域和連接器)-SEQ ID NO. 12突觸融合蛋白3(195-253)/小突觸泡蛋白2 (1_84)(突觸融合蛋白沒(méi)有頭部結(jié)構(gòu)域，但有連接器)-SEQ ID NO. 13突觸融合蛋白3(1-253)/小突觸泡蛋白2 (29_84)(突觸融合蛋白有頭部結(jié)構(gòu)域，但沒(méi)有連接器)-SEQ ID NO. 14突觸融合蛋白3(195-253)/小突觸泡蛋白2 (29_84)(突觸融合蛋白無(wú)頭部結(jié)構(gòu)域，也沒(méi)有連接器)_SEQ ID NO. 73本發(fā)明的所述兩個(gè)螺旋組分含有衍生自突觸融合蛋白的螺旋和衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的螺旋，其可能由上述序列之一構(gòu)成。所述兩個(gè)螺旋組分可以進(jìn)一步含有一個(gè)或多個(gè)與所述多肽螺旋附著的貨物部分。本發(fā)明還提供一個(gè)組分，該組分含有兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，以及一個(gè)要么衍生自小突觸泡蛋白的多肽螺旋，要么衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，其中，這三個(gè)螺旋連接在一起以形成三 螺旋組分，并且其中，這三個(gè)連接的螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的一部分。在一種實(shí)施方式中，這三個(gè)螺旋衍生自小突觸泡蛋白。在另一實(shí)施方式中，這三個(gè)螺旋連接在一起，使它們能夠組裝進(jìn)同一穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。含有SNAP-25螺旋和衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的螺旋的本發(fā)明的三螺旋組分可具有SEQ ID NO. 15。進(jìn)一步地，該三螺旋組分可由該序列組成。或者，這三個(gè)螺旋可以連接在一起，使兩個(gè)SNAP螺旋可以組裝進(jìn)同一穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，但第三個(gè)螺旋不能組裝到與兩個(gè)SNAP螺旋相同的穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體上。在這種可選擇的實(shí)施方式中，所述第三個(gè)螺旋應(yīng)該能夠組裝到與兩個(gè)SNAP螺旋不同的穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體上。這個(gè)三螺旋組分可進(jìn)一步含有一個(gè)或多個(gè)與所述多肽附著的貨物部分。此外，本發(fā)明提供了上述組分的應(yīng)用，例如，形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體用于形成分子支架。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了一個(gè)試劑盒，該試劑盒包括含有與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接的、衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋的組分，并且其中，兩個(gè)連接的螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的一部分。該試劑盒可進(jìn)一步包含兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，其可與突觸融合蛋白/小突觸泡蛋白衍生的螺旋形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。這兩個(gè)SNAP螺旋可連接在一起。在一可選擇的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一個(gè)試劑盒，該試劑盒包括含有兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，和一個(gè)要么衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，要么衍生自小突觸泡蛋白的多肽螺旋的組分，其中，這三個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)連接在一起，形成三螺旋組分，并且其中，這三個(gè)連接的螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的一部分。該試劑盒可進(jìn)一步包括衍生自第四SNARE蛋白的單獨(dú)的多肽螺旋。所以，如果三螺旋組分含有兩個(gè)SNAP衍生的螺旋和一個(gè)小突觸泡蛋白或其同系物衍生的螺旋，該試劑盒可進(jìn)一步包括單獨(dú)的衍生自突觸融合蛋白的多肽，其可與連接的SNAP/小突觸泡蛋白衍生的螺旋形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體?；蛘撸绻@個(gè)三螺旋組分含有兩個(gè)SNAP衍生的螺旋和一個(gè)突觸融合蛋白衍生的螺旋，該試劑盒可進(jìn)一步包括單獨(dú)的衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其可與連接的SNAP/突觸融合蛋白衍生的螺旋形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包括可與此試劑盒一起應(yīng)用的合適的試劑。該試劑盒的所述螺旋和SNARE復(fù)合體的進(jìn)一步特征如上所述。所述復(fù)合系統(tǒng)也可以用來(lái)形成SNARE復(fù)合體的多聚體。這是很多的SNARE復(fù)合體連接在一起。在一個(gè)實(shí)施方式中，兩個(gè)螺旋以這樣的方式連接在一起以使它們?cè)谕粡?fù)合體中不能形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。然而，這兩個(gè)螺旋應(yīng)該以這樣一種方式連接在一起以使它們每個(gè)在不同的SNARE復(fù)合體中都能形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。這可以通過(guò)直接將螺旋連接在一起來(lái)實(shí)現(xiàn)，無(wú)需任何類型的連接器，以使這兩個(gè)螺旋在同一 SNARE復(fù)合體中不能采取正確的構(gòu)象。相反，在這樣雙螺旋連接構(gòu)建體中的每個(gè)螺旋能夠與三個(gè)其他多肽螺旋復(fù)合，以形成兩個(gè)穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。這兩個(gè)螺旋可以任何合適的方式連接在一起，例如，通過(guò)重組的手段或化學(xué)偶合。舉一個(gè)雙組分系統(tǒng)為例，在該雙組分系統(tǒng)中，兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的螺旋連接在一起，且衍生自突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白的兩個(gè)螺旋以限制性的方式連接在一起使它們不能組裝進(jìn)同一 SNARE復(fù)合體中。從突觸融合蛋白-小突觸泡蛋白融合蛋白開(kāi)始，SNAP融合蛋白將與突觸融合蛋白復(fù)合。來(lái)自其他突觸融合蛋白-小突觸泡蛋白融合蛋白的小突觸泡蛋白將與SNAP-突觸融合蛋白的復(fù)合體相結(jié)合形成四-螺旋SNARE復(fù)合體。該復(fù)合體將具有從其伸出的突觸融合蛋白螺旋和小突觸泡蛋白螺旋，來(lái)自突觸融合蛋白-小突觸泡蛋白融合蛋白中的一個(gè)。這些單獨(dú)的螺旋突起是進(jìn)一步形成多個(gè)SNARE復(fù)合體的基礎(chǔ)。因此，SNARE復(fù)合體的多聚體形成了。在上面的例子中，所述SNAP螺旋沒(méi)有連接在一起。此外，在此系統(tǒng)中任何兩個(gè)螺旋都可以連接在一起工作，只要它們都不能組裝進(jìn)同一復(fù)合體中形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。
本發(fā)明還提供了通過(guò)上述系統(tǒng)生產(chǎn)的多聚體?；蛘撸赏ㄟ^(guò)控制系統(tǒng)的反應(yīng)條件來(lái)形成多聚體。該系統(tǒng)的兩個(gè)螺旋必須結(jié)連接在一起。這可以通過(guò)任何合適的方式。這兩個(gè)螺旋并不需要限于上述例子中的任何方式，雖然需要的話它們可以利用那些方式。該系統(tǒng)還包括單獨(dú)的衍生自同一 SNARE蛋白的螺旋，作為兩個(gè)連接在一起的螺旋之一。例如，在含有突觸融合蛋白-小突觸泡蛋白融合蛋白的系統(tǒng)中，該系統(tǒng)可進(jìn)一步含有單獨(dú)的突觸融合蛋白螺旋。為了生產(chǎn)多聚體，所述單獨(dú)的突觸融合蛋白螺旋溶解到溶液中。如上面所討論的那樣，這個(gè)單獨(dú)的螺旋在溶液中可以是游離或固定在基質(zhì)上的。兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的螺旋(可能連接或可能未連接)加入到溶液中。這些螺旋與突觸融合蛋白的螺旋結(jié)合以形成突觸融合蛋白-SNAP三螺旋復(fù)合體。在此之后，突觸融合蛋白-小突觸泡蛋白融合蛋白被添加到該溶液中。來(lái)自此融合蛋白的小突觸泡蛋白螺旋結(jié)合到三螺旋復(fù)合體上以形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，同時(shí)突觸融合蛋白螺旋將保持未結(jié)合并將從SNARE復(fù)合體中伸出。通過(guò)重復(fù)上述相同的步驟，這一突觸融合蛋白突起可以被進(jìn)一步用來(lái)形成SNARE復(fù)合體，從而產(chǎn)生多聚體。由于上述系統(tǒng)需要螺旋以特定順序添加，確保在特定步驟后沒(méi)有多余的分子是需要的。這可以通過(guò)例如固定單獨(dú)的突觸融合蛋白螺旋和在每次結(jié)合步驟后進(jìn)行洗滌來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明還提供了通過(guò)上述系統(tǒng)產(chǎn)生的多聚體。此外，本發(fā)明提供了含有連接在一起的多個(gè)穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的多聚體，其中，每個(gè)SNARE復(fù)合體包括 兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，來(lái)自SNARE復(fù)合體的螺旋與來(lái)自另一個(gè)SNARE復(fù)合體的螺旋連接，以將SNARE復(fù)合體連接在一起，并且其中，一個(gè)或多個(gè)貨物部分附著在所述多肽螺旋上。本發(fā)明的所述多聚體可以是線性的。如果它是線性的，每個(gè)SNARE復(fù)合體的兩端將被附著另外兩個(gè)SNARE復(fù)合體，以形成類似一串珠子的長(zhǎng)的線性鏈。因此，SNARE復(fù)合體中的兩個(gè)螺旋將與兩個(gè)不同的SNARE復(fù)合體的螺旋附著。顯然，在鏈的末端的SNARE復(fù)合體只通過(guò)一個(gè)多肽螺旋與另外的一個(gè)SNARE復(fù)合體附著?；蛘撸龆嗑垠w可以是分支的。這可以通過(guò)例如以任何順序?qū)⑿⊥挥|泡蛋白衍生的螺旋與兩個(gè)突觸融合蛋白衍生的螺旋連接。這個(gè)三連接構(gòu)建體中的小突觸泡蛋白衍生的螺旋將附著到突觸融合蛋白/SNAP衍生的三螺旋中間體上，以形成具有兩個(gè)未被結(jié)合的突觸融合蛋白衍生的螺旋的SNARE復(fù)合體。當(dāng)加入SNAP衍生的螺旋時(shí)(例如SNAP-25)，兩個(gè)連接的突觸融合蛋白/SNAP-25中間體將形成。加入“正?！钡男⊥挥|泡蛋白-突觸融合蛋白(雙螺旋)衍生的構(gòu)建體，兩個(gè)連接的SNARE復(fù)合體將形成，具有兩個(gè)突出的突觸融合蛋白衍生的螺旋。這將產(chǎn)生兩個(gè)分支用于進(jìn)一步的生長(zhǎng)。因此，連接3個(gè)螺旋允許分支存在(與用于線性聚合的兩個(gè)連接螺旋不同)。因此，如果多聚體是分支的，多聚體內(nèi)的SNARE復(fù)合體將附著到三個(gè)其他的SNARE復(fù)合體上，以形成分支點(diǎn)，而不是如線性鏈的附著到兩個(gè)其他的SNARE復(fù)合體上。在分支點(diǎn)上的SNARE復(fù)合體的三個(gè)螺旋將附著在三個(gè)不同的SNARE復(fù)合體的螺旋上該多聚體可具有附著到螺旋任何一個(gè)末端上的貨物部分。該多聚體可具有多個(gè)附著到多聚體的螺旋的末端上的貨物部分。在一種實(shí)施方式中，該多聚體可在每個(gè)SNARE復(fù)合體上具有貨物部分。該多聚體可具有與每個(gè)SNARE復(fù)合體附著的多個(gè)貨物部分。如果該多聚體具有多個(gè)貨物部分，它們可以相同或不同。通過(guò)在每次洗滌步驟后提供攜帶不同貨物的SNARE結(jié)構(gòu)域，可以控制多個(gè)貨物的加入和有序排列。本發(fā)明還提供了生產(chǎn)多聚體的方法，該方法包括以下步驟I)提供衍生自第一 SNARE螺旋的第一多肽螺旋；2)將第二多肽螺旋和第三多肽螺旋與第一多肽螺旋結(jié)合，以形成三螺旋中間體復(fù)合體，其中，第二多肽螺旋和第三多肽螺旋衍生自第二 SNARE螺旋和第三SNARE螺旋；3)將第四多肽螺旋與三螺旋束結(jié)合，以形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，所述第四多肽螺旋衍生自第四SNARE螺旋，并且其中，所述第四多肽螺旋與衍生自第一 SNARE螺旋的第五多肽螺旋連接；并且4)重復(fù)步驟2)和3)，以形成多聚體，其中，一個(gè)或多個(gè)貨物部分與所述多肽螺旋附著。上述有關(guān)復(fù)合系統(tǒng)，多聚體和各種限制的描述也適用于上述方法。步驟2)和3)可根據(jù)需要多次重復(fù)，以生產(chǎn)所需長(zhǎng)度的多聚體。上面的方法涉及第一，第二，第三和第四SNARE螺旋。如上所述，SNARE復(fù)合體由四個(gè)螺旋形成。其中的兩個(gè)螺旋是由SNAP蛋白提供的，一個(gè)是由突觸融合蛋白提供的，一個(gè)是由小突觸泡蛋白或其同系物提供的。因此，在上述方法中，沒(méi)有特定的順序，這四個(gè)螺旋是第一，第二，第三和第四SNARE螺旋。這是因?yàn)橹灰@四個(gè)螺旋用于SNARE復(fù)合體，具體螺旋的同一性并不重要?？蛇x地，如上所述，所述SNARE復(fù)合體也可以結(jié)合復(fù)蛋白。在一種實(shí)施方式中，所述第一螺旋是突觸融合蛋白衍生的螺旋；所述第二螺旋是SNAP衍生的螺旋；所述第三螺旋是SNAP衍生的螺旋；所述第四螺旋是小突觸泡蛋白衍生的螺旋；以及所述第五螺旋是突觸融合蛋白衍生的螺旋。鑒于在SNARE復(fù)合體中四個(gè)螺旋可以以任何順序使用的事實(shí)，所述第五多肽螺旋不需要與所述第一多肽螺旋衍生于相同的SNARE螺旋。同樣，當(dāng)?shù)诙?，第三，第四，第五，第六等形成時(shí)，重復(fù)作為此方法的步驟的多聚體中的SNARE復(fù)合體，第二，第三和第四多肽螺旋不需要與第一 SNARE復(fù)合體中的第二，第三，第四多肽螺旋衍生自相同的SNARE螺旋。唯一的要求是，所有四個(gè)的SNARE螺旋代表每個(gè)SNARE復(fù)合體，以形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的形式。由于上述方法涉及多步驟的過(guò)程，與只要它們形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的第一個(gè)步驟相比，允許在隨后的重復(fù)步驟中引入不同的多肽螺旋的可能性。例如，在第一個(gè)循環(huán)步驟中，衍生自SNAP蛋白的一個(gè)多肽螺旋可能是全長(zhǎng)的SNAP-25螺旋，而在第二個(gè)循環(huán)步驟中，這個(gè)多肽螺旋可能是45個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的SNAP-25螺旋。重要的方面是，兩個(gè)多肽螺旋都衍生自相同的SNARE螺旋(例如，特定的SNAP螺旋)，使所有四個(gè)的SNARE螺旋代表SNARE復(fù)合體。 由于一個(gè)或多個(gè)貨物部分附著所述多肽螺旋，所以得到的多聚體也具有附著其上的貨物部分。這可以通過(guò)在應(yīng)用到此方法之前將貨物部分附著到所述多肽螺旋上來(lái)完成。優(yōu)選地，所述貨物部分附著到所述多肽螺旋的末端?？梢詫⒋罅康呢浳锊糠忠氲剿龆嗑垠w中。這可以通過(guò)將貨物部分附著到大量的多肽螺旋上來(lái)完成，然后利用上述方法將所述多肽螺旋合并到多聚體中。所述貨物部分可以相同或不同。 為了使該方法更簡(jiǎn)單，優(yōu)選地，在重復(fù)步驟中，保持第一，第二，第三和第四SNARE螺旋的同一性。因此，舉例來(lái)說(shuō)，如果在產(chǎn)生第一 SNARE復(fù)合體的第一循環(huán)步驟中，第一SNARE螺旋是突觸融合蛋白，第二和第三SNARE螺旋來(lái)自SNAP蛋白，且第四SNARE螺旋是小突觸泡蛋白或其同系物，那么，在隨后進(jìn)一步產(chǎn)生SNARE復(fù)合體的循環(huán)步驟中，第一 SNARE螺旋總是突觸融合蛋白，第二個(gè)和第三個(gè)SNARE螺旋總是來(lái)自SNAP蛋白，并且第四SNARE螺旋總是小突觸泡蛋白或其同系物。此外，優(yōu)選地，在重復(fù)步驟中，保持第二，第三，第四和第五多肽螺旋的同一性。因此，舉例來(lái)說(shuō)，如果在產(chǎn)生第一 SNARE復(fù)合體的第一循環(huán)步驟中，第二和第三SNARE螺旋來(lái)自SNAP蛋白，第四SNARE螺旋來(lái)自小突觸泡蛋白SNARE螺旋，第五多肽螺旋來(lái)自突觸融合蛋白，在隨后進(jìn)一步產(chǎn)生SNARE復(fù)合體的循環(huán)步驟中，第五多肽螺旋(在下一個(gè)SNARE復(fù)合體中形成第一螺旋)始終是突觸融合蛋白，第二和第三SNARE螺旋總是來(lái)自SNAP-25，并且第四SNARE螺旋始終是小突觸泡蛋白SNARE螺旋。在一種實(shí)施方式中，所述第二和第三多肽螺旋連接在一起，這樣它們可以組裝進(jìn)同一 SNARE復(fù)合體。優(yōu)選地，所述第二和第三多肽螺旋是全長(zhǎng)的SNAP蛋白，如SNAP-25。如果在所有隨后的步驟中，所述多肽螺旋的同一性相同，并且，所述第二和第三多肽螺旋連接在一起，那么，僅僅使用兩種構(gòu)建模塊(building blocks)就能使得多聚體快速形成。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一多肽螺旋固定在基質(zhì)上。合適的基質(zhì)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，并且已在上文進(jìn)行過(guò)討論。該方法還可以進(jìn)一步包括在每次結(jié)合步驟后進(jìn)行洗滌，以去除未結(jié)合的螺旋。這將確保這些未結(jié)合的螺旋在后續(xù)步驟中不干擾多聚體的形成。優(yōu)選地，在洗滌步驟之前，通過(guò)該方法形成的多聚體被固定。該方法可被修飾，以將分支引入到多聚體中。為了做到這一點(diǎn)，衍生自第一 SNARE螺旋的第六多肽螺旋與第二，第三，第四或第五多肽螺旋中的一個(gè)連接，以提供另一個(gè)穩(wěn)定的SNARE復(fù)合可形成于其上的螺旋。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第六多肽螺旋與第二或第三多肽螺旋連接。在另一種實(shí)施方式中，所述第六多肽螺旋與第四或第五多肽螺旋連接。這使得兩個(gè)其他的SNARE復(fù)合體源于特定的SNARE復(fù)合體，從而在多聚體中引入分支。這可以通過(guò)例如，將小突觸泡蛋白衍生的螺旋以任何順序與兩個(gè)突觸融合蛋白衍生的螺旋連接來(lái)實(shí)現(xiàn)，如上所述?；蛘撸挥|融合蛋白螺旋可以與SNAP-25(作為第二和第三螺旋)連接，以起始第二 SNARE復(fù)合體從起始SNARE復(fù)合體處的形成，意味著，起始SNARE復(fù)合體將被整體附著到另外的三個(gè)SNARE復(fù)合體上，以形成分支點(diǎn)。此外，通過(guò)進(jìn)一步引入與所述SNARE復(fù)合體的其他螺旋連接的螺旋(除第六螺旋以外，)可以在特定SNARE復(fù)合體上引入多個(gè)分支。例如，小突觸泡蛋白衍生的螺旋可以以任何順序與三個(gè)或更多個(gè)突觸融合蛋白衍生的螺旋連接?；蛘撸瑑蓚€(gè)或兩個(gè)以上的突觸融合蛋白衍生的螺旋可以與SNAP-25(即第二和第三螺旋)連接，以起始第三，第四等的形成。來(lái)自起始SNARE復(fù)合體的SNARE復(fù)合體，是指起始SNARE復(fù)合體將整體附著到四個(gè)或更多其它的SNARE復(fù)合體，以形成多個(gè)分支點(diǎn)。
在一個(gè)特定的點(diǎn)和整個(gè)多聚體上都可以按需要引入分支。本發(fā)明還提供按上面的方法生產(chǎn)的多聚體。上面描述的多聚體在大量的應(yīng)用中都非常有用，例如，診斷，和如下應(yīng)用中溶液應(yīng)用-重組親和試劑的組裝，包括組合組裝，聚寡聚，同源寡聚和異質(zhì)寡聚；-功能性貨物的靶向輸送，例如，藥物遞送(藥物為小分子，核酸，蛋白)。例如，用于靶向組裝和貨物的內(nèi)在化信號(hào)；-蛋白分子和分子復(fù)合體的標(biāo)簽和標(biāo)記，所述分子復(fù)合體包括蛋白分子，細(xì)胞，組織，器官和含有蛋白分子的生物體；-用于多聚化合物的組裝，例如功能性蛋白，酶，因子，輔因子(以及任何其他的功能蛋白)，F(xiàn)RET標(biāo)簽，多聚無(wú)機(jī)化合物和小分子、多聚有機(jī)化合物；-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的自組裝，和含蛋白(如孢子)的更復(fù)雜組裝，-蛋白在自組裝結(jié)構(gòu)的表面上的組裝后固定。固體表面應(yīng)用-陣列，表面固定；-免疫檢測(cè)(如ELISA)的孔板表面修飾和蛋白的固定；-BIAcore和其他SPR(表面等離子體共振)儀器，表面修飾和蛋白的固定；-QCM的儀器表面修飾和蛋白的固定；-MALDI質(zhì)譜的板表面修飾和蛋白的固定；-微流體儀器的表面修飾和蛋白的固定；-毛細(xì)管電泳的表面修飾和蛋白的固定；-層析柱和固定的介質(zhì)(如珠子)的表面修飾和蛋白的固定；-掃描探針顯微鏡表面和針的修飾以及蛋白的固定；-微熱量測(cè)定儀和納熱量測(cè)定儀傳感器的表面修飾和蛋白的固定；-微粒子和納米粒子的表面修飾；-固體表面(如鍍金玻片)，薄膜，線(如納米線)和納米管的表面修飾。其他應(yīng)用-納米生物技術(shù)，例如將表面與基于可生物降解蛋白的自組裝“膠合劑”“粘結(jié)”在一起;-基于蛋白的纖維和聚合物；-組織支架和組織工程?，F(xiàn)在，僅以舉例的方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，參考圖片如下
圖I是在神經(jīng)遞質(zhì)釋放時(shí)促使囊泡融合的分子機(jī)制的示意圖。核心SNARE復(fù)合體是由4個(gè)由小突觸泡蛋白，突觸融合蛋白和SNAP-25提供的α-螺旋形成的。突觸結(jié)合蛋白(synaptotagmin)作為I丐傳感器，以及密切調(diào)控囊泡融合過(guò)程中SNARE的快速移動(dòng)(zipping)。圖2是多功能單元以不可逆和位點(diǎn)特異的方式連接成束或線性多聚體的示意圖。箭頭代表連接支架；幾何圖形代表功能單元。圖3A展示的是由長(zhǎng)度至少為80個(gè)氨基酸的四個(gè)多肽構(gòu)成的四螺旋SNARE束(Sutton et al. ，1998)。圖3B展示的是為40和45個(gè)氨基酸多肽設(shè)計(jì)的SNARE基序。陰影是疏水層，中央層用深灰色強(qiáng)調(diào)。圖4是SDS-PAGE凝膠電泳圖，展示的是45個(gè)氨基酸的多肽能夠形成不可逆的SNARE復(fù)合體(A組)，而40個(gè)氨基酸的肽則不能(B組)。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，發(fā)明人稱這種組裝體為T(mén)etriCS (四螺旋組合支架)。圖5是圖表，顯示鏈霉親和素可以以高特異性的方式結(jié)合45個(gè)氨基酸的Tetrics肽，該肽要么附著到谷胱甘肽珠，要么附著到鎳珠。圖6是含有全長(zhǎng)的SNAP-25分子(1_206位氨基酸)的三組分SNARE束的示意圖，其具有兩個(gè)SNARE螺旋和單獨(dú)的突觸融合蛋白，以及小突觸泡蛋白SNARE螺旋。圖7是SDS-PAGE凝膠電泳圖，展示的是40個(gè)氨基酸(A組)和45個(gè)氨基酸(B組)多肽都可以與SNAP25B組裝，這表明在三組分系統(tǒng)中，40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多肽足夠與全長(zhǎng)的SNAP-25不可逆地結(jié)合。圖8是圖表，該圖展示了珠子上只有GST-SNAP-25的對(duì)照反應(yīng)表現(xiàn)出微不足道的結(jié)合，而40個(gè)氨基酸的分別攜帶Myc標(biāo)簽和S標(biāo)簽的突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白多肽加入后，導(dǎo)致了三組分復(fù)合體的形成，正如被抗-Myc抗體和S-蛋白與谷胱甘肽珠的強(qiáng)大的結(jié)合所證明的那樣。圖9是傳感圖，展示的是40個(gè)氨基酸的突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白多肽與固定的SNAP25B結(jié)合?？筸yc抗體(Myc)與突觸融合蛋白_myc表位結(jié)合,但可以被O. 1%的SDS洗脫。結(jié)合的突觸融合蛋白/小突觸泡蛋白多肽不能通過(guò)SDS分離。

圖10是含有SNAP-25分子的雙組分SNARE束的示意圖，其具有兩個(gè)SNARE螺旋和突觸融合蛋白/小突觸泡蛋白的融合蛋白。圖11是示意圖，其顯示了大鼠突觸融合蛋白IA SNARE基序(195-254位氨基酸)與大鼠小突觸泡蛋白2SNARE基序(25-84位氨基酸)的連接，如灰色箭頭所示。圖12是SDS-PAGE凝膠電泳圖，展示的是突觸融合蛋白3_小突觸泡蛋白2融合蛋白和大鼠SNAP-25B快速組裝成不可逆的復(fù)合體。
圖13是示意圖，展示的是大鼠突觸融合蛋白3的頭部結(jié)構(gòu)域和SNARE基序(1_260位氨基酸)借助氨基酸的短支鏈(stretch)與大鼠小突觸泡蛋白2的1_84序列融合。圖14A是SDS-PAGE凝膠電泳圖，展示的是辛基吡喃葡萄糖苷能夠“開(kāi)啟”突觸融合蛋白3分子，以允許雙組分組裝體的形成。圖14B是SDS-PAGE凝膠電泳圖，展示的是辛基吡喃葡萄糖苷去垢劑的濃度在CMC(臨界膠束濃度，該去垢劑的CMC為O. 6% )以上時(shí)，辛基吡喃葡萄糖苷去垢劑可促進(jìn)緊密的SNARE復(fù)合體的組裝。一些組裝確實(shí)可在無(wú)去垢劑的情況下發(fā)生，但有效的組裝需要去垢劑辛基吡喃葡萄糖苷“開(kāi)啟”突觸融合蛋白3分子以允許雙組分組裝體的形成。圖15是表面等離子體共振傳感圖，展示的是突觸融合蛋白-小突觸泡蛋白融合蛋白㈩的結(jié)合，以及突觸融合蛋白/小突觸泡蛋白融合蛋白與固定在CM5芯片上的SNAP-25之間的組裝的獨(dú)特的耐受性。使用2M氯化鈉(I)，pH 2. 5的甘氨酸(2)，1% SDS (3)，O. IM氫氧化鈉(4)，O. IM磷酸(5)洗滌，不能破壞二元捕獲試劑。注意，步驟(3)重復(fù)兩次。圖16A是含有三螺旋分子(黑)和第四螺旋(灰)的雙組分SNARE束的示意圖。圖16B是SDS-PAGE凝膠電泳圖，顯示的是40個(gè)氨基酸和45個(gè)氨基酸的突觸融合蛋白IA肽可以與由SNAP-25B和小突觸泡蛋白 2構(gòu)成的三-螺旋融合蛋白(SNAP-25B (22-206)/Syb2 (1-84))組裝體，表明在雙組分系統(tǒng)中，長(zhǎng)度為40個(gè)氨基酸的肽足夠用于不可逆的SNARE復(fù)合體的形成。注意，在SDS凝膠中，SDS耐受復(fù)合體比三-螺旋蛋白的遷移速度快，可能是由于其緊湊的結(jié)構(gòu)。圖17是SDS-PAGE凝膠電泳圖，顯示的是GST_SNAP_25可以以高度特異性的方式與攜帶突觸融合蛋白3/小突觸泡蛋白2融合蛋白的瓊脂糖珠結(jié)合。注意，突觸融合蛋白3/小突觸泡蛋白2融合蛋白共價(jià)連接到BrCN瓊脂糖珠，因此不會(huì)被洗脫下來(lái)，這在SDS PAGE凝膠中是可觀察到的。泳道I為使用zwitergent 3_08得到的細(xì)菌提取物。泳道2為用攜帶突觸融合蛋白3/小突觸泡蛋白2融合蛋白的珠子純化的GST-SNAP-25。圖18是超分子器件的示意圖，該超分子器件的形式為由SNARE蛋白組成的無(wú)限長(zhǎng)度的強(qiáng)線性多聚體。圖19是使用SNARE蛋白形成長(zhǎng)的線性多聚體的方法示意圖。圖20 (A)考馬斯染色的凝膠顯示出突觸融合蛋白3-小突觸泡蛋白2融合蛋白和與珠子結(jié)合的SNAP-25的數(shù)量均逐步增加。注意，當(dāng)用于附著到珠子上的GST-突觸融合蛋白3的數(shù)量保持不變時(shí)，則結(jié)合的SNAP-25和突觸融合蛋白3-小突觸泡蛋白2融合蛋白的數(shù)量逐步增加。為了顯示結(jié)合材料的數(shù)量，將樣品煮沸以破壞組裝體的SDS耐受特性。(B)如A所述，但是，在SDS-PAGE前樣品不煮沸。注意，SDS耐受性聚合物的分子量的增加與額外的聚合步驟成線性相關(guān)。圖21是SNARE蛋白形成的分支多聚體的示意圖。圖22是由突觸融合蛋白3殘基(1-253)直接融合到小突觸泡蛋白2殘基(29_84)構(gòu)造形成的融合構(gòu)建體(無(wú)連接器)的示意圖。圖23是SDS-PAGE凝膠電泳圖，展示的是SNARE束在溶液中通過(guò)簡(jiǎn)單的混合可以是多聚化的(multimerised)。圖24展示的是，SNARE標(biāo)簽允許He-介導(dǎo)的量子點(diǎn)(quantum dots)傳遞到突觸末梢。a圖示意性顯示的是LcHN部分與BoNT/A的He部分的SNARE連接。單個(gè)亞基如在結(jié)構(gòu)模型中所示(改編自Lacy等，1998)。b圖示意性顯示的是SNARE標(biāo)簽圖，用于連接鏈霉未和素包覆的量子點(diǎn)與肉毒桿菌毒素SV2C-結(jié)合部分(He)。生物素(星)-突觸融合蛋白肽(藍(lán)色)允許量子點(diǎn)具有SNARE標(biāo)簽，然而He融合到小突觸泡蛋白SNARE基序上(紫色)。SNAP25(綠色和紅色)，允許量子點(diǎn)與He連接。c圖為考馬斯染色的SDS凝膠圖，呈現(xiàn)的是=Hc-小突觸泡蛋白，SNAP25和生物素化的突觸融合蛋白3多肽不可逆地組裝為SDS耐受復(fù)合體。d圖，Hc-SNARE-Q-dots呈現(xiàn)的是突觸的結(jié)合，正如通過(guò)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的軸突延伸的突觸囊泡標(biāo)記物突觸小泡蛋白(synaptophysin)的免疫染色所證明的。在組裝過(guò)程中SNAP25的缺失阻止Q-dots靶向突觸終端。圖25展示的是=SNARE標(biāo)簽允許獨(dú)立的部分BoNT/A逐步組裝成單分子實(shí)體。a圖顯示二硫鍵的位置，以及LcHN和BoNT/A的He部分的SNARE標(biāo)簽。b圖，帶有SNAP25標(biāo)簽的LcHN，可以純化和用50mM的二硫蘇糖醇(DTT)處理后分解成Lc和HN-SNAP25?？捡R斯染色的SDS凝膠。c圖，帶有SNAP25標(biāo)簽的LcHN，可以與小突觸泡蛋白標(biāo)記的He連接，加入突觸融合蛋白3肽，如通過(guò)考馬斯染色和熒光成像SDS凝膠所證明的。圖26展示的是=SNARE-連接的肉毒桿菌毒素顯示出突觸的定位和分裂其內(nèi)突觸(intrasynaptic)祀標(biāo)。a圖，突光標(biāo)記的LcHN-SNARE-Hc與海馬神經(jīng)元的軸突延伸結(jié)合?？雇挥|小泡蛋白抗體的免疫染色突顯了培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的突觸前末梢。b圖，免疫印跡顯示，內(nèi)突觸SNAP25以與天然的BoNT/A相似的方式被組裝好的神經(jīng)毒素分裂。圖27呈現(xiàn)的是SNARE-連接的肉毒桿菌神經(jīng)毒素抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。a圖，對(duì)離體大鼠腦突觸末梢(突觸小體，synaptosomes)釋放的谷氨酸鹽(glutamate)的突光測(cè)量表明，LcHN SNARE-Hc和BoNT/A之間有類似的抑制程度。在毒素與突觸小體孵育I小時(shí)后，獲得谷氨酸鹽實(shí)時(shí)釋放圖(上圖)和劑量依賴圖(下圖，用35mM氯化鉀和2mM氯化鈣刺激15分鐘后進(jìn)行評(píng)估)。b圖，在與突觸小體孵育I小時(shí)后，單獨(dú)的SNARE-標(biāo)記的神經(jīng)毒素部分不能阻斷谷氨酸鹽的釋放，如15分鐘的刺激后所評(píng)估的。c圖，圖表顯示小鼠橫隔膜(diaphragm)被 LcHN-SNARE-Hc 等長(zhǎng)收縮(siometric contractions)的劑量依賴性抑制。誤差線代表SEM，η = 3。圖28呈現(xiàn)的是突觸融合蛋白3(195-253)標(biāo)記的LcHn，而He是由小突觸泡蛋白(25-84)標(biāo)記的。兩個(gè)肉毒桿菌部分在SNAP-25存在時(shí)混合，毒素的形成在考馬斯染色的SDS凝膠上是可視的。圖29展示的是與來(lái)自A組(panel A)的LcHnSyx3_SNAP25-小突觸泡蛋白He孵育I小時(shí)后評(píng)估的大鼠腦突觸小體的谷氨酸鹽釋放的阻止量。圖30展示的是，在海馬神經(jīng)元上應(yīng)用來(lái)自A組的毒素LcHnSyx3-SNAP25-小突觸泡蛋白HcA后，用抗-SNAP-25抗體借助免疫印跡法對(duì)催化部分Lc的內(nèi)神經(jīng)元(intraneuronal)靶標(biāo)的分裂進(jìn)行評(píng)估。重組毒素具有與天然的肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT/A)相似的切割SNAP-25的活性。注意，在此神經(jīng)元的檢測(cè)中，LcHnSyx3-SNAP25-小突觸泡蛋白HcA比LcHnSyx3-SNAP25-小突觸泡蛋白HcD更有效率。圖31 呈現(xiàn)的是，用生長(zhǎng)抑素肽(somatotostatin peptide)AC-RLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKL SELDDRADAL-AHX-AHX-AGCKNFFffKTFTSC-OH 對(duì)小突觸泡蛋白的 40 個(gè)氨基酸基序的SNARE標(biāo)記,允許生長(zhǎng)抑素-量子點(diǎn)的生成。鏈霉未和素包覆的量子點(diǎn)與生物素化的突觸融合蛋白肽孵育后，然后與生長(zhǎng)抑素-小突觸泡蛋白和SNAP-25混合。組裝好的生長(zhǎng)抑素-Q-dots-應(yīng)用于培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元,且它們進(jìn)入神經(jīng)胞體(neuronal soma)的過(guò)程借助于Q-dots的熒光和標(biāo)記大量?jī)?nèi)神經(jīng)元蛋白的抗SNAP-25抗體的復(fù)染是可視化的。圖32展現(xiàn)的是用生長(zhǎng)抑素肽對(duì)小突觸泡蛋白的40個(gè)氨基酸基序的SNARE標(biāo)記，在與LcHn突觸融合蛋白3和SNAP-25混合后，允許功能性生長(zhǎng)抑素-肉毒桿菌構(gòu)建體的形成。在應(yīng)用重組的毒素20小時(shí)后，LcHn突觸融合蛋白3-SNAP25-小突觸泡蛋白生長(zhǎng)抑素(SS-LcHN)的活性可通過(guò)在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中SNAP-25的分裂來(lái)評(píng)估。
圖33是SDS凝膠電泳圖，呈現(xiàn)的是用具有N-末端截短的SNARE基序形成穩(wěn)定的SDS耐受復(fù)合體。圖34是SDS凝膠電泳圖，呈現(xiàn)的是用具有C-末端截短的SNARE基序形成穩(wěn)定的SDS耐受復(fù)合體。圖35是SDS凝 膠電泳圖，呈現(xiàn)的是用突觸融合蛋白SNARE肽形成穩(wěn)定的SDS耐受復(fù)合體，其中，所述肽的內(nèi)部的蛋氨酸已被非氧化的正亮氨酸取代。圖36是多個(gè)SDS凝膠電泳圖，呈現(xiàn)的是用各種不同的SNARE肽形成穩(wěn)定的SDS耐受復(fù)合體。圖37是SDS凝膠電泳圖，呈現(xiàn)的是用三個(gè)縮短的SNARE肽形成穩(wěn)定的SDS耐受復(fù)合體。圖38是SDS凝膠電泳圖，呈現(xiàn)的是用三個(gè)縮短的SNARE肽形成穩(wěn)定的SDS耐受復(fù)合體。圖39是SDS凝膠電泳圖，呈現(xiàn)的是用三個(gè)縮短的SNARE肽形成穩(wěn)定的SDS耐受復(fù)合體。圖40是SDS凝膠電泳圖，呈現(xiàn)的是當(dāng)神經(jīng)肽與一個(gè)SNARE肽復(fù)合時(shí)，穩(wěn)定SDS耐受復(fù)合體的形成。圖41是SDS凝膠電泳圖，呈現(xiàn)的是當(dāng)精氨酸/血管升壓素肽(AVP)與突觸融合蛋白肽的N-末端或C-末端復(fù)合時(shí)，穩(wěn)定SDS耐受復(fù)合體的形成。圖42是SDS凝膠電泳圖，呈現(xiàn)的是用含少于40個(gè)氨基酸的SNARE肽形成穩(wěn)定復(fù)合體。圖43是SDS凝膠電泳圖，呈現(xiàn)的是蛋白與SNARE肽的基于順丁烯二酰亞胺的交聯(lián)。圖44是圖表，呈現(xiàn)的是TMB(3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺)基質(zhì)在650nm處的吸光度。圖45呈現(xiàn)的是發(fā)光膜的一部分。實(shí)施例介紹由SNARE衍生的多肽組成的束或線型的支架用于功能單元的可控的、不可逆的、非化學(xué)連接。發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種通過(guò)簡(jiǎn)單混合連接功能或結(jié)構(gòu)單元的方法。更好的定義是，納米大小的功能超分子體系結(jié)構(gòu)通過(guò)自組裝提供在生命生物科學(xué)，藥學(xué)，納米技術(shù)中進(jìn)行程序工程的方法。特別地，本發(fā)明涉及用于多功能單元以不可逆的和位點(diǎn)特異的方式進(jìn)行可控連接得到如圖2所示的束或線性多聚體的未滿足的需求。這項(xiàng)新技術(shù)的核心在于用于連接蛋白結(jié)構(gòu)域(實(shí)際上是任何可以想到的化學(xué)實(shí)體)的SNARE蛋白的獨(dú)特性質(zhì)的挖掘。在自然界中，這些蛋白借助于由突觸融合蛋白，SNAP-25和小突觸泡蛋白(也稱為VAMP-囊泡相關(guān)膜蛋白)組成的三元復(fù)合體以促使囊泡與細(xì)胞質(zhì)膜的融合。這個(gè)SNARE復(fù)合體是個(gè)4-螺旋卷曲螺旋(coiled-coil)束，包括兩個(gè)衍生自SNAP-25的螺旋，一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的螺旋和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白的螺旋(圖3);每個(gè)螺旋的長(zhǎng)度為約60-70個(gè)氨基酸(Jahn and Scheller (2006)) 0這個(gè)四螺旋束異常穩(wěn)定，甚至在SDS中，直接顯示了 SNARE組裝的不可逆性(Hu，Ket al.，2002)。已有多種策略用于配體和其他功能基團(tuán)的二聚，寡聚，多聚。其中，小肽(<5kDa)的化學(xué)交聯(lián)(Pillai et al. , 2006 ;Tweedle, 2006),轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的異二聚(Tanakaet al. ,2004)和生物素化的配體與四聚的鏈霉親和素的結(jié)合(Leisner et al.，2008)代表了功能單元連接的幾個(gè)例子。此外，卷曲螺旋作為寡聚反應(yīng)的設(shè)計(jì)模板，在廣泛的應(yīng)用包括蛋白質(zhì)工程，生物技術(shù)，生物材料，基礎(chǔ)研究和醫(yī)學(xué)中引起了相當(dāng)大的興趣(Engel andKammerer, 2000 ;0' Shea et al. , 1993 ；Scherr et al. ,2007)。可用的寡聚反應(yīng)結(jié)構(gòu)域的例子為含有33個(gè)殘基的GCN4的亮氨酸拉鏈，其形成平行的卷曲螺旋二聚體和46個(gè)殘基 的同源五聚體的卷曲螺旋COMPcc (Engel and Kammerer, 2000)。各種應(yīng)用中，卷曲螺旋的選擇取決于幾個(gè)特點(diǎn)卷曲螺旋多肽的長(zhǎng)度，它的溶解度，它們?cè)试S同源或異質(zhì)寡聚的能力；以及卷曲螺旋的強(qiáng)度，即正常和不利條件下承受解離的能力。SNARE卷曲螺旋束獨(dú)有的性質(zhì)如異質(zhì)-四聚和SNARE組裝的不可逆特性還沒(méi)有被考慮挖掘。使用SNARE束的核心理念，涉及到生產(chǎn)診斷/治療/生物技術(shù)蛋白的方法，其必須攜帶不同貨物部分的組合(熒光，放射性，免疫，化學(xué)，親和等)。發(fā)明人提出，用工程多肽，基于突觸融合蛋白、SNAP-25和小突觸泡蛋白，用于生產(chǎn)明確定義的有組織的、能夠由完全不同的獨(dú)立的部分自組裝的、異質(zhì)四聚的超分子體系結(jié)構(gòu)。發(fā)明人首先定義用于四組分束和三組分束的最小核；第二，發(fā)明人描述了用于不可逆結(jié)合的雙組分捕獲系統(tǒng)；以及，第三，發(fā)明人表明了 SNARE束生產(chǎn)線性多聚體的有用性。實(shí)施例I:四組分束發(fā)明人表明縮短的SNARE螺旋可用于功能單位組裝為四組分束。使用縮短的SNARE螺旋對(duì)于化學(xué)實(shí)體通過(guò)合成路徑附著到SNARE多肽來(lái)說(shuō)是必不可少的。目前，對(duì)于約50個(gè)氨基酸來(lái)說(shuō)，多肽合成是有效可靠且經(jīng)濟(jì)可行的。因此，如果SNARE螺旋是縮短的，并允許進(jìn)一步使肽序列或其他化學(xué)實(shí)體附著，這將是有利的。據(jù)悉，單一的SNARE基序的縮短，可導(dǎo)致不可逆的SNARE組裝的中斷(Hao et al.，1997)。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)(I)所有的螺旋截短到45個(gè)氨基酸的多肽時(shí)仍然允許穩(wěn)定的四螺旋復(fù)合體的存在，和(2)各種功能基團(tuán)可以添加到這些多肽的任何一端。這使得在用于各種用途的束中，多價(jià)復(fù)合體的制造變得簡(jiǎn)單，包括親和試劑和試劑盒，或多價(jià)療法(配體陣列或受體多聚(multimerisation)的展示是所希望的)。4個(gè)不同的螺旋的自由末端可以通過(guò)合成或重組的方式，在理想的空間組合中，用于高達(dá)8個(gè)不同的實(shí)體的附著。為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，發(fā)明人將不可逆的異質(zhì)寡聚蛋白復(fù)合體稱為四螺旋組合支架(TetriCS)。發(fā)明人合成了含有40或45個(gè)氨基酸的TetriCS肽。40 個(gè)氨基酸(aa)具有生物素的大鼠SNAP25A1螺旋I (28_67位氨基酸)STRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLDRVEEGMNHI GSGGG-生物素(SEQ ID NO. I)(黑體表示40個(gè)氨基酸的SNARE序列)；具有6-組氨酸標(biāo)簽的大鼠SNAP25A螺旋2(149-188位氨基酸)NLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSN
GSGGGHHHHHH(SEQ ID NO. 2)
(黑體表示40個(gè)氨基酸的SNARE序列)；具有6-組氨酸標(biāo)簽和半胱氨酸的大鼠突觸融合蛋白IA (201-240位氨基酸):EIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHA
GSGGGHHHHHHC(SEQ ID NO. 3)
(黑體表示40個(gè)氨基酸的突觸融合蛋白序列)；用于單克隆抗體識(shí)別的具有S-標(biāo)簽表位的大鼠小突觸泡蛋白-2 (31-70位氨基酸)RLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADAL
GSKETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO. 4)(黑體表示40個(gè)氨基酸的SNARE序列)。發(fā)明人平行測(cè)試了 45個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的TetriCS肽具有生物素的大鼠SNAP25A螺旋I (28-72位氨基酸)生物素
-STRRMLQLVEESKDAGIRTLVMLDEQGEQLDRVEEGMNHINQDMK
C (SEQ ID NO. 5)(黑體表示45個(gè)氨基酸的SNARE序列)； 具有半胱氨酸和6-組氨酸標(biāo)簽的大鼠SNAP25A螺旋2 (149-193位氨基酸)C N E M D E NLEQVSGIIGNLRHMALDMGNEIDTQNRQIDRIMEKADSNKTRID GGHHHHHH(SEQ ID. NO. 6)(黑體表示45個(gè)氨基酸的SNARE序列)；具有N-末端抗體表位和半胱氨酸的大鼠突觸融合蛋白1A(201_245位氨基酸)AC AEDA EIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHAVDYVEC (SEQ ID NO. 7)(黑體表示45個(gè)氨基酸的SNARE序列)；具有用于抗體識(shí)別的N-末端抗體表位的大鼠小突觸泡蛋白2 (31-75位氨基酸)MSATAATVPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNR RLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGAS (SEQ ID NO. 8)(黑體表示45個(gè)氨基酸的SNARE序列)。在20°C下孵育40或45個(gè)氨基酸的肽60分鐘，且利用SDS-PAGE分析它們的組裝。圖4顯示,45個(gè)氨基酸的Tetrics肽能夠形成不可逆的SNARE復(fù)合體(A組)，而40個(gè)氨基酸的肽不能(B組)。組裝體的功能通過(guò)pull-down實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了測(cè)試。發(fā)明人使用帶有GST標(biāo)簽的小突觸泡蛋白(45個(gè)氨基酸的SNARE序列，細(xì)菌中重組產(chǎn)生)，化學(xué)連接生物素的SNAP-25的螺旋I和6-組氨酸標(biāo)簽連接的SNAP-25的螺旋2作為功能單元。發(fā)明人測(cè)試了熒光鏈霉親和素的結(jié)合(用于生物素的結(jié)合)之后的TetriCS組裝體與谷胱甘肽珠(用于GST結(jié)合)或鎳珠(用于結(jié)合6-組氨酸標(biāo)簽)的結(jié)合。圖5示出了鏈霉親和素可以以高度特異性的方式與45個(gè)氨基酸的要么附著在谷胱甘肽珠上要么附著在鎳珠上的TetriCS結(jié)合。這些結(jié)果表明，45個(gè)氨基酸的TetriCS肽可用于附著各種功能基團(tuán)而不影響其功能特性。由于四個(gè)Tetrics肽有8個(gè)自由末端，它可以附著8個(gè)不同的基團(tuán)。因此，TetriCS允許功能超分子器件的發(fā)展，定義為結(jié)構(gòu)性組織和功能性組合的系統(tǒng)，由合適設(shè)計(jì)的分子組分構(gòu)建，執(zhí)行給定的功能(Lehn,2007)。實(shí)施例2:三組分束當(dāng)附著的基團(tuán)少于8個(gè)時(shí)，具有簡(jiǎn)化的TetriCS組裝體是有用的。事實(shí)上，可以利用已攜帶2個(gè)SNARE螺旋的全長(zhǎng)SNAP-25分子(1-206位氨基酸)(見(jiàn)圖6)。因此，發(fā)明人測(cè)試了如上所述的40和45個(gè)氨基酸的大鼠突觸融合蛋白IA和小突觸泡蛋白2肽是否能夠與全長(zhǎng)的大鼠SNAP-25B組裝成不可逆的復(fù)合體。圖7示出了 40個(gè)氨基酸(A組)和45個(gè)氨基酸的肽(B組)能夠與SNAP25B組裝，表明在三組分系統(tǒng)中，40個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽足夠與全長(zhǎng)SNAP-25不可逆的結(jié)合。發(fā)明人測(cè)試了 40個(gè)氨基酸的Tetrics組裝體的功能,該Tetrics組裝體含有(i)全長(zhǎng)的大鼠SNAP25B (1-206位氨基酸)中84，85，90，92位的半胱氨酸被代替為丙氨酸，已知這對(duì)SNAP-25表達(dá)和純化是有幫助的(Fasshauer et al.，1999)。(ii)合成的突觸融合蛋白-myc肽(黑體表示40個(gè)氨基酸的突觸融合蛋白序列)EIIKLENSIRELHDMFMDMAMLVESQGEMIDRIEYNVEHA-GSGEQKLISEEDLC(SEQ ID NO. 9)(iii)合成的小突觸泡蛋白-S-標(biāo)簽肽(黑體表示40個(gè)氨基酸的小突觸泡蛋白序列)RLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADAL
-GSKETAAAKFERQHMDS(SEQ ID NO. 4)將GST融合的SNAP-25與谷胱甘肽珠結(jié)合后，通過(guò)組裝好的三組分TetriCS與熒光抗-Myc抗體和熒光S-蛋白(圖8)結(jié)合的能力對(duì)組裝體的功能進(jìn)行了測(cè)試。在珠子上僅有GST-SNAP-25的對(duì)照反應(yīng)顯示出微不足道的結(jié)合，而另外40個(gè)氨基酸的突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白肽的加入導(dǎo)致了三組分TetriCS的形成，如同通過(guò)抗-Myc抗體和S-蛋白質(zhì)與谷胱甘肽珠的強(qiáng)大的結(jié)合所證明的一樣。發(fā)明人總結(jié)出40個(gè)氨基酸的合成肽允許不同的標(biāo)簽在單獨(dú)的不可逆的復(fù)合體中組裝。三組分系統(tǒng)代表了一套2個(gè)短的多肽和SNAP-25分子的自組裝，允許簡(jiǎn)單的6通路多功能的蛋白標(biāo)記。接下來(lái)發(fā)明人利用表面等離子體共振技術(shù)，測(cè)試了 40個(gè)氨基酸的三組分TetriCS能夠承受不利條件的能力。發(fā)明人將帶有GST標(biāo)簽的SNAP-25B化學(xué)性地附著到BiacoreCM5芯片上，隨后結(jié)合40個(gè)氨基酸的突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白肽，然后結(jié)合抗體。圖9示出了肽的結(jié)合是穩(wěn)定的并允許抗myc抗體附著到芯片的表面。O. 1%的SDS的加入將抗體從固定的SNAP-25上去除了，但不能去除肽。實(shí)施例3 :雙組分束 發(fā)明人還將不可逆的SNARE組裝體簡(jiǎn)化為雙組分系統(tǒng)?；陔p組分親和力的工具是所有基礎(chǔ)研究的基礎(chǔ)，并且在藥物和診斷試劑的發(fā)展中是無(wú)價(jià)的(Uhlen，2008)。應(yīng)用范圍包括親和層析，微陣列技術(shù)，基于微孔板的掃描和許多生物技術(shù)方法。成功產(chǎn)生這些應(yīng)用的主要因素依賴于，蛋白的堅(jiān)固的、不可逆的，或者在固體表面或者在三維矩陣的確定方位上的固定。最近的一些評(píng)論強(qiáng)調(diào)了現(xiàn)有的固定技術(shù)的一些缺點(diǎn)(Kohn, 2009 ;Tomizaki etal.，2005)。例如，在化學(xué)蛋白偶合的情況下，可以實(shí)現(xiàn)不可逆的表面固定，但產(chǎn)品可能是由于定位問(wèn)題和化學(xué)修飾處 于非功能狀態(tài)。相反，可以使用各種標(biāo)簽(GST，His-標(biāo)簽，抗-myc和其他抗體識(shí)別的表位)將蛋白以位點(diǎn)選擇的方式附著到相應(yīng)的表面(谷胱甘肽包覆的，金屬包覆的，抗體包覆的)，但在所有這些情況中，固定都不是永久的(所有存在的肽親和標(biāo)簽將分離)和/或非常昂貴的(基于抗體親和表面)。顯然，理想的固定技術(shù)應(yīng)該允許靶標(biāo)蛋白不可逆的偶合和位點(diǎn)特異性的定位，并且，此外，應(yīng)比目前的基于抗體的方法便宜很多。個(gè)別地，如果它們與不可逆結(jié)合的多肽一起表達(dá)，則在功能方向的兩個(gè)蛋白的不可逆連接將是可能的。對(duì)于雙組分系統(tǒng)，發(fā)明人使用了從頭設(shè)計(jì)的突觸融合蛋白/小突觸泡蛋白融合蛋白，連同雙螺旋SNAP-25 (見(jiàn)圖10)。在第一實(shí)施方式中，發(fā)明人將大鼠突觸融合蛋白IA SNARE基序(195-254位氨基酸)與大鼠小突觸泡蛋白2的SNARE基序(25-84位氨基酸)連接在一起，如圖11所示。突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白序列之間短的氨基酸支鏈(GILDSMGRLELKL(SEQ ID NO. 10)，小箭頭)源于雜合質(zhì)粒中的多聚克隆位點(diǎn)。發(fā)明人純化了融合蛋白，但發(fā)現(xiàn)它具有借助于突觸融合蛋白I的基序聚集的傾向，阻止帶有SNAP-25的SNARE復(fù)合體的形成。下一步，發(fā)明人制得了大鼠的突觸融合蛋白3和小突觸泡蛋白2融合蛋白。在此想法中，發(fā)明人通過(guò)短的氨基酸支鏈將大鼠突觸融合蛋白3的SNARE基序(195-253位氨基酸)與小突觸泡蛋白2的序列1_84融合。突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白序列之間短的氨基酸支鏈(GILDSMGRLELKL)源于雜合質(zhì)粒中的多克隆位點(diǎn)，其允許突觸融合蛋白3和小突觸泡蛋白2之間插入功能單位。當(dāng)與大鼠的SNAP-25B混合后，突觸融合蛋白3和小突觸泡蛋白2融合蛋白迅速組裝成不可逆的如圖12所示的復(fù)合體。在下一個(gè)設(shè)想中，發(fā)明人借助于短的氨基酸支鏈將突觸融合蛋白3(1-260位氨基酸)的SNARE基序和頭部結(jié)構(gòu)域與大鼠小突觸泡蛋白2的序列1-84融合(見(jiàn)圖13)。突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白序列之間短的氨基酸短支鏈(GILDSMGRLELKL (如SEQ ID NO. 10))源于雜合質(zhì)粒中的多個(gè)克隆位點(diǎn)，其允許在突觸融合蛋白3和小突觸泡蛋白2之間插入功能單位。據(jù)悉，突觸融合蛋白3的頭部結(jié)構(gòu)域保護(hù)其SNARE基序不進(jìn)行SNARE組裝，但某些脂質(zhì)能夠“開(kāi)啟”用于SNARE的組裝的突觸融合蛋白(Darios and Davletov, 2006 ；Rickmanand Davletov, 2005) 0發(fā)明人未發(fā)表的工作表明，稱為辛基吡喃葡萄糖苷的溫和去垢劑也可以“開(kāi)啟”突觸融合蛋白3分子。因此，發(fā)明人可以控制突觸融合蛋白的SNARE基序，并以規(guī)范的方式形成SNARE復(fù)合體。圖14A呈現(xiàn)的是在SDS凝膠中測(cè)試的這些可控的雙組分組裝體的一個(gè)例子。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，其他去垢劑或者類似的脂質(zhì)化合物具有相同的效果，如MEGA 8，C-HEGA 10，C-HEGA 11，HEGA 9，庚基吡喃葡萄糖苷，辛基吡喃葡萄糖苷，壬基吡喃葡萄糖苷，zwittergent 3-08, zwittergent 3-10 和 zwittergent 3-12。表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)證明了這雙組分組裝體對(duì)各種干擾劑具有高度的耐受力(圖 15)。作為一種替代的雙組分系統(tǒng)，發(fā)明人生產(chǎn)了具有一個(gè)小標(biāo)簽的二元親和試劑，其中，短的突觸融合蛋白螺旋(< 5kDa)可以不可逆地結(jié)合到圖16A中示意性代表的從頭設(shè)計(jì)的三螺旋SNARE融合蛋白(約27-3IkDa)。在此設(shè)想中，發(fā)明人將兩個(gè)SNAP-25SNARE螺旋(22-206位氨基酸)與小突觸泡蛋白2的序列1-84的SNARE基序融合。SNAP-25和小突觸泡蛋白序列之間的連接器GSGSEQKLISEEDLG(SEQ ID NO. 11)帶有myc標(biāo)簽表位。當(dāng)與突觸融合蛋白40或45個(gè)氨基酸的肽混合時(shí)，如前面所述，所述三螺旋融合蛋白迅速組裝成如圖16B所示的不可逆轉(zhuǎn)的復(fù)合體。這些雙組分系統(tǒng)是目前親和標(biāo)簽的有用替代物(Terpe. 2003)。在二元捕獲系統(tǒng)中的標(biāo)簽可以在細(xì)菌中表達(dá)，并很容易地以位點(diǎn)特異性的方式添加到任何用于重組生產(chǎn)的蛋白中，這是與生物素/鏈霉親和素不同的，或與親和系統(tǒng)高度類似的(生物素不能作為蛋白的一部分表達(dá))。由于二元親和試劑的不可逆特性，從高度稀釋的溶液中快速捕獲目前是可能的，目前沒(méi)有其他的系統(tǒng)存在。必要時(shí)，二元系統(tǒng)中的任何標(biāo)簽可以通過(guò)化學(xué)方法連接到珠子，芯片，微陣列板的表面，并通過(guò)化學(xué)或重組引入的官能團(tuán)進(jìn)行修飾。 以使用雙組分系統(tǒng)用于細(xì)菌提取物中蛋白的純化為例，發(fā)明人首先將含大鼠突觸融合蛋白3 (195-253位氨基酸)的SNARE基序的雙螺旋融合蛋白固定到BrCN瓊脂糖珠上，所述大鼠突觸融合蛋白3借助于短的氨基酸支鏈與大鼠的小突觸泡蛋白2的序列的1-84融合(如上所述)。發(fā)明人還將稱為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的酶與SNAP-25B融合，并在大腸桿菌中表達(dá)后來(lái)的融合蛋白。隨后，使用2%的稱為zwittergent 3_08的去垢劑破壞細(xì)菌膜，細(xì)菌的提取物被置于含有突觸融合蛋白3/小突觸泡蛋白2融合蛋白的瓊脂糖珠上。洗滌后，通過(guò)SDS-PAGE和考馬斯染色分析珠子。圖17示出了 GST-SNAP-25可以以高度特異的方式與攜帶突觸融合蛋白3/小突觸泡蛋白2融合蛋白的瓊脂糖珠結(jié)合。實(shí)施例4 :可控的線性聚合反應(yīng)除了以捆綁的方式附著多個(gè)基團(tuán)以外，SNARE蛋白也提供了生產(chǎn)先進(jìn)的超分子器件的可能性，該超分子器件為無(wú)限長(zhǎng)的強(qiáng)線性多聚體的形式，如圖18所示。在這個(gè)方向，發(fā)明人的組裝代表了一種獨(dú)特的方法，其中，生物材料是由分子組裝成的分子，以生產(chǎn)新型線性超分子體系結(jié)構(gòu)(概述可能的應(yīng)用(Hinman et al. ,2000;Lehn, 2007 ；Ryadnov and ffoolfson, 2003 ；Zhang,2003)) 在這種情況下，發(fā)明人將如上所述的突觸融合蛋白3-小突觸泡蛋白2融合蛋白用于雙組分系統(tǒng)(大鼠突觸融合蛋白3 (1-260位氨基酸)通過(guò)短的氨基酸支鏈與大鼠小突觸泡蛋白2的序列1-84融合)。然而，發(fā)明人使用帶有單獨(dú)的具有頭部結(jié)構(gòu)域的突觸融合蛋白3多肽(與GST融合的1-260位氨基酸)的固體支撐，而非在溶液中混合SNAP-25和突觸融合蛋白3-小突觸泡蛋白2融合蛋白，以啟動(dòng)聚合反應(yīng)。發(fā)明人首先通過(guò)GST標(biāo)簽將GST-突觸融合蛋白3分子單獨(dú)固定在谷胱甘肽珠上。然后，發(fā)明人添加SNAP25B分子(1-206位氨基酸)，以在O. 8%的辛基吡喃葡萄糖苷存在下，允許形成突觸融合蛋白3/SNAP-25 二元復(fù)合體。洗滌珠子以除去未結(jié)合的SNAP-25后，發(fā)明人添加突觸融合蛋白3-小突觸泡蛋白2融合蛋白。根據(jù)需要多次反復(fù)添加2個(gè)構(gòu)建模塊的步驟。圖19描述了這個(gè)過(guò)程。圖20A呈現(xiàn)的是在上述過(guò)程中逐步增加突觸融合蛋白3-小突觸泡蛋白2融合蛋白和SNAP-25的量。雖然用于附著到珠子上的GST-突觸融合蛋白3的量仍然保持不變，但是結(jié)合的SNAP-25和突觸融合蛋白3-小突觸泡蛋白2融合蛋白的量在逐步增加。為了顯示結(jié)合材料的量，將樣品煮沸以破壞組裝的SDS耐受特性。圖20B呈現(xiàn)的是SDS耐受聚合物的分子量的增加與額外的聚合步驟成線性關(guān)系，正如在SDS-PAGE前沒(méi)有煮過(guò)的樣品一樣。由于上述過(guò)程中的每一步都是可控的，可以在聚合反應(yīng)中的任何一步添加不同的SNAP-25或在所需位置上帶有任何所需貨物部分的突觸融合蛋白3-小突觸泡蛋白融合蛋白。SNAP-25和突觸融合蛋白3-小突觸泡蛋白代表用于不同分子結(jié)構(gòu)的可控構(gòu)造物的構(gòu)建模塊。應(yīng)用范圍包括制造功能化纖維，多配體微陣列，超分子酶組件，新的電子器件，和用于生物技術(shù)和醫(yī)藥的生物材料(Zhang，2003)。也可以在特定位點(diǎn)，在線性支架中形成支鏈，如圖21所示，使用突觸融合蛋白-小突觸泡蛋白-突觸融合蛋白或SNAP-25-突觸融合蛋白的融合蛋白，如上所述。最后，發(fā)明人擴(kuò)展了不在表面上而是通過(guò)在溶液中簡(jiǎn)單混合兩個(gè)組分來(lái)制造線性聚合物的可能性。發(fā)明人利用突觸融合蛋白3-小突觸泡蛋白2融合蛋白的修改后的版本，其中，兩個(gè)SNARE蛋白之間的連接區(qū)域被刪 除了。這種融合構(gòu)建體具有直接融合到小突觸泡蛋白2殘基(29-84)的突觸融合蛋白3殘基(1-253)。見(jiàn)圖22。發(fā)明人將大鼠SNAP-25B(1_206位氨基酸)與融合蛋白混合，通過(guò)SDS-凝膠電泳對(duì)60分鐘的反應(yīng)進(jìn)行了分析。圖23呈現(xiàn)的是SNARE束可以在溶液中通過(guò)簡(jiǎn)單混合而多聚化。因此，上面所述的雙組分系統(tǒng)還允許在溶液中聚合，提出了一種以線性方式連接1-4個(gè)蛋白功能域的方法。此外，基于蛋白的全部的SDS耐受的線性聚合物的制造，可用于生產(chǎn)生物降解纖維，其性質(zhì)優(yōu)于蜘蛛絲的多組分組裝體或目前的卷曲螺旋納米纖維。有關(guān)概述，請(qǐng)參閱 Hinman 等，2000 ;Ryadnov 和 Woolfson, 2003。在實(shí)施例1-4中使用的多肽的序列(具有相應(yīng)圖片的指示):3713(1-260)/^^2(1_84)(圖13，14及20)(具有頭部結(jié)構(gòu)域和連接器的突觸融合蛋白)-SEQ ID NO. 12Syx3 (195-253) /Syb2 (1-84)(圖12及17)(沒(méi)有頭部結(jié)構(gòu)域，但有連接器的突觸融合蛋白)-SEQ ID NO. 13Syx3 (1-253)/Syb2 (29-84)(圖22)(有頭部結(jié)構(gòu)域，但沒(méi)有連接器的突觸融合蛋白)-SEQ ID NO. 14SNAP-25B(20-206)/Syb2 (1-84)(圖 16B)-SEQ ID NO. 15實(shí)施例5 :允許肉毒桿菌神經(jīng)毒素分步進(jìn)行裝配的SNARE標(biāo)簽概要通過(guò)合適的結(jié)構(gòu)單元可控連接的納米尺寸的明確的功能超分子體系結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生能夠?yàn)獒t(yī)藥和應(yīng)用技術(shù)提供新的前景。當(dāng)前的連接策略往往依靠化學(xué)方法，該方法有局限性，并且不能充分利用重組技術(shù)。本文中，發(fā)明人使用三種SNARE蛋白，形成了穩(wěn)定的四螺旋復(fù)合體，以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膜的融合，與用于不可逆連接重組體和合成功能單元的通用標(biāo)簽類似。發(fā)明人指出，SNARE標(biāo)簽允許功能超分子藥用毒素的分步生產(chǎn)，即肉毒桿菌神經(jīng)毒素A，俗稱為Β0Τ0Χ。受體結(jié)合域與小突觸泡蛋白SNARE基序的融合允許SNAP25標(biāo)記的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的活性部分遞送至神經(jīng)元。數(shù)據(jù)顯示，SNARE標(biāo)記的毒素能夠分裂其內(nèi)部神經(jīng)元的分子靶點(diǎn)并抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。這些結(jié)果表明，SNARE四螺旋卷曲螺旋允許各種結(jié)構(gòu)單元可控連接為功能納米機(jī)器。介紹分子生物學(xué)和革命性科學(xué)的重組蛋白生產(chǎn)的到來(lái)。重組多肽，蛋白的功能片段和全酶目前廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥，診斷，納米技術(shù)和消費(fèi)生物產(chǎn)業(yè)中。雖然重組技術(shù)明顯成功，但蛋白的大小仍然是生產(chǎn)作為單一功能單元的越來(lái)越復(fù)雜的蛋白的障礙。據(jù)認(rèn)為，在超分子單元中而不是在獨(dú)立的蛋白中結(jié)合多個(gè)功能基團(tuán)，將使我們克服這個(gè)瓶頸。顯然，實(shí)現(xiàn)這樣一個(gè)構(gòu)建納米工廠或納米機(jī)器的目標(biāo)，在很大程度上取決于我們按照要求和高精度地將各功能單元連接的能力。出人意料的是，目前在這個(gè)充滿希望的領(lǐng)域里的努力仍然依賴于幾十年前發(fā)明的連接技術(shù)生物素-鏈霉親和素配對(duì)，抗體-表位識(shí)別，通過(guò)氨基和巰基的化學(xué)連接。這些方法往往由于重組蛋白化學(xué)修飾的需求或基于抗體技術(shù)的復(fù)雜性而受到限制。最近發(fā)展的“點(diǎn)擊”化學(xué)解決了部分這些問(wèn)題，但仍依賴于無(wú)機(jī)化合物，并且迄今沒(méi)有實(shí)現(xiàn)成熟的超分子組裝體與重組蛋白的連接?；贒NA自組裝或寡聚多肽的替代方法在設(shè)計(jì)多功能重組組裝體時(shí)也有其局限性。本文中，發(fā)明人擴(kuò)展了在近二十年前發(fā)現(xiàn)的，使用SNARE(可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著到蛋白受體)蛋白組裝體的可能性，以實(shí)現(xiàn)重組多肽與功能單元的不可逆連接。
SNARE蛋白通過(guò)形成異質(zhì)四螺旋卷曲螺旋來(lái)促使每個(gè)真核細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞膜的融合。腦衍生的SNARE復(fù)合體由三種蛋白組成小突觸泡蛋白，突觸融合蛋白和SNAP25。而突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白均可以貢獻(xiàn)一個(gè)單一螺旋，SNAP25貢獻(xiàn)了兩個(gè)螺旋，以形成四聚體卷曲螺旋。四個(gè)SANRE基序攜帶8個(gè)特征性七殘基重復(fù)序列(heptade repeat),具有55個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度。腦SNARE復(fù)合體表現(xiàn)出其對(duì)離液劑，強(qiáng)去垢劑，蛋白酶和高溫抗性的特殊穩(wěn)定性。發(fā)明人決定研究SNAREs與重組蛋白的融合是否將允許超分子實(shí)體的可控構(gòu)建。作為多功能分子的例子，發(fā)明人關(guān)注被形容為“集識(shí)別，輸送，展開(kāi)，易位，復(fù)性和催化于一體的納米機(jī)器”的肉毒桿菌神經(jīng)毒素。由于其微量(濃度為IpM)原位注射就能夠?qū)е潞荛L(zhǎng)的神經(jīng)肌肉麻痹,A型肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNT/A) (Montecucco，C. et al. (2009))的醫(yī)學(xué)重要性已被證明了。BoNT/A是由三個(gè)主要單元構(gòu)成的150kDa的蛋白50kDa的催化部分(輕鏈，Lc)，其中通過(guò)二硫鍵與被稱為重鏈的連接，所述重鏈相應(yīng)地由N-末端50kDa的易位部分(HN)和C-末端50kDa的部分(He)組成，后者負(fù)責(zé)對(duì)神經(jīng)元神經(jīng)節(jié)苷脂和突觸囊泡受體 SV2C 的識(shí)別(Mahrhold,S. et al. (2006)&Dong,M. et al. (2006))。在 X 射線模型中，這三個(gè)主要單元可以被識(shí)別為獨(dú)立的結(jié)構(gòu)單元(改編自Lacy et al. (1998)，圖24a)。當(dāng)突觸細(xì)胞溶質(zhì)蛋白水解其內(nèi)神經(jīng)元靶標(biāo)SNAP25時(shí)，所述催化部分，以高度特異性，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)的長(zhǎng)期受阻(Schiavo,G. et al. (1993)&Blasi, J. et al. (1993))。BoNT/A 介導(dǎo)的9個(gè)氨基酸從SNAP25C-末端的移除，并未損害SNARE組裝體與突觸融合蛋白和小突觸泡蛋白的穩(wěn)定性(Hayashi, T. et al. (1994))。結(jié)果發(fā)明人首先將SV2結(jié)合部分(He)與小突觸泡蛋白融合(圖24b)并測(cè)試這種融合是否可以輸送量子點(diǎn)(Q-dots)到神經(jīng)元末端。He-小突觸泡蛋白融合蛋白能夠與SNAP25和生物素(用于結(jié)合鏈霉親和素包覆的Q-dots)標(biāo)記的52個(gè)氨基酸的突觸融合蛋白3肽形成SNARE復(fù)合體。我們選擇使用突觸融合蛋白3基序而不是突觸融合蛋白I,因?yàn)楹笳哂型垂丫?homooligomerise)的傾向。圖24c呈現(xiàn)的是在SNAP25存在時(shí)，He-小突觸泡蛋白融合蛋白甚至能夠與修飾的突觸融合蛋白3基序形成不可逆的(SDS耐受)SNARE復(fù)合體。在SNAP25存在時(shí)，將具有預(yù)結(jié)合的生物素化的突觸融合蛋白肽的Q-dots與He-小突觸泡蛋白孵育，并輸送Q-dots到突觸融合蛋白末端，這是在來(lái)自小鼠海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)物中進(jìn)行評(píng)估的。攜帶Hc-SNARE的Q-dots聚集在突觸聯(lián)系(synaptic contact)上，正如用囊泡蛋白小突觸泡蛋白染色所證實(shí)的一樣(圖24d)。這表明，BoNT/A的靶標(biāo)部分仍然能夠識(shí)別其突觸受體，并能夠在與SNARE標(biāo)簽重組融合后輸送大的貨物部分。 下一步，發(fā)明人準(zhǔn)備了酶部分、移位部分和SNAP25的融合(圖25a)。我們?cè)诿覆糠?Lc)和移位部分(HN)之間引入了凝血酶切割位點(diǎn)以方便切割，在分離的過(guò)程中，這兩個(gè)部分仍然通過(guò)二硫鍵保持在一起。LcHN-SNAP25融合蛋白成功地在大腸桿菌中表達(dá)，可以被純化以達(dá)到同質(zhì)性。當(dāng)用二硫蘇糖醇處理時(shí)，這種融合蛋白分成兩個(gè)部分，呈現(xiàn)出二硫鍵的關(guān)鍵功能(圖25b)。然后我們檢測(cè)了 SNARE標(biāo)簽是否允許LcHN和He部分組裝成單一的實(shí)體。圖25c顯示了兩個(gè)重組融合蛋白的結(jié)合，存在而非缺乏突觸融合蛋白肽，導(dǎo)致在60分鐘內(nèi)，新的分子實(shí)體LcHN-SNARE-HC的出現(xiàn)，如被SDS凝膠證明的那樣。為了幫助重組的BoNT/A靶標(biāo)的可視化，我們采用了熒光標(biāo)記的突觸融合蛋白肽，并且LcHN-SNARE-Hc的確可以作為熒光蛋白被觀察到(圖25c)。當(dāng)LcHN-SNARE-Hc用于培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元時(shí)，熒光分子與囊泡標(biāo)記物小突觸泡蛋白局域化的重要程度，表明其與BoNT/A的天然靶標(biāo)相結(jié)合(圖26a)。重要的是，抗SNAP25抗體處理的神經(jīng)元的免疫印跡證明，SNAP25經(jīng)歷與用天然的BoNT/A分子處理神經(jīng)元同樣的分裂(圖26b)。這表明，酶部分被成功地釋放到神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)中，接著LcHN-SNARE-Hc進(jìn)入到突觸囊泡。為了測(cè)試LcHN-SNARE-Hc釋放神經(jīng)遞質(zhì)的效果，我們使用了 96孔谷氨酸鹽釋放法，可以同時(shí)比較多種因素(Darios, F et al. (2009))。圖27a顯示，LcHN-SNARE-Hc可以抑制鈣離子依賴和KCl依賴的谷氨酸鹽從分離的腦神經(jīng)末端的的釋放，與天然BoNT/A具有相同的劑量依賴。從中央突觸末端釋放的谷氨酸鹽的抑制程度與之前得到的數(shù)值有很好的一致性(McMahon，H. T. et al. (1992))，并表明不是所有的中央突觸均攜帶BoNT/A的SV2C受體(Dong，M. et al. (2006))。重要的是，不存在導(dǎo)致失活分子的連接突觸融合蛋白肽的情況下，將SNARE標(biāo)記的LcHN和He混合，確認(rèn)了在連接重組部分與功能實(shí)體中，完整的SNARE組裝是關(guān)鍵因素(圖27b)。用二硫蘇糖醇處理LcHN-SNARE-Hc使組裝的毒素滅活，表明了 Lc和HN之間的二硫鍵的功能(圖27b)。最后，我們測(cè)試了 LcHN-SNARE-Hc麻痹肌肉的能力。我們采用不同濃度的組裝的毒素處理離體的小鼠膈肌，并測(cè)試膈神經(jīng)的麻痹反應(yīng)。確定振幅減少到初始值的50%所需的時(shí)間(半麻痹時(shí)間)。圖27c呈現(xiàn)的是亞納摩爾(subnanomolar)濃度(190pM)下,72分鐘內(nèi)，LcHN-SNARE-Hc麻痹膈肌的情況。不存在連接的突觸融合蛋白肽時(shí)，沒(méi)有觀察到麻痹(數(shù)據(jù)未顯示)。在這里，發(fā)明人證實(shí)SNARE標(biāo)簽允許藥用毒素BoNT/A分步進(jìn)行組裝，BoNT/A俗稱Β0Τ0Χ(Davletov，B et al. (2005))。雖然LcHN-SNARE-Hc阻斷神經(jīng)肌肉接頭的效率小于天然的BoNT/A(MahrhoId，S et al. (2006))，這可以通過(guò)在長(zhǎng)的神經(jīng)肌肉接頭內(nèi)延伸毒素到不同活躍區(qū)的能力的降低來(lái)解釋，或者通過(guò)由于在隔膜肌肉的大體積的突觸前末梢導(dǎo)致效率的損害來(lái)解釋。然而，在神經(jīng)元間的突觸聯(lián)系的情況中，我們?cè)贚cHN-SNARE-Hc和天然的神經(jīng)毒素之間觀察到類似的效率。這些優(yōu)選的對(duì)神經(jīng)元間的突觸聯(lián)系而非神經(jīng)肌肉接頭的效果對(duì)于避免肌肉麻痹副作用的疼痛抑制治療的發(fā)展是有利的。我們觀察到很多可能的結(jié)果，在此列出一些。首先，目前，在細(xì)菌中以安全的方式表達(dá)活性的多組件的藥用菌毒素是可能的。事實(shí)上，我們使用“鎖定”肽允許額外的安全特征。也有可能利用SNARE標(biāo)簽的He部分來(lái)遞送成像試劑以及通過(guò)用SNARE類似物標(biāo)記的未來(lái)療法(Binz，T et al. (2009))。另外，生產(chǎn)抗肉毒桿菌血清時(shí)，寡聚He部分可能用于激發(fā)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答(Webb，R. P. etal. (2007))。LcHN部分的SNARE標(biāo)簽也將允許將BoNT/A的活性部分容易地再靶向到特定的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中(Dolly，J. O. et al. (2009))。在這里，人們可以通過(guò)制造相應(yīng)的SNARE標(biāo)簽的配體來(lái)靶向神經(jīng)肽或生長(zhǎng)因子受體。這種SNARE標(biāo)簽可以讓以尋找最有利的組合為目的的各種功能單元更方便的組合混合，以特定的沉默的神經(jīng)元亞群(Foster，K. A. (2009))。雖然發(fā)明人使用BoNT/A作為復(fù)雜的“納米機(jī)器”的例子，但是明確的是，SNARE標(biāo)簽?zāi)軌蛞愿叨瓤煽氐姆绞接糜跇?gòu)建，許多其他的超分子組裝體。通過(guò)可控的合適的構(gòu)建模塊連接的明確的納米尺寸的功能超分子體系結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，被認(rèn)為為許多領(lǐng)域提供了新的視角(Lehn，J.M. (2007))。相對(duì)較短的SNARE基序允許重組生產(chǎn)的多肽和無(wú)機(jī)分子的結(jié)合，正如在肉毒桿菌神經(jīng)毒素組裝下生物素和熒光素的摻入所證明的一樣。SNARE卷曲螺旋的最大優(yōu)勢(shì)是其異質(zhì)四聚的性質(zhì)(heterotetrameric nature),允許多達(dá)8個(gè)不同功能體的連接。這種潛力已經(jīng)在未來(lái)醫(yī)藥和應(yīng)用技術(shù)中得到擴(kuò)展。方法質(zhì)粒和蛋白的反應(yīng)。所有的蛋白在BL21大腸桿菌菌株中表達(dá)為谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白。用于表達(dá)LcHN-SNAP25的質(zhì)粒的產(chǎn)生過(guò)程如下BoNT/ALc (1-449位氨基酸)的cDNA通過(guò)PCR擴(kuò)增，并且插入到pGEX-KG載體(Guan，K.L.et al. (1991))的SmaI和EcoRI限制性酶切位點(diǎn)之間。BoNT/A易位結(jié)構(gòu)域HN的密碼子優(yōu)化的cDNA (450-872位氨基酸，來(lái)自ATG Biosynthetics,德國(guó))插入到輕鏈的3'末端。凝血酶裂解位點(diǎn)(氨基酸LVPRGS(SEQ ID NO. 16))插入到BoNT/A的輕鏈和易位結(jié)構(gòu)域之間。最后，大鼠SNAP25B的cDNA(1-206位氨基酸)插入在HN的3'末端。允許Hc-Syb表達(dá)的質(zhì)粒生成如下大鼠的小突觸泡蛋白(25-84位氨基酸)的cDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，并插入到pGEX_KG載體的BamHI和EcoRI位點(diǎn)之間。BoNT/A重鏈的cDNA (876-1296位氨基酸)經(jīng)PCR擴(kuò)增，并插入到小突觸泡蛋白的3'末端。合成突觸融合蛋白3SNARE基序的肽(200-250位氨基酸)，化學(xué)連接有生物素或熒光素(多肽合成，英國(guó))。與GST融合的蛋白在谷胱甘肽瓊脂糖珠(GE Healhcare，美國(guó))上純化，并用20mMHEPES，pH 7. 3，IOOmM氯化鈉使用凝血酶從珠上洗脫。將帶有SNARE標(biāo)簽的蛋白與突觸融合蛋白肽，在22°C混合I小時(shí)，組裝得到超分子復(fù)合體。神經(jīng)元成像和免疫印跡。鼠抗突觸素抗體(克隆7. 2)來(lái)自Synaptic System公司，鼠抗SNAP25抗體(克隆SMI81)來(lái)自Sternberger Monoclonals公司。鏈霉親和素連接的Q-dots 525來(lái)自Invitrogen公司。海馬神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物的準(zhǔn)備如(Darios,F.etal. (2009))中所描述和在體外7-10天后使用。神經(jīng)元與帶有SNARE標(biāo)簽的，或天然的毒素接觸2小時(shí)，用4%的PFA固定，然后用抗突觸素抗體免疫染色。在連接有尼康Eclipse熒光顯微鏡的 Radiance 共聚焦系統(tǒng)(Zeiss/Bio-Rad ；HemeI Hempstead, Herts, U. K.)上觀察熒光?；蛘?，將神經(jīng)元與組裝好的毒素或天然BoNT/A孵育20個(gè)小時(shí)，用60mM Tris, pH 6. 8，2mM 氯化鎂，2% SDS, benzonase 核酸酶(Novagen，250U/ml)裂解，然后借助抗 SNAP25抗體進(jìn)行免疫印跡來(lái)分析SNAP25斷裂。阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。如(Darios，F(xiàn). et al. (2009))所述，分離新鮮的大鼠腦突觸體。突觸體(O. 5毫克/毫升的蛋白)在含有指示濃度的LcHN-SNARE-Hc緩沖液A (單位為 mM, 132NaCl，5KCl，20HEPES，I. 2NaH2P04,1. 3MgCl2，0. 15Na2EGTA, IMgSO4, 5NaHC03, IOD-葡萄糖)中，在37°C孵育I小時(shí)，加入等體積的含有谷氨酸脫氫酶(15units/ml，Sigma)和3mMNADP (Sigma)的緩沖液A，10分鐘。在2mM CaCl2存在下，加入KCl (35mM)誘導(dǎo)谷氨酸鹽的釋放，隨后通過(guò)突光進(jìn)行監(jiān)測(cè)(Exc. 340nm,Em. 460nm) (Darios,F. et al. (2009)McMahonH. T. et al. (1992))。如之前所述(Mahrhold，S. et al. (2006))進(jìn)行膈神經(jīng)偏側(cè)膈測(cè)試(Phrenic Nerve hemidiaphragm assay)。小鼠膈神經(jīng)來(lái)自海軍醫(yī)學(xué)研究所(NMRI)小鼠。在5-25mA，IHz的頻率，O. Ims的脈沖寬度下，持續(xù)刺激所述膈神經(jīng)。等長(zhǎng)收縮被力傳感器轉(zhuǎn)化，并用VitroDat在線軟件(FMI GmbH)記錄下來(lái)。確定振幅減少到50%初始值所需的時(shí)間(半麻痹時(shí)間)。
其他信息肉毒桿菌神經(jīng)毒素是最有效的天然設(shè)計(jì)的毒素。這些毒素是由梭菌屬(Clostridium)細(xì)菌產(chǎn)生的，能引起長(zhǎng)期癱瘓和死亡。在過(guò)去的30年，肉毒桿菌家族的一些成員，如A型肉毒桿菌毒素(BoNT/A)也稱為Β0Τ0Χ，已成功地被開(kāi)發(fā)出藥用和美容作用。這些毒素沉默神經(jīng)肌肉接頭，也可以阻止多種類型神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。人體的幾乎每個(gè)部分，除腦以外，都可以通過(guò)Β0Τ0Χ進(jìn)行治療。由于神經(jīng)肌肉接頭的麻痹是可逆的，持續(xù)的肌肉松弛需要每三到四個(gè)月的重復(fù)注射。BoNT/A不僅可以阻止橫紋肌，而且可以阻止平滑肌的神經(jīng)支配。此外，控制出汗，流涎和其他類型分泌的自主神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能接頭(cholinergic junctions)和神經(jīng)肌肉接頭一樣,對(duì)Β0Τ0Χ是敏感的。因此,基于Β0Τ0Χ的治療，最近已擴(kuò)大到包括令人眼花繚亂的近百個(gè)從張力失常到胃腸和泌尿系統(tǒng)疾病的狀況。BoNT/A臨床用藥的有效性導(dǎo)致了對(duì)肉毒桿菌家族其他成員的興趣的增加。比較研究表明，在7個(gè)不同的免疫血清型BoNTs(A-G)中，BoNT/A具有最長(zhǎng)的致癱效果，因此，力口強(qiáng)了特別的BoNT/A在神經(jīng)疾病治療中的有用性。所有的BoNTs都從細(xì)菌合成出來(lái)，是單一的多肽鏈，分子量為150kDa。細(xì)菌死亡和裂解后，毒素被細(xì)菌蛋白酶“切斷”，產(chǎn)生50kDa的輕鏈和IOOkDa的重鏈,二者通過(guò)二硫鍵連接在一起。這兩條鏈,仍然通過(guò)二硫鍵相連，通過(guò)胞轉(zhuǎn)作用穿越腸上皮細(xì)胞進(jìn)入血流中，并最終與外周膽堿能神經(jīng)末梢(peripheralcholinergic nerve terminals)結(jié)合。BoNTs的極端毒性表明，外周神經(jīng)末梢攜帶可以作為BoNTs高親和受體的分子。事實(shí)上，數(shù)個(gè)突觸囊泡蛋白已被證明作為BoNTs受體。重鏈負(fù)責(zé)BoNTs與神經(jīng)末梢的結(jié)合，輕鏈?zhǔn)怯行У墓裟遗萑诤蠙C(jī)器的內(nèi)肽酶，因此必須進(jìn)入神經(jīng)末梢。BoNTs通過(guò)劫持囊泡內(nèi)吞路線來(lái)完成這個(gè)任務(wù)。作為循環(huán)囊泡的內(nèi)部液滴(interior drop)的pH值,BoNTs發(fā)生大的構(gòu)象變化。這使重鏈的移位部分(被稱為HN)，形成橫跨囊泡膜的假定渠道，部分未折疊的輕鏈穿過(guò)該囊泡膜，滑入細(xì)胞溶質(zhì)。在進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)的過(guò)程中，二硫鍵被還原，將輕鏈從重鏈上釋放。BoNT輕鏈?zhǔn)菑?qiáng)的內(nèi)肽酶，其攻擊介導(dǎo)囊泡融合的三種SNARE蛋白的很多亞型，從而使神經(jīng)遞質(zhì)釋放。目前已知的是，BoNT/A和BoNT/E蛋白酶解SNAP-25，而B(niǎo)oNTs B，D，F(xiàn)和G在突觸融合蛋白囊泡上切斷VAMP。被BoNT/A切短僅9個(gè)氨基酸的SNAP-25仍保留其與原生質(zhì)膜突觸融合蛋白和囊泡小突觸泡蛋白相互作用的能力，但不能介導(dǎo)正常的囊泡融合過(guò)程。關(guān)于肉毒桿菌神經(jīng)毒素(BoNTs)的進(jìn)一步信息,可以參見(jiàn)Davletov, B. ajohrs, M. andBinz,T. , Trends Neurosci 28,446-452(2005) ；Johnson, E. A. (1999)Annu Rev Microbiol53,551-575 ；Jankovic, J. (2004)J Neurol Neurosurg Psychiatry 75 (7),951-957 ；Aoki, K. R. and Guyer, B. (2001)EurJNeurol 8Suppl 5,21-29 ；Simpson, L. L. (2004)AnnuRev Pharmacol Toxicol 44,167-193 ;Dolly, 0. (2003)Headache 43Suppl I, S16-24 ;和 Montecucco, C. and Schiavo, G. (1993)Trends Biochem Sci 18(9),324-327. BoNT/A (BOTOX)的完整序列信息公開(kāi)在 Binz，T. et al. (1990) JBiol Chem 265 (16)，9153-9158。重新定向策略迄今為止，BoNTs的好 處被限制用于神經(jīng)肌肉狀況和自主神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療。但是，BoNTs也可以阻止神經(jīng)遞質(zhì)在中央神經(jīng)元的釋放，從而有可能在實(shí)驗(yàn)神經(jīng)科學(xué)和未來(lái)處理較高的腦功能的神經(jīng)學(xué)中利用它們。關(guān)于腦切片的研究，培養(yǎng)的神經(jīng)元和突觸體已經(jīng)表明=BoNTs可以阻止神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，不僅是こ酰膽堿，還有谷氨酸鹽，甘氨酸，去甲基腎上腺素，多巴胺，血清素，ATP和各種神經(jīng)肽(Ashton et al. (1988)，Capogna, M. etal. (1997),Sanchez-Prieto,J. et al. (1987), Verderio, C. et al. (2004), Luvisetto, S. etal. (2004)，and Costantin, L. et al. (2005))。BoNTs 的輕鏈?zhǔn)峭ㄟ^(guò)它們的伙伴重鏈來(lái)天然輸送的，但是其他的輸送的方式也是有效的，如脂質(zhì)體或重組融合構(gòu)建體(de Paiva,A. et al. (1990), Chaddock, J. A. et al. (2004), and Duggan, M. J. et al. (2002))。外源凝集素與BoNT/A的輕鏈進(jìn)行重組的想法最近使得后者被輸送進(jìn)了痛覺(jué)傳導(dǎo)(nociceptiveafferent)或背根節(jié)(Chaddock，J. A. et al. (2004))。重要的是，如果輕鏈與GFP熒光標(biāo)簽融合，則輸送效率能夠很容易跟蹤，并可標(biāo)記沉默的細(xì)胞。BoNTs的重鏈靶向突觸體和輸送它們的輕鏈到神經(jīng)末端的能力提供了另ー個(gè)可以在神經(jīng)生物學(xué)中使用的工具(Goodnough，M-C.et al. (2002)and Bade, S. et al. (2004))。不同分子的輸送，特別是酶，用 BoNT 重鏈更容易操作突觸生理學(xué)。實(shí)際上，最近的報(bào)道稱BoNT/D可以輸送重組的附著的酶到神經(jīng)末端(Bade, S. et al. (2004))。發(fā)明人表明，由兩部分的毒素重組以得到功能性肉毒桿菌毒素是可能的，所述兩部分為具有易位結(jié)構(gòu)域(HN)的輕鏈(LC)，其中，HN的C-末端攜帶SNARE標(biāo)簽(突觸融合蛋白，SNAP-25或小突觸泡蛋白);并且重鏈的受體結(jié)合部分(HC部分)，其N-末端攜帶SNARE標(biāo)簽(突觸融合蛋白，SNAP-25或小突觸泡蛋白)。SNARE標(biāo)簽允許功能単元的不可逆連接。在不具有健康風(fēng)險(xiǎn)的蛋白生產(chǎn)細(xì)菌株中，這兩部分(LCHN和HC)可以分開(kāi)生產(chǎn)。每個(gè)部分都可以通過(guò)安全的方式純化。當(dāng)混合兩部分時(shí)，他們?cè)贗小時(shí)內(nèi)生產(chǎn)出活性的神經(jīng)毒素，其可在暴露的神經(jīng)元中切斷它的分子靶標(biāo)SNAP-25，并阻止神經(jīng)遞質(zhì)從神經(jīng)末梢釋放。由于具有SNARE標(biāo)簽的LCHN部分是功能性的(即，觀察到SNAP-25神經(jīng)元切斷和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的阻止)，通過(guò)加入具有SNARE標(biāo)簽的配體，用于LCHN/配體部分的不可逆組裝，直接將該活性部分加入特異性的神經(jīng)元或內(nèi)分泌細(xì)胞是可能的。ー個(gè)例子是與SNARE標(biāo)簽連接的生長(zhǎng)抑素肽。配體與趨化細(xì)胞的結(jié)合造成LCHN輸送到將釋放輕鏈的細(xì)胞里，因此在神經(jīng)遞質(zhì)或激素釋放中SNAP-25的損害隨后停止。由于具有SNARE標(biāo)簽的HC部分是功能性的(即，在LCHN/具有SNARE標(biāo)簽的附著后，觀察到神經(jīng)遞質(zhì)釋放的阻止)，使用具有SNARE標(biāo)簽的HC部分用于遞送其他酶部分或成像部分至神經(jīng)元是可能的。也可以使用具有SNARE標(biāo)簽的其他受體結(jié)合化合物(如生長(zhǎng)抑素神經(jīng)肽)，用于遞送藥物，成像試劑等進(jìn)入攜帯必要受體的特異性細(xì)胞中。具有SNARE基序標(biāo)簽的LCHN的序列和具有SNARE基序標(biāo)簽的HC的序列如下通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)融合編碼的BoNT/A的輕鏈(1_449位氨基酸)，易位結(jié)構(gòu)域(449-872位氨基酸)和SNARE蛋白的cDNA。凝血酶位點(diǎn)LVPR-GS(SEQ ID NO. 17)插入到輕鏈(LC)和BoNT/A的易位結(jié)構(gòu)域(HN)之間，以模仿毒素被凝血酶切割的天然切ロ(用上述序列中的“-”表示)。與GST融合的蛋白按照如上所述進(jìn)行純化。使用凝血酶，用20mMHepes,pH 7. 3，IOOmM氯化鈉將蛋白從珠子上洗脫下來(lái)。對(duì)于小突觸泡蛋白2 (25-84)BoNT/AHc (876-1296)，洗脫緩沖液中還有O. 8%的辛基葡萄糖苷。洗脫后，我們得到具有以下序列的蛋白LcHN-SNAP25 BoNT/A Lc (1-449)凝血酶 HN(449-872) -SNAP25B (C 至 A) -SEQ IDNO. 18LcHN-Syx BoNT/A Lc (1-449)凝血酶 HN (449-872) _Syx3 (195-253)-SEQ ID NO. 19LcHN-Syb BoNT/A Lc (1-449)凝血酶 HN (449-872) -Syb2 (1-96 ；WWK-AAA) -SEQ IDNO. 20Syb-HcA Syb2 (25-84) BoNT/A He (876-1296)-SEQ ID NO. 21Syb HcD Syb2 (25-84) BoNT/D He (863-1276)-SEQ ID NO. 22納米鎖(Nanolock)HcA:Syx 3 (195-253) Syb 2(1-84) BoNT/A He (876-1296)-SEQID NO. 23SNAP25B (C 至 A) -SEQ ID NO. 24突觸融合蛋白3 (195-253)-SEQ ID NO. 25除了由細(xì)菌生產(chǎn)獲得的重組蛋白(以上所有)タト，也使用合成肽Syx3 肽(45aa，52aa_FITC)生長(zhǎng)抑素-小突觸泡蛋白多妝(Somatostatin-synaptobrevinpeptide)生長(zhǎng)抑素-突觸融合蛋白多肽(Somatostatin-syntaxin peptide)生長(zhǎng)抑素肽-SEQ ID NO. 26AC-RLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADAL-Ahx-Ahx-AGCKNFFWKTFTSC-OH為了使催化部分與受體結(jié)合域部分連接，發(fā)明人將融合有SNARE蛋白的活性部分(LcHN-Syx7LcHN SNAP25或LcHN-Syb)與含有第二 SNARE蛋白的受體結(jié)合部分混合I小時(shí)。通過(guò)加入第三SNARE伴侶封閉組裝。表中給出組合的例子
催化結(jié)構(gòu)域鎖蛋白受體結(jié)合部分
LcHN-Syx3SNAP25Syb-HcA
LcHN-SNAP25Syx3(45aa)Syb-HcA
LcHN-SNAP25Syx3(52aa-FITC)Syb-HcA
LcHN-SNAP25Syx3(195-253)Syb-HcA
權(quán)利要求
1.用于形成分子支架的復(fù)合系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)與所述多肽螺旋附著的貨物部分，其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，并且其中，所述衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋與所述衍生自小突觸泡蛋白或其同系物 的多肽螺旋連接。
2.用于形成分子支架的復(fù)合系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)與所述多肽螺旋附著的貨物部分，其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，并且其中，所述多肽螺旋連接在一起以形成兩個(gè)含有螺旋的組分。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的系統(tǒng)，其中，所述螺旋中的兩個(gè)連接在一起，以使得這兩個(gè)螺旋能組裝進(jìn)同一穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的系統(tǒng)，其中，所述螺旋中的另外兩個(gè)連接在一起，以使得這兩個(gè)螺旋能組裝進(jìn)同一穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的系統(tǒng)，其中，所述螺旋中的三個(gè)連接在一起，以使得所有這三個(gè)螺旋能組裝進(jìn)同一穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的系統(tǒng)，其中，所述兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋和以下多肽螺旋連接在一起衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；或衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中，所述螺旋中的一個(gè)被固定在基質(zhì)上。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中，所述SNAP蛋白為SNAP-25。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中，所述多肽螺旋衍生自小突觸泡蛋白。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中，每個(gè)螺旋的長(zhǎng)度至少為約40個(gè)氨基酸。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中，每個(gè)多肽螺旋的序列與衍生出所述多肽螺旋的蛋白或蛋白的部分的序列具有至少約80%的同一性。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中，該系統(tǒng)包括的貨物部分含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中，該系統(tǒng)包括的貨物部分含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分，或生長(zhǎng)抑素肽或其功能部分。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中，該系統(tǒng)包括的貨物部分包括與單獨(dú)的螺旋或含有螺旋的組分附著的第一貨物部分和第二貨物部分，并且其中，所述第一貨物部分含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分；且所述第二貨物部分含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分，或生長(zhǎng)抑素肽或其功能部分。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的系統(tǒng)，其中，所述第二貨物部分含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中，該系統(tǒng)還包括一個(gè)多肽螺旋，該多肽螺旋衍生自能夠與SNARE復(fù)合體結(jié)合的復(fù)蛋白。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中的任意一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其中，該系統(tǒng)還含有去垢劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的系統(tǒng)，其中，所述去垢劑選自MEGA8、C-HEGA 10、C-HEGA11、HEGA 9、庚基吡喃葡萄糖苷、辛基吡喃葡萄糖苷、壬基吡喃葡萄糖苷、zwittergent3-08、zwittergent 3-10 和 zwittergent 3-12。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的系統(tǒng)，其中，所述去垢劑是辛基吡喃葡萄糖苷。
20.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的系統(tǒng)，其中，所述螺旋中的兩個(gè)連接在一起，以使得這兩個(gè)螺旋不能組裝進(jìn)同一 SNARE復(fù)合體。
21.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的系統(tǒng)，其中，所述螺旋中的兩個(gè)連接在一起，并且其中，所述系統(tǒng)還包括單獨(dú)的多肽螺旋，所述單獨(dú)的多肽螺旋與連接在一起的兩個(gè)螺旋的其中之一衍生自相同的蛋白。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的系統(tǒng)，其中，所述單獨(dú)的多肽螺旋固定在基質(zhì)上。
23.由權(quán)利要求20-22中任何一項(xiàng)所述的系統(tǒng)產(chǎn)生的多聚體。
24.權(quán)利要求1-22中任何一項(xiàng)所述的復(fù)合系統(tǒng)的應(yīng)用。
25.權(quán)利要求1-22中任何一項(xiàng)所述的復(fù)合系統(tǒng)在診斷中的應(yīng)用。
26.其上固定有穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的儀器，所述SNARE復(fù)合體包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)與所述多肽螺旋附著的貨物部分，其中，所述儀器選自陣列，檢測(cè)器，微流體設(shè)備，SPR儀，石英晶體微天平儀，質(zhì)譜儀，電泳儀，層析柱，掃描探針顯微鏡，和熱量測(cè)定儀。
27.形成攜帶一個(gè)或多個(gè)貨物部分的SNARE復(fù)合體的方法，該方法包括將兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋、一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋結(jié)合在一起，以形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，一個(gè)或多個(gè)貨物部分與所述多肽螺旋附著，并且其中(i)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接；或( )所述多肽螺旋連接在一起，以形成兩個(gè)含有螺旋的組分。
28.用于形成分子支架的組分，該組分包括與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接的、衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，并且其中，這兩個(gè)連接的螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的一部分。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的組分，其中，所述組分具有選自SEQIDNOsl2，13，14和73所示的序列。
30.用于形成分子支架的組分，其中，該組分包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，和，衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋或衍生自小突觸泡蛋白的多肽螺旋，其中，這三個(gè)螺旋連接在一起，以形成三螺旋組分，并且其中，這三個(gè)連接的螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的一部分。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的組分，其中，所述組分具有SEQID NO. 15所示的序列。
32.權(quán)利要求28-31中任意一項(xiàng)所述的組分的應(yīng)用。
33.一種包括組分的試劑盒，該組分包括與衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋連接的、衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，并且其中，這兩個(gè)連接的螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的一部分。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中，該試劑盒還包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，所述多肽螺旋能夠與突觸融合蛋白/小突觸泡蛋白衍生的螺旋形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。
35.一種包括組分的試劑盒，該組分包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，和衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋或衍生自小突觸泡蛋白的多肽螺旋，其中，這三個(gè)螺旋連接在一起，以形成三螺旋組分，并且其中，這三個(gè)連接的螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的一部分。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的試劑盒，其中，該試劑盒還包括衍生自第四SNARE蛋白的單獨(dú)的多肽螺旋，所述第四SNARE蛋白為小突觸泡蛋白或其同系物，或突觸融合蛋白，其中，所述單獨(dú)的多肽螺旋能夠與所述三螺旋組分形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。
37.用于形成分子支架的復(fù)合系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)與所述多肽螺旋附著的貨物部分，其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，并且其中，所述SNARE復(fù)合體在去垢劑的存在下形成。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)不含MunclS蛋白。
39.不存在Muncl8蛋白的情況下，去垢劑用于促進(jìn)SNARE復(fù)合體組裝的應(yīng)用。
40.包括多個(gè)連接在一起的穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體的多聚體，其中，每個(gè)SNARE復(fù)合體包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；其中，來(lái)自一個(gè)SNARE復(fù)合體的螺旋與來(lái)自另一個(gè)SNARE復(fù)合體的螺旋連接，以將所述SNARE復(fù)合體連接在一起，并且其中，一個(gè)或多個(gè)貨物部分與所述多肽螺旋附著。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的多聚體，其中，所述多聚體還包括分支，其中，來(lái)自一個(gè)SNARE復(fù)合體的三個(gè)螺旋與三個(gè)不同的SNARE復(fù)合體中的螺旋附著。
42.一種多聚體的生產(chǎn)方法，該方法包括以下步驟I)提供衍生自第一 SNARE螺旋的第一多肽螺旋；2)將第二多肽螺旋和第三多肽螺旋與所述第一多肽螺旋結(jié)合，以形成三螺旋復(fù)合體，其中，所述第二多肽螺旋和第三多肽螺旋衍生自第二 SNARE螺旋和第三SNARE螺旋；3)將第四多肽螺旋與三螺旋束結(jié)合，以形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，所述第四多肽螺旋衍生自第四SNARE螺旋，并且其中，所述第四多肽螺旋與衍生自第一 SNARE螺旋的第五多肽螺旋連接；并且4)重復(fù)步驟2)和步驟3)，以形成多聚體，其中，一個(gè)或多個(gè)貨物部分與所述多肽螺旋附著。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中，在重復(fù)的步驟中，保持第二多肽螺旋，第三多 肽螺旋，第四多肽螺旋和第五多肽螺旋的同一性。
44.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的方法，其中，所述第二多肽螺旋和第三多肽螺旋連接在一起，以使得它們能夠一起組裝進(jìn)同一 SNARE復(fù)合體。
45.根據(jù)權(quán)利要求42-44中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述第一多肽螺旋固定在基質(zhì)上。
46.根據(jù)權(quán)利要求42-45中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，該方法還包括在每個(gè)結(jié)合的步驟后的洗滌步驟，以去除任何未結(jié)合的螺旋。
47.根據(jù)權(quán)利要求42-46中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，通過(guò)使用衍生自第一SNARE螺旋的第六多肽螺旋，將分支引入所述多聚體中，其中，所述第六多肽螺旋與第二多肽螺旋、第三多肽螺旋、第四多肽螺旋或第五多肽螺旋中的一個(gè)附著。
48.由權(quán)利要求42-47中任意一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的多聚體。
49.用于形成包括兩個(gè)貨物部分的二元復(fù)合物的復(fù)合系統(tǒng)，該復(fù)合系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，第一貨物部分與第一螺旋附著，且第二貨物部分與第二單獨(dú)的螺旋附著，并且其中，所述SNARE復(fù)合體的形成導(dǎo)致了所述二元復(fù)合物的形成。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的復(fù)合系統(tǒng)，其中，所述二元復(fù)合物是毒素。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的復(fù)合系統(tǒng)，其中，所述毒素選自肉毒桿菌毒素、白喉毒素、破傷風(fēng)毒素和蓖麻毒素。
52.根據(jù)權(quán)利要求51所述的復(fù)合系統(tǒng)，其中，所述毒素為肉毒桿菌毒素。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的復(fù)合系統(tǒng)，其中，該復(fù)合系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，第一貨物部分與第一螺旋附著，且第二貨物部分與第二單獨(dú)的螺旋附著，并且其中，所述第一貨物部分含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分；且所述第二貨物部分含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分。
54.權(quán)利要求49-53中任意一項(xiàng)所述的復(fù)合系統(tǒng)的應(yīng)用。
55.權(quán)利要求50-53中任意一項(xiàng)所述的復(fù)合系統(tǒng)在治療中的應(yīng)用。
56.根據(jù)權(quán)利要求51所述的復(fù)合系統(tǒng)，其中，所述毒素選自白喉毒素和蓖麻毒素，用于治療腫瘤疾病。
57.根據(jù)權(quán)利要求52或53所述的復(fù)合系統(tǒng)，其中，所述復(fù)合系統(tǒng)用于治療通過(guò)抑制神經(jīng)突觸而緩解的疾病或狀況。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的復(fù)合系統(tǒng)，所述通過(guò)抑制神經(jīng)突觸而緩解的疾病或狀況選自以下組成的組過(guò)度出汗，過(guò)度流涎，肌張力失常，胃腸疾病，泌尿疾病，面肌痙攣，斜視，大腦性癱瘓，口吃，慢性緊張性頭痛，hyperlacrymation,多汗癥,咽下縮肌疫攣,疫攣性膀胱，疼痛，偏頭痛，以及美容，如減少皺紋，抬頭紋等。
59.一種治療通過(guò)抑制神經(jīng)突觸而緩解的疾病或狀況的方法，該方法包括將有效量的含有權(quán)利要求52或53所述的系統(tǒng)的組合物給藥至受試者。
60.形成SNARE復(fù)合體以形成包括兩個(gè)貨物部分的二元復(fù)合物的方法，該方法包括將兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋結(jié)合在一起，以形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，第一貨物部分與第一螺旋附著，且第二貨物部分與第二單獨(dú)的螺旋附著，并且其中，所述SNARE復(fù)合體的形成導(dǎo)致了所述二元復(fù)合物的形成。
61.根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中，所述二元復(fù)合物是毒素。
62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中，所述毒素選自肉毒桿菌毒素，白喉毒素，破傷風(fēng)毒素和蓖麻毒素。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中，所述毒素是肉毒桿菌毒素。
64.根據(jù)權(quán)利要求63以形成肉毒桿菌毒素的方法，該方法包括將兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋結(jié)合在一起，以形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，第一貨物部分與第一螺旋附著，且第二貨物部分與第二單獨(dú)的螺旋附著，其中，所述第一貨物部分含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分；且所述第二貨物部分含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分。
65.用于形成肉毒桿菌毒素的組分，該組分包括衍生自SNAP蛋白、突觸融合蛋白、或小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，所述多肽螺旋與貨物部分附著，所述貨物部分含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分。
66.用于形成肉毒桿菌毒素的組分，該組分包括衍生自SNAP蛋白、突觸融合蛋白、或小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，所述多肽螺旋與貨物部分附著，所述貨物部分含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分。
67.權(quán)利要求65或66所述的組分的應(yīng)用。
68.一種試劑盒，該試劑盒包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋，其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，第一貨物部分與第一螺旋附著，且第二貨物部分與第二單獨(dú)的螺旋附著，并且其中，所述第一貨物部分含有肉毒桿菌毒素的輕鏈或其功能部分，以及肉毒桿菌毒素的重鏈的易位部分，且所述第二貨物部分含有肉毒桿菌毒素的重鏈的受體結(jié)合部分。
69.用于形成分子支架的復(fù)合系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)與所述多肽螺旋附著的貨物部分，其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，并且其中，至少兩個(gè)所述多肽螺旋的長(zhǎng)度小于50個(gè)氨基酸。
70.形成攜帶一個(gè)或多個(gè)貨物部分的SNARE復(fù)合體的方法，該方法包括將兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋，一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋，和一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋結(jié)合在一起，以形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體，其中，一個(gè)或多個(gè)貨物部分與所述多肽螺旋附著，并且其中，至少兩個(gè)所述多肽螺旋的長(zhǎng)度少于50個(gè)氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種復(fù)合系統(tǒng)，該復(fù)合系統(tǒng)包括兩個(gè)衍生自SNAP蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自突觸融合蛋白的多肽螺旋；一個(gè)衍生自小突觸泡蛋白或其同系物的多肽螺旋；和一個(gè)或多個(gè)與所述多肽螺旋附著的貨物部分，其中，這四個(gè)多肽螺旋能夠形成穩(wěn)定的SNARE復(fù)合體。本發(fā)明還涉及該復(fù)合系統(tǒng)的生產(chǎn)方法和該復(fù)合系統(tǒng)的應(yīng)用。
文檔編號(hào)G01N33/94GK102625812SQ201080044446
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2010年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月12日
發(fā)明者B·達(dá)夫列托夫, E·費(fèi)拉里, F·達(dá)里歐斯, M·索洛維耶夫 申請(qǐng)人:醫(yī)藥研究協(xié)會(huì)