本發(fā)明屬于茶業(yè)品質(zhì)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于uhplc串聯(lián)高分辨質(zhì)譜應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)區(qū)分真假日照綠茶的分析方法。

背景技術(shù)：

代謝組學(xué)是對一個(gè)生物系統(tǒng)的給定時(shí)間和條件下所有小分子代謝物質(zhì)的定性定量分析,從而定量描述生物內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其對內(nèi)因和外因變化應(yīng)答規(guī)律的科學(xué)。代謝組學(xué)研究的對象是相對分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子代謝產(chǎn)物，可以系統(tǒng)、細(xì)致的了解和認(rèn)識(shí)生命機(jī)體的活動(dòng)規(guī)律和代謝過程。

代謝組學(xué)的主要研究思想是“全局觀點(diǎn)”，注重對生物代謝物的整體情況進(jìn)行研究，更能反映生物的整體動(dòng)態(tài)情況。代謝組學(xué)方法為生命科學(xué)的發(fā)展提供了有力的現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段,同時(shí)也為實(shí)踐提供了新的技術(shù)支持與保障。

茶葉品質(zhì)一般與色、香、味、形等因素有關(guān)，這些因素受海拔、緯度、光照、溫度、濕度、栽培過程中的灌水及施肥等影響較大。而茶葉中有水分、生物堿、酶、茶多酚、維生素和氨基酸等上百種化學(xué)成分，這些化學(xué)成分之間也是相互聯(lián)系的，它們共同決定著茶葉的品質(zhì)，傳統(tǒng)意義上的依靠感官的茶葉品質(zhì)鑒定方式無法對茶葉中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行定性定量測定，太過于主觀，逐漸不適應(yīng)當(dāng)下茶業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，很難讓人信服。

日照綠茶產(chǎn)于山東省日照市，日照是世界茶學(xué)家公認(rèn)的三大海綠茶城市之一(另兩個(gè)分別為韓國寶城和日本靜岡)。日照市地處山東省東南部，東臨黃海，屬暖溫帶濕潤季風(fēng)氣候，光照充足，雨量充沛，境內(nèi)山地丘陵土壤呈微酸性，屬黃棕壤土，含有豐富的有機(jī)質(zhì)和微量元素，優(yōu)越的沿海氣候條件和優(yōu)良的環(huán)境，孕育了日照綠茶“葉片厚、滋味濃、香氣高、耐沖泡”的獨(dú)待品質(zhì)，沖泡后湯色黃綠明亮、栗香濃郁、回味甘醇，被譽(yù)為“江北第一茶”。2006年3月，國家質(zhì)檢總局批準(zhǔn)對日照綠茶實(shí)施地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)。因此，建立一種區(qū)分日照綠茶的方法有很強(qiáng)的實(shí)用意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種基于uhplc串聯(lián)四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)區(qū)分真假日照綠茶的分析方法，該分析方法能夠有效區(qū)分真日照綠茶和低價(jià)綠茶。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供一種基于uhplc串聯(lián)四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)區(qū)分真假日照綠茶的分析方法，包括以下步驟：

將日照綠茶樣品和待測的綠茶樣品分別采用有機(jī)溶劑進(jìn)行前處理后，應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)對前處理后的樣品中的化學(xué)成分的分離與測定，然后對得到日照綠茶樣品與待測綠茶樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，最后應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法主成分分析(pca)模型區(qū)分待測綠茶樣品是否為日照綠茶。

本發(fā)明中，所述日照綠茶樣品選擇嵐山區(qū)的茶葉、五蓮縣的茶葉、東港區(qū)的茶葉、莒縣的茶葉中的一種或多種。為了能夠得到有效區(qū)分真假日照綠茶，優(yōu)先可以選用這四種茶葉樣品。

本發(fā)明中，所述前處理采用的有機(jī)溶劑是甲醇水溶液，優(yōu)選的，所述甲醇水溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為75～80％，最優(yōu)選的為75％。

本發(fā)明中，樣品前處理過程包括：將綠茶樣品粉碎，與有機(jī)溶劑混合，超聲，離心，過有機(jī)濾膜，得到可上機(jī)檢測的樣品。

其中，超聲時(shí)間為10～30min，優(yōu)選20min；離心條件：800～1200rpm離心4～8min，優(yōu)選1000rpm離心5min；有機(jī)濾膜的孔徑為0.20～0.25μm，優(yōu)選0.22μm；為保證樣品中代謝物提取效果較好，樣品與有機(jī)溶劑的添加比例為1g：(300～400)ml，優(yōu)選1g：350ml。

本發(fā)明中，超高效液相色譜條件為：超高效液相色譜條件為：采用十八烷基鍵合硅膠柱(c18柱)；a相：甲酸水溶液，b相：甲酸乙腈溶液，梯度洗脫流程：0-2.5min95％a，2.5-3min95％-91％a，3-4min91％-80％a，4-5.5min80％-70％a，5.5-6.5min70％-65％a，6.5-8min65％-50％a，8-8.75min50％-30％a，8.75-9.75min30％-15％a，9.75-11.75min15％-10％a，11.75-14min10％-1％a，14-16.5min1％a，16.5-17.5min1％-95％a，17.5-20min95％。流速：0.2～0.5ml/min，柱溫30～37℃。

優(yōu)選的，甲酸水溶液中甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1％，甲酸乙腈溶液中甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1％；流速為0.3ml/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量2微升。

本發(fā)明中，四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜選用thermofisherqexactivemassspectrometer，質(zhì)譜條件為：正離子模式，分辨率，70000；鞘氣流速，40個(gè)單位；輔助氣流速，10個(gè)單位；反吹氣流速，0個(gè)單位；噴霧電壓，3.1kv；毛細(xì)管溫度，320℃。掃描范圍，m/z：75-1125。掃面模式：fullms(全掃描)。

相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)方案具有如下有益效果：

(1)應(yīng)用了代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合超高效液相色譜串聯(lián)四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)對綠茶中化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行宏觀分析，信服力高。

現(xiàn)有的對茶葉的檢測項(xiàng)目僅僅局限在幾個(gè)常見的指標(biāo)，無法對茶葉品質(zhì)做出有效判斷，而人工的判斷方法受各種因素的影響較大，信服力太弱，代謝組學(xué)技術(shù)可以對代謝物的整體情況進(jìn)行研究，更能反映樣本的整體情況，同時(shí)，可應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)知識(shí)尋找差異性的代謝物，為進(jìn)一步研究提供技術(shù)支持。

采用本發(fā)明的分析方法能夠有效區(qū)分日照綠茶和低價(jià)綠茶，結(jié)果以pca得分圖的形式展示，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠直觀的判別其真假情況，無需再進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證和分析，可以得到真假結(jié)論，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

(2)綠茶樣品前處理方法簡單快捷，方法建立后對檢測人員操作技術(shù)要求較低。

在整個(gè)前處理過程，為了保證盡可能多的獲取綠茶樣品的代謝物信息，提取試劑用的是甲醇和水的混合溶劑對測試樣品進(jìn)行溶解，超聲后離心過有機(jī)濾膜即可上機(jī)檢測，前處理步驟簡單，易于操作。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，不合適的前處理方法不能最大限度地提取日照綠茶的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，將會(huì)造成不容易區(qū)分的檢測結(jié)果，使得檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

(3)簡化操作流程。傳統(tǒng)的檢測需要配置標(biāo)準(zhǔn)樣品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)需要對多種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行測定，過程繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。應(yīng)用代謝組學(xué)方法進(jìn)行測定，前處理過程簡單，操作方便，上機(jī)操作也比較便捷，可以進(jìn)行批量處理，省時(shí)省力，可信度高。

(4)針對uhplc串聯(lián)四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)區(qū)分真假日照綠茶的分析方法，本發(fā)明根據(jù)日照綠茶樣品的特點(diǎn)，優(yōu)化篩選得到一組使得分析樣品得到最佳分離效果和檢測效果的超高效液相色譜條件以及四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜的工藝條件，經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，通過該工藝條件，能夠在pca得分圖上將日照綠茶與劣質(zhì)或低價(jià)綠茶有效區(qū)分。

(5)本發(fā)明使用了四極桿-軌道阱高分辨的質(zhì)譜，故分辨率比較高，相比較于其他的檢測方法，可以得到更準(zhǔn)確和更多的物質(zhì)，這在數(shù)據(jù)分析中有顯著的優(yōu)勢。

附圖說明

構(gòu)成本發(fā)明的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。

圖1是嵐山區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶的pca得分圖，其中，lanshan，代表嵐山區(qū)的茶葉；jia，代表低價(jià)的綠茶。

圖2是東港區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶的pca得分圖，其中，donggang，代表東港區(qū)的茶葉；jia，代表低價(jià)的綠茶。

圖3是五蓮縣、莒縣日照綠茶和低價(jià)綠茶的pca得分圖，其中，wulian，代表五蓮縣的茶葉；juxian，代表莒縣的茶葉樣品；jia，代表低價(jià)的綠茶。

圖4是四個(gè)產(chǎn)地的日照綠茶和低價(jià)綠茶的pca得分圖，其中，wulian，代表五蓮縣的茶葉；juxian，代表莒縣的茶葉樣品；lanshan，代表嵐山區(qū)的茶葉；donggang，代表東港區(qū)的茶葉；jia，代表低價(jià)的綠茶。

具體實(shí)施方式

應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說明都是示例性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。

需要注意的是，這里所使用的術(shù)語僅是為了描述具體實(shí)施方式，而非意圖限制根據(jù)本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。如在這里所使用的，除非上下文另外明確指出，否則單數(shù)形式也意圖包括復(fù)數(shù)形式，此外，還應(yīng)當(dāng)理解的是，當(dāng)在本說明書中使用術(shù)語“包含”和/或“包括”時(shí)，其指明存在特征、步驟、操作和/或它們的組合。

術(shù)語解釋：

多元統(tǒng)計(jì)分析方法是建立在多元統(tǒng)計(jì)分布基礎(chǔ)上的一類處理多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)方法的總稱，是統(tǒng)計(jì)學(xué)中的具有豐富理論成果和眾多應(yīng)用方法的重要分支。常用的多元統(tǒng)計(jì)分析方法主要包括：多元回歸分析、聚類分析、判別分析、主成分分析、因子分析、對應(yīng)分析、典型相關(guān)分析等。本發(fā)明主要采用主成分分析法。

儀器與設(shè)備：

acquityuplcbehc18分析柱美國waters公司(2.1×50mm,1.7μm)；

thermoscientificqexactivethermoscientifictmultimate3000美國thermofisher公司；

sigma3-18k高速冷凍離心機(jī)德國sigma公司；

milli-q-a-11超純水機(jī)密理博公司；

超聲波清洗機(jī)寧波新芝生物科技有限公司；

ikams3basic渦旋混合器ika公司；

材料與試劑：

日照綠茶不同日照綠茶產(chǎn)地處收集；

低價(jià)綠茶超市處購買，每斤在100元以下；

超純水milli-q-a-11；

乙腈賽默飛世爾科技有限公司；

甲醇賽默飛世爾科技有限公司；

無水甲酸賽默飛世爾科技有限公司。

正如背景技術(shù)中所介紹的，為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的所存在的不足，本發(fā)明提供一種基于uhplc串聯(lián)四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)區(qū)分真假日照綠茶的分析方法。

該分析方法的原理是：綠茶中含有上百種化學(xué)成分，它們影響了茶葉的品質(zhì)，使用uhplc可以將茶葉中的化學(xué)物質(zhì)分開，使用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行檢測，可以得到茶葉的液相和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，然后應(yīng)用代謝組學(xué)分析技術(shù)，對所得的數(shù)據(jù)應(yīng)用pca技術(shù)進(jìn)行分析，從而直觀區(qū)分待測綠茶樣品是否為日照綠茶。

高效液相色譜是一種采用小顆粒填料色譜柱(粒徑小于2μm)和超高壓系統(tǒng)(壓力大于105千帕)的新型液相色譜技術(shù),能顯著改善色譜峰的分離度和檢測靈敏度，同時(shí)大大縮短分析周期，適用于微量復(fù)雜混合物的分離和高通量研究。同時(shí)，thermofisherqexactivemassspectrometer具有超高分離度、超高速度、超高靈敏度等特點(diǎn)，可以對茶葉中的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行更精確地檢測，使結(jié)果更可靠，更有信服力。

具體包括以下步驟：

將日照綠茶樣品和待測的綠茶樣品分別采用有機(jī)溶劑進(jìn)行前處理后，應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜方法實(shí)現(xiàn)對前處理后的樣品中的化學(xué)成分的分離與測定，然后對得到日照綠茶樣品與待測綠茶樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，最后應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法主成分分析(pca)模型區(qū)分待測綠茶樣品是否為日照綠茶。

對于不同產(chǎn)地的日照綠茶，由于其品質(zhì)與色、香、味、形等因素有關(guān)，這些因素受海拔、緯度、光照、溫度、濕度、栽培過程中的灌水及施肥等影響較大，所以即使同為日照綠茶，不同產(chǎn)地之間的日照綠茶中的代謝物組成和濃度不會(huì)完全相同，故它們之間會(huì)呈現(xiàn)一定差異，但是經(jīng)過本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，這并不影響最終的檢測結(jié)果，能夠與劣質(zhì)或低價(jià)的綠茶進(jìn)行有效的區(qū)分。在本發(fā)明的某些實(shí)施例中，所述日照綠茶樣品選擇嵐山區(qū)的茶葉、五蓮縣的茶葉、東港區(qū)的茶葉、莒縣的茶葉中的一種或多種。為了能夠得到有效區(qū)分真假日照綠茶，優(yōu)先可以選用這四種茶葉樣品。

在整個(gè)前處理過程，為了保證盡可能多的獲取樣品的代謝物信息，提取試劑優(yōu)先選用的是甲醇和水的混合溶劑對測試樣品進(jìn)行溶解，超聲后離心過有機(jī)濾膜即可上機(jī)檢測，前處理步驟簡單，易于操作。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述甲醇水溶液中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為75％。本發(fā)明還進(jìn)行可其他提取劑的研究，例如乙醇水溶液，但是得到的效果并不理想，無法有效區(qū)分日照綠茶和低價(jià)綠茶。

在本發(fā)明某些優(yōu)選的實(shí)施例中，樣品前處理過程包括：將綠茶樣品粉碎，與有機(jī)溶劑混合，超聲，離心，過有機(jī)濾膜，得到可上機(jī)檢測的樣品。其中，超聲時(shí)間為10～30min，優(yōu)選20min；離心條件：800～1200rpm離心4～8min，優(yōu)選1000rpm離心5min；有機(jī)濾膜的孔徑為0.20～0.25μm，優(yōu)選0.22μm；為保證樣品中代謝物提取效果較好，綠茶樣品與有機(jī)溶劑的添加比例為1g：(300～400)ml，優(yōu)選1g：350ml。其中，所述綠茶樣品與有機(jī)溶劑的添加比例較為關(guān)鍵，能夠?qū)y試樣品充分溶解，從而獲取更多的樣品代謝物信息，使得最終檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。

色譜的分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集是同時(shí)進(jìn)行的，為了使每個(gè)組分都得到分離和鑒定，必須選擇合適的色譜和質(zhì)譜分析條件。

本發(fā)明針對日照綠茶樣品組分的特點(diǎn)，考察了超高效液相色譜中的流動(dòng)相、梯度洗脫流程、柱溫和進(jìn)樣量等條件對分離效率和分析速度的影響，最終優(yōu)化篩選得到一組使得分析樣品得到最佳分離效果的超高效液相色譜條件。

在本發(fā)明某些優(yōu)選的實(shí)施例中，超高效液相色譜條件為：采用十八烷基鍵合硅膠柱(c18柱)；a相：甲酸水溶液，b相：甲酸乙腈溶液，梯度洗脫流程：0-2.5min95％a，2.5-3min95％-91％a，3-4min91％-80％a，4-5.5min80％-70％a，5.5-6.5min70％-65％a，6.5-8min65％-50％a，8-8.75min50％-30％a，8.75-9.75min30％-15％a，9.75-11.75min15％-10％a，11.75-14min10％-1％a，14-16.5min1％a，16.5-17.5min1％-95％a，17.5-20min95％。流速：0.2～0.5ml/min，柱溫30～37℃。

綠茶樣品是一個(gè)成分復(fù)雜的試樣，本發(fā)明篩選得到的梯度洗脫程序能夠更好的對綠茶中復(fù)雜包含很多物質(zhì)的組分進(jìn)行強(qiáng)有力的分離，為后續(xù)區(qū)分日照綠茶和低價(jià)綠茶作好基礎(chǔ)。本發(fā)明還采用了其他的梯度洗脫程序，發(fā)現(xiàn)不合適的梯度洗脫程序，無法使每個(gè)組分都得到有效分離，進(jìn)而無法有效區(qū)分日照綠茶和低價(jià)綠茶。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，甲酸水溶液中甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1％，甲酸乙腈溶液中甲酸的體積分?jǐn)?shù)為0.1％；流速為0.3ml/min；柱溫35℃；進(jìn)樣量2微升。

本發(fā)明針對日照綠茶樣品的組分特點(diǎn)，為改善化合物的霧化和電離狀況，提高靈敏度，通過對分辨率、氣體流速、噴霧電壓等條件進(jìn)行考察，最終優(yōu)化篩選得到一組使得檢測效果準(zhǔn)確的四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜條件。

在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中，四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜選用thermofisherqexactivemassspectrometer，質(zhì)譜條件為：正離子模式，分辨率，70000；鞘氣流速，40個(gè)單位；輔助氣流速，10個(gè)單位；反吹氣流速，0個(gè)單位；噴霧電壓，3.1kv；毛細(xì)管溫度，320℃。掃描范圍，m/z：75-1125。掃面模式：fullms(全掃描)。

經(jīng)過試驗(yàn)驗(yàn)證，通過該超高效液相色譜和質(zhì)譜的工藝條件，能夠在pca得分圖上將日照綠茶與劣質(zhì)或低價(jià)綠茶有效區(qū)分，否則，無法有效區(qū)分日照綠茶和低價(jià)綠茶。

應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)可以測定許多內(nèi)源性化合物的定性/定量信息。這些信息在輸出的譜圖上表現(xiàn)為許多信號(hào)峰，在色譜質(zhì)譜圖上表現(xiàn)為不同保留時(shí)間出現(xiàn)色譜峰。

從處理效果和方便性來講，在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施例中，對得到的日照綠茶樣品和待測的綠茶樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)采用compounddiscover軟件進(jìn)行預(yù)處理，該預(yù)處理是指對總離子流圖原始數(shù)據(jù)中的色譜峰的提取、峰對齊、去噪音等處理，得到各個(gè)峰的保留時(shí)間、峰高、峰面積和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)；然后通過多元統(tǒng)計(jì)分析方法pca得分圖的形式對區(qū)分結(jié)果進(jìn)行展示。

其中，compoundsdiscoverer軟件是賽默飛世爾科技有限公司研制的一種處理lc-ms原始數(shù)據(jù)的軟件。

區(qū)分方法是：在pca得分圖中，將待測的綠茶樣品點(diǎn)與日照綠茶樣品點(diǎn)所歸屬的區(qū)域進(jìn)行比較，若是兩者的樣品點(diǎn)分別歸屬于不同的區(qū)域，比如，如圖1～4所示，可判定待測的綠茶樣品不屬于日照綠茶；若是兩者的樣品點(diǎn)相互重疊或者相互摻雜在一起，可判定待測的綠茶樣品屬于日照綠茶。

為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1

一種基于uhplc串聯(lián)四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù)區(qū)分日照綠茶和低價(jià)綠茶的分析方法，包括以下步驟：

(1)樣品前處理

將茶葉樣品粉碎，稱取0.1g樣品于50ml離心管中，加入35ml提取劑(75％甲醇水溶液(v/v))，渦旋混勻溶解，超聲20min，1000rpm離心5分鐘，然后將提取溶液充分混勻，0.22微米濾膜過濾，上機(jī)，進(jìn)樣體積為2微升。

(2)應(yīng)用uhplc串聯(lián)thermofisherqexactivemassspectrometer儀器實(shí)現(xiàn)對樣品中化學(xué)成分的分離與測定。

1)液相色譜參數(shù)

色譜柱：waterbehc18(1.7μm2.1x50mm)色譜柱。

液相：a相，0.1％甲酸水，b相，0.1％甲酸乙腈；流速：0.3ml/min，柱溫35℃。

2)質(zhì)譜參數(shù)

正離子模式

(3)數(shù)據(jù)處理與多元統(tǒng)計(jì)分析

對得到的茶葉樣品的uhplc-ms原始數(shù)據(jù)采用compounddiscover軟件進(jìn)行預(yù)處理，該預(yù)處理是指對總離子流圖原始數(shù)據(jù)中的色譜峰的提取，峰對齊，去噪音等處理，得到各個(gè)峰的保留時(shí)間、峰高、峰面積和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)，然后通過simca軟件的多元統(tǒng)計(jì)分析方法pca得分圖的形式對區(qū)分結(jié)果進(jìn)行展示。

pca得分圖是pca模型的一種分布圖，由于pca分析是建立在同一個(gè)數(shù)據(jù)集x基礎(chǔ)上，經(jīng)過投影方法計(jì)算pca第一主成分后，可以得到各個(gè)樣品點(diǎn)在第一個(gè)主成分的得分t1，再得到各個(gè)樣品點(diǎn)的第二個(gè)主成分上的得分t2。各個(gè)樣品在各個(gè)主成分的得分就是其在計(jì)算的數(shù)學(xué)模型中的空間坐標(biāo)，自然也就決定了其在模型中的具體位置，并直接反映各個(gè)樣品在數(shù)學(xué)模型空間中的分布情況。

(4)不同應(yīng)用對象的成果展示：

1)嵐山區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶的比較

茶葉樣品為嵐山區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶，其中嵐山區(qū)日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為25個(gè)，從不同茶農(nóng)處收集，低價(jià)綠茶的樣品個(gè)數(shù)為23個(gè)，按照(1)～(3)的流程進(jìn)行操作，得到嵐山區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶的pca得分圖。

結(jié)果如圖1所示，從pca得分圖可以看出各個(gè)樣品的聚集、離散程度，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，其中，嵐山區(qū)日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為25個(gè)，該25個(gè)樣品點(diǎn)全部相對集中在圖1中的右半部分，低價(jià)綠茶的樣品個(gè)數(shù)為23個(gè)，該23個(gè)樣品點(diǎn)全部集中在圖1中的左半部分。

圖1說明這25個(gè)嵐山區(qū)日照綠茶的樣品含有的代謝物組成很接近，組內(nèi)差異較小，而與低價(jià)綠茶樣品點(diǎn)距離很大，這說明嵐山區(qū)日照綠茶含有的代謝物組成和濃度與低價(jià)綠茶的區(qū)別較大，采用該方法可以有效區(qū)分嵐山區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶，可見低價(jià)綠茶并非嵐山區(qū)的高品質(zhì)綠茶。

2)東港區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶的比較

茶葉樣品為東港區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶，其中東港區(qū)日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為20個(gè)，從不同茶農(nóng)處收集，低價(jià)綠茶的樣品個(gè)數(shù)為19個(gè)，按照(1)～(3)的流程進(jìn)行操作，得到東港區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶的pca得分圖。

結(jié)果如圖2所示，從pca得分圖可以看出各個(gè)樣品的聚集、離散程度，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，其中，東港區(qū)日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為20個(gè)，該20個(gè)樣品點(diǎn)全部相對集中在圖2中的右半部分，低價(jià)綠茶的樣品個(gè)數(shù)為19個(gè)，該19個(gè)樣品點(diǎn)全部集中在圖2中的左半部分。

圖2說明這20個(gè)東港區(qū)日照綠茶的樣品含有的代謝物組成很接近，組內(nèi)差異較小，而與低價(jià)綠茶樣品點(diǎn)距離很大，這說明東港區(qū)日照綠茶含有的代謝物組成和濃度與低價(jià)綠茶的區(qū)別較大，采用該方法可以有效區(qū)分東港區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶，可見低價(jià)綠茶并非東港區(qū)的高品質(zhì)綠茶。

3)五蓮縣、莒縣日照綠茶和低價(jià)綠茶的比較

茶葉樣品為五蓮縣、莒縣日照綠茶和低價(jià)綠茶，其中五蓮縣日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為7個(gè)，莒縣日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為7個(gè)，從不同茶農(nóng)處收集，低價(jià)綠茶的樣品個(gè)數(shù)為14個(gè)，按照(1)～(3)的流程進(jìn)行操作，得到五蓮縣、莒縣日照綠茶和低價(jià)綠茶的pca得分圖。

結(jié)果如圖3所示，從pca得分圖可以看出各個(gè)樣品的聚集、離散程度，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，其中，五蓮縣日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為7個(gè)，莒縣日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為7個(gè)，該14個(gè)日照綠茶樣品點(diǎn)全部相對集中在圖3中的右半部分，低價(jià)綠茶的樣品個(gè)數(shù)為14個(gè)，該14個(gè)樣品點(diǎn)全部集中在圖3中的左半部分。圖3說明這13個(gè)日照綠茶的樣品含有的代謝物組成很接近，組內(nèi)差異較小，而與低價(jià)綠茶樣品點(diǎn)距離很大，這說明這兩個(gè)產(chǎn)地的日照綠茶含有的代謝物組成和濃度與低價(jià)綠茶的區(qū)別較大，采用該方法可以有效區(qū)分這兩個(gè)產(chǎn)地的日照綠茶和低價(jià)綠茶，可見低價(jià)綠茶并非這兩個(gè)日照產(chǎn)地的高品質(zhì)綠茶。

4)四個(gè)產(chǎn)地的日照綠茶和低價(jià)綠茶間的比較

茶葉樣品為五蓮縣、莒縣、嵐山區(qū)、東港區(qū)日照綠茶和低價(jià)綠茶，其中五蓮縣日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為4個(gè)，莒縣日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為4個(gè)，嵐山區(qū)日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為4個(gè)，東港區(qū)日照綠茶的樣品個(gè)數(shù)為4個(gè)，從不同茶農(nóng)處收集，低價(jià)綠茶的樣品個(gè)數(shù)為14個(gè)，按照(1)～(3)的流程進(jìn)行操作，得到這四個(gè)產(chǎn)地的日照綠茶和低價(jià)綠茶的pca得分圖。

結(jié)果如圖4所示，從pca得分圖可以看出各個(gè)樣品的聚集、離散程度，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，其中，四個(gè)產(chǎn)地的16個(gè)日照綠茶樣品點(diǎn)全部相對集中在圖4中的右半部分，低價(jià)綠茶的樣品個(gè)數(shù)為14個(gè)，該14個(gè)樣品點(diǎn)全部集中在圖4中的左半部分。圖4說明這16個(gè)日照綠茶的樣品含有的代謝物組成很接近，組內(nèi)差異較小，而與低價(jià)綠茶樣品點(diǎn)距離很大，這說明這四個(gè)產(chǎn)地的日照綠茶含有的代謝物組成和濃度與低價(jià)綠茶的區(qū)別較大，采用該方法可以有效區(qū)分這四個(gè)產(chǎn)地的日照綠茶和低價(jià)綠茶，可見低價(jià)綠茶并非這四個(gè)日照產(chǎn)地的高品質(zhì)綠茶。

綜上，基于本發(fā)明的前處理方法、液相色譜參數(shù)和四極桿-軌道阱高分辨質(zhì)譜參數(shù)的前提下，應(yīng)用代謝組學(xué)方法，從圖中可以看到，每一個(gè)產(chǎn)地和低價(jià)的綠茶做對比時(shí)，日照綠茶和低價(jià)茶葉都可以很好地分開；四個(gè)產(chǎn)地作為整體和低價(jià)綠茶做對比時(shí)，兩者也可以很好地分開。由此可見，本研究所使用的方法對于區(qū)分低價(jià)綠茶和日照綠茶有很好的效果。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。