專利名稱：使用未經(jīng)加工的血液的pcr和hla分型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PCR和HLA分型的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明公開了用來在露天場(chǎng)地或醫(yī)務(wù)室環(huán)境內(nèi)以個(gè)體或群體規(guī)模，擴(kuò)增未經(jīng)加工的生物標(biāo)本中的DNA或RNA及其隨后的HLA分型的串聯(lián)PCR過程的方法和系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
在當(dāng)前醫(yī)療中，對(duì)HLA分型的醫(yī)學(xué)意義有著新且迅速增長(zhǎng)的認(rèn)識(shí)。作為ー個(gè)實(shí)例，表I證明了 HLA分型廣闊范圍的診斷和公共健康應(yīng)用。表I
HLA-B等位基因與等位基H的臨床聯(lián)系 HLA-B篩選的臨床用途
B*07埃博拉病_ 0保護(hù)性的(與在存活者中商度 集
B*i4)。對(duì)埃博拉病苒的非B*07+ B*14 致命反應(yīng)。
B*0801HIV-2感染易感對(duì)于AIDS的HIV-2篩選
B*li沙W衣原體(CWa—dia不發(fā)展為失_的那些人的
trachomatis) イ呆,1 免T'% -預(yù)Il
HJ
B*14埃博拉病^^保護(hù)性的(Μ在存活者中高度 集
Β*07 一起)。對(duì)埃博拉病Β*07和B* 14 毒的非致命反應(yīng)·
Β*1502不良藥物反應(yīng)屮W人>1 FDA所有屮W人應(yīng)’I布
屮k巧兩—f-誘導(dǎo)的史蒂文Rx之前篩選 斯-約翰遜 (Stevens - Johnson )綜合怔
B*1503HIV-2 感染d的 AIDS 對(duì)于 AIDS 的 HIV-2 篩選
預(yù)后
B*17兒血病。發(fā)作時(shí)所イ Β*7和Α*33可結(jié)介來預(yù)
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增興趣DNA的方法，包括 獲得包括DNA的未經(jīng)加工的樣本； 在未經(jīng)加工的樣本上進(jìn)行第一 PCR來產(chǎn)生第一擴(kuò)增子； 稀釋第一擴(kuò)增子；以及 就此進(jìn)行第二 PCR直到第二 PCR反應(yīng)中所用的所有引物被耗盡，來產(chǎn)生第二擴(kuò)增子，從而將輸入樣本DNA擴(kuò)增到最終擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物濃度，這受到第二 PCR反應(yīng)中引物濃度的限制，所述第二 PCR反應(yīng)不依賴于包括原始樣本的DNA的量或純度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的所述方法，包括 在未經(jīng)加工的樣本上平行進(jìn)行一組基因靶的第一 PCR來產(chǎn)生第一組擴(kuò)增子； 稀釋第一組擴(kuò)增子；以及 使用一級(jí)擴(kuò)增子產(chǎn)物的整組作為第二 PCR反應(yīng)的一組模板，就此進(jìn)行第二 PCR，直至所有二級(jí)PCR引物被耗盡來產(chǎn)生第二擴(kuò)增子組，從而擴(kuò)增DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的所述方法，其中可平行擴(kuò)增5個(gè)以內(nèi)基因靶、10個(gè)以內(nèi)基因靶或20個(gè)以內(nèi)基因靶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的所述方法，其中基因靶是HLA-DRBl、DQ-Al和DQ-Bl，是DQ-Al和DQ-Bl 或者是 HLA-B 和 KIR。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的所述方法，其中基因靶是線粒體復(fù)制起點(diǎn)附近的兩個(gè)高變區(qū)以及一個(gè)或多個(gè)額外的線粒體基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的所述方法，其中基因靶是微生物特異性微生物16SDNA基因的區(qū)段，所述方法在未經(jīng)加工的樣本中檢測(cè)微生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的所述方法，還包括用一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記第二PCR引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的所述方法，其中熒光團(tuán)是菁染料。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的所述方法，其中DNA包括一個(gè)或多個(gè)興趣基因，還包括 第二擴(kuò)增子與具有興趣基因相關(guān)等位基因變異的序列的探針進(jìn)行雜交； 從雜交的擴(kuò)增子檢測(cè)熒光圖式；以及 基于熒光圖式指定等位基因型。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的所述方法，其中興趣基因是HLA-A基因、HLA-B基因、HLA-DRBl基因、HLA-DQAl基因、或HLA-DQBl基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求I的所述方法，其中第一PCR的引物是基因座特異性引物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的所述方法，其中引物具有SEQID NOS :1-14所顯示的序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求I的所述方法，其中靶向DNA序列的第二PCR反應(yīng)的引物包含在第一PCR反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物中。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的所述方法，其中第二PCR反應(yīng)的引物是一組多外顯子特異性引物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的所述方法，其中引物具有SEQID NOS : 15-27所顯示的序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求I的所述方法，還包括 對(duì)第二擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序用于其分析。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的所述方法，其中分析確定身份、個(gè)體親權(quán)、法醫(yī)信息、組織配型、疾病發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素、或?qū)λ幬锏姆磻?yīng)中的一個(gè)或多個(gè)。
18.根據(jù)權(quán)利要求I的所述方法，其中未經(jīng)加工的樣本是新鮮的或重新水化的，并包括未處理的流體血液、干燥的未處理的血液、新鮮的頰拭子樣本、干燥的頰拭子樣本、排泄物材料、陰道樣本或通過擦拭有生命的或無生命的表面或物體獲得的樣本。
19.根據(jù)權(quán)利要求I的所述方法，其中DNA是線粒體DNA。
20.一種用于擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)興趣RNA的方法，包括 從個(gè)體獲得未經(jīng)加工的生物樣本； 在未經(jīng)加工的生物樣本上進(jìn)行第一逆轉(zhuǎn)錄PCR來產(chǎn)生第一 cDNA擴(kuò)增子； 稀釋第一擴(kuò)增子并就此進(jìn)行第二 PCR直至所有引物被耗盡來產(chǎn)生第二擴(kuò)增子，從而擴(kuò)增興趣RNA。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的所述方法，還包括用一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記第二PCR引物。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的所述方法，其中熒光團(tuán)是菁染料。
23.根據(jù)權(quán)利要求21的所述方法，還包括 第二擴(kuò)增子或擴(kuò)增子的組與具有互補(bǔ)于基因序列興趣區(qū)的序列的探針雜交； 從雜交的擴(kuò)增子中檢測(cè)熒光圖式；以及 基于熒光圖式鑒定一個(gè)或多個(gè)基因或其等位基因型。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的所述方法，其中所述基因是HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-DRBl基因、HLA-DQAl基因、或HLA-DQBl基因或其組合中的一個(gè)或多個(gè)。
25.根據(jù)權(quán)利要求20的所述方法，還包括對(duì)第二擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序用于其分析。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的所述方法，其中分析確定身份、個(gè)體親權(quán)、法醫(yī)信息、組織配型、疾病發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)因素、或?qū)λ幬锏姆磻?yīng)中的一個(gè)或多個(gè)。
27.根據(jù)權(quán)利要求20的所述方法，其中第二PCR是線性PCR并且第二擴(kuò)增子是cRNA。
28.根據(jù)權(quán)利要求20的所述方法，其中第二PCR是實(shí)時(shí)PCR并且引物對(duì)于第一 cDNA擴(kuò)增子是外顯子特異性的。
29.根據(jù)權(quán)利要求20的所述方法，其中第一擴(kuò)增子是HLA-A、HLA-B或HLA-DBR1、HLA-DQAl或HLA-DQ-BlcDNA中的一個(gè)或多個(gè)，并且外顯子特異性引物具有SEQ ID NOS 15-27顯示的序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求20的所述方法，其中未經(jīng)加工的樣本是新鮮的或重新水化的，并包括未處理的流體血液、干燥的未處理的血液、新鮮的頰拭子樣本、干燥的頰拭子樣本、排泄物材料、陰道樣本或通過擦拭有生命的或無生命的表面或物體獲得的樣本。
31.一種用于興趣基因等位基因分型的方法，包括 從一個(gè)或多個(gè)個(gè)體獲得未經(jīng)加工的生物樣本； 在未經(jīng)加工的生物樣本上使用特異于基因基因座或限定的基因基因座的組的引物進(jìn)行第一 PCR來產(chǎn)生第一擴(kuò)增子或擴(kuò)增子的組； 稀釋第一擴(kuò)增子或第一擴(kuò)增子的組，并用這些擴(kuò)增子作為用于第二 PCR反應(yīng)的模板，使用特異于基因基因座中外顯子或外顯子組的引物進(jìn)行第二 PCR，直到所有引物被耗盡來產(chǎn)生來自第二 PCR反應(yīng)的擴(kuò)增子組； 第二擴(kuò)增子或擴(kuò)增子組與具有興趣基因或基因的組相關(guān)的等位基因變異的序列的探針雜交； 從雜交的擴(kuò)增子或擴(kuò)增子組中檢測(cè)信號(hào)；以及基于檢測(cè)的雜交信號(hào)指定等位基因型。
32.根據(jù)權(quán)利要求31的所述方法，其中第一擴(kuò)增子或擴(kuò)增子的組是從包括樣本的RNA擴(kuò)增而得的cDNA，并且第二 PCR是就此進(jìn)行的線性PCR或?qū)崟r(shí)PCR。
33.根據(jù)權(quán)利要求31的所述方法，其中信號(hào)是熒光，用一個(gè)或多個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記所述第二 PCR引物對(duì)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的所述方法，其中熒光團(tuán)是菁染料。
35.根據(jù)權(quán)利要求31的所述方法，其中興趣基因是HLA-A基因、HLA-B基因或HLA-DRBl基因、HLA-DQAl基因、或HLA-DQBl基因或其組合中的一個(gè)或多個(gè)。
31、根據(jù)權(quán)利要求31的所述方法，其中基因座特異性引物具有SEQ ID N0S:1_14所顯示的序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求31的所述方法，其中引物的亞組是外顯子特異性引物。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的所述方法，其中外顯子特異性引物具有SEQID NOS :15-27所顯示的序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求31的所述方法，其中未經(jīng)加工的樣本是新鮮的或重新水化的，并包括血液、干燥的血液、頰拭子樣本、排泄物物質(zhì)或陰道樣本或通過擦拭有生命的表面或物體獲得的其它樣本。
39.根據(jù)權(quán)利要求31的所述方法，其中個(gè)體包括露天場(chǎng)地環(huán)境中的群體。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用串聯(lián)PCR過程擴(kuò)增興趣基因或RNA或其組的方法。第一PCR或PCR反應(yīng)的組中的引物是基因座-特異性的。第二PCR或PCR反應(yīng)的組中的引物特異于基因座-特異性引物的亞序列并且在第二PCR擴(kuò)增期間全部耗盡。對(duì)于RNA擴(kuò)增，第一PCR是逆轉(zhuǎn)錄，并且獲得的cDNA為cRNA合成、終點(diǎn)PCR或?qū)崟r(shí)PCR提供模板。本發(fā)明還提供的是基因或其組的等位基因分型的方法，該方法通過在含有樣本的DNA或RNA上使用串聯(lián)PCR來擴(kuò)增基因、將獲得的擴(kuò)增子或其組與具有基因相關(guān)等位基因變異的序列的探針進(jìn)行雜交。指示雜交的可檢測(cè)信號(hào)對(duì)應(yīng)著基因的等位基因型或者基因的組的等位基因型的組。
文檔編號(hào)G01N33/52GK102834525SQ201080060981
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2010年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月16日
發(fā)明者M·E·奧甘, G·L·帕迪利亞, M·R·馬伊, A·T·阿瓦洛斯, F·H·埃格, K·M·奧布賴恩 申請(qǐng)人:美國(guó)基因組學(xué)有限公司